DE1767183A1

DE1767183A1 - Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Labferment

Info

Publication number: DE1767183A1
Application number: DE19681767183
Authority: DE
Inventors: Feldman Louis Israel
Original assignee: Baxter Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1967-04-18
Filing date: 1968-04-10
Publication date: 1971-08-19
Also published as: DE1767183C3; SE398757B; SE435066B; GB1207892A; NL6805426A; ES351049A1; IT970509B; IL29621A; FR1556473A; CH506621A; DE1767183B2; SE7707286L; SE435194B

Description

Baxter Laboratories, inc. - 46 155 - Dr. ΐ/1-ϊ.ί

'/erfahren zur Herstellung von mikrobiellern Labi'er:;ic-iit

!»ie vorliegende j'Jriir. umg be trifft ein Verx.Uiren zur Herstellung von mikrobiellein. Lab sowie die Verwendung dieses Lubes zur r.eri'tellun;: von nase.

Gemäß dem üblichen '/erfahren zur Herstellung von Käse wird Lab zum Koagulieren der ..ilen verwendet, j ab ist eine Enzym -hai χ lire j, .ischun.j, aie aus dem vierten Magen von milchgefütterten .tJi.lbern hergestellt wira. Bei aer Herstellung von Käse wird das Lab aer l.ilch .zugesetzt, und das Enzym, das Labxeriiieiit, übt eine milde proteclytische Wirkung auf das Kasein und die anderen in der jJilcii vornandenen Proteine auü. ^ier Abbau der x^Jroteine verursacht die Kongulation der i.iiloh und die Bildung von festem Weißkäse. Dieser "Weißkäse wird Von aer i.iolken abgetrennt, welche hauptsächlicii eine wässrige ouspension mit einem geringen Pestkörpergelialt darstellt, l/er Weißkäse wira dann mit 3alz und weiteren Zusatzstoffen vermischt, zu Blockeii ouer itundstiicken geformt und unter Bildung von iJi.se gegoren oder reiben gelassen.

Im liinblick aui die besonders tierische Herkunft des Labes unterliegt die x.ifcferun_r_ una aie Qualität des Labes großen jcnv/ankungen. Jrn .linblick auf uiese ver^nuerlicnen iaktoren sind auf aiesorn tecünischt-n (febiet Versuche unternommen ■//orden, nr^utzntoife ι '\r <ni3 Lj'u zur iier::telluüi' von ir...·'-, zu i'iriden. lü.s .:i.nd «;ahl r- .· · cno tierische und mikrobielle liiii ϋ./:ι f >i'ii f "!-.ι.': b;-1 .air ...,u'j"·.· jimck i'/eei; riete/. λ-Ι'ο:« χ:: a tof fen

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^: V7Ü7

untersucht worden, welche die milchkoagulierenden Eigenschaften dea Labes D/cen konnten. Unter den Mikroorganismen, aie als nützlich für uieaen Zweck beschrieben v.orden sjnd, befinden sich beispielsweise aie verschiedenen kikrοOrganismen, die in uer TJSA-ratent schrift 1 591 21 y beschrieben worden sind, sowie Enuothia parasitica, offenbart in U3P 3 275 453 und iviucer pusillua, offenbart in den UoA-Iatentschriften Nr. 3 151 o39 und 3 212 9o5.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mikrobiellem Lab mit verhältnismäßig hoher milchkoa^ulierender Aktivität und verhältnismäßig niedriger proteolytischer Aktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Mucor miehei NRBL 3169, A 7772, A 13, 131, A 13,o42 und/oder 2543 auf üblichem biologischem Wege unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung enthaltend Kohlenstoff, Stickstoff und Spurennährmittel gezüchtet und das mikrobielle Labferment aus der Gärlösung gewonnen wird.

Das mikrobielle Labferment wird zweckmäßig dann von der Gärlösung abgetrennt, wenn eine nennenswerte Menge des Fermentes gebildet worden ist. Das so hergestellte Labfer ment kann zur Herstellung von Käse bei der i/iilchkoagulierung verwendet werden, wobei das sonst übliche Lab ganz oder teilweise durch das gemäß der Erfindung hergestellte Labferment ersetzt v/erden kann.

Eine Beschreibung der allgemeinen Eigenschaften der Organismen Mucor miehei ist beschrieben von Cooney und Emerson, "Thermophilic Fungi", pp. 17-27 (1964), veröffentlicht von «/. xi. Freeman und Co., Üan Francisco und London.

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T7F7THT

Kulturen uer _c;eiiä:.v der Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind hinterlegt bei den Northern regional Research Laboratories, Peoria, Illinois und heben die oben erwähnten Codenummern erhalten. Besonders bevorzugt ist der Mikroorganismus, der die Codenummer WHRL 31b9 erhalten hat.

Das mikrobielle Labferment,gemäß der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise dadurch hergestellt, dai; eine Kultur von Mucor miehei in einem geeigneten Medium in Gegenwart von Luft bei Temperaturen zwischen etwa 30° C und etwa 55° C für Seiträume von etwa 2 bis 14 Tagen gezüchtet wird. Das Permentationsmedium hat in der Hegel einen pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 8 und vorzugsweise im pH-Wertbereich von etwa 4 bis etwa 7. Es können submerse aerobische Fermentationsmethoden, beispielsweise die Tieigärung in kommerziellen Fermentationstanks oder die Gärung in Kolben auf einem Rotationsschüttler verwendet werden. Es können auch verschiedene Methoden der Aerobenoberi lächenzüciitung angewandt werden, um das mikrobielle Labferment gemä" der vorliegenden Erfindung herzustellen.

Die Gewinnung des mikrobiellen Labfermentes aus dem Kulturmedium kann nach verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wie sie zur Abtrennung von Proteinen aus Gemischen üblich sind, beispielsweise die Lösungsmittelfällung, die Salzfällung, die Chromatography und andere derartige Methoden der Proteinabtrennung. Beispiele für Lösungsmittel, die zur Ausfällung des mikrobiellen Labfermentes angewandt werden können, sind Ketone wie Aceton und LiethyLathylketon, Alkohole wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, sowie andere

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derartige organische lösungsmittel. Als JaJ.ze, die verwendet v/erden Können seien beispielsweise genannt Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und ähnliche ^Mineralsalze. Es können auch andere Verfahren zur Gewinnung uey mikrobiellen Labfermentes angewandt werden, beispielsweise Dialyse, Elektrophorese, Gefriertrocknung usw.

Geeignete Fermentationsmedia können aus kohlenwayserstoifnaltigen »jtoffeu hergestellt werden, wie Molke, abgebaute Maisstärke, Cerelose, Weizenkleie und andere organische Quellen, die Kohlenstoff zur Verfügung stellen. Stickstoffhaltige Produkte sind beispielsweise Brauereihefe, Sojaprotein, Kasein, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate und andere derartige organische oder anorganische Quellen, die Stickstoff zur Verfügung stellen. Die Quellen für diese Bestandteile des Jb'ermentationsmediums können rohe Naturstoffe oder stärker gereinigte Substanzen sein.■Spurennährmittel, die vom Organismus benötigt werden können, sind in der Regel in den hauptsächlichen Bestandteilen des tfermentationsmediums enthalten. Deshalb ist die besondere Zugabe von Spurennährmitteln in der Regel nicht erforderlich. Beispielsweise sind Spurenmengen von anorganischen Salzen wie metallchloriden, -Sulfaten, -Phosphaten und -Nitraten in der Regel im Fermentationsmedium zusammen mit den kohlenstoffliefernden und stickstoffliefernden Bestandteilen enthalten.

Proteasen koagulieren in der Regel Milch. Jedoch verursachen die meisten Proteasen eine beträchtliche Protein-Verdauung. Wenn solche Proteasen von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Ursprung zum Koagulieren von Milch verwendet

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werden, entwickeln die ernaltenen A'eißkäsen unerwünschte Nebengeschmäcke, und zwar aufgrund der Proteolyse. Deshalb sind sie für die Herstellung von Käse nicht besonders gut geeignet.

Ein besonderer Vorteil des gemäß der vorliegenden Erfindung aus Mucor miehei hergestellten Labfermentes besteht darin, daß es unerwartet eine sehr nieurige proteolytische Aktivität bei gleichzeitiger großer milchkoagulierender Aktivität besitzt. Die Milchproteolyse-Kurven, die mit Mucor miehei gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, sind identisch mit denjenigen, die mit Lab erhalten wurden, was eine sehr niedrige proteolytische Aktivität anzeigt. Das Mucor miehei-Labferment scheint außerdem wesentlich weniger proteolytisch aktiv zu sein als Mucor pusillus, welches in der USA-Patentsenrift 3 151 oj>9 offenbart ist. Bei Verwenuung des lvlucor miehei-Labf ermentes sind weniger als 1o ja des gesamten Kjeldahl-Stiekstoffes in der Molke gefunden worden, während gemäß USP ^yj> 151 o39 (Spalte 4, Zeilen 58 bis 61) 2o fi des Kjeldahl-Stickstoffes in die Molke gehen.

Wenn auch die vorliegende Erfindung nicht an eine bestimmte Theorie gebunden werden soll, wird dock angenommen, daß die Käsesorten, welcue in it dem mikrobiellern Labferment gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, im wesentlichen frei sind von Nebengeschmäcken, und zwar zum großen Teil aufgrund der niedrigen proteolytischen Aktivität des Labferment-Produktes.

Bei der Herstellung von gewissen Käsesorten ist es wün-

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sehenswert, ein mikrobielles Labferment, erhalten von Mucor miehei zu verwenden, in dem das Labferraent im wesentlichen ir ei ist von irgendwelcher Lipase. Auf der andere^ oeite kann es bei der Herstellung von gewissen anderen ii-.sesorten wünschenswert sein, ein mikrobielles aus luucor miehei erhaltenes Labferment zu verwenden, in dem das Labferment Lipase enthalt, is wird besonders darauf hingewiesen, dais beiae vorerwähnten mikrobiellen Labiernente bzw. deren Herstellung und Verwendung zum Gegenstand uer vorliegenden Erfindung gehören.

Die folgenden Beispiele erläutern weiter die vorliegenae Erfindung, wobei die Erfindung jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt sein soll. Alle in den Beispielen angegebenen Prozentzahlen sind Gewichtsprozente, soweits nichts anderes gesagt ist.

Beispiel 1 :

Mucor miehei, NRRL 3169, wird von einer agar-Schrägkultur unter sterilen Bedingungen in einen 1 Liter Fernbach-Kolben gegeben, der 2oo ml des folgenden wässrigen Mediums enthält:

Molke 82 %

,abgebaute Maisstärke · 5 <$>

Brauereihefe 1 %

Oerelose (Glucose) 1 #

Wasser , 11 #

1oo fi

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Der kolben wiru auf eine.ji Drehsciiüttelgerät bei 57 G Ibc btunuen lang der Züchtung überlassen. Die liärilüssigkeit wird filtriert, υΐιχ; i-'iltrat zeigt eine Aktivität, die 12.68ο mcg ί\ΙΪ Labfer^ent/ml ,deid ist. Zu dem abgekühlten jj'iltrut ( 5° C) wird aas doppelte Volumen von kalter.* Aceton gegeben. Der ernoltene r.-icderachiag v.ird filtriert und mit Aceton gewaschen, wobei ein feines weißes Pulver Mit einer Aktivität von 9o3 ng HF Labfer::;ent/£- erhalten wird.

Die Aktivität des labf ermenthaJ ti~en Materials, -.vie sie ,lier beschrieben v;iri;, -.vird wie folgt eriittelt:

Lu '■-) ml frischer lioinogenieierter .,ixlch (pH-Wert auf o,2 eingestellt mit Milchsäure) bei 55° G wird 1 ml einer wässrigen lösung j er Labfermentprobe gegeben. Die rrobe wird periodisch gerührt und aie Zeit, die erforderlich ist bis zum erst eil Auftreten einer Ausflockung, wird gemessen. Das gleiche Verfahren wird gleichzeitig unter Anwendung von mehreren opiegeln von ^F-Labferuient durchgeführt. Es wird eine S.tandardkurve für die Ausflockungsseit gegenüber dem'dpiegel an i\T-Labferment gezeichnet. Die Ausilociungszeit für die Versuchprobe wird dann in Relation gesetzt zur Standardkurve, m: aie Aktivität der Versuciisprobe bezogen auf das NF-Lab^"erment zu bestimmen.

Das gemäiS dem Beispiel hergestellte mikrobielle labfermentprodukt kann dazu verwendet werden, um ganz oder teilweise das Lab zu ersetzen, das üblicherweise zur Erzeugung von gereiften Käsesorten wie Käse vom Cheddar Typ, Schweizer Läse

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und anderen sogenannten harten und weichen Käse verwendet wird. Es kann auch zur Erzeugung von irgendwelchen anderen Arten von Käse verwendet werden, wo bisher Lab-Präparate verwendet worden sind.

Beispiel 2 :

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei an Stelle von Mucor miehei, EERL. 3169 derjenige Btamm von Mucor miehei verwendet wird, der vom Horthern Regional Research Laboratories mit JiRHL 2543 bezeichnet wurde. Es wird eine Labferment-Aktivität zur Erzeugung eines zufriedenstellenden Käses erhalten.

Beispiel 3' :

Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei das wässrige Gärmedium durch die folgenden Media ersetzt- wird:

a) Molke 97 <f₀

Glucose 3 J₀

1oo °/o

b) abgebaute Maisstärke , 5 °/o

Brauereihefe 1 °/o

Cerelose (Glucose) 1 ?ό

Molke ο -8o °ß>

Wasser 13-93 Jq

1 OO ^c/o

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_: c) Molke 5o ψ

abgebsiute Maisstärke .. 5 ^a/o

'■'■-■■■ Gerelose (Glucose) ...ο 1 fo

Stickstoffquelle * ο.5- 5 ft Wasser ............. 59-4-5>5 j>

1oo °/o

' * Kasein, Sojaprotein, Pepton, ezymatisch abgebautes Kasein oder Maisquellwasser.

Die obigen Gärmedia sind weitere Beispiele für 'geeignete Media, die Kohlenstoff-, Stickstoff- und Spurennährmittel enthalten. Diese Nährmedia können zur Herstellung eines mikrobiellen labfermentes mit verhältnismäßig großer milchkoagulierender Aktivität und verhältnismäßig niedriger proteolytischer Aktivität gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet werden.

Beispiel 4 :

An Stelle der submersen Fermentation in einem flüssigen Medium gemäß Beispiel 1 wird ein Mucorvmiehei-Labferment hergestellt in (a) einem stehenden und (b) einem bewegten halbfesten Fermentationsmedium, das 25 fo Weizen, 25 $> Zuckerrübenpulpe und 5o fo Molke enthält. Diese labfermentprodukte können zur Herstellung von harten und weichen Käsesorten in zufriedenstellender Weise verwendet werden.

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Beispiel 5 :

Cheddar-Käse wird dadurch, hergestellt, daß die zum Absetzen üblicherweise verwendete Lab-Zubereitung durch eine äquivalente Menge des gemäß Beispiel 1 hergestellten mikrobiellem Labferment-Produktes ersetzt wird. Bei diesen Verfahren wird pasteurisierte Vollmilch auf 3o bis 31,1° 0 erwärmt. Dazu wird 1 fo einer handelsüblichen Liilchsäure-Starterlöaung su-gegeben. Dann· wird das raikrobielle Labferment in einer Menge von 85 g pro 454 kg Milch zu der Milch gegeben. Die Mischung wird gerührt, bis ein Quark mit zufriedenstellender Festigkeit erhalten wird. Der Quark wird in Blöcke geschnitten und dann mehrere Stunden lang bei 37,8° G gekocht. Der Quark wird von der Molke abgetrennt und in Scheiben geschnitten. Der gemahlene Quark wird dann mit 3 Gewichtsprozent Käsesalz gesalzen. Der gesalzene Quark wird dann in Gebinde gegeben, gepreßt, und in einem Reifungsraum gelagert. Von dem mit dem Labferment gemäß diesem Beispiel hergestellten Käse werden nach einigen Tagen der Reifung in Abständen Proben entnommen.Es wird dabei gefunden, daß er eine ausgezeichnete Qualität hat und im wesentlichen frei von Nebengeschmack ist.

Andere übliche Verfahren zur Herstellung von Cheddar-Käse, beispielsweise diejenigen, die durch Prescott und Dünn, "Industrial Microbiology», Kapitel 21 (3 Auflage, 1959) McGraw-Hill Book Go., Inc., New York und den dort angegebenen Literaturnachweisen beschrieben sind, können ebenfalls angewandt werden, um gemäß der vorliegenden Erfindung die Lab-Präparate zu ersetzen, die üblicherweise zur Her-

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Stellung von Käse angewandt werden. Ls kann dabei eine äquivalente Menge des mikrobiellen Labes aus Muαar miehei gemäü Beispiel 1 angewendet werden, um einen Käse von guter Qualität herzustellen.

Dm die Herstellung von mikrobiellem Labferment aus den beanspruchten Stämmen von Mucor miehei gemäß der Erfindung ohne und mit Bildung von Lipase zu demonstrieren, wurde das folgende Verfahren angewandt!

Lie Züchtungen wurden unter Verwendung der Stämme von i.lucOi- miehei, die die liummern HRRL A 7772 und IiRRL 3169 erhielten, in gerührten, belüfteten G-las-Fermentationsgefäßen b-°i 37° C für einen Zeitraum von 166 Stunden durchgeführt. Die angewandten Medien und die Labferment-Aktivitäten der Filtrate der I'ermentationsbrühen sind nachfolgend in der Tabelle A zusammengestellt«

Tabelle A

Fermentation ITr,	1	2	3
M. miehei Stamm	A7772	3169	3169
	5 1 1 43	5 1 1 43	8q i> 5 1 1 13
Medium:.Molke abgebaute Maisstärke Brauereihefe Gerelose (Glucose) Wasser	1 OO ^c/o	1 OO fo	loo i°
	4,38o	8 ,.65 ο	9 j ooo
liltrat: Labferment Aktivität mcg Nl Labferment/ml

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Die Filtrate der Permentationsbrülien der Fermentationen
Nr. 1, 2 und 3 wurden dann wie folgt behandelt:

Fermentation Nr. 1

Fermentation Nr, Fermentation Nr. 3:

Zu dem Filtrat wurde.das zweifache Volumen Aceton gegeben, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wurde, der die folgenden Aktivitäten besaß:

Labferment: 46o mg NF Labferment/g. Lipase: 0 Einheiten/g. Zu dem Filtrat wurde das zweifache Volumen Aceton gegeben, wobei ein Niederschlag mit den folgenden Aktivitäten erhalten wurde: Labferment: 54o mg NF Labferment/g. Lipase: 3ό Einheiten/g. Zu jeweils 1oo ml des Filtrats wurden 3»o Gramm CaGl₂ und 5oo ml Äthanol gegeben, wobei ein bräunlichgelber Niederschlag mit den folgenden Aktivitäten erhalten wurde: Labferment: 652 mg NF Labferment/g. Lipase: 0 Einheiten/g.

Die Labfermentaktivität ist wie oben beschrieben definiert. Die Lipaseeinheiten werden definiert als die Menge an Enzym (Lipase), die aus einem Olivenöl-Substrat ein mikro Äq.uiva-

lent Säure pro Minute bei pH 6,5 und 3o C erzeugt

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bad omim.

Für den Fachmann auf diesem technischen Gebiet ist es klar, daß andere Beispiele als die oben beschriebenen nach Kenntnis der vorliegenden Beschreibung und Patentansprüche durch verschiedene Modifikationen und Anwendungen gefunden werden können, ohne daß vom Schutzumfang der vorliegenden .Erfindung abgewichen wird. Diese Modifikationen und Anwendungsgebiete sollen von den nachfolgenden Ansprüchen ebenfalls umfaßt werden. ;

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche :

1. Verfahren zur Herstellung von mikrobielleni Labferment mit verhältnismäßig hoher milchkoagulierender Aktivität und verhältnismäßig niedriger proteolytischer Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß Mucor miehei NRRL 5169, A 7772, A 13, 131, A 13,o42 und/oder 2543 auf üblichem biologischem Wege unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung enthaltend nutzbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Spurennährmittel gezüchtet und das mikrobielle Labferment aus der Gärlösung gewonnen wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die Züchtung unter submersen aerobischen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen etwa 30° C und etwa 55° G für einen Zeitraum von etwa 2 bis etwa 14 Tagen durchgeführt wird.

3* Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Labferment im wesentlichen befreit ist von Lipase.

4. Verwendung des gemäß Ansprüchen 1 bis 3 hergestellten mikrobiellen Labfermentes zur Herstellung von Käse durch mindestens teilweisen Ersatz des üblicherweise hierfür verwendeten Labes.

5. Verfahren zur Herstellung von Käse durch Herstellung von Weißkäse aus Milch und anschließende Aufarbeitung,

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BAD ORIGiNAt

dadurch gekennzeichnet, daß bei der Herstellung des Weißkäse das üblicherweise hierfür verwendete Lab mindestens teilweise durch das durch Züchtung von Muco miehei HRRL 5169, A 7772, A 13 131» A 13,o42 und/oder 2543 auf üblichen] biologischem Wege erzeugte Labi'erment ersetzt wird.

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