DE2528490C2 - Verfahren zur Herstellung saurer Protease - Google Patents
Verfahren zur Herstellung saurer ProteaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene Verfahren.
Es ist allgemein bekannt und Gegenstand vieler industrieller Herstellungsverfahren, proteolytische Enzyme
mit saurem pH-Wirkungsbereich durch Züchtung von Mikroorganismen verschiedener Gattungen, z. B.
Stämmen der Gattung Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Paecilomyces, Penicillium. Rhizopus und Trametes
zu gewinnen. Diese Proteasen besitzen eine optimale Wirkung bei einem allgemein als »pH-Optimum«
bezeichneten pH-Wert, ihre Aktivität fällt jedoch beiderseits dieses pH-Wertes rasch ab. Ein sinnvoller
Einsatz dieser Proteasen setzt daher eine Kenntnis des bei der Anwendung herrschenden pH-Wertes voraus,
die nicht immer gegeben ist. Zudem ist man gezwungen, jeweils eine für den vorliegenden pH-Wert geeignete
Protease auszusuchen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine saure Protease mit breitem pH-Wirkungsbereich und
hoher enzymatischer Aktivität aufzufinden. Diese Eigenschaft ist besonders nützlich bei einem Einsatz
dieser Protease in der Nahrungsmittel- und Tierfuttermittel-lndustrie,
da gerade hier mit pH-Schwankungen in jeweils unbekannter Größe gerechnet werden muß.
Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung einer sauren Protease durch aerobes
Züchten eines Stammes der Gattung Rhizopus in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und
Stickstoffquellen enthält, bei pH-Werten zwischen 3 und 7 und Temperaturen zwischen 25 und 5O0C, und
Abtrennen der sauren Protease nach üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm der
Gattung Rhizopus den Stamm Rhizopus rhizopodiformis CBS 227.75 einsetzt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm der auf Rhizopus rhizopodiformis wurde mit der
Hinterlcgungsnummer CBS 227.75 im Centraal Bureau voor Schiminelcuitures, Baarn (Nederland). am 23. 3.
1975 deponiert.
Dieser Stamm wurde unter spezifischen Anreicherungsbedingungen bei pH-Werten zwischen 3 und 5 und
mit Proteinen wie Casein oder Gelatine als C- und N-Quelle aus Erdproben isoliert. Er wurde im Centraal
Bureau voor Schiminelcuitures, Baarn (Nederland), klassifiziert.
Das Verfahren zur Herstellung der Protease kann in einem flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt
werden, wobei das flüssige Nährmedium im allgemeinen bevorzugt wird. Bei Züchtung in einer Nährlösung wird
nach dem üblichen aeroben Schüttel-Kultur- oder Fermentationsverfahren gearbeitet.
Der erfindungsgemäß zu verwendende Nährboden wird in üblicher Weise hergestellt und soll eine
Kohlenstoffqueüe, eine Stickstoffquelle und andere von dem Mikroorganismus benötigte Nähr- und Wuchsstof-
; fe enthalten. Als geeignete Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glukose, Fruktose, Maltose
und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen. Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, Harnstoff,
Casein, Gelatine, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl
ίο bzw. -kuchen in Frage. Weiterhin können anorganische
Salze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammoniumhydrogenphosphate.
Calcium- und Magnesiumsalze, dem Nährboden zugesetzt werden. Ferner kann es vorteilhaft sein, Wuchsstoffe, wie z. B. Hefeextrakt und
ι ϊ Vitamine, dem Nährboden zuzusetzen.
Die Fermentationstemperatur bewegt sich zwischen 25° C und 5O0C, ist aber vorzugsweise zwischen 27 bis
32°C zu wählen. Der pH-Wert des Nährbodens liegt zwischen 3 und 7, vorzugsweise beträgt er 4,0 bis 6,0. Die
>o Züchtung wird im allgemeinen in einer Zeit von 20 bis 96
Stunden durchgeführt.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease kann aus der filtrierten oder zentrifugierten
Nährlösung nach üblichen Methoden durch
1-5 Zusatz organischer Lösungsmittel oder durch Aussalzen
mit z. B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Calciumchlorid ausgefällt und konzentriert
werden. Eine Reinigung läßt sich durch Dialyse-Verfahren oder durch Behandlung an Ioner.austauscherharzen
in bewerkstelligen.
Die erfindungsgemäß hergestellte Protease besitzt ein besonders breites Wirkungsspektrum im schwach
sauren Bereich zwischen pH 2,5 bis 6,5. Das Wirkungs-Optimum liegt bei pH 4,5, der Bereich der 80%igen
j5 Maximalaktivität bei pH 3,3 bis 5,9, der Bereich der
60%igen Maximalaktivität bei pH 3,0 bis 6,4. Die Protease eignet sich in besonderem Maße als Zusatzstoff
für Ί ierfuttermittel, insbesondere zur Verbesserung der Ergebnisse bei der Aufzucht und Mast von
Geflügel, Schweinen, Kälbern und Nutzfischen. Sie kann jedoch darüber hinaus auch für andere Einsatzzwecke,
bei denen saure Proteasen verwendet werden können, angewendet werden, wie z. B. in Lebensmittel verarbeitenden
Betrieben, in sauren Wasch- und Reinigungsmit-
4ϊ teln, insbesondere Reinigungsmitteln für Kacheln,
Fußböden und Tische, in Krankenhäusern und im Haushalt, als Lederhilfsmittel in der Gerberei, ferner in
hoch gereinigter Form im medizinischen Anwendungsbereich als Digestivum.
ίο Die Feststellung der proteolytischen Aktivität der
erfindungsgemäß erhältlichen Protease erfolgte nach dem bekannten Prinzip der Bestimmung nach Anson:
eine geeignet verdünnte Menge Enzymlösung wird bei 40°C 20 Minuten mit einem gleichen Volumen einer
l,2%igen Caseinlösung inkubiert, wobei diese 0,6% Milchsäure, 6 Mol Harnstoff und 0,1 Mol Zitronen- oder
Essigsäure enthält. Der pH-Wert der Caseinlösung wird durch Zusatz von 2 N Natronlauge auf 4,5 eingestellt.
Nach der Inkubation wird im Volumenverhältnis 1 : 1
to mit 0,4 N Trichloressigsäure versetzt, der sich bildende Niederschlag von unverdautem Casein abfiltriert und im
Filtrat die beim Abbau entstandenen Protein-Spaltstükke nach einer beliebigen Eiweißbestimmungsmethode
ermittelt. Geeignet hierfür ist z. B. das von Layne in
b5 Methods of Enzymology 3 (1957) Seiten 448 ff.
beschriebene Verfahren.
Für jede Meßprobe muß ein Blindwert angefertigt werden, bei dem zuerst Trichloressigsäure und dann
Caseinlosung zugesetzt werden. Dieser Blindwert gibt neben dem Reagenzien-Leerwert den Anteil an
niedermolekularen Peptiden an, der bereits vor der Verdauung in der Enzymlösung vorhanden ist Die
Differenz zwischen Haupt- und Blindwert wird bei der angegebenen Methode dann mit der Extinktion
verglichen, die eine bestimmte Menge Tyrosin bei dieser Bestimmung liefert Diese Menge Tyrosin ist dann ein
Maß für die proteolytische Aktivität des vorliegenden Enzyms: eine Enzymeinheit (TU) ist diejenige Menge
Enzym, die den gleichen Extinktionsunterschied zwischen Haupt- und Blindwert pro Minute verursacht wie
eine 1-M-Tyrosinlösung, die anstatt der Enzymlösung eingesetzt wird.
Die Messung der proteolytischen Aktivität bei höheren und tieferen pH-Werten als 4,5 ist durch
passende Einstellung der Caseinlosung ohne weiteres möglich, wobei man jedoch den Essigsäurezusatz
günstigerweise durch Zitronensäure ei setzt.
Zur Bereitung des Nährmediums werden in 1 1 Wasser 3 g Sojamehl, 3 g Maisquellwasser, 15 g Casein,
7 g Gelatine, 2,4 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 · 7 H2O, 0,1 g
MnCl2 · 4 H2O1O1I g CaCl2 ■ 2 H2O und 20 g Maisstärke
gelöst bzw. dispergiert. Der pH-Wert der Nährlösung betrug 5,3. Die Maisstärke wurde mittels Amylase
weitestgehend abgebaut. In die sterilisierte Nährlösung wurden Sporen des Stammes Rhizopus rhizopodiformis
CBS 227.75 eingeimpft und die Kultur unter optimaler Belüftung bei 300C etwa 50 Stunden gezüchtet. Nach
dieser Zeit wurde das Pilzmycel abfiltriert und die mycelfreie Kulturbrühe zur Bestimmung der Proteaseaktivität
gemäß vorgenanntem Verfahren verwendet. Dabei ergab sich, daß die Kulturlösung enzymatische
Aktivität bis zu 18 m TU/ml erreichte.
Zur Bereitung des Nährmediums wurden in 1 1 Leitungswasser 10 g Sojamehl (entölt), 5 g Maisquellwasser,
12 g Casein, 5 g Gelatine, 5 g Getreidetrockenschlempe,
2,4 g KH2PO4, 1 g NaNO3, 1 g NH4Cl, 0,01 g
FeSO4 und 30 g native Maisstärke gelöst bzw. dispergiert.
Der pH-Wert der Nährlösung wurde nach dem Autoklavieren auf 5,3 eingestellt. Ein mit dieser
Nährlösung angesetzter 10-Liter-Fermenter wurde mit 100 ml einer Czapek-Dox-Vorkultur (mit 5% Stärke und
0,5% Hefeextrakt) versetzt, die mit Sporen des Pilzstammes Rhizopus rhizopodiformis CBS 227.75
beimpft und 24 Stunden bei 3O0C geschüttelt worden war, unter Belüftung bei 30°C etwa 50 Stunden
betrieben, bis der pH-Wert auf 6,8 bis 7,0 angestiegen war. Danach wurde das Mycel abfiltriert und die klare
Kulturbrühe zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäß vorgenanntem Verfahren verwendet Dabei
ergab sich, daß die Kulturlösung eine enzymatische Aktivität bis zu 20 m TU/ml erreichte.
Die Protease wurde isoliert durch Klarfiltration der ι Brühe unter Zusatz von 5 g Filter CeI und 5 g Standard
Super CeI, Einengen bei 50 Torr auf ein Drittel des Ausgangsvolumens und Ausfällen unter Zusatz von 39%
wasserfreiem Natriumsulfat unter Rühren, wobei die Temperatur auf 38-40°C gebracht wurde. Alternativ
kann die Protease aber auch durch Zutropfen von 2 Volumina Äthanol, Methanol, Aceton oder anderer
wassermischbarer Lösungsmittel bei einer Temperatur von -3 bis 5°C ausgefällt werden. Der Niederschlag
wurde abgesaugt und im Vakuum getrocknet.
Unter Anwendung des vorstehend geschilderten Bestimmungsverfahrens wurde die Aktivität der nach
Beispiel 1 und 2 isolierten Protease in Abhängigkeit vom pH-Wert ermittelt. In der Tabelle sind die pH-Werte
aufgeführt, bei denen die optimale bzw. 50% der beim optimalen pH-Wert gemessenen Aktivität vorliegen.
Wie die ebenfalls in dieser Tabelle enthaltenen Werte für literaturbekannte, saure Proteasen erkennen lassen,
besitzt die aufgefundene Protease einen breiteren und für die genannten Anwendungsgebiete günstigeren
Wirkungsbereich — ausgedrückt in pH-Einheiten — als die bekannten Enzyme.
| j-) Tabelle | pH-Optimum | 50%-Werte |
| Enzym | 2,5-3,0 | 1,5-4,0 |
| ,„ Takamine® | ||
| acid fungal protease | 3,0 | 1,5-4,5 |
| Denapsin® | 2,5 | 1,5-4,0 |
| Aspergillus acid protease | 2,0-3,0 | 1,5-4,5 |
| Proctase® | 2,5 | 2,0-4,5 |
| Samprose® | 4,0-4,5 | 2,5-6,5 |
| Protease aus Rhizopus | ||
| rhizopodiformis CBS 227,75 | ||
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung einer sauren Protease durch aerobes Züchten eines Stammes der Gattung Rhizopus in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, bei pH-Werten zwischen 3 und 7 und Temperaturen zwischen 25 und 50° C, und Abtrennen der sauren Protease nach üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm der Gattung Rhizopus den Stamm Rhizopus rhizopodiformis CBS 227.75 einsetzt.
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