DE3402504C2

DE3402504C2 - Verfahren zur Gewinnung von Bilirubinoxidase

Info

Publication number: DE3402504C2
Application number: DE3402504A
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Kazuo Kyoto Nakajima; Takako Ibaraki Sato
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Priority date: 1983-01-25
Filing date: 1984-01-25
Publication date: 1986-09-18
Also published as: CA1207261A; FR2539757A1; GB2134116A; US4569912A; GB2134116B; DE3402504A1; JPS59135886A; GB8400674D0; FR2539757B1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Bilirubinoxidase, in dem man einen Bilirubinoxidase erzeugenden Mikroorganismus der Genus Schizophyllum züchtet und Bilirubinoxidase aus der Kulturbrühe gewinnt, wobei insbesondere Schizophyllum Commune K-17 (FERM BP-306) eingesetzt wird.

Description

allgemeinen ist die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 35° C, das pH des Züchtungsmediums ist vorzugsweise 4 bis 7 und die Erzeugung von Bilirubinoxidase erreicht das Maximum durch eine Züchtung unter Belüftung/Rühren für 3 bis 10 Tage. In diesem Falle ist es selbstverständlich, daß die Züchtungsbedingungen so festgelegt werden, daß man eine maximale Ausbeute an Bilirubinoxidase erhält je nach der Zusammensetzung des Züchtungsmediums.

Die erfindungsgemäß erzeugte Bilirubinoxidase liegt im Kulturfiltrat vor, und sie kann als Niederschlag abgeschieden werden, indem man 50 bis 80 VoL/VoL% eines organischen Lösungsmittels (z. B. Alkohol, Aceton) oder 20 bis 80 Gew/VOl.% eines Fällungsmittels (z. B. Ammonsulfat, Kalziumchlorid) zum KulturFiitrat zusetzt Der erhaltene Niederschlag wird durch Dialyse oder Sephade;„-Behandlung entsalzt, um eine rohe Enzymlösung zu erzielen. Zur Reinigung der rohen Enzymlösung kann die Gelfiltration der Lösung an einer Säule von Sephadex G-75 durchgeführt werden, die vorher mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert wurde, um eine aktive Fraktion zu sammlen. Danach wird die aktive Fraktion an einer Säule von DEAE-Sephadex A-50 gebunden, die vorher mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert wurde, und das adsorbierte Material wird dann mit 03 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Diese aktive Fraktion wird dann gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert, und das innere Lösungsmitte! der Dialyse wird mit einer Kolloidmembran konzentriert und lyophilisiert, um ein gereinigtes Enzympulver zu erhalten.

Die charakteristischen Eigenschaften der nach der vorliegenden Erfindung erhaltenen Bilirubinoxidase sind wie folgt:

Wirkung:

Wenn das Enzym auf Bilirubin einwirkt, wird BiIiverdin gebildet und es oxidiert auch Biliverdin zu einer unbekannten blaßvioletten Substanz.
Das heißt, es katalysiert die folgende Zwei-Stufen-Reaktion:

Bilirubin +	1/2 O₂-	-Biliverdin + H₂O	O)
Biliverdin ·	+■ 1/2O₂	—»•blaßviolette
		Substanz ■-, H₂O	(2)

Optimales pH und pH-Stabilität:
Ein optimales pH für das Enzym Hegt in der Nähe von 5,5 bis 6,0, was true extrem hohe Aktivität anzeigt, wie auch die Kurve in F i g. 1 angibt. Die pH-Stabilität des Enzyms nach Behandlung bei 4° C und bei wechselnden pH-Werten für 7 Tage ist in F i g. 3 gezeigt. Wie aus F i g. 3 ersichtlich, ist das Enzym bei einem pH von 8 stabil.

Optimale Temperatur und Thermostabilität:
Die optimale Temperatur für das Enzym ist bei etwa 50°C, wie die Kurve in F i g. 2 zeigt. Die Thermostabilität des Enzyms nach Behandlung bei einem pH von 6,0 und bei wechselnden Temperaturen für 10 Minuten ist in Fi g. 4 gezeigt Das Enzym war bis zu 45⁰C stabil.

(5) Isoelektrischer Punkt:

Der isoelektrische Punkt des durch isoelektrische Fokussierung erhaltenen Enzyms betrug 6,0 bis 6,1.

(6) Inhibitoren:

Das Enzym wurde von 1 mM von jeweils Fe²*, NaN3, KCN, Natriumascorbat, Cu²⁺, o-Phenanthrolin, a, o'-Dipyridyl, reduziertem Glutathion und dgl. inhibiert

(7) Bestimmung der enzymatischen Aktivität:

Die enzymatische Aktivität wurde erhalten durch Messen der Abnahme in der Absorption von Bilirubin bei 460 nm. Das heißt, die Reaktion wurde bei 37°C 10 Minuten lang unter Verwendung von 3,0 ml eines Reaktionsgemisches durchgeführt, das 8 mg OMEGA-chemisches Kontrollserum erhöhter Bilirubin (erzeugt von Hyland Co., USA), 300 μίΛοΙ Phosphatpuffer (pH 6.01 und 0,1 ml geeignete verdünnte Enzymlösung e^-;iiielt, und die Abnahme der Absorption bei 460 nm uurch Bilirubin wurde gemessen. Eine Einheit an Bilirubinoxidaseaktivität wurde als Menge des Enzyms de^niert, welche die Absorption bei 460 nm um 1,00 pro Minuu bei 37° C vermindert.

Die konkrete Methode zur Herstellung von Bilirubinoxidase wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele gezeigt, die die Erfindung erläutern.

ß e i s ρ i e 1 1

Ein Schräg-Kulturmedium, das 2% Glukose, 0,5% Ebios und 14% Agar (Ebiosmedium) enthielt, wurde mit Schizophyllum commune K-17 (FERM BP-306) beimpft.

und die Züchtung wurde durchgeführt, indem das Medium ruhig eine Woche bei 25⁰C gehalten wurde, um einen Saatfungus zu erhalten.

Getrennt davon wurden 100 ml eines Kulturmediums, das aus 3% Glycerin, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,30/1 KH₂PO₄ und 0,l%MgSO₄ · 7H₂O bestand, in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben, und nach der Sterilisierung bei 120⁰C für 20 Minuten wurde es abgekühlt und mit dem obigen Saatfungus beimp't. Danach wurde eine Schüttelkultur bei 27° C für 7 Tage bei 120 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung wurde das Mycel durch Filtration entfernt, um ein Kulturfiltrat zu erhalten. Die Bilirubinoxidaseaktivität dieses Kulturfiltrats betrug 1,5 Einheiten pro ml.

Beispiel 2

(4) Molekulargewicht:

Das Molekulargewicht des durch Gelfiltration mit Sephadex G-100 eifcaltenen Enzyms betrug etwa 58 000.

lOümr eines Züchtungsmediums aus 3% Glycerin, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0.3% KH₂PH₄ und Cl % MgSO₄ ■ 7H₂O wurden in einen 500 ml-Eilenmeyer-Kolben gegeben, bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert und mit Schizophyllum commune K-17 beimpft, der im Ebios-Kulturmedii .n von Beispiel 1 gezüchtet war. Danach wurde die Züchtung bei 27° C 5 Tage lang durchgeführt, um eine Saatkulturflüssigkeit zu erhalten. Getrennt davon wurden 15 1 eines -'Kulturmediums aus 3% Glycerin, 03% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 1% Maisquellwasser, 1% entfettete Sojabohnen, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7H₂O und 0,03% eines Entschäumungs-

.C5 mittels in einen 30 1-Fermentationstopf gegeben und bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Nach Abkühlen wurde das Züchtungsmedium mit 100 ml der obigen Saatkulturflüssigkeit beimpft, und die Züchtung wurde bei

27°C 6 Tage lang unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß die Belüftungsrate 10 l/min und die Rührgeschwindigkeit 200 Upm betrug. Nach Beendigung der Züchtung wurde das Mycel durch Filtration entfernt, um ein Kulturfiltrat zu erhalten. Die Bilirubinoxidaseaktivitat dieses Kulturfiitrats betrug 6,5 Einheiten pro ml. Ammonsulfat wurde zu 13 1 dieses Kulturfiitrats zugegeben, und zwar zuerst, bis 5O°/oige Sättigung erreicht war, um Verunreinigungen als Niederschlag zu entfernen. Weiterhin wurde Ammonsulfat zur überstehenden Flüssigkeit zugegeben, bis die Sättigung 70% war, und nach Stehenlassen für einen vollen Tag und eine Nacht wurde der erhaltene Ammonsulfatniederschlag einen ganzen Tag und eine Nacht gegen eine große Menge an destilliertem Wasser dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse is wurde lyophilisiert, und das trockene erhaltene Pulver wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Gelfiltration der erhaltenen Lösung an einer Säule (5,0 X 70 CfTi) von ScphnucX G-75 düfC'hgcfQufi, die inii dem gleichen Puffer gepuffert war, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Die aktive Fraktion wurde in einer Säule (5.0 χ 20 cm) von DEAE-Sephadex A-50 adsorbiert, die vorher mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert war. und das adsorbierte Material wurde mit OJ M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Diese aktive Fraktion wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. und die innere Lösung die Dialyse wurde mit einer Kolloidmembran konzentriert und lyophilisiert, um 320 mg des gereinigten Enzympulvers zu erhalten. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers war 23 Einheiten/mg.

Bei der Reaktion dieses gereinigten Enzyms mit OMEGA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin wurde eine Beziehung zwischen der Reaktionszeit (es wurden 0,2 μg gereinigtes Enzym angewandt) und der Enzymkonzentration (Reaktionszeit 10 Minuten) studiert, wie sie die Abnshms in der Absorbtion bei 460 nm des Bilirubins (/IA 460 nm) beeinflußt.

40 Reaktions- /fA460nm Enzymkonzen- ziA460nm
zeit (min) tration^g)

10 0.048 0.2 0,047

20 0.093 0.4 0,0912

30 0.135 0,6 0,135

40 0.168 0,8 0,170

Wie oben gezeigt hat das gereinigte Enzym die Eigenschaft bei Umsetzung mit Bilirubin dieses abzubauen. Aus dem Ergebnis des Absorptionsspektrums (Fig.5) bei Umsetzung des gereinigten Enzyms mit OMEGA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin sowie als Ergebnis der Dünnschichtchromatographie (Fig.6) mit einem Mischlösungsmittel Chloroform/Methanol (1:1) wurde die Bildung eines oxidierten Produktes von Bilirubin, nämlich Biliverdin, beobachtet. Demgemäß wurde gefunden, daß das vorliegende Enzym Bilirubinoxidase ist die Bilirubin zu Biliverdin oxidiert. Das Enzym hat auch die Eigenschaft Biliverdin zu einer unbekannten blaßvioletten Substanz zu oxidieren (Absorptionsspektrum in F i g. 7 gezeigt).

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

Verfahren zur Gewinnung von Bilirubinoxidase durch Züchten eines Mikroorganismus und Sammeln der Bilirubinoxidase aus der Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Schizophyllum commune FERM BP-306 züchtet

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Verfahren zur Gewinnung von Bilirubinoxidase

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Bilirubinoxidase durch Züchten eines Mikroorganismus und Sammeln der Bilirubinoxidase aus der Kulturbr ihe, wobei man als Mikroorganismus SchizophyHuni commune FERM BP-306 züchtet.

Bilirubin ist eine gelbe Substanz, die im Blut durch Abbau von Hämoglobin erzeugt wird. Der schnelle und genaue Nachweis von Bilirubin im Serum ist sehr wichtig für die medizinische Diagnose des Zustandes von Erkrankungen des Menschen, beispielsweise bei Gelbsucht. Bei Gelbsucht-Patienten nimmt Bilirubin im Serum abnormal zu, so daß der Grad der Gelbsucht durch die Messung des Bilirubin im Serum diagnostiziert werden kann.

Ober Bilirubino-'dase wurde zuerst von R. Brodersen und P. Bortels berichtet und Bilirubin wurde zu Biliverdin durch unlösliche Bilirubinoxidase oxidiert, die ihrerseits aus dem Gehirn von Meerschweinchen isoliert war (European Journal of Biochemistry, vol. 10,468 (1969)). In den letzten Iahren wurde jedoch mitgeteilt, daß Myrothecium verrucaria MT-I, ein Stamm, der zur Genus Myrothecium gehört, Bilirubinoxidase erzeugt, und daß das aus dem Kulturfiltrat erhaltene gereinigte Enzym Bilirubin zu Biliverdin oxidierte (Agricultural and Biological Chemistry. Vol. 45,2385 (1981)).

Bei der Analyse von anderen Proben als Bilirubin im Serum ist Bilirubinoxidase ebenfalls wertvoll zur Entfernung von Bilirubin, das einen Irrtum in der Messung hervorrufen könnte. Zur Messung von Glukose oder Cholesterin im Serum wird eine colorimetrische Methode benutzt, bei welcher Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase mit Serum umgesetzt und das gebildete Wasserstoffperoxid durch Peroxidase aufgefangen wird, und diese Meßmethode wird sehr häufig als Routinemethode angewandt. Insbesondere eine weiterentwickelte Methode mit 4-Aminoantipyrin und Phenol hat eine führende Rolle unter den enzymatischen Methoden wegen ihrer Einfachheit und Raschheit sowie der Stabilität der Reagentien erreicht. Diese colorimetrische Methode umfaßt die Messung der gebildeten roten Chinonfarbstoffe bis 500 nm, jedoch bewirkt das Vorliegen von Bilirubin im Serum einen negativen Fehler. Demgemäß kann die vorherige Umsetzung von Bilirubinoxidase mit dem Serum zur Entfernung von Bilirubin und dann die Umsetzung von Glukoseoxidase oderCholesterinoxida- <se mit dem Serum einen korrekten Glukosewert oder Cholesterinwert des Serum erzielen lassen.

Es wurde nun gefunden, daß Bilirubinoxidase durch einen Stamm aus der Klasse Basisdiomycetes, also anderen als den oben erwähnten Bilirubinoxidase produzierenden Mikroorganismen, erzeugt wird und festgestellt, daß der Stamm FERM BP-306 in einer Züchtungsbrühe

ein starker Produzent von Bilirubinoxidase ist

Der erfindungsgemäß verwendete Stamm ist ein solcher des Genus Schizophyllum der Klasse Basisdiomycetes, nämlich Schizophyllum commune K-17, der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-306 hinterlegt ist

Dieser Stamm wurde aus den Fruchtkörpern isoliert, die in Haufen oder Büscheln auf toten Bäumen in Iwakura, Kyoto City, Japan, wachsen.

Die Merkmale des Fruchtkörpers und der Sporen dieses Stammes sind wie folgt:

Kappe: 10 bis 30 mm Durchmesser, dicht mit groben Haaren auf der Oberfläche bedeckt, was ihr eine weiße, graue, fleischfarbene oder braune Färbung verleiht Laraellen: weiß, grau oder blaß-fleischfarben; der Länge nteh am Rand geschlitzt, wobei die geschlitzten Teile einander zu überlappen scheinen. Fleisch: Iedrig und zäh; schrumpft beim Trocknen, kehrt jedoch nach Befeuchtung zur ursprünlichen Form zurück. Sporew: glatt, in der Masse weiß; zylindrische Form von 4 bis 6 χ 1,5 bis 2 μηι. Beim Vergleich der obigen Merkmale mit der Beschreibung der folgenden Bücher: Sciya Ito: Mycologixal flora of Japan, Vol.
2, Nr. 5,1955 (veröffentlicht von Yoken-do, Tokyo, Japan) und Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo: Colored Illustrations of Fungi of Japan, VoIs. 1 und 2, ist ersichtlich, daß dieser Stamm Schizophyllum commune K-17 ist Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Nummer FERM BP-306 am 17. Mai 1982 deponiert Dieser Stamm hat von Natur aus die Fähigkeit, Bilirubinoxidase zu bilden.

Die Erfahrung wird nun, teilweise unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung, näher beschrieben.

F i g. 1 zeigt eine Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität von Bilirubinoxidase, die nach der vorliegenden Erfindung erhalten ist, und Fig.2 zeigt eine Beziehung zwischen der Temⁿer*itur und der Aktivität. F i g. 3 zeigt eine Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität nach Behandlung der Bilirubinoxidase bei 4° C und bei wechselnden ρHs für 7 Tage, end Fig.4 zeigt eine Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität nach der Behandlung von Bilirubinoxidase bei einem pH von 6,0 und bei wechselnden Temperaturen für 10 Minuten. F i g. 5 zeigt eine Veränderung im Absorptionsspektrum, wenn das vorliegende Enzym mit OME-GA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin umgesetzt war, und F i g. 6 zeigt das Dünnschichtchromatogramm des Reaktionsproduktes nach Umsetzen des vorliegenden Enzyms mit OMEGA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin. F i g. 7 zeigt die Veränderung im Absorptionsspektrum, wenn das vorliegende Enzym zu Biliverdin umgesetzt war.

Bj! der Züchtung des in der Erfindung zu verwendenden Mikroorganismus kann jede wohlbekannte Nährquelle dem Züchtungsmedium zugesetzt werden, wenn sie vom benutzten Stamm verwendet werden kann. Als Kohlenstoffquelle können z. B. Glyzerin, Glukose. Stärke, Saccharose, Maltose. Lactose, Dextrin, öle und Fette, Melassen und dgl. verwendet wurden. Als Stickstoffquelle eignen sich Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser, entfettete Sojabohnen, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt und dgl. Auch anorganische Substanzen, und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesium-' salze, Eisensalze, Zinksalze und dgl. können zugesetzt • werden und weiterhin Vitamine und wachstumsbegünstigende Substanzen.

. Bei der Züchtung des Stammes, der zur Klasse Basidiomycetes gehört, schwankt die Menge an gebildeter Bilirubinoxidase je nach den Züchtungsbedingungen. Im

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