DE3116856A1 - "verfahren zur gewinnung von l-aminosaeure-oxidase" - Google Patents

"verfahren zur gewinnung von l-aminosaeure-oxidase"

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Description

" Verfahren zur Gewinnung von L-Aminosäure-Oxidase "
Beanspruchte Priorität:
30. April 1980, Japan, Nr. 057180/80
L-Aminosäure-Oxidase ist eine L—Aminosäure:Sauerstoff-Oxidoreductase (desaminierend) mit der Systemnummer EC 1.4.3.2., die folgende Gleichung katalysiert:
COOH COOH
I I
H2N-C-H + H2O + O2 -»- CO + NH3 + H2O2
R
L-Aminosäure
2-Oxosäure
Bisher war es bekannt, daß man dieses Enzym in Schlangengift, in den Nieren von Ratten und Mäusen, der Leber von Vögeln, wirbellosen Tieren und neurospora crassa findet (vgl. "Arch. Biochem. Biophys.", Bd. 146, S. 54 bis 63 (1971);
130062/0783
POSTSCHECKKONTO: MÖNCHEN 501 75 - 809 · BANKKONTO: DEUTSCHE BANK A.G. MÖNCHEN. LEOPOLDSTRASSE 71. KONTO-NR. 60.35 73i
"J. Bacteriol.", Bd. 121, S. 656 bis 663 (1975); "Protein, Nucleic Acid, Enzyme", Bd. 17, S. 42 bis 55 (1972)).
Es wurde nun festgestellt, daß man L-Aminosäure-Oxidase im Mycel eines Schimmelpilzes M5073, der aus den Samen von Calophyllum inophyllum in Hahajima, Bonin Inseln, Tokio, Japan, isoliert wurde, produzieren und isolieren kann.
Die Fig. 1 bis 4 zeigen das pH-Optimum, die pH-Stabilität, die Hitzestabilität bzw. die optimale Temperatur der erfindungsgemäß gewonnenen L-Aminosäure-Oxidase.
Die Eigenschaften einer Kultur des Schimmelpilzes M5073 sind nach Beobachtung mit bloßem Auge und Mikroskop in verschiedenen Kulturmedien wie folgt:
A. Wachstum in verschiedenen Kulturmedien
1. Malzextrakt-Agar
Sehr schnelles Wachstum, das nach der Inkubation bei 26°C die Gesamtfläche einer Petrischale (85 mm innerer Durchmesser) in 5 Tagen bedeckt. In der Anfangsphase der Inkubation sind die Lufthyphen flaumig weiß, mit wachsendem Mikroorganismus werden sie kittähnlich (etwa grau 1 de). Klare Exudate auf den Kolonien. Die Grundfarbe der Rückseite ist aprikosenfarben (hue 4 ga) und teilweise braun überdeckt (hue 2 nl).
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2. Kartoffel-Glukose-Agar
Sehr schnelles Wachstum, die Gesamtfläche einer Petrischale (85 mm innerer Durchmesser) in 5 Tagen bei der Inkubation bei 260C bedeckend. Flaumig weiße Lufthyphen in der Anfangsphase der Inkubation, die gräulich (etwa grau 1 fe) oder olivgrau (etwa grau 1 ih) werden. Klare Exudate scheiden sich schwach auf den Kolonien aus. Die Farbe der Rückseite ist perlrosa (hue 3 ca), teilweise neblig blau (hue 14 ig).
3. Czapeck-Agar
Schnelles Wachstum, bei einer Inkubation bei 260C erreicht es 75 bis 80 mm im Durchmesser in 7 Tagen. Flaumige Lufthyphen, die Hyphe steigt relativ dick auf. In der Anfangsphase der Inkubation ist sie weiß, wird jedoch allmählich olivgrau (etwa grau 1 ih), sich mit wachsendem Organismus von der Mitte aus gegen die Ränder verändernd. Die Rückseite ist fleischfarben rosa (hue 4 ca), teilweise schokoladenfarben (hue 4 nl).
Die angegebenen Farbbeschreibungen stimmen mit der Farbbeschreibungsmethode gemäß "Color Harmony Manual", Container Corporation of America 1958, überein.
B. Physiologische Eigenschaften
1. Optimale Wachstumsbedingungen:
pH-Optimum: 4,8
Temperaturoptimum: 24 bis 30°C.
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2. Tolerierbare Wachstumsbedingungen: pH-Wert, bei dem der Mikroorganismus wachsen kann: 2,5 bis 11;
Temperatur, bei der der Mikroorganismus wachsen kann: 8 bis 42°C.
C. Morphologische Eigenschaften
Braune acervuli, platten- oder polsterförmig, auf dem Medium verstreut. Einige braune Stiele an den Rändern der acervuli oder zwischen den Konidiosporen. The Konidiosporen bilden sich gerade aus einfachen und gut gewachsenen Stromata. Farblose Oberfläche mit glatten Wänden, mit 1 bis 2 Segmenten, 10 - 60 χ 3 - 4 μ.
Die Stiele sind dunkelbraun oder dunkeloliv, 50 bis 150 μ lang und 5 bis 7 μ breit an der Basis, mit einer glatten Wandoberfläche und ein oder mehreren Segmenten. Die Konidien sind einzellig, 10 bis 20 χ 3 - 5 μ, oval und an der Basis etwas zugespitzt. Die Wandoberfläche ist glatt,· die Konidien bilden sich als Klumpen am Ende der Konidiosporen. Der Schleim ist orange, jede einzelne Konidie ist farblos oder schwachgelblich grün-Entsprechend den Befunden, daß der Schimmelpilz M5073 dunkelbraune Kolonien bildet, die acervuli mit Stielen gut entwickelt sind und sich die Konidien in Form von Klumpen am Ende der einfachen und gut entwickelten Konidiosporen bilden,
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gehört er zur Gattung Colletotrichum. Ein Artname konnte bis jetzt noch nicht festgestellt werden, da ein Mikroorganismus, der zur Gattung Colletotrichum gehört, auf Pflanzen parasitär ist und eine Identifizierung der Art anhand von Kulturen schwierig ist (J.A. von Arx, "The Genera of Fungi Sporulating Pure Culture", S. 315, 1974; J. Cramer, G.L. Barron, "The Genera of Hyphomycetes from soil", S. 364, The Williams & Wilkins Co., 1968; L.H. Tiffany und J.C. Gilman, "Species of Colletotrichum from Legumes, Mycologia", Bd. 46, S. 52 bis 75, 1954).
Anhand dieser Ergebnisse wird der Schimmelpilz M5073 Colletotrichum sp. M5073 benannt und am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Nummer FERM-P 5441 hinterlegt.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von L-Aminosäure-Oxidase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm der Gattung Colletotrichum, insbesondere Colletotrichum sp. M5073 (FERM-P 5441), in einem Medium kultiviert und daraus die L-Aminosäure-Oxidase isoliert.
Da Mikroorganismen, einschließlich des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stamms, durch natürlichen oder künstlichen Einfluß verändert werden können, ist im erfindungsgemäßen Verfahren jede Variante geeignet, vorausgesetzt, sie behält die Fähigkeit zur L-Aminosäure-Oxidase-Bildung.
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Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Mikroorganismus in herkömmlicher Weise entweder in Flüssigkultur oder in fester Form kultiviert. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus ist es jedoch günstiger, den Mikroorganismus in einem Kulturmedium in großtechnischem Maßstab unter Belüftung und Bewegung zu kultivieren.
Als Nährstoffquellen kommen alle für die herkömmliche Kultur von Mikroorganismen verwendeten Substanzen in Frage. Als Kohlenstoffquelle ist jede Substanz, die assimilierbaren Kohlenstoff liefert, geeignet, z.B. Reis, Reiskleie, Stärke, Glukose, Maltose, Glycerin, Melassen oder lösliche Stärke. Als Stickstoffquelle ist jede Verbindung geeignet, die Stickstoff zur Verfügung stellt, z.B. Pepton, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Aminosäuren, Nitrate, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid. Gegebenenfalls kann man dem Kulturmedium Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogenphosphat oder Kaliumdxhydrogenphosphat, zusetzen.
Die Bebrütungstemperatur liegt im erfindungsgemäßen Verfahren günstigerweise zwischen 20 bis 350C. Die Bebrütungsdauer hängt von verschiedenen Bedingungen ab, im allgemeinen beträgt sie 2 bis 4 Tage. Die Bebrütung wird nach einer in bezug auf die Aktivität geeigneten Zeit abgebrochen, z.B. dann, wenn die Aktivität der L-Aminosäure-Oxidase ihr Maximum erreicht hat. In der so erhaltenen Kulturbrühe befindet sich die L-Aminosäure-Oxidase angereichert im Mycel.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man die L-Aminosäure-Oxidase zum Beispiel wie folgt gewinnen:
Zuerst wird die Kulturbrühe in einen festen und einen flüssigen Teil aufgetrennt, die erhaltenen feuchten Zellen werden gegebenenfalls in einem Tris-HCl-Puffer oder einem Phosphat-Puffer suspendiert. Die L-Aminosäure-Oxidase wird aus den Zellen in herkömmlichen , gegebenenfalls kombinierten Verfahren extrahiert, z.B. durch Lysozym, Ultraschall oder Hochdruckpresse. Auf diese Weise erhält man einen Rohextrakt, der die L-Aminosäure-Oxidase enthält.
Diese rohe L-Aminosäure-Oxidase-Lösung kann man in herkömmlichen Verfahren zur Gewinnung und/oder Reinigung von Proteinen oder Enzymen reinigen. So kann man zum Beispiel die Roh-L-Aminosäure-Oxidase auch aus der Flüssigkeit durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat gewinnen. Man kann aber auch organische Lösungsmittel, wie Aceton, Äthanol oder Isopropanol, zusetzen, um die L-Aminosäure-Oxidase auszufällen.
Man kann das Rohprodukt aber auch dadurch reinigen, daß man die Eigenschaften der L-Aminosäure-Oxidase ausnützt und zum Beispiel durch Elektrophorese ein homogenes Protein erhält. So kann man zum Beispiel die rohe L-Aminosäure-Oxidase in einem geeigneten Medium lösen, wie einem Tris-HCl-Puffer, an einem Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthylcellulose (im folgenden mit DEAE-Cellulose bezeichnet) oder vernetzten! Diäthylaminoäthyldextrangel oder einem Gelfiltrationsmittel,
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wie Dextran- oder Polyacrylamidgel, chromatographxeren und gegebenenfalls mit Dialyseinembranen, Hohlfasern oder Ultrafxltrationsmembranen behandeln. Schließlich erhält man ein reines L-Aminosäure-Oxidase-Pulver durch geeignetes Trocknen des Produkts, z.B. durch Gefriertrocknen.
Die Enzymaktivität sowie die physiko-chemischen Eigenschaften der im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen L-Aminosäure-Oxidase werden wie folgt bestimmt:
1. Enzymaktivität
0,9 ml des folgenden Reaktionsgemisches werden in ein kleines Proberöhrchen eingefüllt und auf 370C erwärmt.
0,2m L-Leucin 0,1 ml
0,2m Tris-HCl-Puffer (ph 7,5) 0,2 ml
0,3% 4-Aminoantipyrin 0,1 ml
0,2% Phenol 0,1 ml
Peroxidase (50 U/ml) 0,1 ml
Wasser 0,3 ml
0,1 ml einer L-Aminosäure-Oxidase enthaltenden Flüssigkeit werden zum Reaktionsgemisch zugegeben und genau 10 Minuten bei 370C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 2,0 ml Äthanol unterbrochen. Die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid wird kolorimetrisch bei 480 nm bestimmt. Die Enzymaktivität errechnet sich aus der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids anhand folgender Gleichung:
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U/mÄ = ΔΑ 480 πια χ 0,699 χ Verdünnung Die Menge an Enzym, die bei 370C in einer Minute ein PMdI Wasserstoffperoxid bildet, wird als eine Einheit (1 U) definiert.
2. Wirkung
In Gegenwart von Sauerstoff katalysiert das Enzym die oxidative Desaminierung von oC-Aminogruppen von L-Aminosäuren zu ct-Oxosäure, Ammoniak und Wasserstoffperoxid. COOH COOH
H2N-C-H + H-O + 0-, -*- CO + NH^ + H2O2
I I
R R
L-Aminosäure 2-Oxo säure
3. pH-Optimum
Die enzymatische Aktivität der L-Aminosäure-Oxidase wird bei verschiedenen pH-Werten mit Dimethylglutarat-Natriumhydroxid-Puffer, pH 4 bis 7,5, Phosphat-Puffer, pH 6,5 bis 8,0, Tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,5 bis 9,0, und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, pH 8,8 bis 9,6, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, das pH-Optimum liegt bei 7,0 bis 8,5.
4. pH-Stabilität
Das Enzym wird mit Dimethylglutarat-Natriumhydroxid-Puffer, pH 4,5 bis 7,5, Phosphat-Puffer, pH 6,5 bis 8, Tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,5 bis 9,0, und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, pH 9 bis 10, bei 37°C 24 Stunden inkubiert, dann
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/M
wird die Enzymaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 angegeben, die L-Aminosäure-Oxidase ist bei einem pH-Wert von 8 oder darüber stabil.
5. Hitzestabilität
Die L-Aminosäure-Oxidase wird in einem Tris-Salzsäure-Puffer, pH 7,5, 10 Minuten bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Das Enzym ist bei einer Temperatur von 600C oder darunter stabil.
6. Optimale Reaktionstemperatur
Die optimale Reaktionstemperatur wird mit der gleichen Reaktionslösung wie für die Bestimmung der Enzymaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 angegeben, die optimale Reaktionstemperatur der L-Aminosäure-Oxidase liegt bei 40 bis 500C.
7. Substratspezifität
Die Enzymaktivität mit verschiedenen Substraten zeigt Tabelle I, wobei die Aktivität mit 5 mMol Substrat und 0,007 ü Enzym wie unter 1. angegeben bestimmt wird.
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Tabelle
relative Substrat relative
Substrat Aktivität L-Histidin Aktivität
L-Leucin 100,0 L-Cystein 11,8
L-Methionin 93 ,6 D-Pheny1alanin 6,4
L-Phenylalanin 70,0 L-Glycin 0,0
L-Arginin 39 ,9 L-Cystein 0,0
L-Lysin 29/6 L-Serin 0r0
L-Isoleucin 29 ,1 L- Asparaginsäure 0,0
DL-Tryptophan 27,1 L- Glutaminsäure 0,0
L-Tyrosin 22,2 D-Alanin 0 ,0
DL-Isoleucin 15 ,3 0 ,0
L-Alanin 12 ,3
Tabelle I zeigt, daß das im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Enzym nicht nur mit L-Leucin, sondern auch mit verschiedenen anderen L-Aminosäuren reagiert.
8. Hemmung und Aktivierung
Die Enzymaktivität wird wie unter 1. angegeben mit 0,01 U Enzym bestimmt. Die in Tabelle II zusammengestellten verschiedenen Metallionen oder andere Zusätze werden in einer Menge von 1 mMol der Reaktionslösung zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben, wobei das Cyanion die stärkste Hemmwirkung auf das Enzym hat. Eine aktivierende Wirkung auf das Enzym konnte mit keinem Ion festgestellt werden.
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-V-
Tabelle II
*Äthylen-diamin-tetraacetat
9. Isoelektrischer Punkt:
er liegt bei pH 3,9.
Zusatz relative
Aktivität		 Zusatz relative
Aktivität
- 100 LiC£ 97,5
NaN3 100 NHi, C£ 97,1
MnC£2 97,1 MgC £ 2 99,2
NaF 97,9 BaC£2 97,1
EDTA* 100 CaCU2 95,4
KCN 14,1 ZnCi 2 94,2
CoC£2 50,6
10. Km-Wert:
-4
der Km-Wert beträgt 1,7 χ 10 Mol (mit L-Leucin).
11. Molekulargewicht:
es beträgt etwa 200 000, bestimmt durch Gelfiltration mit vernetzten! Polyacryl (Sephacryl S-200) .
Aus diesen physiologischen Daten ergibt sich, daß das im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Enzym eine L-Aminosäure-Oxidase mit der Systemnummer EC 1.4.3.2. ist.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene L-Aminosäure-Oxidase ist für die quantitative Bestimmung von Aminosäuren geeignet, wie für klinische Analysen, in denen die Menge
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an Aminosäure aus einem synthetischen Substrat für die Bestimmung von Peptidasen, wie Leucin-Amino-Peptidase, bestimmt wird, oder für die Herstellung von cC-Oxosäuren für Patienten, die an Urämie leiden.
Das Beispiel erläutert die Erfindung.
Ausführungsbeispiel
100 ml Kulturmedium, pH 6,7, das 1,0 % Maltose, 1,0 % Hefeextrakt, 0,5 % Natriumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat (MgSO4-7H2O), 0,05 % Kaliumhydrogenphosphat r 1,0 % Reiskleie und 0,5 % Antischaummittel enthält, werden in zwei 500 ml fassenden Kolben bei 1200C 20 Minuten sterilisiert, dann mit Colletotrichum sp. M5073 (FERM-P 5441) beimpft und 3 Tage unter Schütteln bei 300C bebrütet.
Mit diesen beiden Impfkulturen werden in einem 30 Liter fassenden Fermentator 20 Liter eines Kulturmediums der angegebenen Zusammensetzung beimpft und bei einer Temperatur von 3O0C, unter Rühren bei 300 UpM und einer Belüftung mit 20 Litern Luft/Minute 3 Tage bebrütet. Die Kulturbrühe wird dann bei 3000 UpM 10 Minuten zentrifugiert, die isolierten Naßzellen werden in 2 Liter eines 0,01m Tris-HCl-Puffers, pH 7,5, suspendiert. Die Zellen werden in einem Destruktor (DYNOMIL) zertrümmert und 10 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Man erhält 1,55 Liter eines Überstands mit einer Enzymaktivität von 2700 U, der mit Ammoniumsulfatlösung (Sättigungsgrad: 0,61) fraktioniert ausgefällt und bei
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15 000 UpM 10 Minuten zentrifugiert wird.
Der dabei erhaltene Überstand wird erneut mit Ammoniumsulfatlösung (Sättigungsgrad: 0,88) fraktioniert ausgefällt und bei 15 000 UpM 10 Minuten zentrifugiert. Die Niederschläge werden in 400 ml 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gelöst und 10 Minuten auf 600C erwärmt. Die dabei entstandenen Niederschläge werden durch Zentrifugieren bei 15 000 UpM während 10 Minuten entfernt, man erhält 385 ml eines Überstands, der mit 456 ml kaltem Aceton versetzt wird. Die Niederschläge werden abgetrennt und in 150 ml eines 0,2m Tris-HCl-Puffers, pH 7,5, gelöst. Die ungelösten Feststoffe werden abzentrifugiert, man erhält 112 ml eines Überstands, der über Nacht gegen 5 Liter einer 0,01m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5, in einen Celluloseacetat-Schlauch dialysiert wird. Die entstandene Lösung wird auf eine DEAE-Cellulose-Säule (4,0 χ 30 cm) mit 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, aufgegeben und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5m Kaliumchlorid eluiert. Die bei 0,4m Kaliumchlorid eluierten aktiven Fraktionen werden gesammelt, durch Ultrafiltration eingeengt (Ultrafiltration-Membran XM-50, hergestellt von Amicon), auf eine mit vernetztem Polyacryl (Sephacryl S-200) gefüllte Säule (3,6 χ 80 cm) aufgegeben und mit 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, eluiert. Das Eluat zwischen 580 ml und 640 ml wird gesammelt und gefriergetrocknet. Man erhält 152 mg (entsprechend 621 U) L-Aminosäure-Oxidase in Pulverform.
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Claims (1)

  1. ELISABETH JUNG dr.phil..dipl-ohem. : " : : "" JÜRGEN SCHIRDEWAHN dr.~rer. nat., dipu-phys. GERHARD S C H M I TT-N I LS O N dr.-ing. GERHARD B. HAGEN dr.phil PETER HIRSCH dipl-inq.
    PATENTANWÄLTE
    EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
    8000 MÜNCHEN 40, 'P.O.BOX 4014 68 CLEMENSSTRASSE 30 TELEFON: (089) 34 50 TELEGRAMM/CABLE': INVENT MÜNCHEN TELEX: 5-29 686
    u.Z.: Q 668 C (J/MK/we) Toyo Jozo Company, Ltd.
    28. April 1981
    Patentanspruch
    Verfahren zur Gewinnung von L-Aminosäure-Oxidase, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Stamm der Gattung Colletotrichum, insbesondere Colletotrichum sp. M5073 (FERM-P 5441), in einem Medium kultiviert und daraus die L-Aminosäure-Oxidase isoliert.
    T30062/0783
    POSTSCHECKKONTO: MÖNCHEN 501 75-809 · BANKKONTO: DEUTSCHE BANKA.G. MÖNCHEN, LEOPCLDSTRASSE71, KONTO-NR. 60/35 734
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