DE3402504A1

DE3402504A1 - Verfahren zur herstellung von bilirubinoxidase

Info

Publication number: DE3402504A1
Application number: DE19843402504
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Kazuo Kyoto Nakajima; Takako Ibaraki Sato
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1983-01-25
Filing date: 1984-01-25
Publication date: 1984-07-26
Also published as: US4569912A; DE3402504C2; GB2134116B; CA1207261A; FR2539757B1; GB8400674D0; JPS59135886A; GB2134116A; FR2539757A1

Description

Verfahren zur Herstellung von Bilirubinoxidase

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bilirubinoxidase durch Züchtung eines Stammes, der zur Genus Schizophyllum der Klasse BaEidiomycetes gehört.

Bilirubin ist eine gelbe Substanz, die im Blut durch Abbau von Hämoglobin erzeugt wird. Der schnelle und genaue Nachweis von Bilirubin im Serum ist sehr wichtig für die medizinische Diagnose des Zustandes von Erkrankungen des Menschen, beispielsweise bei Gelbsucht. Bei Gelbsuch-Patienten nimmt Bilirubin im Serum abnormal zu, so daß der Grad der Gelbsucht durch die Messung des Bilirubins im Serum diagnostiziert werden kann.

über Bilirubinoxidase wurde zuerst von R. Brodersen und P. Bortel.s berichtet und Bilirubin wurde zu Biliverdin durch unlösliche Bilirubinoxidase oxidiert, die ihrerseits aus dem Gehirn von Meerschweinchen isoliert war (European Journal of Biochemistry, Vol. 10, 468 (1969)).

In den letzten Jahren wurde jedoch mitgeteilt, daß Myrothecium Verrucaria MT-1, ein Stamm, der zur Genus Myrothecium gehört, Bilirubinoxidase erzeugt, und daß das aus dem Kulturfiltrat erhaltene gereinigte Enzym Bilirubin zu Biliverdin oxidierte (Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 45, 2385 (1981)).

Bei der Analyse von anderen Proben als Bilirubin im Serum ist Bilirubinoxidase ebenfalls wertvoll zur Entfernung von Bilirubin, das einen Irrtum in der Messung hervorrufen könnte. Zur Messung von Glukose oder Cholesterin im Serum wird eine colorimetrische Methode benutzt, bei

welcher Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase mit Serum umgesetzt und das gebildete Wasserstoffperoxid durch Peroxidase aufgefangen wird, und diese Meßmethode wird sehr häufig als Routinemethode angewandt- Insbesondere eine weiterentwickelte Methode mit 4-Aminoantipyrin und Phenol hat eine führende Rolle unter den enzymatischen Methoden wegen ihrer Einfachheit und Raschheit sowie der Stabilität der Reagentien erreicht. Diese colorimetrische Methode umfaßt die Messung der gebildeten roten Chinonfarbstoffe bei 500 nm, jedoch bewirkt das Vorliegen von Bilirubin im Serum einen negativen Fehler. Demgemäß kann die vorherige Umsetzung von Bilirubinoxidase mit dem Serum zur Entfernung von Bilirubin und dann die Umsetzung von Glukoseoxidase oder Cholesterinoxidase mit dem Serum einen korrekten Glukosewert oder Cholesterinwert des Serum erzielen lassen.

Es wurde nun gefunden, daß Bilirubinoxidase durch einen Stamm aus der Klasse Basidiomycetes, also anderen als den oben erwähnten Bilirubinoxidase produzierenden Mikroorganismen,erzeugt wird und festgestellt, daß eine gewisse Art von Stämmen, die zur Klasse Basidiomycetes gehören, in einer Züchtungsbrühe starke Produzenten von Bilirubinoxidase sind.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm ist ein solcher der Genus Schizophyllum der Klasse Basidiomycetes, insbesondere Schizophyllum Commune K-17, der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3 06 hinterlegt ist,

Dieser- Stamm wurde aus den Fruchtkörpern isoliert, die in Haufen oder Büscheln auf toten Bäumen in Iwakura, Kyoto City, Japan, wachsen.

Die Merkmale des Fruchtkörpers und der Sporen dieses

Stammes sind wie folgt:

Kappe: 10 bis 3 0 mm Durchmesser, dicht mit groben Haaren auf der Oberfläche bedeckt, was ihr eine weiße, graue, fleischfarbene oder braune Färbung verleiht.

Lamellen: weiß, .grau oder blaß-fleischfarben;'der Länge nach am Rand geschlitzt, wobei die geschlitzten Teile einander zu überlappen scheinen. Fleisch: ie.drig und zäh; schrumpft beim Trocknen, kehrt jedoch nach Befeuch-» ten zur ursprünglichen Form zurück. Sporen: glatt, in der Masse weiß; zylindrische Form von 4 bis β χ 1,5 bis 2 um. Beim Vergleich der obigen Merkmale mit der Beschreibung der folgenden Bücher: Seiya Ito: Mycological flora of Japan, Vol. 2, Nr. 5, 1955 (veröffentlicht von Yoken-do, Tokyo, Japan) und Rokuya Imazeki und Tsugio Bongo: Colored Illustrations of Fungi of Japan, VoIs. und 2, ist ersichtlich, daß dieser Stamm Schizophyllum Commune K-17 ist. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,. Japan unter der Nummer FERM BP-306 am 17. Mai 1982 deponiert. Dieser Stamm hat von Natur aus die Fähigkeit, Bilirubinoxidase zu bilden.

Die Erfindung wird nun, teilweise unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung, näher beschrieben.

Fig. 1 zeigt eine Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität von Bilirubinoxidase, die nach der vorliegenden Erfindung erhalten ist, und Fig. 2 zeigt eine Be- · Ziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität. Fig. zeigt eine Beziehung zwischen dem pH und der Aktivität nach Behandlung der Bilirubinoxidase bei 4°C und bei wechselnden pHs für 7 Tage, und Fig. 4 zeigt. ein·= Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität nach

35' der Behandlung von Bilirubinoxidase bei einem pH von 6,0

-D-

und bei wechselnden Temperaturen für 10 Minuten. Fig. 5 zeigt eine Veränderung im Absorptionsspektrum, wenn das vorliegende Enzym mit OMEGA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin umgesetzt war, und Fig. 6 zeigt das ° Dünnschichtchromatogramm des Reaktionsproduktes nach Umsetzen des vorliegenden Enzyms mit OMEGA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin. Fig. 7 zeigt die Veränderung im Absorptionsspektrum, wenn das vorliegende Enzym mit Biliverdin umgesetzt war.
10

Bei der Züchtung des in der Erfindung zu verwendenden Mikroorganismus kann jede wohlbekannte Nährquelle dem Züchtungsmedium zugesetzt werden, wenn sie vom benutzten Stamm verwertet werden kann. Als Kohlenstoffquelle können z. B. Glycerin, Glukose, Stärke, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextrin, Öle und Fette, Melassen und dgl. verwendet werden. Als Stickstoffquelle eignen sich Hefeextrakt, Pepton, Maisquellwasser, entfettete Sojabohnen, Sojabohnenpulver, Fleischextrakt und dgl. Auch anorganisehe Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Zinksalze und dgl. können zugesetzt werden und weiterhin Vitamine und wachstumsbegünstigende Substanzen.

Bei der Züchtung des Stammes, der zur Klasse Basidiomycetes gehört, schwankt die Menge an gebildeter BiIirubinoxidase je nach den Züchtungsbedingungen. Im allgemeinen ist die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 35 C, das pH des Züchtungsmediums ist vorzugsweise 4 bis 7 und die Erzeugung von Bilirubinoxidase erreicht das Maximum durch eine Züchtung unter Belüftung/Rühren für 3 bis 10 Tage. In diesem Falle ist es selbstverständlich, daß die Züchtungsbedingungen so festgelegt werden, daß man eine maximale Ausbeute an Bilirubinoxidase erhält, je nach den verwendeten Stämmen und der Zusammensetzung

-6-des Züchtungsmediums.

Die von einem Stamm gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugte Bilirubinoxidase liegt im Kulturfiltrat vor, und sie kann als Niederschlag abgeschieden werden, indem man 50 bis 80 Vol./Vol. % eines organischen Lösungsmittels (z. B. Alkohol, Aceton) oder 20 bis 80 Gew./Vol. % eines Fällungsmittels (z. B. Ammonsulfat, Kalziumchlorid) zum Kulturfiltrat zusetzt.

Der erhaltene Niederschlag wird durch Dialyse oder Sephadex-Behandlung entsalzt, um- eine rohe Enzymlösung zu erzielen. Zur Reinigung der rohen Enzymlösung kann die Gelfiltration der Lösung an einer Säule von Sephadex G-75 durchgeführt werden, die vorher mit 0,1 M Phosphat-. puffer (pH 7,0) gepuffert wurde, um eine aktive'Fraktion zu sammeln. Danach wird die aktive Fraktion an einer Säule .von DEAE-Sephadex A-50 gebunden, die vorher mit ■ 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert wurde, und das adsorbierte Material wird dann mit 0,3 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Diese aktive Fraktion wird dann gegen 0,01 M Phosphatpuff er . (pH 7,0) dialysiert, und das innere Lösungsmittel der Dialyse wird mit einer Kolloidmembran konzentriert und lyophilisiert, um ein gereinigtes Enzympulver zu er-

2.5 halten.

Die charakteristischen Eigenschaften der nach der vorliegenden Erfindung erhaltenen Bilirubinoxidase sind wie folgt:
30

(1) Wirkung:

Wenn das Enzym der Erfindung auf Bilirubin einwirkt, wird Biliverdin gebildet und es oxidiert auch Biliverdin zu einer- unbekannten blaßvioletten Sustanz.

Das heißt, es katalysiert die folgende Zwei-Stufen-Reaktion:

Bilirubin + 1/2 O₃ ?* Biliverdin + H₃O (1)

Biliverdin + 1/2 O₃ 3» blaßviolette

Substanz + HO (2)

(2) Optimales pH und pH-Stabilität:

Ein optimales pH für das vorliegende Enzym liegt in der Nähe von 5,5 bis 6,0, was eine extrem hohe Aktivität anzeigt, wie auch die Kurve in Fig. 1 angibt. Die pH-Stabilität des Enzyms nach Behandlung bei 4 C und bei wechselnden pH-Werten für 7 Tage ist in Fig. 3 gezeigt. Wie aus Fig. 3 ersichtlich, ist das Enzym bei einem pH von 8 stabil.

(3) Optimale Temperatur und Thermostabilität:

Die optimale Temperatur für das vorliegende Enzym ist bei etwa 50⁰C, wie die Kurve in Fig. 2 zei^t. Die Thermo-Stabilität des Enzyms nach Behandlung bei einem pH von 6,0 und bei wechselnden Temperaturen für 10 Minuten ist in Fig. 4 gezeigt. Das vorliegende Enzym war bis zu 45°C stabil.

(4) Molekulargewicht:
30

Das Molekulargewicht des durch Gelfiltration mit Sepha-

dex G-100 erhaltenen Enzyms betrug etwa 58.000.

(5) Isoelektrischer Punkt:

Der isoelektrische Punkt des durch isoelektrische Fokus-

■ sierung erhaltenen Enzyms betrug 6,0 bis 6,1. ■

(6) Inhibitoren:
■

Das vorliegende Enzym wurde von 1 mM von'jeweils Fe , NaN-s, KCN, Natriumascorbat, Cu , o-Phenanthrolin, α,α'-Dipyridyl, reduziertem Glutathion und dgl. inhibiert.-
'

(7) Bestimmung der enzymatischen Aktivität:

Die enzymatische Aktivität wurde erhalten durch Messen der Abnahme in der Absorption von Bilirubin bei 460 nm. Das heißt, die Reaktion wurde bei 3 7°C 10 Minuten lang unter Verwendung von 3,0 ml eines Reaktionsgemisches durchgeführt, das 8 mg OMEGA-chemisches Kontrollserum erhöhtes Bilirubin (erzeugt von Hyland Co., USA), 300 μΜοΙ Phosphatpuffer (pH 6,0) und 0,1 ml geeignete verdünnte Enzymlösung enthielt, und die Abnahme der Absorption bei 460 nm durch Bilirubin wurde gemessen. Eine .· Einheit an Bilirubinoxidaseaktivität wurde als Menge des Enzyms definiert, welche die Absorption bei 460 nm um 1,00 pro Minute bei 37°C vermindert.

Die konkrete Methode zur Herstellung von Bi'lirubinoxidase gemäß der Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele gezeigt, die die Erfindung erläutern.

Beispiel 1

Ein Schräg-Kulturmedium, das 2 % Glukose, 0,5 % Ebios

und 1,5 % Agar (Ebiosmedium ) enthielt, wurde mit

Schizophyllum Commune K-17 (FERM ΒΡ-306) beimpft, und die Züchtung wurde durchgeführt, indem das Medium ruhig eine Woche bei 25°C gehalten wurde, um einen Saatfungus zu erhalten.

Getrennt davon wurden 100 ml eines Kulturmediums, das aus 3 % Glycerin, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₂PO₄ und 0,1 % MgSO₄-VH₃O bestand, in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, und nach der Sterilisierung bei 120⁰C für 20 Minuten wurde es abgekühlt und mit .dem obigen Saatfungus beimpft. Danach wurde· eine Schüttelkultur bei 27 C für 7 Tage bei 120 Umdrehungen pro Minute durchgeführt. Nach Beendigung der Züchtung wurde das Mycel durch Filtration entfernt, um ein Kulturfiltrat zu erhalten. Die Bilirubinoxidaseaktivität dieses Kulturfiltrats betrug 1,5 Einheiten pro ml.

Beispiel 2

100 ml eines Züchtungsmediums aus 3 % Glycerin, 0,3 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,3 % KH₃PH₄ und 0,1 % MgSO₄-7H-⁰ wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben, bei 120⁰C 20 Minuten lang sterilisiert und mit Schizophyllum Commune K-17 beimpft, der im Ebios-Kulturmedium von Beispiel 1 gezüchtet war. Danach wurde die Züchtung bei 27°C 5 Tage lang durchgeführt, um eine •Saatkulturflüssigkeit zu erhalten. Getrennt davon wurden 15 1 eines Kulturmediums aus 3 % Glycerin, 0,3 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 1 % Maisquellwasser, 1 % entfettete Sojabohnen, 0,3 % KH₃PO₄, 0,1 % MgSO₄-7H₂O und 0,03 % eines Entschäumungsmittels (CB-442 von Nippon Yushi Co.) in einen 30 1-Ferinentationstopf gegeben und bei 120⁰C 20 Minuten lang sterilisiert. Nach Abkühlen wurde das Züchtungsmedium mit 100 ml der obigen Saatkulturflüssigkeit beimpft,

-ιοί und die Züchtung wurde bei 27°C 6 Tage lang unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß die Belüftungsrate 10 l/min und die Rührgeschwindigkeit 2 00 üpm betrug. Nach Beendigung tier Züchtung wurde das My eel durch FiI-tration entfernt, um ein Kulturfiltrat zu erhalten. Die Bilirubinoxidaseaktivität dieses Kulturfiltrats betrug 6,5 Einheiten pro ml. Ammonsulfat wurde zu 13 1 dieses Kulturfiltrats zugegeben, und zwar zuerst,bis 50 %ige Sättigung erreicht war, um Verunreinigungen als.Niederschlag zu entfernen. Weiterhin wurde Ammonsulfat zur überstehenden Flüssigkeit zugegeben, bis die Sättigung 70 % war, und nach Stehenlassen für einen vollen Tag und eine Nacht wurde der erhaltene Ammonsulfatniederschlag einen ganzen Tag und eine Nacht gegen eine große Menge an destilliertem Wasser dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse wurde lyophilisiert, und das trockene erhaltene Pulver wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Die Gelfiltration der erhaltenen Lösung wurde an einer Säule (5,0 χ 70 cm) von Sephadex G-75 durchgeführt, die wit dem gleichen Puffer gepuffert war, um eine aktive Fraktion zu sammeln. Die aktive Fraktion wurde in einer Säule (5,0 χ 20 cm) von DEAE-Sephadex A-50 adsorbiert, die vorher mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert war, und das adsorbierte Material wurde mit 0,3 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Diese aktive Fraktion wurde gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert, und die innere Lösung der Dialyse wurde mit einer Kolloidmembran konzentriert und lyophilisiert, um 320 mg des gereinigten Enzympulvers zu erhalten. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers war 23 Einheiten/mg.

Bei der Reaktion dieses gereinigten Enzyms mit OMEGA-■chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin wurde eine Beziehung zwischen der Reaktionszeit (es wurden 0,2 ug gereinigtes Enzym angewandt) und der Enzymkonzentration

-11-

(Reaktionszeit 10 Minuten) studiert, wie sie die Abnahme in der Absorption bei 46 0 nm des Bilirubins (^i>A46 0 nm) beeinflußt.

Reaktionszeit	ΔΑ460 nm	Enzymkonzentration	Za A4 60 nm
(min)		(ng)
'10	0,048	0,2	0,047
20	0,093	0,4	0,0912
30 .	0,135	0,6	0,135
40	0,168	0,8	0,170

Wie oben gezeigt, hat das gereinigte Enzym die Eigenschaft, bei Umsetzung mit Bilirubin dieses abzubauen.

Aus dem Ergebnis des Absorptionsspektrums (Fig. 5) bei Umsetzung des gereinigten Enzmys mit OMEGA-chemischem Kontrollserum erhöhtem Bilirubin sowie als Ergebnis der Dünnschichtchromatographie (Fig. 6) mit einem Mischlösungsmittel Chloroform/Methanol (1:1) wurde die BiI-dung eines oxidierten Produktes von Bilirubin, nämlich Biliverdin, beobachtet. Demgemäß wurde gefunden, daß das vorliegende Enzym Bilirubinoxidase ist, die BiIi-. rubin zu Biliverdin oxidiert. Das Enzym hat auch die Eigenschaft, Biliverdin zu einer unbekannten blaßvioletten Substanz zu oxidieren (Absorptionsspektrum in Fig. 7 gezeigt).

Claims

Patentanwälte · European Patent Attorneys * Dr. W. Müller-Bore * Dr. MüUer-Borf und Partner ■ POB 260247 ■ Π-8000 Mündien 28 „. . „. Dipl.-Phys. Dr. Paul Deufel DipL-Chem., Dipl.-Wirtscii.-Ing. Dr. Alfred Schön Dipl.-Chem. Werner Hertel Dietrich Lewald Dipl.-Ing. Dr.-Ing. Dieter Otto Dipl.-Ing. T 1573 D/sm Takara Shuzo Co., Ltd. Kyoto / Japan Verfahren zur Herstellung von Bilirubinoxidase Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Bilirubinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bilirubinoxidase erzeugenden Mikroorganismus der Genus Schizophyllum züchtet und Bilirubinoxidase aus der Kulturbrühe sammelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bilirubinoxidase erzeugenden Mikroorganismus Schizophyllum Commune K-17 (FERM BP-3 06) einsetzt.

D-8000 Mündien 2 POB 26 02 47 Kabel: Telefon Telecopier Infotec 6400 B Telex

Isartorplatz 6 D-8000 München 26 Muebopat 089/221483-7 GII + III (089)2296 43 5-24285