DE2123707C3

DE2123707C3 - Verfahren zur Herstellung einer eßbaren, Protein enthaltenden Substanz

Info

Publication number: DE2123707C3
Application number: DE2123707A
Authority: DE
Inventors: Gerald William Chinnor Oxford Scammell
Original assignee: RANKS HOVIS MCDOUGALL Ltd LONDON GB
Current assignee: RANKS HOVIS MCDOUGALL Ltd LONDON GB
Priority date: 1970-05-14
Filing date: 1971-05-13
Publication date: 1982-10-14
Also published as: CA988445A; OA03719A; RO85120A; NL168266C; NL7106649A; NL168266B; IL36848A; PL77194B1; TR18665A; DE2123707B2; BG25524A3; FR2095004A5; RO85120B; AR199545A1; ES391093A1; IE35176L; IT1027006B; LU63157A1; CH528592A; IL36848A0

Description

lieber Hinsicht zu wünschen übrig, und zwar auch dann, wenn man von einer Gattung Fusarium ausgeht, welche in der US-PS neben mehr als 100 anderen Gattungen als Ausgangsstoff vorgeschlagen wird.

Um mit Hilfe des aus der US-PS 31 51 038 bekannten Verfahrens ein qualitativ hochwertiges Protein herzustellen, wird vorgeschlagen, den Anteil an Zink drastisch zu erhöhen. Dies aber macht das Enderzeugnis als Nahrungsmittel ungeeignet

In diesem Zusammenhang sei ferner ein Referat von I m h ο 11 e und Schramm erwähnt, das sich mit der Herstellung von Fusarium graminearum befaßt und im »Journal of Pharmaceutical Sciences«, Band 57, Nr. 1 (Januar 1968), Seiten 97 bis 100 beschrieben ist Das bekannte Verfahren scheint dem erfindungsgemäßen Verfahren bei oberflächlicher Betrachtung ähnlich zu sein. Bei eingehender Untersuchung wird jedoch klar, daß das in dem Referat beschriebene Kulturmedium keine optimalen Eigenschaften zur Herstellung eines qualitativ hochwertigen Proteinerzeugnisses besitzt und daß das Wachstum der Kultur genau wie bei dem Verfahren nach der weiter oben erwähnten US-PS 31 51 038 nicht durch den zur Verfügung stehenden Kohlenstoff begrenzt wird.

In einem Kulturmedium mit optimalen Eigenschaften verläuft die Wachstumskurve logarithmisch. Die Wachstumskurve in Fig.3 auf Seite 99 des Referats verläuft dagegen im wesentlichen geradlinig, was offenbar auf das Fehlen von Biotin als ein die Wachstumsgeschwindigkeit erhöhendes Vitamin zurückgeht

Hinsichtlich der Wachstumsbegrenzung durch Kohlenstoff heißt es im ersten Absatz, rechte Spalte, auf Seite 98 des Referats, das maximale Wachstumsgewicht werde erreicht, bevor der in Form von Glukose vorhandene Kohlenstoff abgebaut ist und dies wiederum sei ein Zeichen dafür, daß Glukose das Wachstum der Kultur nicht begrenzt

Im Gegensatz dazu bildet gemäß Erfindung Kohlenstoff in Form assimilierbarer Kohlehydrate das Grenzsubstrat bei der Vermehrung der Mikroorganismen, wobei, ausgehend von einem nichttoxischen Stamm der Gattung Fusarium, eine qualitativ hochwertige, eßbares Protein enthaltene Substanz mit einem hohen Netto-

Protein-Ausnutzungswert entsteht

Der aus dem Kulturmedium abgetrennte, eßbares Protein enthaltende Organismus läßt sich in Nahrungsmittel für den menschlichen oder tierischen Verbrauch einarbeiten.

Das in der Brutstufe verwendete, das Wachstum des Mikroorganismus begrenzende Substrat kann pflanzlichen Ursprungs sein, wie beispielsweise Stärke, Stärke enthaltende Stoffe oder Hydrosyseprodukte davon. Saccharose, Saccharose enthaltende Stoffe oder hydrolisierte Saccharose, z. B. Invertzucker oder Mischungen davon. Bei dem Substrat kann es sich ferner um hydroliserte Kartoffelprodukte, Melasse, Glukose, Maltose, hydrolisierte Bohnenstärke oder Cassava handeln. Alternativ lassen sich auch Substrate tierischen Ursprungs verwenden, die Molke enthalten.

Die nichttoxische Fusarium-Art kann vorzugsweise eine Fusarium-graminearum-Art sein.

Der bevorzugte Stamm ist der Fusarium-graminearum-Schwabe-Stamm, der beim Commonwealth Mycological Institute hinterlegt und unter der Nummer Ι.Μ.Ϊ. 145.425 eingetragen ist, oder Varianten und Mutanten von diesem Stamm.

Es lassen sich ebenfalls neue Mutanten verwenden:

1-7, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer I.M.I. 154.209;

1-8, hinter'egi beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer I.M.I. 154.211;

1-9, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer I.M.I. 154.212;

1-15, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer I.M.I. 154.213;

1-16, hinterlegt beim Commonwealth Mycological Institute und eingetragen unter der Nummer I.M.I. 154.210.

Die neue Fusarium-graminearum-Schwabe-Art I.M.I. 145.425, ist nichtpathogen bezüglich Weizen. Sie hat folgende morphologische Charakteristika:

Nährmedium

Wachstumsbedingungen

Wachstumsgeschwindigkeit

Wachstumscharakter

Kartoffel-Saccharose-Agar

Czapek-Dox
(modifiziert)
Agar (Oxoid)

250 Gramm gewaschene und in Stücke geschnittene Kartoffeln werden 15 Minuten lang bei einem Druck von 1,05 atü in ein Druck-Kochgerät gegeben. Der Absud wird dann durch zwei Schichten Musselin gedrückt. Dem trüben Filtrat werden 2% Saccharose und 2% Agar zugesetzt, und das Medium wird dann im Autoklav behandelt und dispergiert

mehrere Wochen bei 25⁰C
4,0 cm in 3 Tagen

Flockige, sich ausbreitende Kolonien mit weißem Luftmycel. Substrat auf Kartoffel-Saccharose-Agar (KSa) gräulichrosa mit karmesinroten bis gelben Flecken. Auf Czapek-Dox-Agar (CDA) besteht die Neigung zu einer etwas blasseren Farbgebung. Gelegentlich wird ein tiefrotes Pigment erzeugt, insbesondere bei der Alterung. Nach ein bis zwei Wochen hat das Luftmycel die Neigung, braun zu werden und zusammenzufallen. Die Kolonie wird dann ziemlich schleimig bzw. schlammartig, wenn Sporodochien gebildet werden, wobei die Farbe auf KSa pink bis braun und auf CDA lachsrosa ist.

3,0 cm in 3 Tagen

Fortsetzung	5	21	23 707	6	I	Czapek-Dox (modifiziert) Agar (Oxoid)
Nährmedium	Kartoffel-Saccharose-Agar
Wachstums charakter	Es bildet sic'i kein Exsudat, Mycelfarbe zu folgen	und	die Pigmentbildung	neigt dazu, der

Konidien Von diesem Organismus werden Mikrokonidien nicht erzeugt Makro-

konidien werden von einzelnen seitlichen Zweigen bzw P^v'. .. :n oder vielverzweigten Konidienträgern mit kurzen Phialiden pzw. Zweigen gebildet In ältersn Kulturen vereinigen sich die Konidienträger zur Bildung von Sporodochien, insbesondere auf CDA. Die Konidien variieren von sichelförmiger Gestalt zu einer gekrümmten dorsi-ventral dickspindeligen Gestalt, wobei die Septierung von 3 bis 5 variiert, und zwar in jüngeren Kulturen allgemein 5. Die Sporengröße variiert von 25 bis 50 μ χ 25 bis 4,0 μ.

Die Basiszelle ist häufig gestielt, insbesondere bei den längeren 5fach septierten Sporen. Im Mycel treten geschwollene bzw. aufgequollene Zellen auf, wobei unter Umständen auch eingeschoben, einzeln oder in Ketten, Chlamydosporen auftreten können

Die Inkubationstemperatur bei dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt vorzugsweise zwischen 25 und 34° C, insbesondere bei etwa 30⁰C.

Das Impfen, durch das der Prozeß eingeleitet wird, kann mittels einer vorgekeimten Saatstufe erfolgen, wobei 2 bis 10%, insbesondere 5 bis 10% Impfstoff verwendet werden können.

Der pH-Wert des Substratmediums während der Inkubation wird vorzugsweise innerhalb eines ein maximales Wachstum gewährleistenden Bereiches, zwischen 3,5 und 7, gehalten.

Die Wachstumsdauer beim absatzweisen Betrieb der Kulturen, und zwar unter Berücksichtigung der obenerwähnten Bedingungen, liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 48 Stunden.

Sowohl bei absatzweise arbeitenden als auch bei kontinuierlichen Prozessen sollte belüftet und umgerührt werden, um eine ausreichende Versorgung mit gelöstem Sauerstoff zu gewährleisten und keinen Sauerstoffmangel aufkommen zu lassen, der ein wachstumshemmender Faktor sein kann.

In dem Substratmedium werden in der üblichen Weise ausreichende Mengen wesentlicher Wuchsstoffe wie eine Stickstoff-, Schwefel-, Phosphor-Quelle und andere Spurenelemente aufrechterhalten, so daß das Wachstum des Organismus nur durch die für den Fusarium verfügbaren Kohlehydrate begrenzt wird.

Zusätzlich zu den obengenannten Nährstoffen kann auch das Vorhandensein eines oder mehrerer Vitamine wie beispielsweise Biotin wünschenswert bzw. vorteilhaft sein, um eine maximale Wachstumspeschwindigkeit zu erhalten.

Es ist auch wünschenswert bzw. vorteilhaft, dem Substratmedium ein nichttoxisches Antischaummittel zuzusetzen, um die Schaumbildung während der Fermentation zu regeln.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Substanz kann in der üblichen Weise isoliert werden. So kann das resultierende Mycel durch Fällung, Waschen, Filtern und Trocknen gewonnen werden. In diesem Zusammenhang wurde jedoch herausgefunden, daß, wenn der Feuchtigkeitsgehalt der Substanz durch Filtern unter Druck unter einen kritischen Wert von etwa 50% (w/w) (Gewicht in Gewichtskonzentration) reduziert wird, die folgenden Trocknungsverfahren nicht innerhalb scharfer Temperaturgrenzen durchgeführt werden müssen, was für die Wirtschaftlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ein wesentlicher Faktor ist. Die Trocknungsmethode muß nicht eine Beeinträchtigung des Nährwertes des Mycels zur Folge haben, und die Trocknung kann in einem Luftstrom von 75° C oder als Gefriertrocknung durchgeführt werden.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Pilzmycel hat eine sehr gute Wasserbindungskapazität und läßt sich in vorteilhafter Weise als Eindickungs- und Geliermittel verwenden. Da es sich nicht um ein Isolat handelt, behält es seine Vitamine ebenso wie zu Ernährungszwecken geeignete Stoffe wie Lipoide und einige Kohlehydrate. Das Pilzmycel hat hervorragende Backeigenschaften, die bei der Herstellung von mit Protein angereichertem Brot, Frühstücksnahrung und Imbissen von besonderem Wert sind. Das Pilzmycel kann infolge seiner faserigen bzw. fadenförmigen Struktur gebacken oder gebraten werden, oder es kann bei der Herstellung von unter Verwendung von Treibmitteln hergestellten Backwaren benutzt werden und der Bevölkerung in vielfältiger Weise als Nahrungsmittel zugeteilt weiden, das in seinem Aussehen und in seiner Eignung den Nahrungsmitteln vergleichbar ist, an die die jeweiligen Bevölkerungskreise gewöhnt sind.
Es folgt nunmehr in beispielhafter Weise eine

so Beschreibung von Methoden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei den Beispielen 1 bis 4 handelt es sich um absatzweise arbeitende Kulturen.

Beispiel 1

10 Liter des im folgenden angegebenen Kultur- bzw. Nährmediums wurden in der beschriebenen Weise in einem mit einem Rührwerk versehenen Fermenter-Behälter präpariert und sterilisiert

Rohrzuckermelasse entsprechend 6% w/v Zucker

Ammoniumsulfat 1,2%

NaH₂PO₄ · 0,25%

30 min sterilisiert 1,05 atü

CaCO₃ 0,5% w/v

3 Std. sterilisiert 1,05 atü

(w/v gleich Gewicht je Volumenkonzentration)

Die Mediumkomponenten wurden aseptisch zugesetzt und auf 30° C erwärmt. Ein entweder auf einem Glukose-Maisquellwasser-Medium oder anderen geeigneten Medien hergestellter Impfstoff in einer Menge von 5 bis 10%, bezogen auf das Volumen des Kulturmediums, wurde mit einer Sporensuspension der den neuen Fusarium-graminearum-Schwabe-Stamm I.M.I. 145.425 enthaltenden Organismus-Kultur geimpft und 18 bis 24 Std. bei 30° C in einem rotierenden Schüttelapparat wachsen gelassen und aseptisch dem Fermenter zugesetzt.

Der bei 30° C inkubierte Fermenter wurde dann bei 800 U/min umgerührt, und zwar unter Verwendung einer sechsflügeligen Scheibenturbine (0,5 D) in einem völlig mit Schikanen versehenen Behälter, und 1 v/vm sterile Luft wurde durch den Fermenter geblasen. Nach 35 Std. wurde das gewachsene bzw. gebildete Mycel aus dem Fermenter entnommen, zentrifugiert, mit Wasser gewaschen und bei einer Lufttemperatur von 75° C auf einem Warmluft-Bandtrockner getrocknet

Das getrocknete Produkt hatte die folgende Zusammensetzung:

Gesamt-Stickstoff

Asche

Lipoid

NPUop(= wirksamer

Netto-Protein-

Ausnutzungswert)

8,0%
53%
2,7<"υ

52, basierend
auf dem
Gesamt-Stickstoff

Beispiel 2

10 Liter des folgenden Kultur- bzw. Nährmediums wurden in der beschriebenen Weise in einem 14-Liter-Mikroferm-Fermenter präpariert und sterilisiert.

Endgültig (o/o)

Lösung 1
Lösung 2
Lösung 3

Lösung 4

Lösung 5

sung 6

Glukose

Ammoniumsulfat
Kaliumdihydrogenphosphat
FeSO4 - 7 H2O
MnSOt · 4 H₂O
CuSO4 · 5 H2O
MgSO4 · 7 H2O
Na2MoO4 · 2 H2O
C0CI2 · 6 H2O
CaCh · 2 H2O
NaOH

pH 3,0 3,0

0,7

pH 5,0 1,0

pH

0,001

0,0005

0,0001

0,025

0,0001

0,0015

0,1

Die oben beschriebenen Lösungen wurden unter Hitze 15 min bei 1,05 atü sterilisiert

Lösung 7 Vitamine und/oder Aminosäuren, die in der unten beschriebenen Weise durch Filtrieren sterilisiert wurden

Die Lösungen wurden aseptisch dem Behälter zugesetzt Es wurde ein Impfstoff hergestellt bzw. wachsen gelassen und wie in Beispiel 1 zugesetzt, jedoch mit der Ausnahme, daß die endgültige Konzentration im Fermenter so eingestellt wurde, daß 0,5 g/l Trockengewicht des Mycels vorlag.

Die Wachstumsbedingungen waren wie folgt: Temperatur 30° C; Belüftung 1 v/vm, die Rührgeschwindigkeit

wurde so eingestellt, daß der Wert des gelösten Sauerstoffes über 25% des Sättigungswertes im Kulturbzw. Nährmedium lag, und zwar gemessen mittels einer Sonde. Als steriles Antischaummittel wurde Polypropylenglykol 2000 in der notwendigen Menge zugesetzt, um die Schaumbildung zu unterdrücken, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von steriler Kaliumhydroxydlösung zwischen 6,0 und 6,3 gehalten.

Wachstumsgeschwindig
keiten

(Std.-')

(i) zu vernachlässigende Lösung 7 sehr langsam (Minimalwert)

(ii) Lösung 7 in der Weise, daß die 0,2

endgültige Konzentration des

Biotins in dem Kulturmedium

50 μ g/l betrug
(iii) Lösung 7 in der Weise, daß die 0,25

endgültige Konzentration des

Biotin 50 μ g/l, des Cholinchlorids

30 mg/1 und des Methionin 300 mg/1

in dem Kulturmedium betrug

Beispiel 3.

Das Medium und die Bedingungen waren wie in Beispiel 2, wobei jedoch die Glukose durch Maltose ersetzt war.

Wachstumsgeschwindig
keiten

(Std-i)

(i) Lösung 7 wie Beispiel 2 (ii) 0,18

(ii) Lösung 7 wie Beispiel 2 (iii) 0,21

Beispiel 4

100 Liter des folgenden Kulturmediums wurden in der beschriebenen Weise in einem aus korrosionsbeständigern Stahl bestehenden 130-Liter-Fermenter präpariert und sterilisiert

	Glukose	Endgültige
	Maisquellwasser	Konzentration
50	(50% Gesamtfeststoff)	(%)
55 Ammoniumsulfat	4,0
Kaliumdihydrogenphosphat
MgSO₄ · 7 H₂O	0,8
ZnSO₄ - 7 H₂O	0,2
FeSO₄ - 7 H₂O	0,2
60 MnSO₄ · 4 H₂O	0,025
0,0005
0,0005
0,0001

Das Medium wurde 30 min lang bei 1,05 atü und einem pH-Wert von 3,0 sterilisiert und bei der Abkühlung auf 30° C durch sterilen Zusatz von Ammoniak auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt

Biotin, das durch Filtrierung sterilisiert wurde, um 40ug/l endgültige Konzentration zu ergeben, wurde aseptisch zugesetzt

Der Behälter wurde mit 10 Liter einer Kultur geimpft, die in einem Aufgußbehälter während einer Zeit von 18 Std. bei 30⁰C auf einem Medium gewachsen war, das folgende Stoffe enthielt: Glukose 2%; Trypton 0,4%; Hefeextrakt 0,1%; Ammoniumsulfat 0,15%; Kaliumdihydrogenphosphat 1%; Natriumhydroxid 0,1%; Magnesiumsulfat 0,025%; Ferrosulfat 0,001%; Zinksulfat 0,001%; Mangansulfat 0,0005%; Kupfersulfat 0,001%; 0,05% Polypropylenglykol 2000 als Antischaummittel, das 45 min lang bei 1,05 atü sterilisiert worden ist, und mit einer Sporensuspension des neuen Fusarium-graminearum-Schwabe-Stamms I.M.I. 145.425 geimpft worden ist.

Die Temperatur beim Wachstum betrug 30⁰C, während die Belüftung so eingestellt war, daß die Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff über 10% des Sättigungswertes für die Kulturbrühe lagen. Steriles Antischaummittel, Polypropylenglykol 2000, wurde zur Unterdrückung der Schaumbildung zugesetzt, und der pH-Wert wurde durch Zusätze von sterilem Ammoniak auf 5,0 gehalten. Mycelproben, die während der Wachstumsdauer entnommen wurden, enthielten auf Trockengewichtsbasis: Gesamtstickstoff 8,0 bis 8,6%; Λ-Amino-Stickstoff 6,4 bis 6,6%. Die Anfangswachstumsgeschwindigkeit in diesem komplexem Medium, das sowohl von dem absatzweise arbeitenden Kulturmedium und dem Impfstoff abgeleitet wurde, betrug etwa 0,3 Std.-¹.

Die folgenden Beispiele 5 und 6 beziehen sich auf kontinuierlich arbeitende Kulturen.

Beispiel 5

Es wurde ein Kulturmedium folgender Zusammensetzung präpariert:

Abschließend,

Lösung 1	3,0
Glukose	0,25
Ammoniumsulfat	0,3
Kaliumdihydrogenphosphat	0,025
Magnesiumsulfat	0,01
Antischaummittel, Polypropylen
glykol 2000
30 min lang bei 1,05 atü und einem
pH-Wert von 3,0 sterilisiert
Lösung 2	0,0005
MnSOi · 4 H2O	0,0005
FeSOi ■ 7 H2O	0.0005
ZnSO4 · 7 H2O	0,0001
C0CI2 · 6 H2O	0,0001
CuSCm · 5 H2O	0,0001
Na₂MoOt · 2 H2O
15 min lang bei 1,05 atü sterilisiert

Lösung 3

In der unten beschriebenen Weise durch Filtrierung

sterilisierte Vitamine und/oder Aminosäure

Sämtliche Lösungen wurden in der notwendigen Weise aseptisch zugesetzt. In einem 8,5-Liter-Chemostat waren die Wachstumsbedingungen wie folgt:
Temperatur 30°C; Belüftung 1 v/vm; 800 U/min mit einer einzigen, sechsflügeligen Scheibenturbine, 0,5 D, in einem völlig mit Schikanen versehenen Behälter. Als Organismus wurde der neue Stamm Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145.425 benutzt. Der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von sterilem Ammoniak bei 5,0 gehalten.

Std.-¹

Ausbeutefaktor Mycel
TN, %

AN,

Basierend
auf

TN AN

(i) Lösung 3 in der Weise, daß die endgültige Biotinkonzentration in dem
Kulturmedium 20 μ g/l betrug

0,17-0,19 0,5

7,2 bis 73 63 bis 6,8 54 65

(ii) Lösung 3 in der Weise, daß die end- 0,20—0,21 gültige Biotinkonzentration in dem
Kulturmedium 20 μ g/l und die
Methioninkonzentration 600 mg/1 betrug

0,5

7,7 bis 8,6 6,1 bis 6,5 59 78

Bern.: TN=Stickstoff gesamt,
AN=Amino-Stickstoff.

Beispiel 6

Es wurde ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung präpariert:

Bohnenstärke	3,0% Kohlehydrat
(behandelt mit «-Amylase)	1^3%
Maisquellwasser	0,25%
Ammoniumsulfat	0,15%
Kaliumdihydrogenphosphat	0,025%
Magnesiumsulfat
Antischaummittel

Polypropylenglykol 2000 (v/w)
30 min lang bei 1,05 atü
und einem pH-Wert von 4,0
sterflisiert

0,025%

Das Medium wurde dem 8,5-Liter-Chemostat unter den gleichen Bedingungen zugeführt wie in Beispiel 5, jedoch mit der Ausnahme, daß der pH-Wert zwischen 3,5 und 6,0 variiert wurde und die Wachstumsgeschwindigkeit während der gnazen Zeit bei 0,1 Std.-¹ lag. Es wurde folgendes Ergebnis erhalten:

TN. % AN, %

NPU, ba- NPU, basierend sierend auf TN auf AN

Produkt, gewachsen bei pH 4,0 7,8 6,6 54 67

Produkt, gewachsen bei pH 5,0 8,6 7,1 57 71

Produkt, gewachsen bei pH 6,0 7,7 5,9 61 80

Bern.: NPU = Netto-Protein-Ausnutzungswert.

Beispiel 6(b)

Das Kulturmedium und die Bedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 6, jedoch mit der Ausnahme, daß der pH-Wert während der ganzen Zeit auf 5,0 gehalten und die Temperatur zwischen 26 und 34° C variiert wurde. Als optimale Temperatur stellte sich der Bereich zwischen 30 und 32° C heraus.

Die Beispiele 7 bis 11 beschreiben die Fermentation von fünf Mutanten von Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145.425.

Beispiel 7

Es wurden doppelte Schüttelkolben mit einem Aufnahmevermögen von 1 Liter präpariert, die 200 ml des folgenden Mediums enthielten:

Endgültige
Konzentration Ergebnissen ließen sich folgende Wachstumsgeschwindigkeiten ableiten:

Wachstums-

geschwindigketi

(Std.-')

(i) Lösung 3, nicht zugesetzt sehr langsam

(Mindestwert)

(ii) Lösung 3 in der Weise, daß die 0,22 abschließend« Biotin-Konzentration in dem Kulturmedium 50 μ g/l betrug

(iii) Lösung 3 in der Weise, daß die 0,27 abschließende Biotin-Konzentration in dem Kulturmedium 50 μ g/l und die Cholinchlorid-Konzentration 50 mg/1 betrug

25

Lösung 1 Glukose (10 min lang 3,0
gesondert bei 0,7 atü und
einem pH-Wert von 3,0
sterilisiert)

Lösung 2 Ammoniumsulfat 0,565

Kaliumdihydrogen- 1,0
phosphat

MgSO» - 7 H2O 0,025

FeSO4 - 6 H2O 0,0005

MnSO4 · 4 H2O 0,0005

CuSO4 · 5 H2O 0,0001

CoCb - 6 H2O 0,0001

CaCb - 2 H2O 0,005

Na2MoO4 · 2 H2O 0,00001

NaOH 0,2
Die Salze wurden 15 min
lang bei 1,05 atü sterilisiert
Abschließender pH-Wert
6.0

Lösung 3 In der unten beschriebenen
Weise durch Filtrierung
sterilisierte Vitamine

Beispiel 8

Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 154.211 eingesetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

Die Lösungen wurden aseptisch zugesetzt, um ein endgültiges Volumen von 200 ml zu ergeben, und die Kolben wurden mit gewaschenen Sporen von Fusarium eo graminearum LML 154.209 geimpft, um eine Konzentration von 8 · 10³ZmI zu ergeben.

Wachstumsbedingungen: Temperatur 30⁰C; 140 U/min auf einer Rotations-Schüttehnaschine mit einem Hub von 50 mm.

Das Wachstum wurde in Abständen von jeweils einer Stunde gemessen, indem die optische Dichte einer Probe bei 600 πιμ festgestellt wurde. Aus den erhaltenen

Wachstumsgeschwindigkeit

(Std.-·)

(i)	Wie	7	(i)
(ü)	Wie	7	(ü)
(iii)	Wie	7	(iü)

sehr langsam

0,21

0,27

50

55

Beispiel 9

Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 154.212 eingesetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

Wachstumsgeschwindigkeit

(Std-')

sehr langsam

0,21

0,27

Beispiel 10

Das Verfahren gemäß Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 154.213 eingesetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

(i)	Wie	7(0
(ü)	Wie	7(ü)
(iii)	Wie	7(üi)

13

Wachstumsgeschwindigkeit

(Std.-¹

(Ο	Wie	7	(i)
(ü)	Wie	7	(ü)
(iii)	Wie	7	(iii)

sehr langsam

0,21

0,27

Beispiel 11

Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt, wobei jedoch Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 154.210 eingesetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

Wachstumsgeschwindigkeit

(Std.-')

Wie 7 (i)
Wie 7 (ii)
Wie 7 (iii)

sehr langsam

0,21

0,27

Beispiel 12
Das Verfahren von Beispiel

wurde wiederholt, wobei jedoch Fusarium graminearum Schwabe I.M.I. 145.425 eingesetzt wurde. Es wurden folgende Wachstumsgeschwindigkeiten erhalten:

Wachstumsgeschwindigkeit

(Std.-')

sehr langsam

0,22

0,27

(i)	Wie	7	(i)
(ü)	Wie	7	(«)
(iii)	Wie	7	(iii)

400-Liter-Behälter, geteilt. Die Saat wurde in ein Medium folgender Zusammensetzung geimpft:

Stärke 6,00%

KH₂PO₄ 0,20%

(NH₄J₂SO₄ 0,25%

Maisquellwasser 0,50%
(50% Gesamt-Feststoff-Anteii)

Der pH-Wert wurde durch Zugabe von sterilem

H) Ammoniak auf 5,5 ei' ^!'°n; Temperatur 30°C; 2,1 atü; Luftdurchsatz l.uv/vm. Die Drehzahl des Rührwerkes wurde kontinuierlich von 92 auf 184 U/min erhöht, um in dem Behälter eine ausreichende Menge an gelöstem Sauerstoff zu gewährleisten. Das Rührwerk bestand aus zwei Turbinen mit 0,4 D. Nachdem das Kohlehydrat ausgenutzt worden war, wurde das gewachsene Mycel aus dem Fermenter herausgenommen, gefiltert, mit Wasser gewaschen, zentrifugiert und bei 75° C auf einem Warmluft-Bandtrockner getrocknet. Das getrocknete Produkt hatte die folgende Zusammensetzung:

Gesamt-Stickstoff
Asche

9,1%
8,3%

Wenn dieses Produkt an Ratten verfüttert wurde, ergab sich ein NPUop von 41, basierend auf Gesamt-Stickstoff.

Beispiel 14

Fusarium oxysporum I.M.I. 154.214 wurde in der im vorangegangenen Beispiel beschriebenen Weise zum Wachsen gebracht, jedoch mit der Ausnahme, daß die Stärke durch Rohrzuckermelasse mit einer solchen Konzentration ersetzt wurde, daß 6% Zucker erzeugt wurde.

Das getrocknete Produkt hatte folgende Zusammen-

In den Beispielen 13 und 14 ist die Fermentation unter Verwendung von anderen Fusarium-Arten als der Art Fusarium graminearum beschrieben.

Beispiel 13

Eine Sporensuspension von Fusarium solani I.M.I. 154.217 wurde in einen Saatfermenter mit einem Inhalt von 801 geimpft, der ein Glukose-Maisquellwassermedium enthielt Nachdem der Saatfermenter auf 10 bis 20 Gramm pro Liter angewachsen war, wurde der Inhalt in zwei Teile von jeweils 40 Liter, aufgeteilt auf zwei

Setzung:

Gesamt-Stickstoff

Asche

NPUop

9,9%
10,8%

47,0, basierend
auf dem
Gesamt-Stickstoff

Die Analysemethoden für den Gesamt-Stickstoff (TN) basieren auf Automatic Kjeldahl digestor A. Ferrari, Ann. N.Y. Sei. 87,792 (1960).

Aminostickstoff (AN) (TNBS modifiziert). M. A. Pinnegar, Technicon Symposium 1965, Seite 80. (TNBS = 2,4,6-Tri-Nitrobenzol-Schwefelsäure.)

Claims

Patentansprüche:

I. Verfahren zur Herstellung einer eßbaren. Protein enthaltenden Substanz in Form eines durch Wucherung entstandenen Fusarium-Organismus. dadurch gekennzeichnet, daß man einen nichttoxischen Stamm der Gattung Fusarium oder eine nichttoxische Mutante hiervon unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, in dem in der üblicheti Weise für die Vermehrung dieser Mikroorganismen ausreichende Mengen wesentlicher Wuchsstoffe wie eine Stickstoff-, Schwefel- und Phosphor-Quelle sowie Spurenelemente aufrechterhalten werden, so daß die Vermehrung dieser Mikroorganismen allein durch die verfügbaren Kohlehydrate begrenzt wird, nach Oberimpfung der Mikroorganismen auf dieses Kulturmedium züchtet, und daß man die Zellen in üblicher Weise aus dem Kulturmedium isoliert
2 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kulturmedium eingesetzt wird, in weichem die verfügbaren Kohlehydrate in Form von Stärke, Stärke enthaltenden Stoffen oder Hydrolyseprodukten davon, Saccharose, Saccharose enthaltenden Stoffen, hydrolisierter Saccharose oder Mischungen davon, vorhanden sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlehydrate in Form von hydrolisierten Kartoffelprodukten, Melasse, Glukose, Maltose, hydrolisierter Bohnenstärke oder Molke vorhanden sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtungstemperatur zwischen 25 und 34° C liegt
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturmediums während der Impfung zwischen 3,5 und 7 liegt
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß das Kulturmedium ein nichttoxisches Antischaummittel enthält
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein nichttoxischer Stamm der Art Fusarium graminearum oder eine nichttoxische Mutante davon eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der nichttoxische Stamm Fusarium graminearum Schwabe, der beim Commonwealth Mycological Institute hinterlegt und unter der Nummer I.M.I. 145.425 eingetragen ist, eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet daß ein nichttoxischer Stamm der Ar; Fusarium solani oder Fusarium oxysporum oder eine nichttoxische Mutante hiervon eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als kontinuierliches Verfahren durchgeführt wird.

II. Verwendung des nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellten nichttoxischen Fusarium-Organismus als Zusatz zu einem für den menschlichen oder tierischen Verbrauch bestimmten Nahrungsmittel.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer eßbaren, Protein enthaltenden Substanz in Form eines durch Wucherung entstandenen Fusarium-Organismus.

Die auf die Aiimelderin zurückgehende britische Patentanmeldung 53 312/66, Serial 12 10 356 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz, die eßbares Protein enthält Das ältere Verfahren besteht darin, daß man unter aeroben Bedingungen

ίο einen Mikroorganismus, der aus einem nichttoxischen Stamm eines Mikropilzes des Genus Fungi Imperfecti besteht in einem Kulturmedium züchtet, in welchem wachstumsfördernde Nährstoffe im Überschuß vorhanden sind, wobei der in Form von assimilierbaren Kohlehydraten vorhandene Kohlenstoff das Wachstum des Mikroorganismus begrenzt Danach wird der durch Vermehrung entstandene Organismus, der die eßbare, Protein enthaltende Substanz bildet aus dem Kulturmedium abgetrennt.

Während bei dem älteren Verfahren von einem Mikropilz des Genus Fungi Imperfecti ausgegangen wird, liegt die Aufgabe der Erfindung in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer eßbaren, Protein enthaltenden Substanz in Form eines durch Wucherung entstandenen Fusarium-Organismus.

Zur Lösung der Aufgabe sieht die Erfindung ein Verfahren vor, welches dadurch gekennzeichnet ist daß man einen nichttoxischen Stamm der Gattung Fusarium oder eine nichttoxische Mutante hiervon unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, in dem in der üblichen Weise für die Vermehrung dieser Mikroorganismen ausreichende Mengen wesentlicher Wuchsstoffe wie eine Stickstoff-, Schwefel- und Phosphor-Quelle sowie Spurenelemente aufrechterhalten werden, so daß die Vermehrung dieser Mikroorganismen allein durch die verfügbaren Kohlehydrate begrenzt wird, nach Überprüfung der Mikroorganismen auf dieses Kulturmedium züchtet und daß man die Zellen in üblicher Weise aus dem Kulturmedium isoliert

Um eine Wachstumsbegrenzung durch die verfügbaren Kohlehydrate herbeizuführen, muß durch Versuche und Berechnungen der Anteil des verfügbaren Kohlenstoffes gegenüber den übrigen, im Kulturmedium vorhandenen Wuchsstoffen ermittelt werden.

Zur Überprüfung des ermittelten Kohlenstoffanteils wird ein weiteres Kulturmedium angesetzt in welchem die Kohlenstoffquelle unverändert bleibt das anteilige Verhältnis aller übrigen Stoffe aber 20 bis 50% größer ist Tritt jetzt keine Wachstumsänderung ein, so ist dies ein sicherer Beweis dafür, daß eine Wachstumsbegrenzung durch Kohlenstoff vorliegt.

Bedingt durch den Aufbau der Zellen und die für das Wachstum der Zellen erforderliche Energie darf im Kulturmedium das Verhältnis Kohlenstoff/Stickstoff nicht größer sein als etwa 10 :1. Bei einem C/N-Verhältnis von mehr als 10 :1 ist zu wenig Stickstoff für das Wachstum der Zellwandungen und für eine maximale Proteinerzeugung vorhanden; außerdem findet keine Wachstumsbegrenzung durch Kohlenstoff statt

Bei einem aus der US-PS 31 51 038 bekanntgewordenen Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Eiweiß beträgt das C/N-Verhältnis 38 :1. Abgesehen davon, daß somit keine Wachstumsbegrenzung durch Kohlenstoff stattfindet wird durch den überschüssigen Kohlenstoff, der in Form von Glukose vorhanden ist ein zweiter Prozeß in Gang gesetzt, bei dem eine Vielzahl von sekundären Stoffwechselprodukten entsteht. Das bekannte Verfahren läßt daher zumindest in wirtschaft-