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Verfahren zur Herstellung von im sauren Bereich wirksamer Protease
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von im -sauren Bereich wirksamer
. Protease durch Züchten von Mikroorganismen in üblichen Nährmedien, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Aspergillus niger var. macrosporus
ATCC 16513 einsetzt.
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Es sind bereits Verfahren zur Herstellung verschiedener Proteasen
bekannt. In der USA-.-Patentschrift 3 063 911 wird die Herstellung einer Protease
in flüssiger Kultur mit Hilfe von Aspergillus Oryzae var. microsporus TPR-18 auf
Koji-Nährböden beschrieben. Gemäß der USA.-Patentschrift 3 097145 wird durch Züchtung
von Mikroorganismen der Gruppe Polyporaceae in flüssiger Kultur ebenfalls eine im
sauren Bereich wirksame Protease erhalten. Diese bekannten Verfahren unterscheiden
sich jedoch wesentlich von dem erfindungsgemäßen Verfahren.
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F i g.1 gibt eine elektronenmikroskopische Aufnahme der Konidien von
Aspergillus niger var. macrosporus ATCC 16513 wieder; der im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet wird.
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F i g. 2 zeigt die pH-Abhängigkeit der Aktivität der ungereinigten
sauren Protease, die von ATCC 16513 synthetisiert und mit der colorimetrischen Methode
von F o 1 i n bestimmt wird; die Reaktionszeit beträgt 10 Minuten bei 30°C; Milchcasein
dient als Substrat.
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F i g. 3 zeigt die pH-Abhängigkeit der Aktivität aller aktiven Fraktionen
des gereinigten Enzyms mit Proteaseaktivität. Die Bestimmung erfolgt mit der colorimetrischen
Methode nach F o 1 i n mit 0,6 °/a Milchcasein als Substrat und einer Reaktionszeit
von 10 Minuten bei 30°C.
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F i g. 4 zeigt die Temperaturabhängigkeit der Aktivität aller Fraktionen
des gereinigten Enzyms mit einer Proteaseaktivität; die Aktivitätsbestimmung erfolgt
ebenfalls nach F o 1 i n. F i g. 5 zeigt die Temperaturabhängigkeit der proteolytischen
Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten Protease im Vergleich zu den aus den
USA.-Patentschriften bekannten Produkten bei Milchcasein (pH 1,5; 10 Minuten).
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Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus ATCC 16513 wurde aus
Erdproben unter Verwendung besonderer saurer Kulturmedien mit Milchcasein als Substrat
isoliert.
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Die folgenden Merkmale der Mikroorganismen lassen mit Sicherheit darauf
schließen, daß der Stamm ATCC 16513 in enger Beziehung zu Aspergillus niger van
Tieghem steht.
| MikrobioIogische Merkmale von Aspergillus niger var. macrosporus
ATCC 16513 |
| 1. Konidienköpfe: 5. Vesicles: |
| Schwarz. Kugelförmig, selten nur nahezu kugelförmig. |
| 2. Assimilation von Nitrit: 6. Durchmesser der Vesicles: |
| Negativ. 58 bis 70 p, (Durchschnitt 67 #t). |
| 7. Länge der ersten Sterigmata: |
| 3. Koniäien : 18 bis 30 #t (Durchschnitt 26 #t). |
| Im ausgereiften Zustand kugelförmig, mit deut- B. Länge der
zweiten Sterigmata: |
| licher Seeigeleiform. 5 bis 8 #t (Durchschnitt 7 #t). |
| 4. Durchmesser der Konidien: 9. Länge der Konidiophoren: |
| 4,9 bis 5,9 #t (Durchschnitt 5,4 #t). 1,75 bis 3,13 mm (Durchschnitt
2,29 mm). |
Die oben aufgeführten mikrobiologischen Merkmale sind die Ergebnisse
von zehn Proben am 5: Tag (Konidien am 25. Tag), die bei 29 bis 30°C auf Malzextrakt-Agar
als Medium gezüchtet wurden. Die Verwertung von Nitrit ergibt sich aus der Registrierung
des Wachstums am 3. Tag bei Verwendung eines nitrit- statt nitrathaltigen Szapek-Agar-Mediums.
Die Form der Konidien von ATCC 16513 ist in F i g.1 wiedergegeben.
| Wirkung der Temperatur auf das Wachstum von ATCC 16513 |
| Wachstums- |
| Medium temperatur 1. Tag 2. Tag 3. Tag 4. Tag 5. Tag |
| foC . |
| 28 -E- -f' |
| Malzextrakt-Agar ....... 30 -E- + -f- + -f- -E- -E-
-f- -E- -(- -(- -f- |
| 37 -f- -f- |
| 50 - - - - - |
| 28 - + -i- + -f- |
| Czapek-Agar . . . . . . . . . . . 30 -[- + + + -E- -E- -t-
-f- -f- |
| 37 -1- + + + + + -f- |
| 50 - - - - |
Das pH-Optimum der Protease liegt im sauren Bereich. Daher wird. die Protease nicht
nur als Pepticum in der Medizin verwendet oder als Nahrungszusatz, sondern auch
bei der Nahrungsmittelherstellung. Weiterhin ist die Protease ein wichtiges Enzym,
das als Heilmittel gegen Entzündungen und zum Lösen mucöser Stoffe in eitrigen Exsudaten
verwendet werden kann.
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Bisher wurden als Ausgangsmaterial zur Isolierung dieses Enzyms tierische
Organe und pflanzliche Gewebe verwendet.
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Zu den bisher bekannten Enzymen gehören das Pepsin, Papain, Ficin
und Bromelin. Vor kurzem wurde das Vorkommen saurer Proteasen mit einem pH-Optimum
nahe, pH 3,0 auch in Mikroorganismen beschrieben. Besonders-über die von Aspergillus
saitoi produzierte Protease wurde eingehend berichtet. Weiterhin ist auch bekannt,
daß die sogenannten Butylbakterien Trametes sanguinea oder Varianten des gelben
Aspergillus das Enzym synthetisieren.
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Aus den -Kurven A, B und C in F i g. 2 (A stellt die
Kurve für die ungereinigte Protease aus einer submersen Kultur nach Aussalzen und
Entsalzen dar, B- die Kurve für die ungereinigte saure Protease aus einer Festkultur
nach Alkoholfällung und C die Kurve für die ungereinigte saure Protease aus einer
flüssigfesten Zweistufenkultur nach Alkoholfällung) geht klar hervor, daß die ungereinigte
saure Protease, die mit Hilfe von ATCC 16513 gewonnen wurde, ein pH=Optimum nahe
pH-2,6 besitzt. Im Vergleich zu handelsüblichen, im sauren Bereich wirksamer Protease
aus Schimmelpilzen besitzt die vorliegende Protease nahe pH 1,5 eine beträchtliche
Aktivität und eine gute Temperaturbeständigkeit, so daß man sagen kann, daß das
-beschriebene Rohenzym im sauren Bereich eine ausgezeichnete proteolytische Aktivität
und Temperaturstabilität besitzt.
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Die. Untersuchungen über die Wirkungsweise des ungereinigten Enzyms
im Vergleich mit bereits bekanntem, im sauren Bereich wirksamem Enzym mit Proteasewirkung
aus Schimmelpilzen mit einem pH-Optimum nahe: pH 3,0 ergaben, daß hier -beschriebene
Rohenzym eine Protease darstellt, die ihr Optimum nahe pH.2,6 hat und im sauren-Bereich
eine sehr hohe Temperaturstabilität aufweist.
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Wie bereits erwähnt, zeigt der erfindungsgemäß verwendete Stamm ATCC
16513, was die Merkmale der Mikroorganismen und zusätzlich die Synthese einer neuen
Protease anbelangt, sehr große Ähnlichkeit mit Aspergillus niger van Tieghem; einige
der Kennzeichen sind kugelförmige Konidien mit deutlicher Seeigeleiform, mit einem
durchschnittlichen Durchmesser von 5,4 t,, meist jedoch größer als 5,0 p.. Diese
Eigenschaften unterscheiden sich von den entsprechenden Merkmalen von Aspergillus
niger van Tieghem, dessen Konidien meist 2,5 bis 4,0 #t, gelegentlich bis zu 5,0
#t betragen. Aus diesen Unterschieden kann geschlossen werden, daß von den Stämmen
des Aspergillus niger van Tieghem der Stamm, dessen Konidien kugelfürmig und seeigeleiförmig
sind und einen Durchmesser über 5,0 #t besitzen, eine neue Variante darstellt; daher
wird dieser Stamm hier als Aspergillus niger var. macrosporus ATCC 16513 bezeichnet.
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Das erfindungsgemäß herstellbare Rohenzym, d. h: das Rohenzym, das
dadurch gewonnen wird, daß das Filtrat einer submersen Kulturbrühe bei tiefen Temperaturen
eingeengt, das Konzentrat mit Ammoniumsulfat ausgesalzen wird, der so gewonnene
Niederschlag entsalzt, die entsalzte Substanz mit Alkohol ausgefällt und gefriergetrocknet,
sprühgetrocknet oder ähnlich behandelt wird, z. B. das entsprechend dem Beispiel
4 gewonnene Rohenzym, besitzt im Vergleich zu Handelsprodukten der sauren Protease
(hergestellt aus Schimmelpilzen) höhere proteolytische Aktivität; dies wird in der
folgenden Tabelle gezeigt für den Fall; daß das Reaktions-pH 1,5 und die Reaktionstemperatur
55°C beträgt, und weiter für den Fall, daß Weizenkleber als Substrat dient.
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Vergleich der proteolytischen Aktivität des aus dem Stamm ATCC 16513
erzeugten Rohenzyms mit einer handelsüblichen sauren Protease aus Schimmelpilzen
1. Einfluß des Reaktions-pH und der Reaktionstemperatur auf die proteolytische Aktivität
| Reak- Reaktions- |
| Enzym tions- temperatur |
| PH 30°C I 55°C |
| ATCC 16513 . . ... . . . . : . . . . 1,5 0,505 0,740 |
| Rohenzym ............... 2,6 0,580 0,695 |
| Handelsübliches-Enzym_.. 1,5. 0,115 0 |
| 2,6 0,470 0,365 |
a) Die Veränderung der optischen Dichte wird nach einer Reaktionszeit
von 30 Minuten mit 10/, Hämoglobin als Substrat mit dem colorimetrischen Verfahren
nach F o 1 i n gemessen.
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b) Die Enzymlösungen werden in einer Konzentration von 0,5 mg/ml bei
pH 1,5 und 0,1 mg/ml bei pH 2,6 verwendet.
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z. Beziehung zwischen Substrat und proteolytischer Aktivität
| Reak- Substrate |
| Enzym tions- Milch- Gluten |
| PH casein |
| ATCC 16513 . . . . . . . . . . . . . . 1,5 0,395 0,370 |
| Rohenzym ............... 2,6 0,570 0,610 |
| Handelsübliches Enzym . . 1,5 0 0 |
| 2,6 0,485 0,405 |
a) Die Veränderung der optischen Dichte wird nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten
bei 37°C mit 10/, Substrat mit dem colorimetrischen Verfahren nach F o 1 i n gemessen.
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b) Die Enzymlösung wird in einer Konzentration von 1 mg/ml bei pH
1,5 und 0,25 mg/ml bei pH 2,6 verwendet.
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Die Hauptfraktionen 50-1I, 50-1V und 75-I mit einer Proteaseaktivität
werden durch Fraktionierung des Rohenzyms mit Sephadex, Ammoniumsulfatfraktionierung
und Chromatographie mit Celluloseaustauscher und Konzentrierung der Fraktionen isoliert
und enthalten saure Proteasen mit pH- und Temperaturoptima, wie sie in den F i g.
3 und 4 angegeben sind.
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In F i g. 3 geben die Kurven A, B und C die Abhängigkeit der
Aktivität der Fraktionen 50-1I, 50-N und 75-I vom pH-Wert wieder, wobei die Enzymlösungen
in einer Konzentration von 0,51 mg/ml, 0,0285 mg/ml und 0,044 mg/ml verwendet werden.
In F i g. 4 zeigen die Kurven A, A' und A" die Abhängigkeit der Aktivität
der Fraktion 50-1I von der Temperatur bei pH 1,5 und einer Enzymkonzentration von
0,51 mg/ml, pH 2,6 und 0,51 mg/ml bzw. pH 2,6 und 0,284 mg/ml. Die Kurven
B und B' sind die Aktivitätskurven der Enzymlösungen der Fraktion
50-1V bei pH 1,5 und einer Konzentration von 0,288 mg/ml bzw. pH 2,6 und 0,0288
mg/ml bei verschiedenen Temperaturen. Die Kurven C und C sind die Aktivitätskurven
der Enzymlösungen der Fraktion 75-I bei pH 1,5 und 0,283 mg/ml bzw. pH 2,6
und 0,0283 mg/ml. Aus den F i g. 3 und 4 ist zu ersehen, daß die Fraktionen 50-1V
und 75-I das gleiche Enzym enthalten, was durch das Muster der Säulenchromatographie
mit Gradienten an Sulfoäthylcellulose bestätigt wird. Das Enzym besitzt ein pH-Optimum
nahe pH 2,6 und ein Temperaturoptimum in diesem sauren Bereich von 55'C; die Aktivität
des Enzyms nimmt bei Temperaturen über 30°C bei einem pH-Wert von 1,5 beträchtlich
ab und geht bei 50°C völlig verloren. Daher entspricht dieses Enzym der bereits
beschriebenen sauren Protease, die von Mikroorganismen synthetisiert wird. Die Fraktion
50-1I dagegen besitzt ein pH-Optimum nahe pH 2,0 und ein Temperaturoptimum, das
bei pH2,6 bei 70°C liegt, wobei die Aktivität siebenmal höher ist als bei 30°C.
(Die Aktivität der Fraktionen 50-IV und 75-I beträgt bei 70°C nur noch ein Viertel
der Aktivität bei 30°C, und die Aktivität ist selbst beim Temperaturoptimum von
55'C nur ungefähr um das 2,5fache erhöht.) Selbst bei pH 1,5 nimmt die Aktivität
bei steigender Temperatur zu, und die proteolytische Aktivität erreicht ein Optimum
bei 60°C; dabei beträgt die Aktivität das 3fache der Aktivität bei 30°C. Die Fraktion
50-1I ist auch im Elektrophoresemuster bei Verwendung der Tiselius-Apparatur deutlich
von den Fraktionen 50-1V (oder 75-I) verschieden. So ist es auch verständlich, daß
das Enzym der Fraktion 50-1I andere charakteristische Eigenschaften besitzt, da
das pH-Optimum weiter im sauren Bereich liegt, die proteolytische Aktivität ein
hohes Temperaturoptimum besitzt und die Proteasenaktivität bei steigender Reaktionstemperatur
beträchtlich zunimmt.
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Der Vergleich der proteolytischen Aktivität des erfindungsgemäß hergestellten
Enzyms mit den aus den USA: Patentschriften bekannten Enzymen bei Milchcasein, pH
1,5 und 55'C während 10 Minuten, ergibt folgendes Bild:
| Enzym Proteolytische |
| Aktivität |
| Erfindungsgemäß hergestelltes |
| Produkt ..................... 35000 E/g |
| Produkt nach USA.-Patentschrift |
| 3063911 .................... - |
| Produkt nach USA.-Patentschrift |
| 3097145 .................... - |
Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität erfolgte nach O g i h a r a - A n s
o n durch Messung der gebildeten Mengen an Tyrosin in Gamma.
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Der Einfluß der Temperatur auf die proteolytische Aktivität bei Milchcasein
(pH 1,5; 10 Minuten) geht aus der F i g. 5 hervor. Aus den Kurven ist ersichtlich,
daß die erfindungsgemäß hergestellte Protease eine andere Protease sein muß und
eine wesentlich höhere Aktivität bei pH 1,5 und Temperaturen oberhalb 50°C besitzt
als die aus der USA.-Patentschrift 3 097145 bekannte Protease. Das aus der USA.-Patentschrift
3 063 911 bekannte Produkt zeigte unter den angewendeten Bedingungen keine Aktivität.
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Das erfindungsgemäß erzeugte Enzym der Fraktion 50-1I wurde bisher
nicht beschrieben und stellt damit eine neue Protease dar. Die Züchtung in submersen
Kulturen kann vorteilhaft als aerobe Kultur bei 30°C durchgeführt werden, wobei
das Kulturmedium als eine geeignete Kohlenstoffquelle z. B. Glucose, lösliche Stärke,
Stärke usw. enthält, als organische Stickstoffquelle z. B. entfettetes Sojabohnenmehl,
Extrakte aus gequollenem Mais (Maisquellwasser) oder Kleie usw., als anorganische
Stickstoffquelle Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat usw. und geeignete
anorganische Substanzen, wie monobasisches Kaliumphosphat, Calciumcarbonat usw.
Für eine besonders günstige Synthese der sauren Protease ist es vorteilhaft, den
Gehalt an entfettetem Sojabohnenmehl über 5 °/o zu erhöhen, ebenso eine Erhöhung
des Gehaltes an Extrakt aus gequollenem Mais und Ammoniumphosphat, um das N : C-Verhältnis
des Mediums zu erhöhen; desgleichen ist es ratsam, die Belüftung der Kulturen zu
steigern und die Temperatur der Kultur über 30°C zu halten. Um eine gute Proteaseausbeute
zu
erhalten, kann der Stamm ATCC 16513 als feste Kultur bei Verwendung von Kleie, entfettetem
Sojabohnenmehl, Reisschalen und ähnlichen Stoffen oder als flüssig-feste Zweistufenkultur
gezüchtet werden. Das flüssig-feste Zweistufenverfahren erfordert eine vorhergehende
Züchtung des Stammes in einer submersen Kultur, dann werden Kleie, entfettetes Sojabohnenmehl,
Reishülsen und ähnliche Substanzen der Kulturbrühe zugegeben, in der das Enzym noch
nicht in größeren Mengen gebildet, jedoch das Mycelwachstum sehr gut ist, anschließend
werden die Feststoffe isoliert und die weitere Züchtung wie bei Festkulturen durchgeführt.
Auch in diesem Fall ist es vorteilhaft, den Anteil an entfettetem Sojabohnenmehl
zu erhöhen.
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Die Extraktion und Reinigung des Enzyms erfolgt bei einer submersen
Kulturbrühe als Ausgangsprodukt nach dem vorher erwähnten Verfahren. Wenn man jedoch
von dem Extrakt einer Festkultur oder flüssig-festen Zweistufenkultur ausgeht, wird
das direkte Fällungsverfahren mit organischen Lösungsmitteln oder Salzen verwendet:
Auch das Konzentrierungsverfahren mit Ionenaustauschern und Sprühtrocknung usw.
kann vorteilhaft verwendet werden.
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Die Aktivität der sauren Protease kann nach folgendem Verfahren gemessen
werden: I. Reagentien 1. n/10-Walpole-Acetatpufferlösung, pH 2,6, 2. 0,6%ige Caseinlösung.
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In einen 300-ml-Erlenmeyerkolben werden 0,65 g Casein (nach Hammersten,
Merck) und 90 ml einer Milchsäurelösung (90 ml destilliertes Wasser + 0,7 ml einer
75%igen Milchsäurelösung) gegeben und auf dem kochenden Wasserbad zur Lösung gebracht.
Nach dem Abkühlen wird das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.
Der pH-Wert der Lösung beträgt 2,7 und wird mit n-HCl (ungefähr 3 Tropfen) auf pH
2,6 eingestellt.
| 3. Enteiweißungsreagenz, |
| Trichloressigsäure, 1/3molar Lösung |
| Natriumacetat, 2/3molar mischen |
| Essigsäure, lmolar |
4. 0,55 m Natriumcarbonatlösung, 5. Folin-Reagenz.
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Phenolreagenz von Daiichi Chemicals Co., Ltd.; als Folin-Reagenz wird
die Lösung mit destilliertem Wasser auf das 3fache verdünnt.
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II. Durchführung Enzymlösung Die Proben werden zur Herstellung der
Enzymlösung mit n/10-Walpole-Acetatpufferlösung auf die gewünschte Konzentration
gebracht.
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2. Reaktion 1 ml Enzymlösung wird in ein Teströhrchen (18 - 1,6 cm)
gegeben und in einem Wasserbad von 30°C temperiert; dazu werden 5 ml der im Wasserbad
auf 30°C vorgewärmten Caseinlösung pipettiert. Nach genau 10 Minuten werden zum
Abstoppen der Reaktion 5 ml der Enteiweißungslösung zugegeben. Der Leerwert wird
in der Reihenfolge Enzymlösung, Enteiweißungsreagenz und Caseinlösung angesetzt.
Der Meßwert bleibt im Wasserbad von 30°C etwa 30 Minuten stehen. Nach vollständiger
Ausfällung des Proteins wird der Ansatz über ein Filter (Toyo Filterpapier Nr. 131,
Durchmesser 11 cm, Trichterdurchmesser 5 cm) in ein neues Teströhrchen filtriert.
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3. Farbentwicklung In einem Teströhrchen werden 2 ml des Filtrates
mit 5 ml der 0,55molaren Natriumcarbonatlösung und 1 ml Folin-Reagenz (1: 3 verdünnt)
gemischt und sofort geschüttelt. Nach einer Inkubation im Wasserbad bei
30'C werden 3 ml der Farblösung in eine Küvette gegeben. Die optische Dichte
wird bei 660 m#t im Spektrophotometer gemessen.
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4. Berechnung der Aktivität Eine Einheit (E) der proteolytischen Aktivität
des Enzyms ist die Enzymmenge, die eine Farbintensität erzeugt, die 1 y gebildetem
Tyrosin in 1 ml Reaktionslösung pro Minute entspricht. Diese wird an Hand einer
mit der colorimetrischen Methode nach F o 1, i n mit Tyrosin aufgestellten Eichkurve
ermittelt. Die proteolytische Aktivität pro Milliliter der Enzymlösung wird aus
dem Produkt von Extinktionsänderung mit dem Faktor 69,30 berechnet.
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Die Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
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Beispiel 1 Aspergillus niger var. macrosporus ATCC 16513 wird von
einer Kartoffelstärke-Zucker-Schrägagarkultur mit einer Osenfüllung auf 30 ml einer
Flüssigkultur überimpft, die 2 % Glucose, 10/, lösliche Stärke, 4% Maisquellwasser,
0,2% Ammoniumsulfat, 0,20/0 K,HP04 und 0,5% CaC03 enthält und in einer konischen
100-ml-Kulturflasche sterilisiert wurde. Die Züchtung erfolgt unter submersen Bedingungen
24 Stunden bei 28°C. 0,5 ml dieser Keimkultur werden auf 30 ml einer Flüssigkultur
überimpft, die 2% lösliche Stärke, 1% Maisquellwasser, 6 % entfettetes Sojabohnenmehl,
0,1% K2H'04 und 0,5% CaC03 enthält und in einer konischen 100-ml-Kulturflasche sterilisiert
wurde. Nach einer Inkubation von 7 Tagen bei 33'C werden 903 Einheiten saure Protease
pro Milliliter gebildet.
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Beispiel 2 Eine Ösenfüllung ATCC 16513 aus einer Schräg= ugarkultur
von Beispiel 1 wird auf eine Mischung von 1,5 g Kleie, 1,5 g entfettetem Sojabohnenmehl,
0,5 g Reisschalen und 3 ml Wasser, die in einer konischen 100-ml-Kulturflasche sterilisiert
wurde, überimpft und 4 Tage bei 28'C als Festkultur inkubiert. Die Festkultur wird
bei 15°C über Nacht mit 30 ml Wasser und 3 ml Toluol extrahiert. Die Aktivitätsbestimmung
der sauren Protease ergab 900 E/ml.
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Beispiel 3 0,5m1 der Keimkultur von Beispiel l werden auf 30 ml Medium
einer Flüssigkultur mit 20/0 löslicher Stärke, 2 % Kleie, 1% Maisquellwasser, 3
0/0 löslichem )@flanzenprotein, 0,10/0 K,HP04 und 0,5 0% CaCO3, das in einer konischen
100-ml-Kulturflasche sterilisiert wurde, überimpft und als submerse Kultur 24 Stunden
bei 28'C inkubiert. Zu diesem Kulturansatz werden 3 g entfettetes Sojabohnenmehl
und 0,5 g Reisschalen, die vorher sterilisiert wurden, zugegeben, gut durchgemischt
und
unter sterilen Bedingungen auf einer Nutsche filtriert. Der feste Rückstand wird
in eine durch Trockenhitze sterilisierte Petrischale von 9 cm Durchmesser gegeben
und die Züchtung dieser Festkultur 2 Tage bei 28°C fortgesetzt. Der Kulturansatz
wird sodann in drei gleiche Teile aufgeteilt. Ein Teil wird mit 10 ml Wasser und
1 ml Toluol versetzt und über Nacht bei 28'C extrahiert. Der Gehalt an saurer Protease
in diesem Extrakt beträgt 830 E/ml. Dieses Verfahren wird als flüssig-festes Zweistufenverfahren
bezeichnet. Beispiel 4 ATCC 16513 wird auf einen Fermenter überimpft, der 501 des
im Beispiel l angegebenen Keimkulturmediums enthält, und 24 Stunden bei 33'C als
Submerskultur gezüchtet. Diese Kultur wird auf 8001 eines Mediums übertragen, das
zusammen mit einem geeigneten Antischaummittel 10/, Weizenstärke, 1 °/o Maisquellwasser,
6 °/o entfettetes Sojabohnenmehl, 0,33 °/o Ammoniumphosphat, 0,10/, KZHP04 und
10/, CaCO3 enthält, und 164 Stunden bei 33'C inkubiert. Der Kulturansatz
(mit einem Endvolumen von etwa 6501) mit 1095 Einheiten saurer Protease pro Milliliter
wird auf einer Filterpresse abgepreßt. Das Filtrat beträgt zusammen mit 4701 Waschwasser
7701 und wird durch Gefriertrocknung konzentriert und mit Ammoniumsulfat auf 0,30/,Sättigung
gebracht. Der gebildete Niederschlag wird entfernt und die Konzentration an Ammoniumsulfat
im Überstand auf 0,7 °/o Sättigung erhöht. Der dabei auftretende Niederschlag wird
isoliert, entsalzt und sprühgetrocknet. Auf diese Weise erhält man 341 g eines Rohenzympräparates
mit ungefähr 275 000 E/g.
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40 g des Rohemzyms werden mit ungefähr 400 g Sephadex G-75 behandelt,
um die Fraktionen mit proteolytischer Aktivität zu konzentrieren. Das Konzentrat
wird in zwei Teile geteilt, von denen ein Teil mit Ammoniumsulfat auf eine Sättigung
von 5001,
der andere Teil auf 75 °/o Sättigung gebracht wird (im Überstand
des Ansatzes mit 75 % Sättigung ist keine Proteaseaktivität mehr enthalten).
Die jeweiligen Fällungen werden in einem kleinen Volumen Pufferlösung aufgenommen
und gefriergetrocknet. Man erhält 9 g einer Enzymfraktion mit 243 000 E/g bzw. 16,5
g einer Enzymfraktion mit 342 000 E/g. Je 5 g dieser Fraktionen werden über 100
g Sephadex G-25 entsalzt und einer Gradientenchromatogiaphie mit 30 g Sulfoäthylcellulose
unterworfen; die Elution erfolgt mit einer Pufferlösung nach M c 11 v a i
n e bei pH 2,6 bis 7,2. Ausgehend von der Fällung bei 50 °/o Sättigung mit Ammoniumsulfat
erhält man zwei Hauptfraktionen (diese sind mit den obenerwähnten Fraktionen 50-1I
und 50-1V identisch) und aus der Fällung mit 75 °/o Sättigung an Ammoniumsulfat
nur eine Hauptfraktion (diese entspricht der obenerwähnten Fraktion 75-I). Diese
Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält so folgende Enzymfraktionen: 450
mg mit ungefähr 37 000 E/g (die entsprechende Aktivität bei pH 1,5 beträgt 44 000
E/g), 280 mg mit ungefähr 848 000 E/g (die Aktivität bei pH 1,5 beträgt 384 000
E/g) bzw. 355 mg mit ungefähr 960 000 E/g (und einer Aktivität bei pH 1,5 von 295
000 E/g).
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Mehrere Eigenschaften des Rohenzyms und der drei gereinigten Enzymfraktionen
wurden bereits erwähnt. Die Fraktion 50-1I enthält das bisher noch nicht beschriebene
Enzym.