DE69621663T2

DE69621663T2 - Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure

Info

Publication number: DE69621663T2
Application number: DE69621663T
Authority: DE
Inventors: William R. Barclay
Original assignee: OmegaTech Inc
Current assignee: Martek Biosciences Corp
Priority date: 1995-01-24
Filing date: 1996-01-16
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2016-01-17
Also published as: JP2008136493A; JP2006345866A; US20020037561A1; AU711967B2; DE69621663D1; US6245365B1; CA2163278A1; US5882703A; US20010016218A1; US20040248266A1; EP0726321A3; EP0726321B1; US20080044389A1; EP1726217A1; EP1188383A1; CA2163278C; EP0726321A2; US20070026050A1; US6749849B2; US20080044388A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fettsäurematerials, das Arachidonsäure enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Lebensmittelprodukt und ein Verfahren zur Herstellung des Lebensmittelproduktes, das ein solches Fettsäurematerial mit Arachidonsäure enthält.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Arachidonsäure (all-cis-5,8,11,14-Eicosatetraensäure) ist eine mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA), die 20 Kohlenstoffatome mit vier Doppelbindungen enthält. Die Doppelbindungen sind so angeordnet, dass die letzte sechs Kohlenstoffatome vom Methylende der Kette entfernt ist. Daher wird Arachidonsäure als Omega-6-Fettsäure bezeichnet. Arachidonsäure ist eine der häufigsten C&sub2;&sub0;-PUFA im menschlichen Körper. Sie ist insbesondere vorherrschend in Organen, Muskeln und Blutgeweben. Arachidonsäure ist ein direkter Vorläufer für eine Anzahl zirkulierender Eicosenoide, wie Prostaglandine, Thromboxane, Leukotriene und Prostacycline, die wichtige biologische Regulatoren sind. Diese Eicosenoide haben eine regulierende Wirkung auf den Lipoproteinmetabolismus, die Blutrheologie, den Gefäßtonus, die Leukozytenfunktion, die Blättchenaktivierung und das Zellwachstum. Die Anwendung von Arachidonsäure für Kindernahrung ist besonders wichtig wegen des schnellen Körperwachstums eines Kindes. Arachidonsäure ist ein wichtiger Vorläufer für viele Eicosanoide, die den zellulären Metabolismus und das Wachstum bei Kindern regeln. Sie findet sich natürlicherweise in der menschlichen Muttermilch, aber nicht in den meisten Säuglingsfertignahrungsprodukten. In dem Bestreben, dass die Säuglingsfertignahrung das Profil der langkettigen Fettsäuren, das sich in Muttermilch findet, erfüllt, haben wissenschaftliche und lebensmittelüberwachende Gremien empfohlen, dass Arachidonsäure Säuglingsfertignahrung zugegeben wird, insbesondere bei Säuglingsfertignahrung, die für frühgeborene Kinder verwendet wird.
Es ist insbesondere bevorzugt, arachidonsäurehaltiges Öl, das zur Verwendung für Säuglingsfertignahrung hergestellt wird, wenig oder keine anderen langkettigen hochungesättigten Fettsäuren (z. B. Eicosapentansäure) enthält. Solche anderen langkettigen hochungesättigten Fettsäuren sind nicht bevorzugt, da einige dieses Fettsäuren die Verwertung der Arachidonsäure durch den Säugling bzw. das Kind stören können und/oder das Vermischen des arachidonsäurehaltigen Öls mit anderen Ölen hemmen können, um das geeignete Verhältnis von Fettsäuren zur Nachahmung der Muttermilch oder für andere gewünschte Anwendungen zu erfüllen. Hochungesättigte Fettsäuren werden definiert als Fettsäuren, die vier oder mehr Doppelbindungen enthalten.
Traditionelle Quellen für Arachidonsäure schließen Geflügeleier, Rinderhirngewebe, Schweinenebennierenrinde, Schweineleber und Sardinen ein. Die Ausbeute an Arachidonsäure ist jedoch gewöhnlich geringer als 0,2% auf Basis des Trockengewichts. Die Verwendung von Mikroorganismen, die Arachidonsäure de novo erzeugen können, wurde von verschiedenen Forschern vorgeschlagen, einschließlich Kyle in PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/13086, veröffentlicht am 6. August 1992; Shinmen et al., US Patent Nr. 5,204,250, ausgegeben am 20. April 1993; Shinmen et al. Seiten 11-16, 1989, Appl.Microbiol. Biotechnol., Band 31; Totani et al., Seiten 1060-1062, 1987, LIPIDS, Band 22; Shimizu et al., Seiten 509-512, 1992, LIPIDS, Band 27; Shimizu et al., Seiten 342-347, 1989, JAOCS Band 66; Shimizu et al., Seiten 1455-1459, 1988, JAOCS, Band 65; Shimizu et al., Seiten 254-258, 1991, JAOCS, Band 68, Sajbidor et al., Seiten 455-456, 1990, Biotechnology Letters, Band 12; Bajpai et al., Seiten 1255-1258, 1991, Appl. Environ. Microbiol., Band 57; Bajpai, Seiten 775-780, 1991, JAOCS, Band 68; und Gandhi et al., Seiten 1825-1830, 1991, J. Gen. Microbiol., Band 137. Die Arachidonsäureproduktivität von Mikroorganismen, die von den früheren Forschern offenbart wird, ist jedoch weniger als 0,67 Gramm pro Liter pro Tag. Solche Mengen sind deutlich geringer als Mengen an Arachidonsäure, die von den Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Diese niedrigen Produktivitätswerte sind das Ergebnis der Anwendung von Stämmen: (1) mit langsamem Wachstum oder langsamen Lipidproduktionsraten, die zu langen Fermentationszeiten führen (d. h. mehr als 2 bis 3 Tage) (Kyle, 1992, s.o.; Shinmen et al., 1993, s.o.; Shinmen et al., 1989, s.o.; Bajpai et al., 1991, s.o.; Bajpai, s.o. und Gandhi et al., s.o.) und/oder (2) die geringe Arachidonsäuregehalte (ausgedrückt als % Fettsäuren) im fertigen produzierten Öl aufweisen (Shinmen et al., 1993, s.o.; Shimizu et al., 1989, s.o.; und Kendrick und Ratledge, 1992, Seiten 15-20, Lipids, Band 27); und/oder (3) die lange Stressperioden erfordern (d. h. Altern einer Biomasse über 6 bis 28 Tage), um hohe Anteile an Arachidonsäure in der Biomasse zu erreichen (Bajpai et al., 1991, s.o. und Shinmen et al., 1989, s.o.); und/oder (4) die einen hohen Arachidonsäuregehalt nur bei nicht kommerziellen Wachstumsbedingungen zeigen (z. B. Malzagarplatten) (Totani und Oba, 1987, Seiten 1060-1062, Lipids, Band 22). Von anderen Mikroorganismen, als Mortierella schmuckeri, die zur Erzeugung von Arachidonsäure vorgeschlagen wurden, insbesondere Pythium insidiosum-Mikroorganismen, die von Kyle, 1992, s.o., offenbart wurden, wurde berichtet, dass für Menschen und/oder Tiere pathogen sind.
EP-A-0276541 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure durch Züchtigung von Mikroorganismen, die zur Gattung Mortierella gehören, insbesondere Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila.
WO-A-94/28913 offenbart ein Verfahren zur Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Mortierella (wobei eine bevorzugte Art Mortierella alpina ist) zur Herstellung von Arachidonsäure, die im wesentlichen frei von Eicosapentaensäure (EPA) ist.
DE 3920679 offenbart die Verwendung von Arachidonsäure in einem Lebensmittelprodukt, aber nicht Arachidonsäure, die von Mikroorganismen der Gattung Mortierella hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, um Fettsäurematerial ökonomisch herzustellen, das Arachidonsäure enthält, wobei das Verfahren umfasst, dass Mikroorganismen der Gattung Mortierella der Sektion schmuckeri in einem Medium gezüchtet werden, das eine Quelle für assimilierbaren organischen Kohlenstoff und eine Quelle assimilierbaren Stickstoff enthält. Mikroorganismen der Gattung Mortierella Sektion schmuckeri gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugen eine überraschend erhöhte Menge an Arachidonsäure und können mindestens 0,70 Gramm Arachidonsäure pro Liter pro Tag erzeugen.
Die vorliegende Erfindung schließt weiterhin ein Lebensmittelprodukt ein, das das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält. Insbesondere kann das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens Säuglingsfertignahrung und Babynahrung zugegeben werden, um den Gehalt an Arachidonsäure oder langkettiger Omega-6- Fettsäure in solchen Nahrungsmitteln zu erhöhen.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein therapeutisches Mittel, das das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält.
Die niederen Pilze Phycomycetes enthalten mindestens zwei Klassen, u. a. Oomycetes und Zygomycetes. Die Klasse Zygomycetes enthält mindestens zwei Ordnungen, u. a. Entomophthorales und Mucorales. In der Ordnung der Mucorales enthalten sind zahlreiche Gattungen, einschließlich Mortierella. Die Gattung Mortierella weist neue Sektionen auf, einschließlich der Sektion schmuckeri (Garns, 1977, Seiten 381-391, Persoonia, Band 9 und Garns, 1977, Seite 216 in Abstracts Band A-L, Second International Mycological Congress, Universität von Südflorida). Die schmuckeri-Sektion der Gattung Mortierella enthält drei Arten, die als Mortierella camargensis, Mortierella clausenii und Mortierella schmuckeri bezeichnet werden.
Alle anderen Stämme von Mortierella, die bezüglich der Arachidonsäureproduktion ausgewertet wurden, gehören zu den Mortierella-Sektionen alpina, hygrophila oder spinosa. Es wurde nun festgestellt, dass Stämme von Mortierella sect. schmuckeri besonders vorteilhaft sind bei der Produktion von Arachidonsäure verglichen mit diesen anderen Stämmen von Mortierella. Insbesondere wurde gefunden, dass Stämme von Mortierella sect. schmuckeri Arachidonsäure mit hoher Produktivität erzeugen können. Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung können mindestens etwa 0,70 Gramm Arachidonsäure pro Liter pro Tag erzeugen, bevorzugt mindestens etwa 0,80 Gramm Arachidonsäure pro Liter pro Tag und bevorzugter etwa 0,86 Gramm Arachidonsäure pro Liter pro Tag. Bevorzugt können Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung einen Gesamtfettsäuregehalt von mindestens etwa 20 Trockengewicht, bevorzugt mindestens etwa 30% Trockengewicht und bevozugter mindestens etwa 40% Trockengewicht erzeugen. Außerdem enthalten bevorzugte Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung mindestens etwa 20% der Gesamtfettsäuren als Arachidonsäure, bevorzugter mindestens etwa 35% der Gesamtfettsäuren als Arachidonsäure und noch bevorzugter mindestens etwa 48% der Gesamtfettsäuren als Arachidonsäure. Der Arachidonsäuregehalt der Zellbiomasse von Stämmen von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung kann mindestens etwa 5% des Zelltrockengewichts, bevorzugt mindestens etwa 8% des Zelltrockengewichts und noch bevorzugter mindestens etwa 13% des Zelltrockengewichts sein.
Öl, das z. B. durch Extraktion aus einem bevorzugten Stamm von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung gewonnen wird, enthält mindestens etwa 20% Arachidonsäure, bevorzugter mindestens etwa 30% Arachidonsäure und noch bevorzugter mindestens etwa 41% Arachidonsäure. Die Ausdrücke "Lipid", "Lipidextract", "Öl" und "Ölextrakt" werden hier austauschbar verwendet.
Morphologische Wachstumsformen von Pilzen können eine signifikante Wirkung auf Wachstum und Produktbildung in Fermentern haben. Die Pilzmorphologie in Fermentern kann in einem Bereich von einer verteilten filamentösen Form bis zu einer dichten Pelletform sein. Arten von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung haben Vorteile gegenüber früher verwendeten Arten von Mortierella einschließlich der Fähigkeit, schnell zu wachsen (früh in der Fermentation) in Form von verteilten Filamenten, wenn sie in gerührten Flüssigkulturen gezüchtet werden, z. B. Schüttelkolben oder Fermentern. Einige andere Arten von Mortierella, die im Fermentionsmedium gezüchtet werden, wachsen typischerweise in Form von Pellets oder kugelförmigen Aggregaten (d. h. haben das Aussehen eines sehr dichten Baumwollballs), wobei sie manchmal erst nach mehreren Tagen Fermentation eine dispergierte Form zeigen. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass das Wachstum und die Produktivität von Zellen in der Pelletform begrenzt ist, da die Zellen in der Mitte eines Pellets oder Aggregats nicht den notwendigen Nährstoffen ausgesetzt sind, die in dem Fermentationsmedium enthalten sind. Traditionelle Methoden zum Züchten dieser Pilzpopulationen können einschließen, dass die Bewegung des Fermentes erhöht wird, oder dass Detergenzien zugegeben werden in einem Versuch, solche Aggregate zu verteilen und das Zellwachstum zu verbessern. Der vorliegende Erfinder hat gefunden, dass Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung leicht in Form von dispergierten Filamenten wachsen, wodurch Wachstum und Produktivität dieser Zellen verbessert wird, indem die Nährstoffe alle Zellen erreichen können. Der Ausdruck "Filament" bzw. "filamentös" wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf das Wachstum von Pilzen als lose verzweigtes Netzwerk kurzer Mycelien statt Pellet oder Aggregat.
Bevorzugte Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung schließen Stämme von Mortierella sect. schmuckeri ein, die aus kalten, ariden Böden isoliert wurden, in denen die Mikroorganismen kurze Perioden von Nässe erfahren. Insbesondere können solche Bereiche Böden einschließen, die einige längere Perioden unter Frostbedingungen oder nahe Frostbedingungen durchmachen. Bevorzugtere Stämme von Mortierella sect. schmuckeri werden aus der Südwestregion von Nordamerika isoliert, insbesondere den Wüstenregionen der Vereinigten Staaten und/oder von Mexiko. Insbesondere werden Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der Art Mortierella schmuckeri aus Südkalifornien und/oder Mexiko isoliert.
Stämme von Mortierella können aus Böden oder dem Wasserhabitat isoliert werden unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken (Stevens, 1974, in Mycology Guidebook, University of Washington Press, Seattle; und Barron, Seiten 405-427, 1971, in Methods of Microbiologiy, Band 4). Genauer können Arten von Mortierella sect. schmuckeri isoliert werden, indem kleine Proben von Boden in destilliertem Wasser suspendiert werden und dann eine Portion der Suspension auf Maismehlagarplatten oder Agarplatten, die gewünschte Fermentationsmedien enthalten, ausgestrichen werden. Außerdem kann eine Art von Mortierella sect. schmuckeri isoliert werden aus dem Wasserhabitat unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,130,242 von Barclay et al., ausgegeben am 14. Juli 1992 und US-Patent Nr. 5,340,594 von Barclay et al., ausgegeben am 23. August 1994). Auf Agarplatten können Mortierella-Kolonien teilweise durch verschiedene Eigenschaften bzw. Kennzeichen identifiziert werden, u. a. z. B. als weiß gefärbte Kolonien, die im wesentlichen in dem Agar wachsen statt hauptsächlich Luftwachstum aufzuweisen. Mortierella-Kolonien können auch von anderen Pilzen unterschieden werden unter Verwendung von allgemeinen Kennzeichen der Pilztaxonomie, die z. B. von Talbot ausgeführt wurden (Principles of Fungal Taxonomy, 1971, Macmillan Press). Nach Isolierung einer reinen Kolonie können Mitglieder der Gattung Mortierella auch z. B. durch einen knoblauchartigen Geruch identifiziert werden, wenn sie in einem Schüttelkolben oder auf Agarplattenkulturen, die von Stevens beschriebene Medien (s.o.) enthalten, gezüchtet werden. Die Kultur, die die beste Sporulation erzeugt, kann dann verwendet werden, um die Art der Kultur zu identifizieren unter Verwendung der bei Gams (Seiten 381-391, 1977, Persoonia, Band 9 und in Taxonomic problems in Mortierella, Abstracts, 2nd International Mycological Conference, Universität von Südflorida, Tampa, veröffentlicht von Hamilton Newell, Inc., Amherst, MA) ausgeführten Mortierella-Kennzeichen,
Nach Isolierung einer reinen Kolonie von Stämmen von Mortierella sect. schmuckeri, kann die Biomasse eines Stamms auf Lipidgehalt und Arachidonsäuregehalt mit Gaschromatographie analysiert werden. Bevorzugte Kolonien, die schnelles Wachstum und einen hohen Lipid- und Arachidonsäuregehalt zeigen, können dann selektiert werden. Eine weitere Selektion auf Gegenwart oder Abwesenheit anderer Eigenschaften kann auch durchgeführt werden. Z. B. ist für die Anwendung extrahierter Lipide in Säuglingsfertignahrung zugunsten des Arachidonsäuregehaltes die Gegenwart von Eicosapentansäure (C20:5n-3; "EPA") schädlich. Daher kann man auf Abwesenheit eines hohen EPA-Gehalts selektieren. Eine bevorzugte Art von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung ist Mortierella camargensis. Besonders bevorzugte Stämme von Mortierella camargensis der vorliegenden Erfindung haben das identifizierende Merkmal, das sie etwa 0,86 g Arachidonsäure pro Liter pro Tag erzeugen können. Ein weiteres identifizierendes Kennzeichen besteht darin, dass zwischen etwa 25% und etwa 33% aller Fettsäuren, die von solchen besonders bevorzugten Mortierella camargensis erzeugt werden, Arachidonsäure sein können. Somit kann der entstehende Arachidonsäuregehalt einer Biomasse einer besonders bevorzugte Mortierella camargensis der vorliegenden Erfindung zwischen etwa 9,6 und etwa 10,8% unter geeigneten Fermentationsbedingungen liegen. Ein weiteres identifizierendes Merkmal ist, dass das entstehende Öl, das aus einem besonders bevorzugten Mortierella camargensis der vorliegenden Erfindung gewonnen wird, einen Arachidonsäuregehalt im Bereich von etwa 20 bis etwa 30% aller Fettsäuren haben kann.
Ein weitere bevorzugte Art Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung, Mortierella schmuckeri hat das identifizierende Kennzeichen, dass sie etwa 0,84 Gramm Arachidonsäure pro Liter pro Tag erzeugen kann. Ein weiteres identifizierendes Kennzeichen ist es, dass zwischen etwa 40 und 49% der von einem solchen besonders bevorzugten Mortierella schmuckeri der vorliegenden Erfindung erzeugten Fettsäuren Arachidonsäure sein können. Somit kann der entstehende Arachidonsäuregehalt einer Biomasse einer besonders bevorzugten Mortierella schmuckeri der vorliegenden Erfindung zwischen etwa 12,5% und etwa 13,6% unter geeignete Fermentionsbedingungen liegen. Ein weiteres identifizierendes Kennzeichen besteht darin, dass das entstehende Öl, das von einem besonders bevorzugten Mortierella schmuckeri gewonnen wird, einen Arachidonsäuregehalt im Bereich von etwa 33 bis 41% aller Fettsäuren haben kann.
Zusätzlich zu bekannten Stämmen von Mortierella sect. schmuckeri sowie denen bei der American Type Culture Collection (z. B. ATCC) hinterlegten, können neu identifizierte Stämme aus der Natur und Mutantenstämme, die von bekannten oder neu identifizierten Stämmen stammen, verwendet werden, um Arachidonsäure zu erzeugen. Natürlich vorkommende Mutanten eines Elternstamms von Mortierella sect. schmuckeri, die Arachidonsäure erzeugen können, können z. B. isoliert werden, indem ein Elternstamm mindestens einer Runde einer chemischen oder physikalischen Mutagenese unterzogen wird, um die Rate der Mutagenese zu erhöhen, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, einen Mikroorganismen zu erhalten, der erhöhte Mengen an Arachidonsäure erzeugt. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es offensichtlich, dass mutierte Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung auch Arachidonsäure produzierende Mikroorganismen einschließen können, die durch gentechnisch hergestellte Mikroorganismen erhalten wurden, um erhöhte Mengen an Arachidonsäure zu erzeugen. Es liegt z. B. im Bereich der vorliegenden Erfindung, Mortierella sect. schmuckeri Mikroorganismen mit Nukleinsäuremolekülen zu transformieren, die Enzyme des Arachidonsäurebiosynthesewegs kodieren, die aus pilzartigen arachidonsäureproduzierenden Mikroorganismen erhalten wurden, wie Seuchen der Gattung Mortierella sect. schmuckeri. Ein Mortierella sect. schmuckeri-Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann aus natürlichen Quellen erhalten werden, entweder als vollständiges Gen oder als Teil davon, der ein stabiles Hybrid mit dem vollständigen Gen bilden kann. Ein Nukleinsäuremolekül aus einem Stamm von Mortierella sect. schmuckeri kann auch erzeugt werden unter Verwendung rekombinanter DNA-Technik (z. B. Polymerasekettenreaktion- (PCT)-Amplifikation, Klonierung) oder chemische Synthese. Der Ausdruck "mutierter Mikroorganismus" bzw. "Mutant", wie er hier verwendet wird, ist ein mutierter Elternmikroorganismus, in dem die Nukleotidzusammensetzung solcher Mikroorganismen modifiziert wurde durch Mutation(en), die natürlich auftreten, die das Ergebnis des Kontakts mit einem Mutagen sind oder die das Ergebnis der Gentechnik sind.
Bevorzugte Mutanten von Stämmen von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung haben ein oder mehrere der identifizierenden Kennzeichen eines bevorzugten Mortierella camargensis der vorliegenden Erfindung und eines bevorzugten Mortierella schmuckeri der vorliegenden Erfindung, wie im Detail oben beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Mikroorganismen der Gattung Mortierella sect. schmuckeri, die Arachidonsäure erzeugen können, in einem wirksamen Medium gezüchtet, das hier als irgendein Medium definiert wird, das die Arachidonsäureproduktion fördern kann. Bevorzugt fördert das wirksame Medium auch ein schnelles Pilzwachstum. Die Mikroorganismen der Gattung Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung können in üblichen Fermentionsarten gezüchtet werden, was diskontinuierliche, Fed-Batch- und kontinuierliche Züchtung einschließt, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, um ein Fettsäurematerial herzustellen, das Arachidonsäure enthält, das umfasst, dass Mikroorganismen der Gattung Mortierella sect. schmuckeri in einem Medium gezüchtet werden, das eine Quelle für assimilierbaren organischen Kohlenstoff und eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff umfasst.
Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff schließen Zucker und deren Polymere, einschließlich Stärken, Dextrin, Saccharose, Maltose, Lacose, Glucose, Fructose, Mannose, Sorbose, Arabinose, Xylose, Lävulose, Cellobiose und Molassen; Fettsäuren und Polyalkohole wie Glycerin ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Bevorzugte Kohlenstoffzellen der vorliegenden Erfindung schließen Monosaccharide, Disaccaride und Trisaccharide ein. Die am meisten bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose.
Quellen für assimilierbaren Stickstoff, die zur Fermentation eines Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen einfache Stickstoffquellen, organische Stickstoffquellen und komplexe Stickstoffquellen ein. Solche Stickstoffquellen schließen Ammoniumsalze und Substanzen tierischen, pflanzlichen und/oder mikrobiellen Ursprungs ein. Solche organischen Stickstoffquellen schließen Maiseinweichwasser, Proteinhydrolysate, mikrobielle Biomassenhydrolysate, Sojaton, Sojamehl, Fischmehl, Fleischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trypton, Hefeextrakt, Hefe, Molke, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Aminosäuren ein.
Bevorzugte Stickstoffquellen zur Verwendung für ein wirksames Medium der vorliegenden Erfindung schließen komplexe Stickstoffquellen ein. Die Verwendung einer komplexen Stickstoffquelle in einem Fermentationsmedium der vorliegenden Erfindung erhöht die Arachidonsäureproduktion durch einen Stamm vom Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung um mindestens etwa 50% und bevorzugt um mindestens 100%, entweder gemessen als %-Trockengewicht oder % Gesamtfettsäuren in einem Öl verglichen mit einem Stamm Mortierella sect. schmuckeri, der ohne eine komplexe Stickstoffquelle gezüchtet wurde. Geeignete komplexe Stickstoffquellen schließen z. B. Maiseinweichwasser, Proteinhydrolysate, mikrobielle Biomassehydrolysate, Sojaton, Sojamehl, Fischmehl, Fleischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Trypton, Hefeextrakt, Hefe und Molke ein. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann bestimmen, welche komplexe Stickstoffquelle die Arachidonsäureproduktion bei einem Stamm von Mortierella sect. schmuckeri, der bei dem Fermentationsverfahren angewendet wird, am besten stimuliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Fermentation durchgeführt, bei der ein Nicht-Kohlenstoffnährstoff, z. B. Stickstoff oder Magnesium und bevorzugt Stickstoff, begrenzt ist. Auf diese Weise wird der Zellmetabolismus zur Lipidproduktion gerichtet, was die Gesamtproduktion an Arachidonsäure verbessert.
Das wirksame Medium kann andere Verbindungen, wie anorganische Salze, Vitamine, Spurenmetalle oder Wachstumspromotoren enthalten. Solche Verbindungen können in Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Mineralquellen in dem wirksamen Medium enthalten sein oder können spezifisch dem Medium zugegeben werden. Niedrige Konzentration an Magnesium sind auch bevorzugt.
Während der Fermentation werden Variable, wie der Sauerstoffgehalt, pH, Temperatur, Kohlendioxidgehalt und die Rate der Zugabe der Kohlenstoffquelle kontrolliert, um die Produktion von Arachidonsäure zu maximieren, ohne die Länge des Zeitraums, während dem eine erfolgreiche Fermentation erreicht werden kann, unnötig zu beschränken. Die optimale Sauerstoffkonzentration für die Arachidonsäureerzeugung kann für jede spezielle Population von Mortierella sect. schmuckeri bestimmt werden durch Variation des Sauerstoffgehalts des Mediums. Insbesondere wird der Sauerstoffgehalt des Fermentationsmediums auf einem Sauerstoffgehalt gehalten, der bevorzugt in einem Bereich von etwa 20% Sättigung bis etwa 60% Sättigung liegt.
Das Wachstum von Stämmen von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung kann bei jeder Temperatur bewirkt werden, die zu einem befriedigendem Wachstum des Stamms führt, z. B. etwa 25ºC bis 33ºC, bevorzugt zwischen etwa 27 und etwa 32ºC und noch bevorzugter bei etwa 30ºC. Das Kulturmedium wird typischerweise während der Fermentation alkalischer, wenn der pH nicht durch Säurezugabe oder Puffer kontrolliert wird. Die Stämme von Mortierella sect. schmuckeri der vorliegenden Erfindung wachsen über einen pH- Bereich von etwa 4,0 bis etwa 10,0, wobei ein Ausgangs-pH von etwa 5,5 bevorzugter ist.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt ein Lebensmittelprodukt ein, das das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält. Das Lebensmittelprodukt kann Lipide enthalten, die aus dem Fettsäurematerial gewonnen werden, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird. Gewonnene Lipide schließen Lipide ein, die aus Mikroorganismen gewonnen werden. Im ersteren Fall schließt die Lipidzusammensetzung Arachidonsäure in etwa der gleichen relativen Menge ein, wie sie in dem Mikroorganismus vorliegt. Alternativ können die gewonnenen Lipide weiter verarbeitet werden, um die Arachidonsäure zu konzentrieren, um eine Zusammensetzung zu erhalten, mit einer höheren Konzentration an Arachidonsäure, als sie natürlich in dem Organismus vorkommt.
Die Gewinnung von Lipiden aus Stämmen von Mortierella sect. schmuckeri kann erreicht werden mit jedem geeigneten Verfahren, einschließlich zahlreicher Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind. Z. B. kann die Gewinnung folgende Methode einschließen. Geerntete Zellen (frisch oder getrocknet) können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken aufgerissen werden. Die Lipide können dann aus den Zellen mit jedem geeigneten Mittel extrahiert werden, z. B. durch Extraktion mit superkritischen Fluiden oder Extraktion mit Lösungsmitteln, wie Chloroform, Hexan, Methylenchlorid, Methanol, Isopropanol, Ehylacetat und dergleichen, und der Extrakt bei vermindertem Druck eingedampft werden, um eine Probe eines konzentrierten Lipidmaterials zu erzeugen. Falls erwünscht kann die Arachidonsäure weiter von den anderen Lipiden abgetrennt werden durch Abkühlen einer Fettsäurezusammensetzung, so dass die gesättigten Fettsäuren in der Zusammensetzung ausfallen, währen die Arachidonsäure in Lösung bleibt. Die Lösung kann dann gewonnen werden.
Die Mortierella sect. schmuckeri-Mikroorganismen können auch aufgebrochen oder lysiert werden und die Lipide in essbaren Öl gewonnen werden unter Verwendung von Standardmethoden, die im Stand der Technik bekannt sind. Die gewonnenen Öle können mit wohlbekannten Verfahren raffiniert werden, die routinemäßig angewendet werden, um pflanzliche Öle zu raffinieren (z. B. chemisches oder physikalisches Raffinieren). Die Raffinierverfahren entfernen Verunreinigungen aus gewonnenen Ölen, bevor sie als essbare Öle verwendet oder verkauft werden. Das Raffinierverfahren besteht aus einer Reihe von Verfahren des Degummierens, Bleichens, Filtrierens, Deodorierens und Schleifens der gewonnenen Öle. Nach der Raffinierung können die Öle entweder direkt als Lebensmittel oder Lebensmitteladditiv verwendet werden, um mit- Arachidonsäure angereicherte Produkte herzustellen. Alternativ kann das Öl weiter verarbeitet werden und wie unten ausgeführt gereinigt werden und dann für die hier beschriebenen Anwendungen verwendet werden.
Das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit jedem tierischen Lebensmittelmaterial vereinigt werden (insbesondere Lebensmittelmaterialien für Menschen), um ein Lebensmittelprodukt zu erzeugen mit erhöhter Konzentration an Arachidonsäure. Ein geeignetes Lebensmittelmaterial, das zur Bildung eines Lebensmittelprodukts gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich ist, schließt Tierlebensmittel ein. Der Ausdruck "Tier" bedeutet jeden Organismus, der zum Reich der Tiere gehört und schließt, ohne Beschränkung, Primaten (Z. B. Menschen und Affen), Vieh und Haustiere ein. Der Ausdruck "Lebensmittelprodukt" bzw. "Nahrungsmittelprodukt" schließt jedes Produkt ein, das an solche Tiere verfüttert wird.
Die Menge an Fettsäuren, die natürlich in Lebensmittelprodukten vorkommen, variiert von einem Lebensmittelprodukt zum anderen. Ein Lebensmittelprodukt der vorliegenden Erfindung kann eine normale Menge an Arachidonsäure oder eine modifizierte Menge an Arachidonsäure aufweisen. Im ersten Fall wird ein Teil der natürlich vorkommenden Lipide durch das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens ersetzt. Im letzteren Fall werden natürlich vorkommende Lipide durch das Produkt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ergänzt.
Bevorzugt wird das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens Nahrungsmitteln für Säuglinge bzw. Kleinkinder, wie Säuglingsfertignahrung und Babynahrung zugegeben. Erfindungsgemäß bezieht sich der Ausdruck Säugling bzw. Kleinkind auf Kinder im Uterus und Kinder, die weniger als etwa 2 Jahre alt sind, einschließlich insbesondere von frühgeborenen Kindern. Arachidonsäure ist eine besonders wichtige Komponente für Säuglingsfertignahrung und Babynahrung, wegen des schnellen Wachstums der Kleinkinder (d. h. Verdopplung oder Verdreifachung des Gewichts während des ersten Lebensjahres). Eine wirksame Menge an Arachidonsäure, um Säuglingsfertignahrung zu ergänzen, ist eine Menge, die sich der Konzentration von Arachidonsäure in menschlicher Muttermilch annähert. Bevorzugte Mengen an Arachidonsäure, die Säuglingsfertignahrung oder Babynahrung zugegeben werden, liegen in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1,0% der Gesamtfettsäuren, bevorzugter etwa 0,1 bis 0,6 % der Gesamtfettsäuren, noch bevorzugter etwa 0,4% der Gesamtfettsäuren.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein therapeutisches Mittel, das das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält. Das therapeutische Mittel kann verwendet werden zur Behandlung von Kleinkindern mit Arachidonsäuremangel. Das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in einem parenteralen Präparat enthalten sein, das dem Kleinkind über parenterale Wege verabreicht werden kann, um die Zufuhr von Arachidonsäure für das Kleinkind zu verstärken. Bevorzugte parenterale Wege schließen subkutane, interdermale, intravenöse, intramuskuläre und intraperitoneale Wege ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Ein parenterales Präparat kann das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens und einen Träger, der für die parenterale Abgabe geeignet ist, einschließen. Der Ausdruck "Träger", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jede Substanz, die als Vehikel geeignet ist, um ein Molekül oder eine Zusammensetzung an einer geeigneten Stelle in vivo abzugeben. Beispiel für solche Träger schließen Wasser, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Ringerlösung, Dextroselösung, serumhaltige Lösungen, Hanks-Lösung und andere wässrige physiologisch ausgeglichene Lösungen ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Annehmbare Protokolle, um Arachidonsäure in wirksamer Weise zu verabreichen, schließen die einzelne Dosisgröße, die Anzahl der Dosen, Häufigkeit der Verabreichung der Dosis und die Art der Verabreichung ein. Die Bestimmung solcher Protokolle kann vom Fachmann auf diesem Gebiet erreicht werden, abhängig von einer Vielzahl von Variablen, einschließlich dem Gewicht des Kleinkindes und dem Ausmaß des Arachidonsäuremangels. Das therapeutische Mittel, das das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält, kann auch zur Behandlung von Erwachsenen verwendet werden, insbesondere von Schwangeren. Annehmbare Protokolle zur Verabreichung von Arachidonsäure an Erwachsene schließen parenterale Fütterungstechniken oder Verkapseln von Öl, das von einem Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung gewonnen wurde, in eine Kapsel, wie eine Gelatine-(d. h. verdaubare) Kapsel für die orale Verabreichung und/oder als flüssiges Nahrungspräparat ein. Ein flüssiges Nahrungspräparat kann eine flüssige Zusammensetzung umfassen, die Nährstoffe enthält, die geeignet sind zur Ergänzung einer Diät oder Nährstoffe, die als vollständige Nahrung ausreichend sind.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung des Produkts des erfindungsgemäßen Verfahrens al Reagenz, um Regulatoren der metabolischen Wege zu identifizieren, für die Arachidonsäure ein Vorläufer ist. Z. B. ist Arachidonsäure ein Vorläufer für Leukotriene. Es wird angenommen, dass Leukotriene an dem Auftreten bestimmter Krankheiten beteiligt sind, die Entzündung und Allergie beinhalten. Als solche können Inhibitoren der Leukotrienproduktion wertvolle therapeutische Mittel sein. Das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann verwendet werden, um mögliche hemmende Mittel in vitro zu testen, indem der mögliche Inhibitor mit dem Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens unter geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, inkubiert wird und die Leukotrienproduktion gemessen wird.
Die folgenden Beispiele und Testergebnisse werden zum Zwecke der Erläuterung angegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung nicht beschränken.

BEISPIELE

Beispiel 1

Diese Beispiel beschreibt die Herstellung von Arachidonsäure durch den Stamm S12 von Mortierella sect. schmuckeri, der ein Stamm von Mortierella schmuckeri ist.
Ein Stamm von Mortierella schmuckeri wurde mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert. Ein solcher Stamm wird hier als S12 bezeichnet. Ein Teil mit 1 cm² eines Mortierella schmuckeri-Stamms S12 wurde aus einer festen Agarplatte geschnitten und in 100 ml Aliquot Medium gebracht, das 10 Gramm pro Liter (g/l) Maiseinweichwasser, 0,1 g/l CaCO&sub3;, 0,1 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 Milliliter pro Liter (ml/l) PII Metalle (6,0 g Na&sub2;EDTA, 0,24 g FeCl&sub3;·6H&sub2;O; 6,84 g H&sub3;BO&sub3;; 0,86 g MnCl&sub2;·4H&sub2;O; 0,133 g ZnSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,026 g CoCl&sub2;·6H&sub2;O; 0,005 g NaMoO&sub4;·2H&sub2;O; 0,002 g CuSO&sub4;·5H&sub2;O und 0,052 g NiSO&sub4;·6H&sub2;O, gelöst in einem Liter Wasser und der pH eingestellt auf 8,0) und 1 ml/l Vitaminmischung (100 mg/l Thiamin; 500 ug/l Biotin und 500 ug/l Vitamin B12) in 250 ml Schüttelkolben mit Prallblechen enthielt. Die Kulturen wurden 72 Stunden lang bei 30ºC auf einem Drehschüttler (225 Upm) inkubiert. Nach 72 Stunden hatten die Kulturen eine hohe Dichte und das Wachstum hatte aufgehört.
Die Zellen in den Kolben wurden dann gesammelt, um die aschefreien Trockengewichte zu bestimmen und den Fettsäuregehalt der Zellen quantitativ auszuwerten. Die Zellen von Mortierella schmuckeri Stamm S12 wurden geerntet und zentrifugiert. Fettsäuren in der Trockenbiomasse von geernteten Zellen wurden dann in 4% methanolischer H&sub2;SO&sub4; (4 ml H&sub2;SO&sub4; in 96 ml Methanol) bei 100ºC eine Stunde lang methyliert. Die Fettsäuremethylester wurden dann mit Gaschromatographie quantitativ ausgewertet (Varian 3500 Gaschromatograph, Supelco SP 2330 Säule; Anfangssäulentemperatur = 70ºC; Detektortemperatur = 250ºC; Injektortemperatur = 220ºC; Trägergas = Helium; Temperaturprogramm: Anfangssäulentemperatur = 3 Minuten 70ºC lang, 20ºC pro Minute auf 195ºC, dann 5 Minuten halten, dann 25ºC pro Minute auf 220ºC, dann 8 Minuten halten). Die Zusammensetzung der Fettsäuren in der Pilzbiomasse ist in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 S12 Fettsäureprofil
*TFA = Gesamtfettsäuren
*dwt = Zelltrockengewicht
Die Ergebnisse zeigten, dass unter diesen Fermentationsbedingungen die Biomasse des Stamms S12 etwa 33,7% Fettsäuren enthielt. Ungefähr 40,3% der Gesamtfettsäuren wurden von Arachidonsäure gebildet. Der Arachidonsäuregehalt der Biomasse war daher 13,6% Zelltrockengewicht.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung, wenn das Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff in dem Fermentationsmedium variiert wird, auf die Arachidonsäureerzeugung bei der Fermentation von Zellen von Mortierella schmuckeri Stamm S12.
Fermentationkulturen wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zahlreiche Fermentationsproben wurden hergestellt, die steigende Konzentrationen von Glucose hatten (die Mengen sind in Tabelle 2, erste Spalte, gezeigt). Die relativen Mengen der Gesamtfettsäuren von Arachidonsäure wurden mit dem in Beispiel beschriebenem Verfahren gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Stamm S12: Wirkung d. C N/Verh. auf Trockengew., Lipid und Arachidonsäureausbeuten
Die Ergebnisse zeigten, dass das optimale Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff für die Fermentation von Stamm S12 etwa 40 : 1 bis etwa 60 : 1 ist. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die Menge an Arachidonsäure, die von S12-Zellen erzeugt wird, erhöht werden kann, indem die Menge an Nicht- Kohlenstoffnährstoffen, insbesondere Stickstoff, in dem Fermentationsmedium beschränkt wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert die Wirkung der Nährstoffmanipulationen auf die Arachidonsäureerzeugung durch Mortierella schmuckeri Stamm S12 und Mortierella camargensis Stamm S3.
Ein Stamm von Mortierella camargensis wurde identifiziert mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Ein solcher Stamm wird hier als S3 bezeichnet. Fermentationskulturen wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zahlreiche Fermentationsproben wurden hergestellt, bei denen verschiedene Nährstoffe aus dem Fermentationsmedium entfernt waren. Die Nährstoffe, die aus den verschiedenen Fermentationsproben entfernt waren, sind in Tabelle 3 (erste Spalte) gezeigt. Die relativen Mengen der gesamten Fettsäuren und der Arachidonsäure wurden gemessen mit dem in. Beispiel 1 beschriebenem Verfahren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Stämme S12 und S3 Auswertung eines Nährstoffwegfalls auf die ARA Produktion
Die Ergebnisse zeigten, dass für beide Stämme von Mortierella sect. schmuckeri eine Minimierung der Magnesiumkonzentration im Fermentationsmedium eine größere Wirkung auf die Arachidonsäureproduktion hatte, als die Entfernung von Kalzium, Vitaminen, Spurenmetallen und Kaliumphosphat. Z. B. war die Menge an Arachidonsäure, die von Zellen des Stammes S12 erzeugt wurde, die in Abwesenheit von Magnesium gezüchtet wurden, etwa 0,7 g Arachidonsäure pro Liter, während die Arachidonsäureproduktion durch Zellen des Stamms S12, die ohne Calcium gezüchtet wurden, durchschnittlich etwa 0,4 g Arachidonsäure pro Liter war.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt einen Vergleich der Arachidonsäureproduktion von Mortierella camargensis Stamm S3 zwischen Zellen die in Gegenwart oder in Abwesenheit von Maiseinweichwasser, einer komplexen Stickstoffquelle, gezüchtet wurden.
Eine erste Fermentationprobe wurde hergestellt unter Verwendung des Verfahrens und des Kulturmediums, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Eine zweite Fermentationsprobe wurde hergestellt unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Mediums, wobei aber an Stelle von Maiseinweichwasser Hefeextrakt als Stickstoffquelle verwendet wurde. Lipide wurden aus den Zellen von Stamm S3 hergestellt und analysiert unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methode. Die Zusammensetzung der Fettsäuremischung, die aus jedem der vorhergehenden Fermentationsverfahren erhalten wurde, ist in den Tabellen 4 und 5 gezeigt. Die S3 Probe, die mit Maiseinweichwasser gezüchtet wurde, enthielt 35,9% des Trockengewichts in Form von Fettsäuren. Der Arachidonsäuregehalt dieser Probe war 10,8% des Zelltrockengewichts. Bei der S3-Probe, die ohne Maiseinweichwasser gezüchtet worden war, wurde gefunden, dass sie 19,8% des Trockengewichts als Fettsäuren enthielt. Der Arachidonsäuregehalt der Probe war 4,8% des Zelltrockengewichts. Tabelle 4 S3 Stamm gewachsen auf Maiseinweichwasser
*TFA = Gesamtfettsäuren
*dwt = Zelltrockengewicht Tabelle 5 S3 Stamm gewachsen ohne Maiseinweichwasser
*TFA = Gesamtfettsäuren
*dwt = Zelltrockengewicht
Die Ergebnisse zeigten, dass die Zugabe von Maiseinweichwasser als Stickstoffquelle zu dem Fermentationsmedium die Arachidonsäureproduktion durch S3- Zellen etwa um das zweifache verstärkte. Z. B. erzeugten S3- Zellen, die in Gegenwart von Maiseinweichwasser wuchsen, etwa 107,8 mg Arachidonsäure pro Gramm Pilzbiomasse. Arachidonsäure bildete etwa 30% aller Fettsäuren. Umgekehrt erzeugten S3-Zellen, die ohne Maiseinweichwasser gezüchtet wurden, etwa 48,8 mg Arachidonsäure pro Gramm Pilzbiomasse. Arachidonsäure bildete etwa 24,7% aller Fettsäuren. Somit verbesserte die Fermentation in Gegenwart von Maiseinweichwasser (einer komplexen Stickstoffquelle) die Produktion von Arachidonsäure.
Die Ergebnisse zeigen, dass Maiseinweichwasser eine der besten komplexen Stickstoffquellen zur Stimulierung der Arachidonsäureerzeugung bei Stamm S3 ist. Die Arachidonsäureproduktion wird jedoch bei Stamm S12 (Mortierella schmuckeri) von einem breiteren Bereich an komplexem Stickstoff stimuliert, u. a. von Maiseinweichwasser, Hefeextrakt, Hefe, Molke und Sojamehl, ohne darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 5

Diese Beispiel beschreibt einen Vergleich zwischen dem Arachidonsäuregehalt von Mortierella camargensis Stamm S3 und Mortierella schmuckeri Stamm S12 mit bereits bekannten ATCC- Stämmen der Sektion schmuckeri von Mortierella
Vier Stämme, Mortierella camargensis Stamm S3, Mortierella schmuckeri Stamm S12 und Mortierella schmuckeri (ATCC Nr. 42658) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Maiseinweichwasser gezüchtet, wie in Beispiel 4 beschrieben. Der Fettsäuregehalt des S3-Stamms und der zwei bekannten Stämme wurde mit der in Beispiel 1 beschriebenen Methode gemessen. Ein Vergleich der Ausbeute an Gesamtfettsäuren und der Arachidonsäureausbeute ist unten in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Vergleich von Arachidonsäure und Gesamtfettsäureproduktion bei Stämmen vom Mortierella aus der Schmuckeri Gruppe der Pilze
w/o csl = ohne Maiseinweichwasser
w/csl = mit Maiseinweichwasser
%dwt = Prozent Trockengewicht der Biomasse
Den in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse kann entnommen werden, dass die Gegenwart von Maiseinweichwasser in dem Fermentationsmedium die Produktion der Gesamtfettsäuren um etwa das Zweifache bei Stamm S3 und Stamm S12 erhöht und um etwa ein Drittel bei Mortierella schmuckeri (ATCC Nr. 42658). Während jedoch die Gegenwart von Maiseinweichwasser im Fermentationsmedium den Arachidonsäuregehalt (als %dwt) um etwa das Zweifache bei Stamm S3 erhöhte, beeinflusste Maiseinweichwasser die Arachidonsäureproduktion bei Mortierella schmuckeri (ATCC Nr 42658) nicht. Mortierella clausenii (ATCC Nr. 64864) zeigte kein signifikantes Wachstum, weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von Maiseinweichwasser.

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt die Analyse der Fermentationsproduktivität und des Lipidgehalts von Öl, das aus Mortierella schmuckeri Stamm S12 erhalten wurde.
Die Fermentationen wurden durchgeführt unter Verwendung von Mortierella schmuckeri Stamm S12 in zwei 14 Liter Fermentionskulturen, die als Gefäß B20 und B23 bezeichnet werden. 14-3 Medium wurde in Gefäß B20 verwendet und M-6 Medium wurde in Gefäß B23 verwendet. M-3 Medium enthielt 12 g/l Cargill 200/20 Sojamehl, 0,1 g/l MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,1 g/l CaCO&sub3;, 1 ml/l PII Metalle, 1 ml/l Vitaminmischung, 2 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 43,8 g/l Glucose und 0,5 ml/l K60K Antischaummittel. M-6 Medium hatte die gleichen Inhaltsstoffe, wie das M-3 Medium außer, dass es 12 g/l Nutrex 55 (Red Star Specialty Products, Milwaukee, WI) enthielt, eine sprühgetrocknete Form inaktiver Bäckerhefe, anstelle von Sojamehl. Die Ölproben wurden gereinigt und auf den Arachidonsäure-(ARA)-Gehalt analysiert Die Ergebnisse dieser zwei Fermentationen sind in Tabelle 7 unten gezeigt. Tabelle 7 ARA Produktion durch S12 Zellen bei grossen Fermentationen
Das Öl wurde aus der Pilzbiomasse, die in den zwei Fermentationen erzeugt worden war, gemäß dem folgenden Verfahren extrahiert. Proben der S12-Fermentationsbrühe aus den Gefäßen B23 und B20 wurde in Vakuum filtriert, um einen Kuchen aus Biomaterial zu erzeugen, der isoliert wurde und in einem Dampfofen getrocknet wurde Das getrocknete Biomaterial (200 g) wurde mit Hexan (2 · 600 ml) in einem Waring-Mischer extrahiert, um das Nassmahlverfahren nachzuahmen. Die gemahlene Pilzbiomasse wurde filtriert, um Feststoffe zu entfernen, und das Hexan wurde verdampft, was ein rohes Öl lieferte. Ungefähr 75% des theoretischen Ölgehalts wurden mit den Nassmahlverfahren gewonnen. Das rohe Öl wurde gereinigt, indem es durch eine Säule von Silicagel geleitet wurde und die neutrale Ölfraktion (Triacylglyceride) wurde isoliert, indem die Säule mit 30% Ethanol in Essigsäure in Hexan eluiert wurde. Fraktionen, die neutrales Öl enthielten (90% des rohen Öls) wurden zusammengefasst und eingeengt, was eine reine Ölfraktion ergab, die mit Gasflüssigchromatographie analysiert wurde. Die Ergebnisse der Fettsäurenanalysen, die an den gereinigten Ölproben durchgeführt wurden, sind in Tabelle 8 unten gezeigt. Tabelle 8 Fettsäuregehalt von S12 Öl
Die Ergebnisse zeigen, dass das gereinigte Öl, das aus der im Gefäß B20 erzeugten Biomasse erhalten wurde, 41% Arachidonsäure enthielt und das Öl aus der im Gefäß B23 erzeugten Biomasse 37% Arachidonsäure enthielt.
Obwohl verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben wurden, ist es offensichtlich, dass Modifikationen und Anpassungen dieser Ausführungsformen auftreten. Es versteht sich jedoch, dass solche Modifikationen und Anpassungen im Schutzbereich der Erfindung liegen, wie er in den folgenden Ansprüchen ausführt ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Fettsäurematerial, das Arachidonsäure enthält, wobei das Verfahren Züchten von Mikroorganismen der Gattung Mortierella in einem eine Quelle für assimilierbaren organischen Kohlenstoff und eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Medium umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen von der Gattung Mortierella Sektion schmuckeri sind, wobei die Mikroorganismen mindestens 0,70 Gramm Arachidonsäure pro Liter pro Tag erzeugen können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin Gewinnen von Arachidonsäure enthaltenden Lipiden aus dem Fettsäurematerial umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Medium eine komplexe Stickstoffquelle umfasst, die die Arachidonsäure- Erzeugung von dem Mortierella Sektion schmuckeri um mindestens 50%, gemessen als Prozent Zelltrockengewicht oder Prozent Gesamtfettsäuren in einem Öl, verglichen mit Mortierella Sektion schmuckeri, das in Abwesenheit der komplexen Stickstoffquelle gewachsen ist, erhöht.

4. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Mikroorganismen der Gattung Mortierella Sektion schmuckeri von der Art Mortierella schmuckeri und/oder Mortierella camargensis sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Mikroorganismen der Gattung Mortierella Sektion schmuckeri von den Arten Mortierella camargensis sind.

6. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Mikroorganismen unter Flüssigkulturbedingungen als eine disperse filamentöse Form wachsen können.

7. Therapeutisches Mittel, umfassend das durch das Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch erhaltene Produkt.

8. Nahrungsmittel, umfassend das nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltene Produkt.

9. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen Produkts als Nahrungszusatz.

10. Verwendung des nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen Produkts als Reagenz, um Regulatoren metabolischer Wege, für die Arachidonsäure die Vorstufe darstellt, zu identifizieren.