DE1442118C - Verfahren zur Herstellung von milchkoagulierendem Ferment durch Züchten von Schimmelpilzen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen milchkoagulierenden Ferments durch Züchten von Schimmelpilzen in Nährmedien.

In der nachstehenden Beschreibung wird das durch Züchtung von Schimmelpilzen erhaltene milchkoagulieiende Ferment als »mikrobiologisches Labferment« bezeichnet.

Das bisher bekannte Labferment zum Koagulieren von Milch wird aus dem vierten Magen des Kalbes gewonnen. Dieses Ferment besitzt eine kräftige Aktivität zur Koagulierung von Milch, und es findet in weitem Umfang bei der Käseherstellung Verwendung. Das Ausgangsmaterial zu seiner Herstellung steht jedoch nicht in unbeschränkten Mengen zur Verfügung und ist teuer.

Im allgemeinen koagulieren Proteasen Milch. Sowohl Proteasen tierischen Ursprungs, wie Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Kathepsin usw., als auch diejenigen pflanzlichen Ursprungs, nämlich Papain, Ficin, Bromelain usw., besitzen bis zu einem gewissen Grad milchkoagulierende Aktivität. Auch die koagulierende Aktivität der durch Bakterien erzeugten Proteasen, ζ. B. Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis und Serratia marcescens, ist bereits bekannt. Diese Proteasen wirken jedoch auf Proteine stark spaltend, sie zeigen eine niedrige Aktivität zur Koagulierung des Proteins, und sie kommen zur praktischen Verwendung als milchkoagulierende Fermente nicht in Betracht.

Weiterhin ist ein Ferment bekannt, welches die Gerinnung von Milch hervorruft und welches man durch Züchten des Pilzes Mucor rouxii auf einem geeigneten Nährmedium, vorzugsweise auf Reis, erzeugen kann.

Das durch Züchten von Mucor rouxii erhältliche Ferment hat jedoch nur eine niedrige milchkoagulierende Aktivität, so daß es zur praktischen Verwendung an Stelle von aus dem Kälbermagen stammendem Lab nicht in Betracht kommt.

Es ist Zweck der Erfindung, ein milchkoagulierendes mikrobiologisches Labferment sehr niedriger Proteasenaktivität, jedoch beachtlich hoher milchkoagulierender Aktivität durch Züchtung von Schimmelpilzen herzustellen.

Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß man in technischem Ausmaß und auf billigem Wege· ein neues milchkoagulierendes Ferment, d. h. ein mikrobiologisches Labferment, mit sehr niedriger Proteasenaktivität, jedoch hoher milchkoagulierender Aktivität herstellen kann, wenn man Mucor pusillus Lindt verwendet.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von milchkoagulierendem Ferment durch Züchten von Schimmelpilzen in Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen und organische Salze enthaltenden Nährmedien bei üblichen Temperaturen und pH-Werten ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Schimmelpilz Mucor pusillus Lindt verwendet.

Wie bereits angegeben, ist es bekannt, daß Mucor rouxii auf einem geeigneten Nährmedium, vorzugsweise Reis, ein die Koagulierung von Milch hervorrufendes Ferment bildet. Es war jedoch nicht zu erwarten, daß Mucor pusillus Lindt ein milchkoagulierendes Ferment mit sehr niedriger Proteasenaktivität und beachtlich hoher milchkoagulierender Aktivität in hoher Ausbeute in dem Medium erzeugt.

Nachstehend wird das Verfahren gemäß der Erfindung, wobei durch Züchten von Mucor pusillus Lindt, in einem Medium, mikrobiologisches Labferment gebildet wird, beschrieben. Dieses Ferment wird hierauf konzentriert und isoliert. Unter dem Ausdruck Konzentrieren und Isolieren des mikrobiologischen Labfermentes ist die Überführung dieses Fermentes in einen reineren Zustand als seinen Rohzustand oder in einen Zustand gemeint, in welchem es in höherer Konzentration oder höherer Reinheit ' vorliegt. Das gemäß der Erfindung zur Züchtung von Mucor pusillus Lindt verwendete Medium kann jedes

ίο geeignete künstliche oder natürliche Medium sein, sofern es mindestens eine Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff und anorganische Salze enthält. Als Kohlenstoffquelle können die Monosaccharide, Disaccharide und Polysaccharide verwendet werden, welche durch Mucor pusillus Lindt assimiliert werden können, z. B. Rohrzucker, Lactose, Glucose oder Stärke. In gleicher Weise können als Stickstoffquelle eine große Anzahl von Stickstoffverbindungen verwendet werden, sofern sie assimilierbar sind, wie anorganische Ammoniumsalze, Aminosäuren und eine große Anzahl anderer Eiweißstoffe. Zu den anorganischen Salzen gehören z. B. Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze und zahlreiche andere anorganische Salze. Jedenfalls kann die Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle des natürlichen oder künstlichen Mediums von jeder Art sein, sofern sie von dem verwendeten Mucor pusillus Lindt-Pilz gebraucht werden kann.. Als ein bevorzugtes Medium kann Weizenkleie verwendet werden.

Im allgemeinen eignet sich eine Züchtungstemperatur zwischen 20 und 40⁰C. Gewöhnlich führt man die Züchtung etwa 2 bis 7 Tage mit Hilfe einer flüssigen Kultur oder einer festen Kultur bei pH 3 bis 8, insbesondere pH 5 bis 7, und vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch. Im Falle einer flüssigen Kultur kann man eine Oberflächenkultur verwenden. Bessere Ergebnisse werden mit Schüttelkulturen oder Submerskulturen erhalten. Als Ergebnis der Züchtung wird das milchkoagulierende mikrobiologische Labferment im Medium gebildet. Zur Isolierung des Ferments aus dem Kulturmedium wird es im Falle einer festen Kultur mit Wasser oder einer wäßrigen Lösung extrahiert. Im Falle einer flüssigen Kultur wird das Mycel abgetrennt; man erhält eine fermenthaltige- Lösung. Als wäßrige Lösungen können solche verwendet werden, die Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw., Säuren, wie Salzsäure, Zitronensäure, Essigsäure usw.. enthalten, sowie verschiedene andere Typen von Pufferlösungen.
Die das mikrobiologische Labferment enthaltende Lösung kann hierauf eingeengt oder einer Reinigungsbehandlung unterworfen werden, indem man Einengen unter vermindertem Druck oder eine Reinigungsbehandlung, wie Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen, Reinigung mit Hilfe von Ionenaustauschern usw. durchführt. Als zur Fällung verwendete Lösungsmittel können mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isöpropanol, Aceton usw., verwendet werden. Zum Aussalzen kann jedes Salz verwendet werden, welches sich leicht in Wasser löst, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat usw.

Das gemäß der Erfindung hergestellte mikrobiologische Labferment besitzt Eigenschaften, die sich deutlich von den bisher bekannten Proteasen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs oder solchen Proteasen, die von anderen Mikroben gebildet werden, unterscheiden.
Das mikrobiologische Labferment besitzt eine kräf-

tige milchkoagulierende Aktivität, doch ist seine Proteaseaktivität sehr schwach.

Die milchkoagulierende Aktivität des mikrobiologischen Labfermentes zeigt ähnlich wie das Labferment aus dem vierten Kälbermagen eine starke Aktivität im sauren pH. Mit steigendem pH nimmt seine Aktivität ab. Im alkalischen pH-Bereich wird die Aktivität vernichtet.

Bei der Herstellung von Quark mit dem anmeldegemäß hergestellten Ferment beträgt der Stickstoffgehalt, der in die Molke übergeht, nach 150 Minuten etwa 2O°/o (bestimmt nach K j e 1 d a h 1). Somit verhält sich das Ferment gemäß vorliegender Anmeldung praktisch gleich wie Labferment. Bei der Bestimmung der Proteaseaktivität des mikrobiologischen Labfermentes nach Ans ο η unter Verwendung der entsprechenden Menge an Fermenten, welche die gleiche milchkoagulierende Aktivität zeigen, beträgt die Absorption bei 660 ηιμ im Falle der sauren Protease aus Aspergillus saitoi 0,641 (optische Dichte) und von Labferment 0,059, während die von mikrobiologischem Labferment weniger als 0,102 beträgt. Dies zeigt, daß das Labferment gemäß der Erfindung von vollständig anderer Art ist als die übliche Protease, da seine milchkoagulierende Aktivität ungewöhnlich stark im Vergleich zu seiner Proteaseaktivität ist.

Das gemäß der Erfindung durch Züchtung von Mucor pusillus Lindt hergestellte mikrobiologische Ferment ist außer zur Koagulierung von Milch auch z. B. zur Herstellung von Desserts, Eiskreme und Konfekt verwendbar.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

10 Teile Weizenkleie wurden mit 7 Teilen Wasser versetzt. Nach dem Vermischen wurde die Masse 15 Minuten bei 115°C gekocht. Die Masse wurde nach dem Abkühlen mit einem Stamm von Mucor pusillus Lindt (IAM F-27) angeimpft und bei 30⁰C inkubiert. Am dritten Tag erreichte die milchkoagulierende Aktivität ihr Maximum. Die Weizenkleie wurde mit 50 ml Wasser je 10 g versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Hierauf wurde das Mycel abfiltriert, und man erhielt 40 ml der mikrobiologisches Labferment enthaltenden Lösung. Die milchkoagulierende Aktivität dieses Extraktes betrug 800 Soxhlet-Einheiten/ml für eine 10°/_oige Lösung pulverisierter entrahmter Milch, welche Vioo Mol Calciumchlorid enthielt. Somit erhielt man aus 10 g Weizenkleie 32 000 Einheiten mikrobiologisches milchkoagulierendes Ferment. Hierauf wurde dieser Extrakt mit Ammoniumsulfat auf einen Sättigungsgrad von 0,22 bis 0,66 ausgesalzen. Praktisch die gesamte Aktivität ging in die Fällung über. Weiterhin kann eine Fällung mit einer Aktivität von 78, 80, 60 bzw. 75°/₀ mit Hilfe organischer Lösungsmittel der nachstehend genannten Konzentrationen gewonnen werden: Äthanol 70%, Methanol 75%, Aceton 66% und Isopropanol 70%. Die Aktivität des auf diese Weise erhaltenen mikrobiologischen Fermentes betrug 100 Soxhlet-Einheiten/mg, während die Kälbermagenlabfermenttabletten der Chr. Hansens Laboratory, Inc. eine Aktivität von 200 Einheiten/mg haben.

Beispiel 2

Ein 10% pulverisierte, entrahmte Milch, 1% Glucose (Traubenzucker), 0,1% Hefeextrakt, V200 Mol CaCI₂ enthaltendes Medium wurde mit einem Stam.ni von Mucor pusillus Lindt (IAM F-27) beimpft. Nach 4 Tagen Schütteln der Kultur bei 30⁰C wurde das Mycel abfiltriert, und man erhielt eine Fermentlösun^. Die Aktivität dieser Fermentlösung betrug 115 Soxhlet-Einheiten/ml; somit entsprach ImI 0,05 mg Labfermenttabletten. Aus dieser Lösung wurde in ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 ein gereinigtes festes Fermentpräparat hergestellt.

Vergleichsversuche

Vergleich der Leistungsfähigkeit als Milchgerinnungsenzym zwischen Mucor pusillus Lindt uiui Mucor rouxianus (früherer Name: Mucor rouxii).

Sämtliche Stämme wurden vom Centraalburcau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, erhalten.

Die bei diesen Versuchen benutzten Stämme waren:

Mucor pusillus Lindt
Mucor pusillus Lindt
Mucor pusillus Lindt
Mucor pusillus Lindt

CBS 219.31 CBS 23Uv) CBS 245.5$ CBS 253.53

Mucor rouxianus (Calmette) Wehmer CBS 120.08

In einen 300-ml-Erlenmeyerkolben, der mit einem Baumwollstopfen ausgestattet war, wurden 10 g Weizenkleie und 7 ml Leitungswasser und 100 mg Ammoniumsulfat eingebracht, gemischt und in einem Autoklav bei 120⁰C 20 Minuten lang sterilisiert.

Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden die Medien durch die obengenannten Stämme geimpft, und die geimpften Medien wurden bei 35⁰C bis /u 5 Tagen gezüchtet.

Das erzeugte Enzym wurde mit 100 ml destilliertem Wasser bei Raumtemperatur während 2 Stunden extrahiert und dann zentrifugiert, um eine klare Enzymlösung zu erhalten.

Die Prüfung der Milchgerinnungsaktivität wurde wie folgt durchgeführt: Zu 0,5 ml Enzymlösung von geeigneter Verdünnung wurden 5 ml 10%ige Magermilchlösung, die mit M/100 CaCl₂ versetzt war, hei 35⁰C zugegeben, und es wurde die Gerinnungs/eit mit einer Stoppuhr gemessen.

Die Milchgerinnungsaktivität der Enzymlösting wurde nach der folgenden Formel berechnet:

Labstärke =

2400
/ (sec)

Verdünnungskoeffizient,

wobei / die Gerinnungszeit ist.

. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Stamm Nr.	55	CBS 219.31	3	Jage	Züchtungszeit	SE/ml	5	Tasi·
CBS 231.29	350	SE/ml	4 Tage	SE/ml	393	Sli/ml
CBS 245.58	322	SE/ml	390	SE/ml	320	SE/ml
6o CBS 253.53	552	SE/ml	323	SE/ml	777	SE/ml
CBS 120.08	588	SE/ml	705	SE/ml	553	SE/ml
	35	SE/ml	725		42	SE/ml
	62

SE = Soxhlet-Einheiten.

Diese Werte sind Mittelwerte von jeweils /wei (»5 durchgeführten Versuchen.

Der technische Fortschritt der vorliegenden Krfindung ist aus den obengenannten Versuchen deutlieh ersichtlich.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von milchkoagulierendem Ferment durch Züchten von Schimmelpilzen in Kohlehydrate, Stickstoffsubstanzen und organische Salze enthaltenden Nährmedien bei üblichen Temperaturen und pH-Werten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schimmelpilz Mucpr pusillus Lindt verwendet.