DE1642752C - Verfahren zur Herstellung von L-Prolin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-ProlinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-ProHn durch aerobes
Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien.
L-Prolin ist eine der wichtigsten biologisch aktiven
Aminosäuren, welche auf dem pharmazeutischen Gebiet Interesse als wertvolle Substanz erweckt. Als
praktische Methoden zur Gewinnung waren jedoch bisher nur die Hydrolyse von natürlichem Protein und
die Extraktion von L-Prolin aus dem Hydrolysat f.ie
durch Züchten von Mikroorganismen in bestimmten Nährmedien nach der französischen Patentschrift
1 427 534 bekannt. Demzufolge ist es schwierig, die Verbindung in industriellem Maßstab zu liefern. Denn
auch nach dem letztgenannten biotechnischen Verfahren unter Einsatz von Brevibacterium flavum-Stämmen
und Verwendung einer der Aminosäuren i-Leucin, Ornithin, Citrullin, Arginin, Histidin enthält
die Fermentationslösung optimal nur 0,5 bis 1.5 g/dl L-Prolin, bestimmt durch Biotitration der Fermentationsflüssigkeit
mit Hilfe von Leuconostoc Citrovorum.
Es wurde nun gefunden, daß Kurthia catenaforma ATCC 21 144 eine starke Fähigkeit zur Akkumulation
von L-Prolin in hoher Konzentration in einem Nährmedium hat und damit die stets mit Verlusten verbundene
Isolierung in größerer Menge gestattet.
Die morphologischen, züchterischen und physiologischen Merkmale des Stammes Kurthia Catenaforma
ATCC 21 144 werden wie folgt beschrieben:
(A) Züchtungsmerkmale
1. Wachstum in Nähragar
Bildet glatte, insgesamt runde Kolonie mit konvexer,
grauer und durchscheinender Peripherie. Es ist kein fauliger Geruch zu beobachten.
2. Wachstum in Nährbrühe
Wächst ohne Häutchenbildung zu Ringen. Es ist keine mäßige Trübung zu beobachten, jedoch
wird Sediment gebildet.
3. Wachstum in Nähragar-Schrägschnitten
Ausbreitung, graues strahlenförmiges Wachstum.
Ausbreitung, graues strahlenförmiges Wachstum.
(B) Morphologie
Aussehen: Bildet Stäbchen, gekrümmte Stäbchen, kokkoide Formen und Fäden
Länge: 0,8 · 3,5 μ
Länge: 0,8 · 3,5 μ
10 ·5Ο μ.
Zellen existieren in unabhängiger Form, in Paaren oder in wachsenden langen Ketten mit gerundeten
Enden ohne Verzweigung. Die Ketten sind sehr oft gekrümmt und können sich später zu kokkoiden Formen
(eilen. Schwach motil mit fragiler peritrkhischer Fla·
gella. Sie werden nicht eingekapselt und bilden keine
Sporen.
(C) Physiologische Merkmale
1. Bedingungen für Züchtung
2. Verhalten gegen Sauerstoff fakultativ
anaerob
3. Oram-Einteilung (Gram's stain) ... variabel
4. Methylrotprüfung negativ
5. Voges-Proskauer-Reaktion .... negativ
6. Bildung von Indol aus Tryprophan negativ
7. Produktion von Schwefelwasserstoff (auf Bleiacetat-Agar und Cystin-medium)
,...,. negativ
8. Reduktion von Nitrat zu Nitrit negativ
9. Produktion von Katalase . positiv
10. Verflüssigung von G.'.adne negativ
11. Hydrolyse von Stärke positiv
12. Citratverwertung positiv
13. Koagulation von Milch negativ
14. Reduktion von Lackmusmilch positiv
15. Verwertung von Harnstoff negativ
16. Kovac's Oxydasetest negativ
17. Wachstum bei NaCl Konzentration
von 5 °/0 positiv
Wachstum bei NaCl Konzettration von 7 % negativ
(D) Kohlenhydrat-Reaktionen
a5 Diese Reaktionen sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Kohlehydrate | Säure | Gas |
Glucose | negativ negativ positiv negativ positiv negativ negativ negativ negativ negativ |
negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ negativ |
Lactose | ||
Maltose | ||
Saccharose | ||
3^ Galactose | ||
Mannit | ||
Mannose | ||
Glycerin | ||
Melibiose | ||
4o Stärke |
Im Hinblick auf die obenerwähnten Merkmale wurde der Stamm in den Genus Kurthia eingeteilt,
und zwar gemäß der Klassifikation von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage.
Die morphologischen Merkmale des Stammes waren nämlich identisch mit denjenigen des Genus Kurthia,
die durch die Bildung von besonderen langen Stäben und das Wachsen zu Fäden, die sich später ohne Verzweigung
in kokkoide Formen teilen können, charakterisiert ist. Die physiologischen Merkmale des
Stammes passen ebenfalls zu denen des Genus Kurthia, welches Kohlehydrate wenig oder nicht angreift. Im
Hinblick auf die Kettenbildung wurde die Bezeichnung
Ausgehend von der biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen
in hierfür üblichen Nährmedien ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus
Kurthia catenaforma ATCC 21144 einsetzt und das Nährmedium L-Asparaginsäure in eine Menge von 0,5
bis 5 Gewichts/Volumprozent enthält.
Nach Durchführung der Fermentation unter geeigneten Bedingungen wird eine FermentationsflUssig-
keit erhalten, welche L-Prolin in hoher Konzentration bis zu 35 mg/ml enthält, öa die Bildung anderer
Aminosäuren als L-Prolin als Nebenprodukt bemerkenswert gering ist, wird im Verfahren der Erfindung
L-Prolin fast als einziges Produkt gebildet, so daß das
angesammelte t-Prolin leicht aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert werden kann.
Als zweckmäßige Nährstoffe des Mediums zur Erzeugung
von L-Prolin können vorzugsweise Zucker, wie Glucose, als hauptsächliche Kohlenstoffquelle verwendet
werden (insbesondere bei einer Konzentration von etwa 3 bis 10°/0) und als Stickstoff quelle derartige
Stoffe wie Maisquellwasser, Reisquellwasser, Casaminosäure, Harnstoff oder Malzextrakt (insbesondere
bei einer Konzentration von etwa 0,5 bis 4°/0). Es
können jedoch auch anorganische Quellen für Stickstoff
verwendet werden, wie Ammoniak oder Ammoniumsalze. Stets erfolgt ein Zusatz von A'paraginsäure
in einet Konzentration von 0,5 bis 5 Gewichts-/Volumprozent. Als Mineralstoffe können auch Kaliumsalze,
Magnesiumsalze und andere anorganische Salze, je nach den jeweiligen Bedingungen, dem Medium zugesetzt
werden. Das Verfahren der Erfindung wird gewöhnlich als aerobe Schüttelkultur in einem wäßrigen
Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis 370C durchgeführt.
Nach der Fermentation kann das angesammelte L-Prolin aus der Fermentationsflüssigkeit durch geeignete
Maßnahmen gewonnen werden. So wird z. B. die Fermentationsflüssigkeit filtriert oder zentrifugiert,
um die Zellen zu entfernt,), und L-Prolin wird aus dom Filtrat durch Konzentrieren, vorzugsweise unter anschließender
üblicher Ic.ienaustauscherharzbehandlung,
isoliert. Kationenaustauscherharze sind für diesen Zweck geeignet. In diesem Fall wird L-Prolin am Harz
aus dem Filtrat adsorbiert, mit einer wäßrig alkalischen Lösung, wie wäßrigem Ammoniak, eluiert und aus dem
Eluat auf übliche Weise kristallisiert.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Es wurde ein Fermentationsmedium hergestellt, das folgende Bestandteile enthielt:
Gewichts
prozent
Glucose 6
Maisquellwasser 0,7
Casaminosäure 1,1
xo L-Asparaginsäure 2
Harnstoff 0,5
NH4Cl 0,3
K1HPO4 2,0
MgSO4 · 7 H2O 0,1
Wasser Rest
Das obige Medium wurde auf pH 7,0 eingestellt. ml des Mediums wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben
eingebracht und sterilisiert. Ein Löffel voll ao Inoculum von Kurthia catenaforma ATCC 21144
wurde in das Medium inokuliert, und das Medium 72Stundea bei 28°C unter Hin- und Herschütteln
(140 Upm) inkubiert. Auf diese Weise wurden 18,4mg/ ml an L-Prolin in der Fermentationsflüssigkeit anas
gesammelt.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Prolin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in hierfür üblichen Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Kurthia catenaforma ATCC 21144 einsetzt und das Nährmedium L-Asparaginsäure in einer Menge von 0,5 bis 5 Gewichts-/Volumprozent enthält.
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