DE2415461A1

DE2415461A1 - Verfahren zum erzeugen von algenzellen

Info

Publication number: DE2415461A1
Application number: DE2415461A
Authority: DE
Inventors: Koji Mitsugi; Shigeru Yamanaka
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1973-03-30
Filing date: 1974-03-29
Publication date: 1974-10-10
Also published as: GB1471921A; FR2223454A1; JPS49124278A; JPS564233B2; FR2223454B1; IT1011203B; US3882635A

Description

Priorität: 30. März 1973, Japan, Nr. 35598/73

Verfahren zum Erzeugen von Algenzellen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Algenzellen durch Züchten einer Alge in einem wässrigen Kulturmedium.

Algenzellen haben als Nahrungsmittel- und Futtermittelzusatz Beachtung gefunden. Unter den übrigen Algenzellen wurden Zellen von Chlorella beachtet und die Erzeugung und Ausnutzung dieser Zellen wurde untersucht. Es existieren jedoch zahlreiche organische Naturstoffe, die durch Chlorella überhaupt nicht oder kaus: verbraucht bzw. assimiliert werden können, beispielsweise Saccharose, und daher sind assimilierbare organische Nährquellen, die billig sind und in großen Mengen eingesetzt werden können, ziemlich eingeschränkt.

Es wurde nun gefunden, daß eine neue Alge des Genus Prototheca eine große Vielfalt von organischen Naturstoffen aufnehmen und zum Wachstum verwerten kann. Diese Alge ist den

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bekannten Stämmen des Genus Prototheca im. Hinblick auf die Assimilation verschiedener organischer Verbindungen überlegen.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Erzeugung von Algenzellen durch Züchten einer Alge des Genus Prototheca bis zur Vermehrung der Zellen in einem wässrigen Kulturmedium und Gewinnung der vermehrten Zellen aus dem Medium. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Prototheca sphaerica FERM P-1943 in einem wässrigen Kulturmedium züchtet, das- assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze und organische Spurennährstoffe enthält.

Die erfindungsgemäß verwendete Alge ist Prototheca sphaerica PERM P-1943', diese durch ihre FSRM P-Nummer identifizierte Alge ist von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry for Industrial Trade and Industry, Chiba, Japan, frei erhält-lich.

Die Alge wurde aus der Atmosphäre isoliert.

Die Alge Prototheca sphaerica FERM P-1943 hat folgende morphologische und physiologische Eigenschaften:

A. Morphologische Eigenschaften·

1. Zellen:

Die Zellen wurden auf Hefe-Malzextrakt-Agar (Y.M.-Agar) gezüchtet, der folgende Bestandteile enthielt:

Hefeextrakt 0.3 g/dl

Malzextrakt ' 0.3 g/dl

Glucose 1 g/dl

Pepton 0.5 g/dl

Agar 1.5 g/dl

pH 6.8

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Die erhaltenen Zellen sind sphärisch und haben eine Größe von 5 bis 7 Mikron.

Diese Zellen bilden rauhe Kolonien, gelegentlich jedoch glatte Kolonien. Zellen, die glatte Kolonien bilden, sind etwas größer als die Zellen, die rauhe Kolonien bilden, und einige der zuerst genannten Zellen sind länglich und oval.

Es handelt sich um Zellen mit einem Septum, die noch ein anderes Septum vertikal zu dem ersteren aufweisen, ausgenommen Einzelzellen. Diese Kultur bildet kein Mycel unter aeroben Bedingungen und zeigt keine Verbindung durch Schnallenbildung (clamp connection).

2. Submers-Kultur:

Die Kulturen, die in einem flüssigen Hefe-Malzextrakt-Medium bei 3O°G während 48 Stunden unter Schütteln gebildet wurden, zeigten am Ende des Züchtens, daß zahlreiche Zellen in unregelmäßigen Massen gebildet wurden und sich rasch absetzten.

3. Agar-Kultur:

Kulturen, die auf Hefe-Malzextrakt-Agarmedium bei 5O⁰C während 48 Stunden erhalten wurden, erscheinen blaßgelb, rauh und nicht glänzend.

Die Kolonien sind blaßgelb, fast kreisrund und erhaben. Gelegentlich treten auch glatte Kolonien auf.

B. Physiologische Eigenschaften

1. Assimilation von Kohlenhydraten:

Die Assimilation von Kohlenhydraten wurde geprüft, indem die Kultur auf einem Medium durchgeführt wurde, das

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"Yeast Nitrogen Base" (Warenname der DII¹CO Co.) und 0,5 g/dl der nachstehend angegebenen Kohlenhydrate enthielt.

Es zeigte sich,·daß D-G-lucose, D-Galactose, Saccharose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Trehalose und D-Ribose assimiliert werden. Raffinose wird schwach assimiliert. Dagegen Melibiose, L-Arabinose, D-Mannit, D-Sorbit, Inosit und Dulcit werden nicht angegriffen.

2. Assimilation von organischen Säuren:

Sie wurde in gleicher Weise wie unter B.1 beschrieben wurde, festgestellt.

Essigsäure, G-luconsäure und Milchsäure werden assimiliert. Dagegen werden Zitronensäure und Bernsteinsäure nicht assimiliert.

3. Assimilation von Alkoholen:

Diese wurde in gleicher"Weise wie in Abschnitt B.1 geprüft.

Äthanol wird assimiliert. n-Propanol und n-Butanol werden nicht assimiliert.

4. Optimaltemperatur: 30 - 37⁰C

5. Aerob

6. H₂S: wird gebildet

7. Indol: wird nicht gebildet

8. Acetylmethylcarbinol: wird nicht gebildet

9. Katalase: Positiv

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10. Sporen: keine Sporenbildung

11. Äthylalkohol: wird nicht gebildet

12. Beweglichkeit: nicht beweglich ■

Die Eigenschaften des Stammes wurden mit dem Bericht von W. Krügel (Hedwigia 33.» 241 (1894)) und von T. Benedict und 0. Ciferri (Mycopathologie et Mycologie Applicata, "]_, 251 (1956)) verglichen, in denen Prototheca-Algen definiert sind und ihre Eigenschaften beschrieben sind. Auf Grund dieser Angaben wird angenommen, daß der Stamm eine Alge des Genus Prototheca ist. Der erfindungsgemäße Stamm ist kein.Bakterium, weil ein so großes Bakterium mit einem Durchmesser von 5 bis 7 u bisher nicht bekannt ist. Der Stamm ist auch keine HeCe." Dies ist daraus zu schließen, daß die Zellteilung des Stammes in Form einer Querwand fortschreitet und nur bei Hefestämmen des Genus Sehizosaccharomyces die Zellteilung in dieser Form stattfindet. Der erfin-dungsgemäße Stamm unterscheidet sich jedoch von einer Hefe im Hinblick auf die Alkoholgärung. Alle Stämme des Genus Schizosaccharomyces können Alkohol als Fermentationsprodukt bilden, während der erfindungsgemäße Stamm dazu nicht befähigt ist. Der Stamm gehört auch nicht zu Schimmelpilzen oder Basidiomyceten, da unter aeroben Bedingungen kein Mycel gebildet wird und keine Schnallenstruktur in der Zelle auftritt.

Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes wurden da- nach experimentell mit denen von bekannten Stämmen des Genus Prototheca verglichen, wobei sich zeigte, daß-zahlreiche Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes sich von den Eigenschaften der bekannten Stämme unterscheiden. Die Ver-

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such'sergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Daraus wurde geschlossen, daß der erfindungsgemäße Stamm einen neuen Stamm von Prototheca sp. darstellt und er wurde als neue Spezies Prototheea sphaeriea bezeichnet.

Das zur Züchtung von Zellen dieser Alge verwendete Kulturmedium enthält mindestens eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Salze und organische Nährstoffe.

Zu assimilierbaren Kohlenstoffquellen gehören Kohlenhydrate, wie D-Glucose, D-ffalactose, Saccharose, Maltose und Lactose, organische Säuren, wie Essigsäure und Milchsäure, Alkohole, wie Äthanol, sowie Lipoide. Zu assimilierbaren Stickstoffquellen gehören Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumsuccinat, Amide, wie Acetamid, und organische Naturstoffe.

Abwasser, das aus Anlagen der organische Naturstoffe verarbeitenden Industrie abgeleitet wird, eignet sich als Nährstoffquelle für die Alge, weil das Abwasser gewöhnlich die angegebenen assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische' Salze und organische Nährstoffe enthält. Zu den angegebenen Industriezweigen gehören die Nahrungsmittelindustrie, wie Zuckerherstellung, Brauereiindustrie, verschiedene GärungsIndustrien, wie die Herstellung von Aminosäuren, Nucleinsäuren und Antibiotika, die Industrie der Fleischprodukte, Molkereiprodukte, die Fischaufarbeitungsindustrie, Konservenindustrie, Bäckerei- und Süßwarenindustrie, die Müllerei, Lederindustrie und dergleichen.

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Die Züchtung wird unter aeroben .-Bedingungen im Dunklen durchgeführt, wobei der pH-Wert "bei 5 "bis 9 und die Temperatur vorzugsweise bei 30 bis 37⁰C gehalten wird. Die Alge kann natürlich auch unter Licht wachsen. Die Algenzellen werden durch Dekantieren aus der Brühe gewonnen, weil die Zellen in Form eines Koagulats wachsen und sich daher augenblicklich abscheiden. Die Zellen können auch durch Zentrifugieren oder Filtration gewonnen werden. Die gewonnenen Zellen lassen sich leicht durch Waschen mit Wasser reinigen.

Zucker wurde mit Hilfe der Fehling-lehmann-Schoorl-Methode bestimmt. Die Ausbeute der Algenzellen wurde in folgender Weise berechnet. Die durch Zentrifugieren gewonnenen Algenzellen wurden gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, bis ihre Suspension keine Farbtönung der Kulturflüssigkeit zeigt (mehr als dreimal). Danach wurden die gewaschenen Zellen 20 bis 40 Stunden in einem Trockenschrank bei 105r-110°C getrocknet.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher verdeutlicht.

Beispiel 1

Prototheea sphaerica FERM P-1943 wurde auf Hefe-Malzextrakt-Schrägagar 48 Stunden bei 30⁰C gezüchtet und zwei Platinösen der so gebildeten Kolonien wurden in einen 100 ml-Anteil eines flüssigen Hefe-Malzextrakt-Mediums eingeimpft, das folgende Bestandteile enthielt:

Hefeextrakt Malzextrakt Glucose Pepton

pH 6,8

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ο,	3	g/dl
ο,	3	g/dl
1		g/dl
0,	5	g/dl

Dieses Medium war in einem 500 ml-Schüttelkolben sterilisiert worden. Das beimpfte Medium wurde dann 48 Stunden unter Schütteln (120 Upm) bei 30°C gehalten.

5 ml der dabei gebildeten Kulturbrühe wurden in 100 ml eines Kulturmediums eingeimpft, das 20 ml/1 Rohrzuckermelasse (pH 7,2) enthielt, das. in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben und 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert worden war. Die Züchtung wurde dann bei 30⁰C während 6 Tagen unter Schütteln durchgeführt.

Parallel zu dieser Züchtung wurde die gleiche Kulturbrühe in 100 ml eines Kulturmediums eingeimpft, das 6,7 g/l "Yeast Nitrogen Base" (Warenname der DIPCO Co.) und 10 g/1 Glucose enthielt und einen pH-Wert von 7,2 hatte. Die Züchtung wurde in der gleichen Weise wie vorher durchgeführt.

Die Ergebnisse beider Versuche sind in Tabelle 2 angegeben.

	Züch tungs dauer , Tage	Gewicht d.trok- kenen Zellen (g/dl)	Tabelle 2	Verbrauch an Sacchariden (*)	Ausbeute an trocke nen Zellen.. ()
Medi.um	0 3 6	0,11 0,42 0,60	Konzen tration der Saccha ride	44,3 83,1	29,3 46,2
Melasse- Medium	0 3 6	0,12 0,26 0,66	1,06 0,59 0,18	57,2 90,0	13,2 59,3
Glucose- Medium		0,91 0,39 0,09

bezogen auf die verbrauchten Saccharide

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Beispiel 2

100 ml eines Kulturmediums, das 20 g/l Milchsäure und 6,7 g/l "Yeast Nitrogen Base" (DIPCO Co.) enthielt und einen pH-Wert von 6,0 hatte, wurden hergestellt, in einen 500 ml-Schüttelkorben gegeben und 15 Minuten "bei 120⁰C sterilisiert. Das Medium wurde mit 5 nil der Impfkultur von Prototheca sphaerica IERM P-1943, die vorher in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gebildet worden war, geimpft und die Züchtung wurde während 4 Tagen bei 30⁰C unter Schütteln (120 TJpm) durchgeführt.

Am Ende der Züchtungsdauer wurden die Algenzellen durch Zentrifugation gewonnen, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurden 5»2 g des trockenen Zellmaterials erhalten.

Beispiel 3

Es wurden 100 ml eines Kulturmediums hergestellt, das folgende Bestandteile enthielt:

Acetamid 10 g/l

Glucose 10 g/l

MgSO₄.7H₂O K₂HPO₄.

KH₂PO₄ FeSO₄.7H₂O Ap--Lösung

(2,86 g H₃BO₅; 2,50 g MnSO₄.7H₂O; 0,222 g ZnSO₄.7H₂O; 0,079 g CuSO₄ und 0,021 g Na₂MoO₄ wurden in 1 1 Wasser gelöst)

pH 6,0

0,3	g/l
0,3	g/l
0,7	g/l
0,003	g/l
1	ml/1

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Dieses Medium wurde in einen 500 ml-Sciiüttelkorben gegeben und 15 Minuten bei 120 C sterilisiert. Das Medium wurde mit .5 ml der Impfkultur von Prototheca sphaerica PERM P-1943 angeimpft, die vorher in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, und die Züchtung und die Gewinnung der dabei gebildeten Algenzellen wurde" in gleicher Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt. Es wurde trockenes Zellmaterial in einer Menge von 3,1 g erhalten.

Beispiel 4

Ein Kulturmedium wurde durch Vermischen von 10 ml Äthanol mit einer Lösung vom pH 7,0 hergestellt, die 6,7 g "Yeast Nitrogen Base" (DIPCO Co.) und 1 1 V/asser enthielt und vorher 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert worden war. Das Medium wurde mit 5 ml der Impfkultur von Prototheca sphaerica PERM P-1943 beimpft, die in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 erhalten worden war, und die Züchtung wurde 43 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln (120 TJpm) durchgeführt. Es wurden 6,8 g der trockenen Algenzellen gewonnen.

Beispiel 5

100 ml eines Abwassers, das beim Verfahren des Kochens von Makrelen abgelassen wurde (biologischer Sauerstoffbedarf (BOD) 24.000 ppm) wurden in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben, mit 5 ml der Impfkultür von Prototheca sphaerica PERM P-1943, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten v/orden war, angeimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 30 C bebrütet.

Nach dem ZüchtungsVorgang wurde die Brühe zentrifugiert und es wurden 1,03 g/dl der trockenen Algenzellen gewonnen. Es v-'urde festgestellt, daß der biologische Sauerstoffbedarf der¹ überstehenden Flüssigkeit 4.600 ppm betrug.

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Beispiel 6

100 ml der überstehenden Flüssigkeit einer Histidin-Fermen— t.ationsbrühe (BOD 11.200 ppm) wurden in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben und 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert. Das Medium wurde mit 5 ml der Impfkultur von Prototheca sphaerica FERM P-1943j die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, angeimpft und bei 30⁰C während 48 Stunden unter Schütteln bebrütet (120 Upm).

Nach der Züchtung wurde die Brühe zentrifugiert und es wurden trockene Algenzellen in einer Menge von 0,34 g/dl gewonnen. Der BOD der überstehenden Flüssigkeit betrug 2.000 ppm.

Beispiel 7

5 1 Abwasser, das während des Reinigungsverfahrens für Rohstärke zur Herstellung von Dextrose abgelassen wurde (bestehend aus Kanalwasser und abgeleitetem Abwasser) (BOD 5.200 ppm) wurden in einen 10 1-Schüttelkolben gegeben, mit 100 ml der Impfkultur von Prototheca sphaerica FERM P-1943, die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, beimpft und die Züchtung wurde 24 Stunden unter Schütteln (120 Upm) bei 30⁰C durchgeführt.

Nach der Züchtung wurde die Brühe zentrifugiert und es wurden 0,20 g/dl der trockenen Algenzellen gewonnen.. Der BOD der überstehenden Flüssigkeit betrug 80 ppm.

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Tabelle

Stamm P.ciferrii P.moriformis P.trispora P.wickerhamii P.zopfii P.stagnora gem.Srfin- IFO 6994 IPO 6995 IEO 6996 IFO 6997 IFO 6998 ATOC 16528

dung

Form d. Zellen (auf Hefe-Malzextrakt-Agar bei 30⁰C,1 Tag)

sphärisch.

sphärisch oder ellipsoid

sphärisch

sphärisch sphärisch oder ellipsoid

Größe d.Zellen (u) auf Hefe-Malzextrakt-Agar bei 3O⁰C, 1 Tag

5-7

6-9x6-30 6-9x9-15

9-24x15-45

3-12

6-24x'6-54

2-12

Sporen

nicht nicht nicht gebildet nicht nicht gebildet gebildet gebildet gebildet gebildet gebildet

Kolonien

(auf Hefe-Malz

extrakt-Agar)

blaßgelb weiß

weiß

Temperaturverhalten

Wachstum bei 20-45 C

Wachstum bei Wachstum 15-45⁰C bei _n 20-34 C

Wachstum bei .
20-37 C

Wachstum
bei
20-37 C

Wachstum
bei
20-37 0

Wachstun bei 20-30⁰O

Assimilation v. Kohlenhydraten, organischen Säuren etc. L-Glucoe

D-Galactose Saccharose

Maltose
Lactose

Fortsetzung Tabelle

Cellobiose Trehalose-Melibiose L-Arabinose D-Ribose D-Mannit Milchsäure Bernsteinsäure Zitronensäure Essigsäure Äthanol

O OO OO

H₂S Urease

Voges-Proskauer-Test Methylrot-Test Indo;

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Erzeugung von Algenzellen durch Züchtung eines Stammes des Genus Prototheca in einem wässrigen Kulturmedium bis zur Vermehrung der Zellen und Gewinnung der vermehrten Zellen aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Stamm Prototheca sphaerica PEM P-1943 in einem wässrigen Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, anorganische Salze und organische Spurennährstoffe enthält, züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1_f dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein Abwasser aus der Industrie der Aufarbeitung organischer Naturstoffe verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein Abwasser aus der Nahrungsmittelindustrie verwendet.

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