KR101194235B1 - 장쇄 고도 불포화 지방산을 구성요소로서 포함하는 인지질의 제조방법, 및 그 이용 - Google Patents

장쇄 고도 불포화 지방산을 구성요소로서 포함하는 인지질의 제조방법, 및 그 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LCPUFA-PL을 효율적이고 안정적으로 제조하는 방법을 제공한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 장쇄 고도 불포화 지방산(LCPUFA)를 구성요소로서 포함하는 지질을 생산하는 지질 생산균을 출발원료로 하여, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 인지질(LCPUFA-PL)을 제조하는 인지질의 제조방법으로서, 상기 지질 생산균 균체로부터 트리글리세리드(TG)를 포함하는 유지를 추출한 후의 탈지균체로부터 인지질(PL)을 추출하는 PL 추출공정을 포함하는 인지질의 제조방법을 제공한다.
인지질, LCPUFA, LCPUFA-PL, 지질 생산균, PL 추출

Description

장쇄 고도 불포화 지방산을 구성요소로서 포함하는 인지질의 제조방법, 및 그 이용{PROCESS FOR PRODUCING PHOSPHOLIPID CONTAINING LONG CHAIN POLYUNSATURATED FATTY ACID AS CONSTITUENT THEREOF AND UTILIZATION OF THE SAME}
본 발명은 장쇄 고도 불포화 지방산을 구성요소로서 포함하는 인지질의 제조방법, 및 그 이용에 관한 것으로서, 특히 상기 인지질을 효율적이고 안정적으로 제조하는 방법과, 이 제조방법에 의해 얻어지는 인지질 및 그 대표적인 이용에 관한 것이다.
인지질(PL)에는 뇌기능 개선 효과나 항스트레스 효과, 콜레스테롤 저하 작용 등 다양한 생리 기능이 알려져 있다. PL에는 몇 가지 종류가 알려져 있으며, 주요한 것으로서는, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI) 등을 들 수 있다. 이 PL들은 각각 다른 기능 및 물성을 갖고 있다.
PL 중에서도, 탄소수 20 이상인 장쇄 고도 불포화 지방산(LCPUFA로 약칭함)을 구성요소로 하는 인지질(설명의 편의상, LCPUFA-PL로 약칭함)은, 뇌기능 개선효과가 높고, LCPUFA를 구성 성분으로 하지 않는 인지질(설명의 편의상, non-LCPUFA- PL로 약칭함)보다 높은 효과를 가지고 있다(예를 들면, 비특허 문헌 1 참조). 또한 LCPUFA의 구체적인 예로서는, 예를 들어 도코사헥사엔산(DHA)나 아라키돈산(AA) 등을 들 수 있다.
또한 인지질형이 아닌 LCPUFA 유도체에도 뇌기능 개선 효과가 있음이 알려져 있다(예를 들면, 특허 문헌 1 참조). 단 인지질형이 아닌 LCPUFA 유도체의 뇌기능 개선 효과는 상기 LCPUFA-PL나 non-LCPUFA-PL 등의 인지질과는 달리, 대뇌의 해마에 대한 작용에 의거하는 것으로 여겨지고 있다.
LCPUFA-PL의 뇌기능 개선효과가 우수한 이유로서는, (1)뇌 내에서 실제로 존재하고 있는 구조이며, (2)뇌혈관 관문을 통과할 수 있으며, (3)간장을 경유하지 않고 흡수되기 때문에 간장에서 포착 또는 변형(수식)되지 않고 뇌 등의 조직에 도달하는 등의 각 이유를 들 수 있다.
각 이유에 대해 구체적으로 설명한다. 우선 (1)의 이유에 대해서는, 뇌 내의 LCPUFA는 거의 인지질의 형태로 존재함이 알려져 있다. 더욱 구체적으로는 LCPUFA는 주로 상기 PC, PS, PE, PI 등의 화합물로서 존재하고 있으며, 뇌 내에서 다양한 기능을 발휘하고 있다. 이어서, (2)의 이유에 대해서는, 표식한 인지질을 경구섭취하면 뇌조직에서 표식한 인지질이 검출됨을 통해, 인지질이 뇌조직에 도달하는 것을 알 수 있다(비특허 문헌 2 참조). 또한 (3)의 이유에 대해서는, 인지질이 흡수될 때에는 소화기관 내에서, 구성하는 2개의 지방산 중 하나가 가수분해되어 리소 인지질이 생성된다. 이 리소 인지질이 소장에서 흡수되어 소장 세포 내에서 인지질로 재구성된 후 림프관에서 흡수된다(비특허 문헌 3 참조). 이로 인해 LCPUFA-PL은 간장을 경유하지 않고 생체의 전신으로 운반되게 된다.
상기 LCPUFA-PL은 종래부터 이것을 포함하는 동물의 장기나 알 등으로부터 조제 또는 정제함으로써 생산되고 있다. 구체적으로는 소 뇌로부터의 조제나, 돼지 간장 혹은 물고기 알로부터의 인지질 획분의 정제 등을 들 수 있다(특허 문헌 2 및 3 참조). 또한 어떤 종류의 해양세균이 LCPUFA-PL을 생산하는 것 또한 알려져 있다(비특허 문헌 4 참조). 나아가, 아라키돈산을 생산하는 사상균이, 아라키돈산을 함유하는 대량의 트리글리세리드와 함께 아라키돈산을 함유하는 미량의 인지질을 생산하는 것도 알려져 있다(비특허 문헌 5 참조).
그런데 인지질의 공업적인 생산은, 일반적으로, 원료로부터 트리글리세리드를 주성분으로 하는 유지를 추출할 때, 이 유지와 함께 추출된다. 추출시의 용매로서는 헥산 등이 이용된다. 추출된 유지에는 검질(gum substance)이 포함되어 있는데, 이 검질은 유지의 착색, 거품 발생의 원인이 된다. 여기서, 검질을 탈검공정으로 제거하게 되는데, 이 공정에서 대부분의 인지질이 검질로 이행하므로, 이 검질을 정제함으로써 인지질을 제조한다.
예를 들면, 인지질 중 대두 레시틴을 제조하는 경우에는, 먼저 원료가 되는 대두로부터 헥산을 용매로 하여 원유를 추출한다. 잔사의 탈지 대두는 식품 또는 사료 등으로 이용한다. 한편 원유에는 검질이 포함되므로 탈검공정에 의해 검질을 분리하여 이 검질을 정제한다. 이에 의해 대두 레시틴이 제조된다. 상기 일련의 대두 레시틴 제조 과정에 있어서의 대두 레시틴 즉 인지질의 소재를 확인하면 원유 내에는 1.5~2.5%의 인지질이 포함되어 있는 반면, 정제유 내에는 0.05% 이하의 인 지질 밖에 포함되어 있지 않다. 따라서 주로 탈검공정에서 인지질이 제거되고 있음이 밝혀졌다(비특허 문헌 6 참조).
[특허문헌 1]
일본 특개 2003-48831호 공보(2003년(평성 15) 2월 21일 공개)
[특허문헌 2]
일본 특개평 11-35587호 공보(1999년(평성 11) 2월 9일 공개)
[특허문헌 3]
일본 특개평 8-59678호 공보(1996년(평성 8) 3월 5일 공개)
[비특허문헌 1]
G. Toffano et al., Nature Vol.260 p331-333(1976)
[비특허문헌 2]
G. Toffano et al., Clinical Trial Journal Vol.24 p18-24(1987)
[비특허문헌 3]
이마이즈미 카츠미, 임상 영양, 제67권, p119(1985)
[비특허문헌 4]
야자와 카즈나가 등, 유(油)과학, 제44권, p787-793(1995)
[비특허문헌 5]
S. jareonkitmongkol et al., Apple Environ Microbiol Vol.59 p4300-4304(1993)
[비특허문헌 6]
유지?유량 핸드북 p178-184 사이와이 서방(1988)
그러나 상기 종래의 기술에서는 LCPUFA-PL을 효율적이고 안정적으로 제조하는 것이 곤란한 문제가 있었다.
구체적으로는 현재 입수할 수 있는 LCPUFA-PL은, 일반적으로는 상술한 동물의 장기나 난황 등을 유래로 하기 때문에 한정된 공급원으로부터 소량 밖에 얻을 수 없게 된다. 이로 인해, 그 공급량이 불안정해질 뿐 아니라, 품질은 반드시 안정되어 있는 것은 아니다. 나아가 소 뇌를 비롯한 동물 장기에 대해서는 광우병의 유행 이후, 이용이 매우 곤란한 상황이다.
또한 미생물을 이용한 기술의 경우, 해양 세균 유래의 LCPUFA-PL은 사람이나 동물에는 거의 보이지 않아 세균 특유의 지방산인 분기형 지방산을 주요한 성분으로서 포함하고 있어, 영양 조성물로서는 적합하지 않다. 또한 아라키돈산을 생산하는 사상균은 아라키돈산을 함유하는 인지질을 생산하나, 대량의 트리글리세리드에 혼입된 미량 성분으로서 검출되고 있음에 불과하다. 이로 인해 산업적으로 이용하는 것은 곤란하다.
본 발명은, 상기의 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은, LCPUFA-PL을 효율적이고 안정적으로 제조할 수 있고, 저렴하고 공급량이나 품질이 안정된 LCPUFA-PL을 공급하는 것이 가능한 기술과, 그 대표적인 이용 기술을 제공함에 있다.
본 발명자는 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, LCPUFA 지질을 생산하는 지질 생산균을 출발원료로 하여 LCPUFA-PL을 제조하는 경우, (1)먼저, 균체로부 터 트리글리세리드를 추출하면 트리글리세리드와 함께 인지질도 추출될 것으로 예상됨에도 불구하고 실제로는 트리글리세리드를 주성분으로 하는 추출물 획분에는 인지질이 거의 검출되지 않고, 트리글리세리드를 추출한 후에 남는 미생물 균체 잔사(탈지균체) 내에 대량의 LCPUFA-PL가 잔존하고 있는 것, (2)또한 상기 탈지균체로부터는, 유기용매 등의 추출매를 이용한 간편한 조작에 의해 LCPUFA-PL을 용이하게 추출하는 것이 가능함을 발견하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉 본 발명에 따른 인지질의 제조방법은, 장쇄 고도 불포화 지방산(LCPUFA)을 구성요소로서 포함하는 지질을 생산하는 지질 생산균을 출발원료로 하여, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 인지질(LCPUFA-PL)을 제조하는 인지질의 제조방법으로서, 상기 지질 생산균 균체로부터 트리글리세리드(TG)를 포함하는 유지를 추출한 후의 탈지균체로부터, 인지질(PL)을 추출하는 PL 추출공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 제조방법에 있어서는, 추가로, 상기 PL 추출공정의 전단에서 실시되고, 상기 지질 생산균 균체로부터 TG를 포함하는 유지를 추출함과 아울러 탈지균체를 얻는 유지 추출공정을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 상기 지질 생산균으로서는, 특히 한정되지 않으나, 모르티에렐라(Mortierella)속, 코니디오보러스(Conidiobolus)속, 위티움(Pythium)속, 피토프토라(Phytophthora)속, 페니시륨(Penicillium)속, 클라도스포륨(Cladosporium)속, 무코르(Mucor)속, 프자륨(Fusarium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 엔토모프토라(Entomophthora)속, 에키노스포란지움(echinosprangium)속, 및 사프롤레그니아(Saprolegnia)속으로부터 선택되는 적어도 1종이 이용되는 것이 바람직하다. 이 중, 상기 지질 생산균으로서 모르티에렐라속이 사용되는 경우, 이 모르티에렐라속의 균이 모르티에렐라 아속인 것이 바람직하고, 이 모르티에렐라 아속의 균이 모르티에렐라?알피나(Mortierella alpina)인 것이 바람직하다.
상기 제조방법에 있어서는, 상기 PL 추출공정에서는, 상기 탈지균체로부터 PL을 추출하기 위한 추출매로서, 지방족계 유기용매 및 물 중 적어도 어느 하나의 추출액, 또는, 초임계 탄산가스를 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 지방족계 유기용매로서, 포화탄화수소, 알콜, 포화탄화수소와 알콜과의 혼합용매, 또는 할로겐화 탄화수소와 알콜과의 혼합용매가 사용되는 것이 바람직하다. 상기 추출액으로서는, 구체적으로는 헥산, 에탄올, 메탄올, 물 함유 에탄올, 이소프로필알콜, 아세톤 중 적어도 어느 하나가 사용되는 것이 바람직하고, 추출액으로서는, 헥산 및 에탄올의 혼합용매가 사용되는 것이 바람직하다. 이 헥산 및 에탄올의 혼합용매에 있어서는, 헥산 : 에탄올의 혼합비가, 체적비로 4:1~0:6의 범위 내에 있는 것이 바람직하다.
또한 상기 제조방법에 있어서는, 상기 유지 추출공정에서는, 가압에 의한 압착추출, 렌더링에 의한 추출, 및 추출매에 의한 추출 중 적어도 어느 하나에 의해, 상기 지질 생산균 균체로부터 유지를 추출하는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 추출매로서, 지방족계 유기용매 및 물 중 적어도 어느 하나의 추출액, 또는 초임계 탄산가스를 사용하는 것이 바람직하다. 이 중, 상기 지방족계 유기용매로서는 헥 산이 사용되는 것이 바람직하다. 또한 상기 유지 추출공정에서 사용되는 지질 생산균 균체는 건조균체인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 인지질은, 상기 인지질의 제조방법에 의해 제조된 것으로서, 구성요소로서 LCPUFA를 포함하는 것이다. 구성요소로서 포함되는 LCPUFA는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 에이코사디엔산, 에이코사트리엔산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코사디엔산, 도코사트리엔산, 도코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 도코사헥사엔산,테트라코사디엔산, 테트라코사트리엔산, 테트라코사테트라엔산, 테트라코사펜타엔산, 및 테트라코사헥사엔산으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다.
또한 상기 LCPUFA의 분자중에 포함하는 탄소-탄소 이중결합 중, 적어도 하나가 공역이중결합으로 되어 있을 수도 있고, 또한 상기 LCPUFA에는, 아라키돈산 및/또는 도코사헥사엔산이 포함되는 것이 더 바람직하다. 또한 모든 LCPUFA-PL의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에 있어서의 아라키돈산의 함유율이 0.3 중량% 이상인 것이 바람직하다.
구체적으로는 상기 LCPUFA-PL로서, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 및 카르디올리핀으로부터 선택되는 적어도 1종의 글리세로인지질을 포함하는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 인지질에 있어서는, LCPUFA-PL로서 적어도 포스파티딜콜린이 포함되어 있는 것이라면, 모든 포스파티딜콜린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에서의 아라키돈산의 함유율이 15 중량% 이상인 것이 바람직하다. 또한 LCPUFA-PL로서 적어도 포스파티딜세린이 포함되어 있는 것이라면, 모든 포스파티딜세린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에서의 아라키돈산의 함유율은 5 중량% 이상인 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 인지질에는, LCPUFA-PL로서 적어도 포스파티디딜콜린 및 포스파티딜세린이 포함되어 있으며, 또한 LCPUFA로서는 적어도 아라키돈산이 포함되어 있음과 아울러, 모든 포스파티딜콜린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에서의 아라키돈산의 함유율이 40 중량% 이상이며, 또한 모든 포스파티딜세린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에서의 아라키돈산의 함유율이 20 중량% 이상인 것도 포함된다.
상기 인지질에 있어서는, 상기 LCPUFA-PL로서, 적어도 디호모-γ-리놀렌산이 LCPUFA로서 포함되어 있는 포스파티딜콜린이 포함되어 있음과 아울러, 모든 포스파디딜콜린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에 있어서의 디호모-γ-리놀렌산의 함유율이 3 중량% 이상일 수도 있고, 상기 LCPUFA-PL로서 적어도 디호모-γ-리놀렌산이 LCPUFA로서 포함되어 있는 포스파티딜세린이 포함되어 있을 뿐 아니라, 모든 포스파티딜세린의 구성요로서 포함되는 총 지방산 내에 있어서의 디호모-γ-리놀렌산의 함유율이 1 중량% 이상일 수도 있다.
본 발명에 따른 지질조성물의 제조방법은, 상기 인지질의 제조방법에 있어서의 PL 추출공정을 적어도 포함함과 아울러, 이 PL 추출공정에서 얻어진 LCPUFA-PL을 포함하는 PL을, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 액상 지질에 용해시켜 인지질 용액을 조제하는 용액조제공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 지질조성물의 제조방법에 있어서는, 추가로, 상기 유지 추출공정을 포함함과 아울러, 이 유지 추출공정에서 얻어진 유지를 상기 액상 지질로서 사용하는 것이 바람직하고, 유지 추출공정에서의 유지의 추출량을 억제함으로써, PL 추출공정에 의해, LCPUFA-PL을 상기 액상 지질에 용해시킨 지질조성물로서 추출하는 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 지질조성물은, 상기 지질조성물의 제조방법에 의해 제조되고, 적어도 LCPUFA-PL 및 LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 액상 지질을 포함하는 것이다. 이 지질조성물에 있어서는, 상기 액상 지질에 있어서의 총 지방산 내에 차지하는 LCPUFA의 비율이 11 중량% 이상인 것이 바람직하다.
혹은, 본 발명에 따른 지질조성물은, 상기 인지질을 포함하는 것이면 가능하고, 반드시 상기 지질조성물의 제조방법에 의해 얻어진 것이 아니어도 무방하다.
본 발명에 따른 지질조성물은, 영양조성물로서 사용될 수 있고, 예를 들면, 캡슐상 또는 정제상으로 가공할 수 있다.
본 발명에서는, 상기 지질조성물을 식품에 이용할 수 있다. 즉 본 발명에는, 상기 지질조성물을 함유하는 식품이 포함된다. 또한 본 발명의 식품에 있어서는, 인지질에 의해 리포솜화된 수중유적형의 분산액을 포함하는 구성일 수도 있다. 더욱 구체적인 식품의 종류의 하나로서는, 영양보조식품을 들 수 있다.
본 발명의 추가적인 다른 목적, 특징, 및 우수한 점은 이하에 나타내는 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 이익은, 첨부 도면을 참조한 다음의 설명에서 명백해질 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에 대해 설명하면 다음과 같으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 본 실시의 형태에서는, 본 발명에 따른 인지질 및 그 제조방법, 본 발명에 따른 지질조성물 및 그 제조방법, 및, 본 발명의 이용의 순서로, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
(Ⅰ) 본 발명에 따른 인지질 및 그 제조방법
본 발명에 따른 인지질은, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 지질을 생산하는 지질 생산균을 출발원료로 하고, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 인지질(LCPUFA-PL)로서, 본 발명에 따른 인지질의 제조방법(이하, 단순히 제조방법으로도 약칭)은, 상기 LCPUFA-PL을 제조하는 방법이나, 특히 본 발명에서는 지질 생산균 균체로부터 트리글리세리드(TG)를 포함하는 유지를 추출한 후의 탈지균체로부터, 인지질(PL)을 추출하는 PL 추출공정을 적어도 포함하고 있다.
즉 본 발명에서는, 트리글리세리드 등의 유지를 제거한 후에 남는 탈지균체(미생물 균체 잔사)를 LCPUFA-PL의 공급원으로 하고 있다. 따라서 본 발명에는 상기 PL 추출공정의 전단에서 실시되고, 상기 지질 생산균 균체로부터 TG를 포함하는 유지를 추출함과 아울러 탈지균체를 얻는 유지 추출공정을 포함하고 있을 수도 있다.
<지질 생산균>
본 발명에서 출발원료가 되는 지질 생산균은, LCPUFA-PL을 생산할 수 있는 미생물이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 예를 들면, 모르티에렐라(Mortierella)속, 코니디오보러스(Conidiobolus)속, 위티움(Pythium)속, 피토프토라(Phytophthora)속, 페니시륨(Penicillium)속, 클라도스포륨(Cladosporium)속, 무코르(Mucor)속, 프자륨(Fusarium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 엔토모프토라(Entomophthora)속, 에키노스포란지움(echinosprangium)속, 사프롤레그니아(Saprolegnia)속 등을 들 수 있다.
출발원료로서 지질 생산균을 선택하는 경우, 생산되는 LCPUFA의 종류에 따라 균주를 1종만을 선택할 수도 있고, 2종 이상을 조합하여 선택하는 것도 가능하다.
상기 지질 생산균 중에서도, 모르티에렐라속은, LCPUFA로서 아라키돈산(AA)을 구성요소로서 포함하는 LCPUFA-PL(AA-PL로 약칭)의 생산능을 갖는 종이나 균주가 많이 알려져 있다. 이 모르티에렐라속을 선택하는 경우에는, 이 모르티에렐라속의 균이 모르티에렐라 아속인 것이 바람직하다. 모르티에렐라 아속의 균으로서는 모르티에렐라 알피나(Mortiella alpina), 모르티에렐라 폴리세팔라((Mortiella polycephala), 모르티에렐라 엑시구아(Mortiella exigua), 모르티에렐라 휘그로필라(Mortiella hygrophila), 모르티에렐라 엘론가타(Mortiella elongata) 등을 들 수 있다.
AA-PL의 생산능을 갖는 모르티에렐라 아속의 균의 더욱 구체적인 균주로서는, 예를 들면, M.폴리세팔라(M.polycephala) IFO6335, M.엘론가타(M.elongata) IFO8570, M.엑시구아(M.exigua) IFO8571, M.휘그로필라(M. hygrophila) IFO5941, M.알피나(M.alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등을 들 수 있다.
또한 모르티에렐라 아속 이외에 AA-PL의 생산능을 갖는 균주로서는, 에키노스포란지움 트랜스버살리스(Echinosporangium tansversalis) ATCC16960, 코니디오보러스 헤테로스포러스(Conidiobolus heterosporus) CBS138.57, 사프롤레그니아 라포니카 (Saprolegnia Lapponica) CBS284.38 등을 들 수 있다.
이 균주들은 모두 오사카시의 재단법인 발효연구소(IFO) 미국의 아메리칸 타이프 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC) 및 centrralbureau voor schimmelcultures(CBS) 등으로부터 아무런 제한 없이 입수할 수 있다.
또한 AA-PL의 생산능을 갖는 모르티에렐라 아속의 다른 균주로서는, 본 발명자들을 포함하는 연구진이 토양으로부터 분리한 균주 M.엘론가타(M. elongata) SAM0219(부다페스트조약에 의거한 국제기탁번호 FERMBP-1239)를 들 수도 있다.
또한 LCPUFA로서 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)를 구성요소로서 포함하는 LCPUFA-PL(DGLA-PL로 약칭함)의 생산능을 갖는 미생물의 더욱 구체적인 균주로서는, 본 발명자들을 포함하는 연구진이 토양으로부터 분리한 균주 M. 엘론가타(M. elongata) SAM1860(부다페스트 조약에 의거한 국제기탁번호 FERMBP-3589)을 들 수 있다.
또한 LCPUFA로서 미드산(mead acid)을 구성요소로서 포함하는 LCPUFA-PL(미드산-PL로 약칭함)의 생산능을 갖는 미생물의 더욱 구체적인 균주로서는, 본 발명자들을 포함하는 연구진이 토양으로부터 분리한 균주 M.알피나(M.alpina) SAM2086(부다페스트 조약에 의거한 국제기탁번호 FERMBP-6032)을 들 수 있다.
<지질 생산균의 배양>
본 발명에서는 상술한 LCPUFA-PL을 생산할 수 있는 미생물(지질 생산균)을 배양하고 충분한 양의 균체를 취득한다. 따라서 본 발명에 따른 제조방법에는, 지질 생산균을 배양하는 지질 생산균 배양공정이 포함되어 있을 수도 있다.
지질 생산균을 배양하는 구체적인 방법은 특별히 한정되지 않으나, 지질 생산균의 종류에 따라 공지의 배양방법으로 배양하면 된다. 일반적으로는 배양하고자 하는 지질 생산균의 균주의 포자, 균사, 또는 미리 배양하여 얻어진 전배양액을, 액체 배지 또는 고체 배지에 접종하여 배양한다. 대량으로 균체를 취득하고자 하는 경우에는 액체 배양이 바람직한 경우가 많다. 배양 설비에 대해서는 특별히 한정되지 않으나 소량의 배양이면 각종 시험관이나 플라스크에 액체 배지를 넣고 진탕배양하거나, 한천플레이트에 접종하여 정치배양하면 된다. 대량의 배양의 경우에는 각종 발효조나 자퍼멘터(jar fermentor)를 이용하면 된다.
배양에 이용되는 배지의 종류도 특별히 한정되지 않으나, 지질 생산균의 종류에 따라 공지의 성분을 적절히 선택하여 조제하면 된다. 혹은 공지의 조성의 배지나 시판중인 배지를 그대로 사용할 수도 있다.
배지가 액체 배지인 경우에는 탄소원은 특별히 한정되지 않으나 일반적인 당류를 바람직하게 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 글루코스, 프락토스, 크실로스, 사카로스, 말토스, 가용성 전분, 당밀, 글리세롤, 만니톨 등을 들 수 있다. 이 탄소원들은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상을 적절히 조합하여 사용할 수도 있다.
질소원도 특별히 한정되지 않으며 공지의 것을 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카자미노산, 콘스티프리큐어(corn steep liquor), 대두 단백, 탈지 대두, 면실 찌꺼기 등의 천연질소원; 요소 등의 유기질소원; 질산나트륨, 질산암모니움, 황산암모니움 등의 무기질소원 ; 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 배양하고자 하는 균주의 종류에 따라 사용하면 되나, 상기 중에서도 특히 대두로부터 얻어지는 천연질소원, 구체적으로는 대두, 탈지대두, 대두플레이크, 식용 대두단백, 비지, 두유, 콩가루 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 이 가운데에서도 탈지대두에 열변성을 실시한 것, 더욱 바람직하게는 탈지대두를 약 70~90%로 열처리하고, 또한 에탄올 가용성분을 제거한 것을 이용할 수 있다. 이 질소원들은 단독으로 사용하는 것도 가능하고, 2종류 이상을 적절히 조합하여 사용하는 것도 가능하다.
상기 탄소원/질소원 이외의 성분도 특별히 한정되지 않으나, 필요에 따라 공지의 미량 영양원 등을 적절히 선택하여 첨가할 수 있다. 미량 영양원으로서는, 예를 들면 인산 이온 등의 무기산 이온; 칼슘 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온 등의 알칼리금속 또는 알칼리토류 금속의 이온 ; 철, 니켈, 코발트, 망간 등의 VIIB~VIII 족의 금속 이온; 구리, 아연 등의 IB~IIB족의 금속 이온; 각종 비타민류; 등을 들 수 있다.
액체 배지에 있어서의 상술한 각 성분의 함유율(첨가율)은, 특별히 한정되지 않고, 지질 생산균의 생육을 저해하지 않는 농도이면 공지의 범위 내로 하면 된다. 실용상, 일반적으로는 탄소원의 총 첨가량은 0.1~40 중량%의 범위 내인 것이 바람직하고, 1~25 중량%의 범위 내가 더욱 바람직하다. 또한 질소원의 총 첨가량은 0.01~10 중량%의 범위 내가 바람직하고, 0.1~10 중량%의 범위 내가 더욱 바람직하다. 또한 배지 유가하는 경우에는 초기의 탄소원의 첨가량을 1~5 중량%의 범위 내로 함과 아울러 초기의 질소원의 첨가량을 0.1~6 중량%의 범위 내로 하는 것이 바람직하다. 배양 도중에 유가하는 배지의 성분은, 탄소원 및 질소원의 쌍방일 수도 있으나, 더욱 바람직하게는 탄소원만을 유가하는 것이 좋다.
또한 본 발명에 따른 제조방법에 있어서는 LCPUFA를 포함하는 불포화지방산의 흡수율을 증가시킬 목적으로, 불포화지방산의 전구체를 배양중에 부가할 수도 있다. 불포화지방산의 전구체로서는 구체적으로는 예를 들어 헥사데칸, 옥타데칸 등의 탄화수소; 올레인산, 리놀산 등의 지방산 또는 그 염; 에틸 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 솔비탄 지방산 에스테르 등의 지방산 에스테르; 올리브유, 대두유, 채종유, 면실유, 야자유 등의 유지류; 등을 들 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다. 이 전구체들은 단독으로 사용할 수도 있고, 2 종류 이상을 적절히 조합하여 사용할 수도 있다.
상기 불포화지방산의 전구체의 첨가량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 배지 전중량에 대해 0.001~10%의 범위 내이면 되고, 0.5~10%의 범위 내인 것이 바람직하다. 또한 이 전구체들을 유일한 탄소원으로 하여 지질 생산균을 배양할 수도 있다.
배양조건도 특별히 한정되는 것은 아니며, 배양하고자 하는 균주의 종류에 따라 적절히 설정하면 된다. 예를 들어, 배양 온도는 일반적으로는 5~40℃의 범위 내이면 되고, 20~30℃의 범위 내인 것이 바람직하다. 또한 먼저 20~30℃의 범위 내에서 배양하여 균체를 증식시킨 후 5~20℃의 범위 내에서 배양을 계속할 수도 있다. 이와 같은 온도 관리를 수행하는, 즉 최초로 비교적 고온에서 배양하고, 그 후 최초의 배양온도보다 저온이 되는 온도 범위에서 배양하면, 생산되는 불포화지방산 내의 고도 불포화지방산(PUFA)의 비율을 높일 수 있다.
배지의 pH도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 pH 4~10의 범위 내이면 되고, pH 5~9의 범위 내인 것이 바람직하다. 배양 기간도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상은 2~30일간의 범위 내이면 되고, 5~20일간의 범위 내가 바람직하며, 5~15일간의 범위 내가 더욱 바람직하다. 배양중에 배지에 실시하는 외적인 처리도 특별히 한정되지 않으나, 통기교반배양, 진탕배양, 정치배양 등의 공지의 배양방법을 적절히 선택하면 된다.
<유지 추출공정>
본 발명에서는, 상기 지질 생산균 배양공정에 의해 집균된 균체에 대해, 먼저 유지 추출공정을 수행한 후 PL 추출공정을 수행한다. 이 유지 추출공정은, 집균된 균체로부터 탈지균체(미생물 균체 잔사)를 제조하기 위한 공정으로서, 이 균체로부터 트리글리세리드 등의 유지를 추출하여 제거한다. 이 공정에서는 LCPUFA-PL의 대부분을 잔존시킨 채, PL 이외의 지질 전부 또는 일부를 제거하게 된다. 다시 말해, 유지 추출공정은, PL 추출공정의 전처리가 된다. 단 이 때 추출되는 트리글리세리드 등의 유지에는, 구성요소로서 LCPUFA가 함유되어 있으므로 이 유지는 LCPUFA를 함유하는 유지로서 높은 상품가치를 갖는다.
유지 추출공정에서는 집균한 후의 상태 그대로의 균체, 즉 생균인 채로 이용할 수 있으며, 멸균처리한 후 이용할 수도 있다. 또한 집균하지 않고 배양액인 채로 처리하는 것도 가능하다. 집균한 균체는 괴상인 채로 이용할 수도 있고, 판상, 끈상, 입상, 분말상 등 임의의 형상으로 가공한 후 이용할 수도 있다. 균체의 집균 방법도 특별히 한정되는 것은 아니며, 배양한 균체가 소량인 경우에는 일반적인 원심분리기를 이용하여 원심분리하면 된다. 대량인 경우에는 연속원심분리에 의해 분리하는 것이 바람직하나 여기에 막 등에 의한 여과를 조합하는 것도 가능하다.
또한 집균한 균체는 습균체 상태 그대로일 수도 있고, 습균체를 건조시킨 건조균체로서 이용할 수도 있다. 특히 본 발명에서는, 건조균체를 이용하는 것이 바람직하다. 이에 의해 효율적으로 유지를 추출할 수 있다(실시예 참조). 습균체의 건조방법은 특별히 한정되는 것이 아니고, 송풍, 열처리, 감압처리, 동결건조 등의 공지의 건조처리를 들 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 제조방법에 있어서는, 지질 생산균 배양공정 후에 균체를 집균하는 집균공정, 집균한 균체를 가공하는 균체 가공공정이 포함되어 있을 수도 있다. 균체 가공공정에서 수행되는 가공에는, 집균한 균체를 임의의 형상으로 만들거나, 습균체를 건조시켜 건조균체로 만드는 가공이 포함된다.
상기 유지 추출공정에서는, 균체로부터 유지를 추출하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지의 추출방법을 이용할 수 있다. 구체적으로는 가압에 의한 압착추출, 열수나 스팀을 이용한 렌더링에 의한 추출, 각종 추출매에 의한 추출의 적어도 어느 하나를 들 수 있다.
상기 가압에 의한 압착추출로서는, 원료에 압력을 가하여 균체중의 유분을 압출하는 방법이면 특별히 한정되지 않으나, 구체적으로는 예를 들어, 배치(batch)식의 유압프레스, 연속식의 익스펠러 등의 장치를 이용하는 방법을 들 수 있다.
상기 렌더링에 의한 추출로서는, 건식 또는 습식 중의 어느 한 방법을 사용할 수 있으며 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로는 직화에 의한 건식법, 오토클레이브에 의한 스팀 렌더링(습식법) 등을 들 수 있다.
건식법에 대해 구체적으로 설명하면, 예를 들어 균체를 직화나 쟈켓 증기 가열 등에 의해 유지를 용출시킨다. 또한 스팀 렌더링에 대해 구체적으로 설명하면, 균체에 가열수증기를 불어넣어 가열 및 교반하면 유분이 수분, 단백질 등과 함께 에멀젼의 형태로 얻어진다. 이것을 원심분리기에 의해 폐수를 분리하고, 필요한 경우 여과하여 원유를 얻는다. 스팀 렌더링의 조건으로서는 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 3~4kg/cm2의 가열증기로 4~6 시간 용출시키는 조건을 들 수 있다.
상기 추출매에 의한 추출로서는, 사용되는 추출매는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로는 지방족계 유기용매 및 물 중 적어도 어느 하나의 추출액, 또는 초임계 탄산가스를 들 수 있다. 상기 추출액 중 지방족 유기용매로서는 구체적으로는 예를 들면, 헥산, 석유 에테르(펜탄 및 헥산을 주성분으로 하는 유기용매) 등의 포화탄화수소; 아세톤 등의 케톤류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알콜류; 에틸 아세테이트 등의 에스테르류; 클로로포름, 디클로로메탄 등의 할로겐화 탄화수소; 아세토니트릴 등의 시안화탄화수소; 디에틸에테르 등의 에테르류; 등을 들 수 있다. 상기 추출액 중, 물은 공지의 용질을 용해시킨 수용액으로서 사용할 수도 있다. 이 추출액들은 1종류만을 사용할 수도 있고, 2종류 이상을 적절히 선택하여 사용할 수도 있다. 상기 추출액 가운데에서도 트리글리세리드 등의 유지를 효율적으로 제거하기 위해서는 헥산이나 석유 에테르 등의 포화탄화수소를 이용하는 것이 바람직하고, 헥산이 더욱 바람직하다.
상기 추출매에 의한 추출처리는 배치식으로 수행할 수도 있고 연속식으로 수행할 수도 있다. 또한 추출매에 의한 추출의 조건도 특별히 한정되지는 않으나, 추출하고자 하는 트리글리세리드 등의 유지의 종류나, 균체의 양(체적이나 중량)에 따라 적절한 온도, 적절한 추출매의 양, 적절한 시간으로 추출하면 된다. 추출시에는 균체를 추출매에 분산시킨 후에 부드럽게 교반하는 것이 바람직하다. 이에 의해 효율적인 추출이 가능해진다.
또한 상기 유지 추출공정을 수행한 후, 얻어진 탈지균체를 그대로 연속하여 PL 추출공정에 이용할 수도 있고, 일단, 처리완료된 탈지균체를 거내 보관할 수도 있다. 전술한 바와 같이 유지 추출공정은 탈지균체의 제조공정일 뿐 아니라, 그 자체 상품가치를 갖는 유지의 제조공정이기도 하다. 따라서 유지를 중심으로 본 경우, 탈지균체는 폐기물로서 간주하는 것도 가능하다. 이 때문에 유지를 제조하는 라인에서 부생물로서 얻어진 탈지균체를 보관해 두고, 이 탈지균체를 본 발명의 제조라인에 있어서의 원료로서 이용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 제조방법에서는 유지 추출공정은 필수의 공정은 아니다.
<PL 추출공정>
본 발명에 따른 제조공정에서는 탈지균체로부터 PL을 추출하는 PL 추출공정을 필수의 공정으로서 갖는다. 이 PL 추출공정에 있어서, 탈지균체로부터 PL을 추출하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 상기 유지 추출공정과 마찬가지로 추출매에 의한 추출을 이용하는 것이 바람직하다.
여기서 상기 탈지균체로부터 PL을 추출하기 위한 추출매로서는, 특별히 한정되지 않으나, 상기 유지 추출공정과 마찬가지로, 지방족계 유기용매 및 물 중 적어도 어느 하나의 추출액, 또는 초임계 탄산가스를 바람직하게 사용할 수 있다. 이 추출액들 중, 지방족 유기용매로서는 구체적으로는 예를 들어 헥산, 석유에테르(펜탄 및 헥산을 주성분으로 하는 유기용매) 등의 포화탄화수소; 아세톤 등의 케톤류; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알콜류; 에틸 아세테이트 등의 에스테르류; 클로로포름, 디클로로메탄 등의 할로겐화 탄화수소류; 아세토니트릴 등의 시안화탄화수소; 디에틸에테르류의 에테르류; 등을 들 수 있다. 상기 추출액 중, 물은 공지의 용질을 용해시킨 수용액으로서 사용할 수도 있다. 이 추출액들은 1종류만을 사용할 수도 있고, 2종류 이상을 적절히 선택하여 사용할 수도 있다.
상기 추출액 가운데에서도 지방족계 유기용매로서는, 포화탄화수소, 알콜, 포화탄화수소와 알콜과의 혼합용매, 또는 할로겐화탄화수소와 알콜과의 혼합용매가 이용되는 것이 바람직하다. 포화탄화수소로서는 헥산이 사용되는 것이 바람직하고, 알콜로서는 에탄올이 사용되는 것이 바람직하고, 포화탄화수소와 알콜과의 혼합용매로서는 헥산/에탄올 혼합용매가 사용되는 것이 바람직하고, 할로겐화탄화수소와 알콜과의 혼합용매로서는 클로로포름/메탄올 혼합용매를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 각 유기용매 중에서도 특별히, 식품에 사용하는 경우에는 헥산 및/또는 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 헥산 및 에탄올의 혼합용매를 이용하는 경우에는, 헥산:에탄올의 체적비가 4:1~0:6의 범위 내에서 혼합하면 되고, 4:1~1:4의 범위 내에서 혼합하는 것이 더 바람직하고, 4:1~2:4의 범위 내에서 혼합하는 것이 더욱 바람직하다. 단, 헥산:에탄올=0:6인 경우에는 에탄올 100%의 유기용매를 이용하게 된다. 또한 헥산 및 에탄올의 혼합용매나 에탄올을 이용하는 경우에는 여기에 소량의 물을 첨가할 수도 있다.
상기 추출매에 의한 추출처리는 배치식으로 수행할 수도 있고 연속식으로 수행할 수도 있다. 또한 추출매에 의한 추출의 조건도 특별히 한정되는 것은 아니며, 추출하고자 하는 PL의 종류나, 균체의 양(체적이나 중량)에 따라 적절한 온도, 적절한 추출매의 양, 적절한 시간으로 추출하면 된다. 추출시에는 균체를 추출매에 분산시킨 후 부드럽게 교반하는 것이 바람직하다. 이에 의해 효율적인 추출이 가능해진다.
<기타 공정>
본 발명에 따른 제조방법에서는 상술한 바와 같이 적어도 PL 추출공정을 포함하고 있으면 되고, 바람직하게는 유지 추출공정을 포함하고 있으나, 이 밖의 공정들을 포함할 수도 있다. 기타 공정으로서는, 구체적으로는 예를 들어 전술한 바와 같은 집균공정이나 균체 가공공정 등을 들 수 있다. 이외에도, 후술하는 실시예에도 나타내는 바와 같이, PL 추출공정에서 얻어진 PL을 정제하는 PL 정제공정 등을 들 수 있다.
PL 정제공정의 구체적인 방법, 즉 PL 추출공정에서 얻어진 원료 PL(crude PL)을 정제하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 정제방법을 바람직하게 이용할 수 있다. 후술하는 실시예에서는 박층 크로마토그래피(TLC)이나 아세톤분획에 의해 PL을 정제하고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 칼럼크로마토그래피법 등의 용매 분획법 등을 이용할 수 있다. 크로마토그래피에 사용되는 담체는 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 용매 분획법에 사용되는 용매도 특별히 한정되는 것은 아니며 공지의 용매를 바람직하게 사용할 수 있다.
<본 발명에 따른 인지질>
본 발명에 따른 인지질(PL)은, 상술한 제조방법에 의해 제조된 인지질이다. 다시 말해, 본 발명에 따른 인지질은 지질 생산균 균체로부터 TG를 포함하는 유지를 추출한 후의 탈지균체로부터 추출되어 이루어지는 인지질로서, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 인지질은, 구성요소로서 LCPUFA를 포함하고 있는 것(LCPUFA-PL)이면 특별히 한정되지 않으며, 공지의 모든 인지질을 들 수 있다. 글리세로 인지질로서는 구체적으로는 예를 들어, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜글리세롤(PG), 포스파티딘산(PA), 카르디올리핀(CL) 등의 글리세로 인지질: 스핀고미에린(SP) 등의 스핀고 인지질: 리소포스파티딜콜린(LPC), 리소포스파티딜세린(LPS), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 리소포스파티딜이노시톨(LPI), 리소포스파티딜글리세롤(LPG), 리소포스파티딘산(LPA) 등의 리소 인지질; 등을 들 수 있다. 이 인지지들 중에서도 PC, PS, PE, PI, 포스파티딘산이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 인지질은, 상술한 인지질이 적어도 1종 포함되어 있을 수도 고, 2종 이상의 인지질이 포함되어 있을 수도 있다. 또한 정제공정을 거치지 않은 원료 인지질(crude phospholipids)인 경우에는 각종 미량 성분이 포함되어 있을 수도 있다. 이와 같은 미량성분으로서는 지질 생산균 유래의 인지질 이외의 지질성분(유지 등)을 들 수 있다.
본 발명에 따른 인지질에 구성요소로서 포함되는 LCPUFA로서는, 탄소수 20 이상이고 이중결합을 갖는 불포화구조의 지방산이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 예를 들어 에이코사디엔산; 디호모-γ-리놀렌산, 미드산 등의 에이코사트리엔산; 아라키돈산(AA) 등의 에이코사테트라엔산; 에이코사펜타엔산; 도코사디엔산; 도코사트리엔산; 도코사테트라엔산; 도코사펜타엔산; 도코사헥사엔산(DHA); 테트라코사디엔산; 테트라코사트리엔산; 테트라코사테트라엔산; 테트라코사펜타엔산; 테트라코사헥사엔산; 등을 들 수 있다. 상기 LCPUFA 중에서도 아라키돈산(AA) 및/또는 도코사헥사엔산(DHA)이 더욱 바람직하게 사용된다. 이 LCPUFA들은 LCPUFA-PL의 구성요소로서 1종류만 포함될 수도 있고 2종류 이상 포함될 수도 있다.
상기 LCPUFA에 있어서는 구조중에 포함되는 탄소-탄소 이중결합 구조(-C=C-) 중, 적어도 하나가 공역 이중 결합이 되어 있을 수도 있다. 이 공역 이중 결합은 카르보닐기(C=O)와 공역하고 있는 것일 수도 있고 서로 인접하는 탄소-탄소 이중 결합간에서 공역하고 있는 것일 수도 있다.
상기 LCPUFA-PL에 포함되는 총 지방산중에 차지하는 LCPUFA의 비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만 22 중량% 이상인 것이 바람직하고, 31 중량% 이상이면 더욱 바람직하고, 37 중량% 이상이면 더욱 바람직하다. LCPUFA로서 아라키돈산(AA)이 포함되어 있을 경우에는 LCPUFA-PL에 포함되는 총 지방산중에 차지하는 AA의 비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만 0.3 중량% 이상인 것이 바람직하고, 5 중량% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 20 중량% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 34 중량% 이상이면 특히 바람직하다.
이 가운데에서도 LCPUFA-PL가 PC이면, 모든 PC의 구성 요소로서 포함되는 총지방산 중에 있어서의 AA의 함유율이 15 중량% 이상인 것이 바람직하고, 40 중량%이상인 것이 더 바람직하다. 또한 LCPUFA-PL가 PS이면, 모든 PS의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 중에 있어서의 AA의 함유율은 5 중량% 이상인 것이 바람직하고, 20 중량% 이상인 것이 더욱 바람직하다. 이에 따라 본 발명에 따른 인지질을 영양조성물 등으로서 사용한 경우 더욱 우수한 것을 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 따른 인지질에는 그 제조방법에 상관없이 LCPUFA-PL로서 적어도 PC 및 PS가 포함되어 있으며, 또한 LCPUFA로서 적어도 AA가 포함되어 있는 것도 포함된다. 단 이와 같은, PC/PS를 포함하고, 또한 LCPUFA로서 AA를 포함하는 인지질에 있어서는 모든 PC의 구성요소로서 포함되는 총 지방산중에 있어서의 아라키돈산의 함유율은 40 중량% 이상이 되어 있으며, 또한 모든 PS의 구성요소로서 포함되는 총 지방산중에 있어서의 AA 함유율은 20 중량% 이상으로 되어 있다.
상기 인지질에 있어서는, 또한 LCPUFA로서 DGLA를 포함하는 PC가 적어도 포함되어 있을 수도 있고, 더불어, LCPUFA로서 DGLA를 포함하는 PS도 포함되어 있을 수도 있다. 단, 이와 같이 상기 인지질에, LCPUFA로서 DGLA를 포함하는 PC가 포함되어 있을 경우에는 모든 PC의 구성요소로서 포함되는 총 지방산중에 있어서의 DGLA의 함유율은 3 중량% 이상으로 되어 있다. 또한 상기 PC와 함께 LCPUFA로서 DGLA를 포함하는 PS가 더 포함되어 있을 경우에는 모든 PS의 구성요소로서 포함되는 총 지방산중에 있어서의 DGLA의 함유율은 1 중량% 이상으로 되어 있다.
상기 PC 및 PS의 생체내의 거동 및 생리 작용은 자명하게 다를 뿐 아니라, LCPUFA로서 AA를 포함하고 있으면 이 생체들 내에서의 상승 효과에 의해 본 발명에 따른 인지질을 영양 조성물로 하여 더욱 우수한 것으로 만들 수 있다. 또한 포함되어 있는 LCPUFA가 AA 또는 DGLA이므로 다음에 나타내는 바와 같은 AA 또는 DGLA의 특성이나 기능 등에 의해, 본 발명에 따른 인지질을 영양조성물로 하여 더 한층 우수한 것으로 만들 수 있다.
즉, AA는 고도 불포화지방산의 1종으로서, 혈액이나 간장 등의 중요한 기관을 구성하는 지방산의 약 10% 정도를 차지하고 있다. 구체적으로는 예를 들어 인간 혈액 중의 인지질중의 지방산 조성비에서는, AA는 11%, 에이코사펜타엔산(EPA)는 1%, DHA는 3%로 되어 있다. AA는 세포막의 주요 구성성분으로서, 이 세포막의 유동성의 조절에 관여하고 있으며, 체내의 대사에서 다양한 기능을 나타내는 한편, 프로스타그란딘류의 직접적인 전구체로서 중요한 역할을 담당하고 있음이 알려져 있다.
특히 최근에는 유유아 영양으로서의 AA의 역할이나, AA가 신경활성작용을 나타내는 내인성 칸나비노이드(2-아라키도노일 모노글리세롤, 아난다미드)의 구성 지방산인 점 등이 주목되고 있다. 통상은 리놀산이 풍부한 식품을 섭취하면 체내에서 AA로 변환되는데, 성인병 환자나 그 예비군, 유아, 노인의 경우에는 AA의 생합성에 관여하는 효소의 작용이 저하되고, 이로 인해 AA는 쉽게 부족하게 된다. 이 때문에 AA는 직접 섭취하는 것이 바람직하다.
한편 DGLA도 고도 불포화지방산의 1종으로서, 혈액이나 간장 등의 중요한 기관을 구성하는 지방산으로서 포함되어 있다. 사람 등의 경우에는 DGLA의 조성비는 모든 지방산의 수% 정도로 되어 있다. DGLA도 AA와 마찬가지로 세포막의 유동성의 조절에 관여하고 있으며 체내의 대사에서 다양한 기능을 나타내는 한편, 프로스타그란딘류의 전구체로서 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 특히 DGLA로부터는 프로스타그란딘류 1 시리즈가 산생됨이 알려져 있다.
특히 DGLA로부터 산생되는 프로스타그란딘류 1 시리즈가, 혈소판 응집 억제작용, 혈관 확장 작용, 기관지 확장 작용, 항염증 작용 등을 갖는 것이 주목받고 있다. 통상은 DGLA는 리놀산으로부터 변환되나, 생합성에 관여하는 효소의 작용이 저하된 경우에는 상기 AA와 마찬가지로 부족하기 쉽게 된다. 이 때문에 DGLA도 직접 섭취하는 것이 권장된다.
이와 같이 본 발명에 따른 인지질은 LCPUFA-PL로서 적어도 PC/PS를 포함하고 있으며 나아가 PC/PS의 구성요소로서 AA를 일정량 이상 포함하고 있으므로 영양 조직물로서 매우 뛰어난 것이 된다.
(Ⅱ) 본 발명에 따른 지질조성물 및 그 제조방법
본 발명에 따른 지질조성물은 본 발명에 따른 인지질을 포함하는 것이면 되고 그 조성이나 상태 등은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 하나의 바람직한 조성으로서 용매인 액상 지질에 대해, 용질로서 적어도 LCPUFA-PL을 용해하고 있으며, 상기 액상 지질로서 LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 지질(LCPUFA 지질)이 이용되는 조성을 들 수 있다. 즉 본 발명에 따른 지질조성물의 일 예로서는 LCPUFA-PL을 액상의 LCPUFA지질에 용해시킨 "인지질 용액"으로 되어 있는 구성을 들 수 있다.
<인지질 용액으로 한 경우의 LCPUFA-PL의 흡수>
인지질은 고도로 정제하면 분말상이며, 일반적으로 극히 흡습성이 높고 또한 분해되기 쉽다(생화학실험강좌 3 지질의 과학 p22-23 동경화학동인(1974) 참조). 이 때문에 취급성을 향상시키기 위해 소량의 액상 지질을 용매로 하여, 여기에 인지질을 용해시켜 이용하는(인지질 용액으로서 이용하는) 경우가 많다. 이 때 용매로서 이용되는 액상 지질로서는 트리글리세리드(TG) 등이 바람직하게 사용된다.
여기서 LCPUFA-PL을 상기 인지질 용액으로 한 경우, LCPUFA-PL의 품질 저하를 효과적으로 회피하여 취급성을 높일 수 있음에 반해, 식품으로서 섭취하는 경우에는 LCPUFA-PL의 효율적인 흡수를 방해하는 경향이 있다. 구체적으로는 상기 배경 기술의 항에서도 설명한 바와 같이, 소화관내에서는 인지질은 리소 인지질로 되어 흡수된 후 소장 세포내에서 인지질로 재구성된다. 이 때 인지질이 인지질 용액으로서 섭취되는 경우에는 흡수된 리소 인지질이 인지질로 재구성되는 단계에서, 아실기로서, LCPUFA-PL 유래의 LCPUFA와, 액상 지질 유래의 지방산이 혼재하게 된다.
상기 액상 지질로서 일반적으로 이용되는 TG는, 구성요소로서 LCPUFA를 포함하고 있는 경우는 있으나, 그 함유 농도는 일반적으로 낮다. 이 때문에 아실기로서 존재하는 지방산에는 LCPUFA가 아닌 지방산(편의상, 비LCPUFA 지방산이라 칭함)이 포함되게 된다.
따라서 용매인 액상 지질이 LCPUFA를 그다지 포함하지 않으면, 리소 인지질로부터 인지질로의 재구성시에 비LCPUFA 지방산이 많이 이용되게 된다. 그 결과 고품질의 LCPUFA-PL을 인지질로서 섭취하여도 LCPUFA-PL의 실질적인 흡수량을 크게 저하시키게 된다.
이에 반해 액상 지질로서 구성요로서의 LCPUFA를 높은 함유율로 함유하는 TG 등의 LCPUFA지질을 이용하면 LCPUFA-PL을 효율적으로 흡수시키는 것이 가능해져 매우 바람직하다. 이 때문에 본 발명에 따른 지질조성물로서는, LCPUFA-PL을 액상의 LCPUFA 지질에 용해시킨 구성을 들 수 있다.
<지질조성물의 성분>
상기 인지질 용액의 용매로서 이용되는 액상의 LCPUFA 지질로서는, 특별히 한정되는 것은 아니나, 트리글리세리드, 디글리세리드, 모노글리세리드, 지방산, 지방산 알콜 에스테르 등을 들 수 있다. 또한 LCPUFA 지질의 구성요소로서 포함되는 LCPUFA로서는, 상기 <본 발명에 따른 인지질>의 항에서 설명한 각 LCPUFA를 들 수 있다. 또한 상기와 같이 LCPUFA 지질로서는, 지방산 그 자체를 이용할 수 있으므로 액상의 LCPUFA 그 자체를 LCPUFA 지질로서 이용할 수 있다.
또한 후술하는 바와 같이 LCPUFA 지질로서는 본 발명에 따른 제조방법의 유지 추출공정에서 얻어진 TG를 포함하는 유지를 사용할 수 있다. 본 발명의 유지 추출공정에서 추출되는 트리글리세리드 등의 유지에는 구성요소로서 LCPUFA가 포함되어 있다. 따라서 LCPUFA 유지로서 바람직하게 사용할 수 있다.
여기서 상기 LCPUFA 지질에 있어서의 총 지방산 중에 차지하는 LCPUFA의 비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 11 중량% 이상인 것이 바람직하고, 25 중량% 이상이면 더욱 바람직하고, 27 중량% 이상이면 더욱 바람직하다. LCPUFA로서 아라키돈산(AA)이 포함되어 있을 경우에는 LCPUFA 지질에 포함되는 총 지방산 중에 차지하는 아라키돈산의 비율은 특별히 한정되는 것은 아니나, 9중량% 이상인 것이 바람직하고 20중량% 이상이면 더욱 바람직하다. 또한 상한에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니고 비율이 높으면 높을수록 좋다.
총 지방산 중에 차지하는 LCPUFA의 비율은 상기 수치 이상이면 지질조성물 전체적으로 본 경우에 총 지방산 중의 LCPUFA의 비율이 저하되는 것을 억제 또는 회피할 수 있다. 다시 말해, LCPUFA-PL과 공존하는 액상 지질에 포함되는 LCPUFA의 함유율을 높이게 된다. 이로 인해 소장에서 흡수되었을 때, 리소 인지질로부터 인지질로의 재구성시에 아실기로서 LCPUFA를 많이 사용할 수 있으므로 LCPUFA-PL의 실질적인 흡수량의 저하를 회피 또는 억제할 수 있다. 또한 LCPUFA-PL은 본래는 분말상이고, 매우 흡습성이 높으며 또한 분해되기 쉬우나, 상기와 같이 인지질 용액으로 하면 흡습성이나 분해성의 높음을 고려할 필요가 없고, 또한 액상이므로 종합적인 취급성을 한층 향상시킬 수 있다.
용질인 인지질은, 본 발명에 따른 인지질, 즉 본 발명에 따른 제조방법에 의해 얻어진 인지질이 이용된다. 또한 본 발명에서는 인지질 이외의 지용성 물질을 용질로서 포함하고 있을 수도 있다.
상기 지용성 물질로서는 구체적으로는 예를 들면 스테롤, 스테롤 에스테르, 당지질, 스핀고 지질, 왁스, 색소, 카로테노이드, 토코페롤류 등을 들 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다 이 지용성 물질들은, 본 발명에 따른 지질조성물의 용도 등에 따라 적절히 선택된다.
본 발명에 따른 지질조성물에는, 각종 첨가제를 첨가할 수 있다. 이 첨가제로서는, 구체적으로는, 예를 들어 비타민E, 토코토리에놀, 세사민, 세사미놀, 세사몰, 아스타키산틴, 아스타키산틴 에스테르, 스테롤류, 카로텐류 등을 들 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다. 이 첨가제들 중에는 상기 지용성 물질에 포함되는 것이 많으나, 지용성 물질이 아니어도 가능하다. 본 발명에 따른 지질조성물은, 영양 조성물로서 식품 등에 이용할 수 있으므로 식품에 첨가 가능한 첨가제는 모두 첨가 가능하다.
<지질조성물의 제조방법>
상기 지질조성물의 제조방법은 특별히 한정되지 않고, 본 발명에 따른 인지질의 제조방법으로 얻어진 인지질을 액상의 LCPUFA 지질에 용해시켜 필요에 따라 기타 성분을 첨가하여 용해 또는 분산시키면 된다. 다시 말해, 본 발명에 따른 지질조성물의 제조방법은, 상기 PL 추출공정을 적어도 포함하고, 또한 상기 PL 추출공정에서 얻어진 LCPUFA-PL을 포함하는 PL을 LCPUFA 지질에 용해시켜 인지질 용액을 조제하는 용액 조제공정을 포함하고 있으면 된다.
또한 본 발명에 따른 지질조성물에서는, 상기 유지 추출공정에서 얻어진 유지를 LCPUFA 지질로서 바람직하게 사용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 지질조성물의 제조방법에는 유지 추출공정이 포함되어 있을 수도 있다.
여기서 유지 추출공정에 있어서의 트리글리세리드 등의 추출조작이나, PL 추출공정에 있어서의 LCPUFA-PL의 추출 조작을 제어함으로써, 본 발명에 따른 지질조성물을 용이하게 제조할 수 있다. 구체적으로는 지질 생산균 균체로부터 유지를 제거할(추출할) 때 제거의 정도를 억제하면, 얻어지는 탈지균체에 잔존하는 지질의 조성을 바꿀 수 있다.
상기 제거의 정도에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니고, 얻고자 하는 지질조성물의 조성, 지질 생산균의 종류, 균체로부터 유지를 제거할 때의 추출 방법 등의 전제조건에 따라 추출 조건을 적절히 변경하면 된다. 예를 들면, 추출매로서 지방족계 유기용매를 이용하는 경우에는 유지 추출공정에 있어서 유기용매의 양, 추출 처리 회수, 추출 온도 등을 변화시킨다. 이에 의해 PL 추출공정에서 얻어지는 인지질에, 트리글리세리드(TG) 등의 액상 유지를 잔존시킬 수 있다. 또한 잔존하는 액상 유지는, 구성요소로서 LCPUFA를 포함하는 LCPUFA 지질이므로, 용이하게 지질조성물을 얻을 수 있다. 따라서 본 발명에서는 유지 추출공정에 있어서의 유지의 추출량을 억제함으로써, PL 추출공정으로 인지질 용액으로서의 지질조성물로서 추출할 수 있다. 다시 말해, 상기 인지질 용액으로서의 지질조성물은, 본 발명에 따른 인지질의 제조방법에 있어서, 유지 추출공정의 조건을 변화시킴으로써 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 지질조성물의 경우에는, 주요성분인 LCPUFA-PL와 LCPUFA 지질은 임의의 비율로 혼합할 수 있다. 따라서 LCPUFA 지질의 양은 특별히 한정되는 것은 아니고, 인지질 용액으로서 우수한 취급성을 발휘할 수 있기에 충분한 유동성을 실현할 수 있는 양이면 된다.
또한 상기 주요성분의 농도를 조절하기 위해 본 발명에 따른 지질조성물에 대해서는 본 발명에 따른 제조방법의 과정에서 얻어진 지질, 즉, 출발원료인 지질 생산균 균체로부터 얻어지는 LCPUFA-PL이나 유지 이외의 지질을 첨가할 수 있다. 이 경우에 첨가되는 지질로서는, LCPUFA-PL, non-LCPUFA-PL, LCPUFA 지질 중 어느 것이나 가능하다.
또한 본 발명에 따른 지질조성물은 취급성을 높이기 위한 상기 인지질 용액에 한정되지 않고, 다른 조성일 수도 있다. 또한 상기 인지질 용액으로서 조제되는 지질조성물은 LCPUFA-PL의 취급성을 높이는 것을 주목적으로 용액화되어 있으므로 실질적으로 인지질 그 자체로서 사용할 수 있다.
(Ⅲ) 본 발명의 이용
본 발명의 이용 방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 대표적인 것으로서는, 본 발명에 따른 인지질 또는 지질조성물을, LCPUFA-PL을 보급하기 위한 영양조성물로서 이용하는 용도를 들 수 있다. 영양 조성물의 사용 대상이 되는 생물은 특별히 한정되는 것은 아니고, 어떠한 생물도 가능하나, 대표적으로는 사람이고, 그 밖에는 가축 동물이나 실험 동물 등을 들 수 있다. 영양 조성물은 어떠한 형태로도 섭취할 수 있으나, 경구 섭취하는 방법이 가장 바람직하다. 따라서 본 발명에는 상기 인지질 또는 지질조성물을 함유하는 식품도 포함된다.
본 발명에 따른 식품은, 본 발명에 따른 인지질 또는 지질조성물을 함유하고 있으면 되므로 그 종류는 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 빵, 일본식 과자(얼음과자도 포함), 반찬, 유제품, 시리얼 식품, 두부/유부류, 면류, 도시락류, 조미료, 밀가루나 식육 등의 농산 가공품, 장기보존식품(통조림, 냉동식품, 레토르트 식품 등), 청량 음료수, 우유 음료, 두유, 포타주 수프 등의 수프류 등의 일반 식품을 들 수 있으나 특별히 한정되는 것은 아니다. 이 일반 식품들에 대한 인지질 또는 지질조성물의 첨가방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 일반 식품의 종류에 따라 공지의 적절한 방법을 채용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 식품에는 건강 식품이나 영양 식품 등과 같이 일반 식품이 아닌 특정 용도로 사용되는 기능성 식품을 들 수 있다. 구체적으로는 각종 서플리멘트 등의 영양 보조 식품, 특정 보건용 식품 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 인지질은 그 취급성 등을 고려하여 인지질 용액으로서 조제되어 있는 것이 바람직하나, 서플리멘트 등의 경우에는 이 인지질 용액(지질조성물)을 적당한 형상으로 가공만 하여 그대로 사용할 수 있다. 이 때의 가공 형상은 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 본 발명에 따른 지질조성물(또는 식품)은 액상 또는 분말상일 수도 있으며, 캡슐상일 수도 있으며(후술하는 실시예 6 참조), 정제나 타블렛상일 수도 있다. 본 발명에 따른 인지질 또는 지질조성물의 이용에 있어서는, 일반적인 유지계 식품에의 용해, 분말화 등 일반적인 유지에 대해 이용할 수 있는 기술은 모두 적용하는 것이 가능하다.
본 발명의 이용에 있어서는, 상술한 제조방법에 의해 얻어지는 인지질을 이용하게 된다. 그 때문에 본 발명에 따른 인지질이나 지질조성물에 대해 추가로 다른 성분을 가하여 식품 등으로서 이용하는 경우에는 인지질을 이용하여 다른 성분을 리포솜화하여 가용화하는 것도 가능하다. 이 경우, 리포솜화하여 얻어진 수중유적형(O/W형)의 분산액도 본 발명에 따른 조성물로서 이용할 수 있다.
이와 같이 본 발명에서는 미생물 발효에 의해 얻어지는 지질 생산균 균체로부터 LCPUFA-PL을 효율적이고 또한 안정적으로 얻을 수 있다. 이제까지 LCPUFA-PL의 주요 공급원으로서는 소 뇌를 비롯한 동물 장기였으나, 이와 같은 공급원은 광우병의 유행 이후 선호되지 않고 있다. 이이 반해 본 발명에 따르면 LCPUFA-PL을 발효 기술에 의해 얻을 수 있으므로 특히 본 발명에 따른 인지질이나 지질조성물을 상기 일반 식품이나 기능성 식품으로서 이용할 경우에는 소비자의 수용 용이성을 향상시킬 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같은 식품 분야 뿐 아니라 의약품 분야에도 이용할 수 있다. 즉 본 발명에 따른 인지질이나 지질조성물은 의약품으로서 이용될 수도 있다. 의약품으로서 이용하는 경우의 구체적인 예도 특별히 한정되는 것은 아니고 그 목적에 따라 공지의 기술을 이용하면 된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 건조균체 및 탈지균체의 제조예 1~5에서 이용한 배지의 상세는 다음에 나타내는 [배지의 조제]의 항목에 기재한다.
[배지의 조제]
건조균체 및 탈지균체의 제조예 1에서 이용한 종배지 A는, 그 조성은 효모추출물 1%, 글루코스 2%, 잔부 물이고, pH 6.3으로 하였다. 마찬가지로 종배지 B는 그 조성은 효모추출물 1%, 글루코스 2%, 대두유 0.1%, 잔부 물이고, pH 6.3으로 하였다.
마찬가지로 본배지 C는 배지 C-c에 배지 C-b를 부가하고 pH 6.1로 하여 조제했다. 배지 C-a는 대두분 336kg, KH2PO4 16.8kg, MgCl2?6H2O 2.8kg, CaCl2?2H2O 2.8kg, 대두유 56kg을 물에 넣고 교반하여, 4500L로 한 후 121℃, 20분의 조건으로 멸균하여 조제했다. 배지 C-b는, 물을 함유한 글루코스 112kg을 물에 넣고 교반하여 1000L로 한 후 140℃, 40초의 조건으로 멸균하여 조제했다.
건조균체 및 탈지균체의 제조예 2~5에서 이용한 본배지 D는 그 조성이 글루코스 1.8%, 대두분 1.5%, 대두유 0.1%, KH2PO4 0.3%, Na2SO4 0.1%, CaCl2?2H2O 0.05%, MgCl2?6H2O 0.05%, 잔부 물이고, pH 6.3으로 하였다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 1]
지질 생산균으로서, 아라키돈산 함유 인지질 생산균으로서 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) CBS754.68을 사용했다. 이 CBS754.68의 보존 균주를, 종배지 A에 접종하고, 왕복 진탕 100rpm, 온도 28℃의 조건에서 종배양(제 1 단계)을 개시하고 3일간 배양했다. 이어서 30L의 종배지 B를 50L 용량의 통기교반배양조 내에서 조제하고, 여기에 종배양액(제 1 단계)을 접종하여 교반 회전수 200rpm, 온도 28℃, 배양조 내압 150kPa의 조건에서, 종배양(제 2 단계)을 개시하고 2일간 배양했다.
이어서 용적 10kL의 배양조에 초기 배양액량에 맞춘 5600L의 본배지 C를 넣고, 종배양액(제 2 단계)을 접종하여, 온도 26℃, 통기량 49Nm3/hr, 내압 200kPa으로 본배양을 개시했다. 적당한 시간이 경과 후에 물을 함유한 글루코스를 적당량 첨가하는 배지 유가를 적절히 수행했다. 이 배지 유가로서는 총 1454kg의 물을 함유한 글루코스를 6회에 나누어 유가했다. 이와 같이 하여 본배양을 306 시간 계속했다.
본배양 종료 후, 120℃, 20분의 조건으로 살균한 후 연속식 탈수기로 습균체를 회수하고, 이 습균체를 진동 유동층 건조기로 수분 함량 1wt%까지 건조하고, 건조균체를 얻었다. 건조균체는 공기 수송기를 이용하여 충진 장소로 수송하여 용적 약 1m3의 알루미 파우치제 콘테이너 백에 질소 가스와 함께 충진하고, 백 입구부를 히트 씰한 후 10℃ 이하의 냉장실에서 보관했다.
콘테이너 백에서 꺼낸 건조균체 1kg에, 헥산 3L를 첨가하고 상온에서 15시간 부드럽게 교반한 후 헥산층을 여과로 제거했다. 얻어진 핵산 추출 처리완료된 건조균체로부터, 잔류하는 헥산을 통풍에 의해 제거하고, 탈지균체 A-1을 얻었다. 이 탈지균체 A-1에 다시 헥산 3L를 첨가하고 상온에서 3시간 부드럽게 교반한 후 동일한 조작을 수행함으로써 탈지균체 A-2를 얻었다.
또한 상기의 2번째 헥산 추출처리 후 탈지균체 A-2에 대해서 다시 한번 헥산 3L를 첨가하고 상온에서 3시간 부드럽게 교반한 후 동일한 조작을 수행함으로써 탈지균체 A-3을 얻었다. 아울러, 탈지균체 A-3에 대해 다시 한번 헥산 3L를 첨가하고 상온에서 3시간 부드럽게 교반한 후 마찬가지의 조작을 수행함으로써 탈지균체 A-4를 얻었다.
상기 4회의 헥산 추출 처리에서는, 회수한 헥산층 모두에 있어서 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서 인지질은 검출되지 않았다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 2]
용적 10L의 통기 교반 배양조에 5L의 본배지 D를 넣어 멸균하고, 지질 생산균으로서 아라키돈산을 생산하는 사상균 모르티에렐라 폴리세팔라(Mortierella polycephala) IFO6335를 식균하고, 온도 26℃, 통기량 1vvm, 교반회전수 300rpm으로 9일간 배양했다. 글루코스 소비에 따라 적절히 1% 상당의 글루코스를 유하시켰다. 얻어진 배양균체를 실시예 1과 동일하게 하여 멸균하고 배지를 제거한 후에 실시예 1과 동일하게 하여 건조시켜 건조균체를 얻었다.
이 건조균체 40g에 헥산 120mL을 넣고, 상온에서 3시간 부드럽게 교반한 후 헥산층을 여과로 제거했다. 그 후 건조균체에 대해 다시 헥산 120mL를 넣고 상온에서 15시간 부드럽게 교반한 후 헥산층을 여과로 제거했다. 헥산 추출 처리 완료된 건조균체로부터, 잔류하는 헥산을 통풍에 의해 제거하고 탈지균체 B를 얻었다.
상기 헥산 추출 처리에서 회수한 헥산층에 있어서는, 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서, 인지질은 검출되지 않았다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 3]
지질 생산균으로서, 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)를 생산하는 사상균 모르티에렐라 엘론가타(Mortierella elongata) SAM1860(부다페스트 조약에 따른 국제기탁번호 FERMBP-3589)을 식균한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 하여 탈지균체 C를 얻었다.
상기 헥산 추출처리에서 회수한 헥산층에 있어서는, 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서, 인지질은 검출되지 않았다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 4]
지질 생산균으로서, 미드산을 생산하는 사상균 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) SAM2086(부다페스트 조약에 따른 국제기탁번호 FERMBP-15766)을 식균한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 하여 탈지균체 D를 얻었다.
상기 헥산 추출처리에서 회수한 헥산층에 있어서는, 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서, 인지질은 검출되지 않았다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 5]
지질 생산균으로서, 아라키돈산을 생산하는 사상균 에키노스포란지움 트랜스버살리스(Echinosporangium transversalis) ATCC16960을 식균한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 하여 탈지균체 E를 얻었다.
상기 헥산 추출처리에서 회수한 헥산층에 있어서는, 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서, 인지질은 검출되지 않았다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 6]
배양 시간을 6일간으로 한 것을 제외하고는 제조예 2와 동일하게 하여 모르티에렐라 폴리세팔라(M. polycephala) IFO6335의 건조균체를 얻었다. 또한 건조균체를 20g, 첨가하는 헥산의 양을 모두 60mL로 한 것을 제외하고는 제조예 2와 동일하게 하여 모르티에렐라 폴리세팔라(M. polycephala) IFO6335의 탈지균체 F를 얻었다.
상기 헥산 추출처리에서 회수한 헥산층에 있어서는, 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서, 인지질은 검출되지 않았다.
[건조균체 및 탈지균체의 제조예 7]
배양 시간을 6일간으로 한 것을 제외하고는 제조예 5와 동일하게 하여 에키노스포란지움 트랜스버살리스(E. transversalis) ATCC16960의 건조균체를 얻었다. 또한 건조균체를 20g, 첨가하는 헥산의 양을 모두 60mL로 한 것을 제외하고는 제조예 2와 동일하게 하여 에키노스포란지움 트랜스버살리스(E. transversalis) ATCC16960의 탈지균체 G를 얻었다.
상기 헥산 추출처리에서 회수한 헥산층에 있어서는, 추출된 지질의 대부분이 트리글리세리드로서, 인지질은 검출되지 않았다.
[실시예 1 : 탈지균체 A-2로부터의 아라키돈산 함유 인지질의 추출]
건조균체 및 탈지균체의 제조예 1에서 얻어진 1g의 탈지균체 A-2에 대해, 추출매로서 다양한 유기용매 25mL를 첨가하고 60℃에서 1시간 부드럽게 교반했다. 추출매로서는 헥산, 헥산/에탄올 혼합용매 a~e, 에탄올, 클로로포름/메탄올 혼합용매를 사용했다. 이 추출매들의 조성(혼합 체적비)을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
추출매 조성(체적 조성비)
헥산
헥산/에탄올 혼합용매 a
〃 b
〃 c
〃 d
〃 e
에탄올
클로로포름/메탄올 혼합용매		 헥산:에탄올=6:0
헥산:에탄올=4:1
헥산:에탄올=4:2
헥산:에탄올=3:3
헥산:에탄올=2:4
헥산:에탄올=1:4
헥산:에탄올=0:6
클로로포름:메탄올=2:1
모든 경우에 유기용매층을 여과후에 모두 모아 유기용매를 유거함으로써 원료 인지질 획분을 얻었다. 얻어진 원료 인지질 획분을 실리카겔 박층 크로마토그래피(TLC)로, 트리글리세리드(TG) 및 인지질(PL)로 분획했다. 전개 용매는 헥산:에틸에테르=7:3의 혼합용매로 하였다. 두 획분을 각각 긁어 염산메탄올법으로 메틸에스테르로 유도하여 지방산의 정성 및 정량을 수행했다. 또한 내부 표준에는 펜타데칸산을 이용했다. 정성 및 정량의 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
추출매(유기용매)
 추출된 지방산으로서의 지질(mg/g 탈지균체) PL의 총지방산 중의 LCPUFA 함유율(%)
PL TG AA DGLA
헥산
헥산/에탄올 혼합용매 a
〃 b
〃 c
〃 d
〃 e
에탄올
클로로포름/메탄올 혼합용매		 0.0
20.0
24.4
24.1
19.9
16.4
16.3
24.9		 35.0
40.0
40.4
43.4
45.2
41.8
42.0
66.1		 -
43.0
43.7
42.5
42.7
42.5
41.7
40.4		 -
2.6
2.5
2.5
2.6
2.6
2.6
2.5
추출매로서 헥산만을 이용한 경우에는 인지질이 검출되지 않았으나 기타의 경우에는 대량의 인지질을 추출할 수 있었다. 또한 인지질 중의 전체 지방산의 40% 이상이 아라키돈산(AA)이나 디호모-γ-리놀렌산(DGLA) 등의 LCPUFA였으나, 에이코사펜타엔산(EPA)은 검출되지 않았다.
[실시예 2 : 탈지균체 A-1~A-4로부터의 아라키돈산 함유 인지질의 추출]
건조균체 및 탈지균체의 제조예 1에서 얻어진 200g의 탈지균체 A-1~A-4 각각에 대해, 1:1의 체적혼합비의 헥산/에탄올 혼합용매 1L를 첨가하고 60℃에서 90분간 부드럽게 교반했다. 용매층을 여과한 후 다시 같은 조작을 추가로 2회 반복했다. 그 후 용매층을 모두 회수하고, 용매를 유거함으로써 원료 인지질 획분을 얻었다. 얻어진 원료 인지질 획분은 실시예 1과 마찬가지로 실리카겔 TCL로, TG 및 PL로 분획하여 지방산의 정성 및 정량을 수행했다. 정성 및 정량의 결과를 표 3에 나타내었다. 또한 표 3에서의 중량은 모두 탈지균체 1g 당의 양을 나타낸다.
[표 3]
탈지균체
 획분 추출된 지방산으로서의 지질(mg) 각 획분의 총 지방산중의 LCPUFA의 비율(%) 추출된 지질중의 LCPUFA(mg)
AA DGLA 합계 AA DGLA 합계
A-1
 PL 22.4 42.5 2.5 45.0 9.52 0.56 10.1
TG 98.3 42.0 2.5 44.5 41.3 2.46 43.8
A-2
 PL 23.0 42.5 2.6 45.1 9.78 0.60 10.4
TG 46.2 42.0 2.5 44.5 19.4 1.16 20.6
A-3
 PL 23.0 42.5 2.6 45.1 9.78 0.60 10.4
TG 26.8 41.8 2.5 44.3 11.2 0.67 11.9
A-4
 PL 22.8 42.4 2.6 45.0 9.67 0.59 10.3
TG 19.7 40.9 2.5 43.4 8.06 0.49 8.55
또한 탈지균체 A-2로부터 추출한 원료 인지질 획분을, 4℃에서 냉아세톤에 용해시켜 아세톤 불용성분을 회수하는 조작을 2회 반복함으로써 정제 인지질 획분을 얻었다. 정제 인지질 획분에는 중성 지질은 포함되어 있지 않았다. 또한 총 지방산 중의 AA 및 DGLA의 비율은 각각 43.4% 및 2.6%였다.
또한 상기 정제 인지질 획분을 실리카겔 TLC에 의해 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 당지질(GL)로 분획하고, 지방산의 정성 및 정량을 수행했다. 전개용매는 클로로포름:메탄올:초산:물=100:75:7:4의 혼합용매를 사용하였다. 얻어진 정제 인지질의 조서을 표 4에 나타냈다.
[표 4]
획분
 지방산으로서의 중량비(%) 각 획분의 총 지방산중의 LCPUFA 비율(%)
AA DGLA
PC
PE
PS
PI
GL		 58.9
25.1
3.1
5.4
7.5		 53.7
33.9
23.5
22.2
18.3		 3.1
1.7
1.4
3.3
1.4
[실시예 3: 탈지균체 B-E로부터의 PUFA를 함유하는 인지질의 추출]
건조균체 및 탈지균체의 제조예 2~5에서 얻어진 5g의 탈지균체 B~E 각각에 대해, 1:1의 체적혼합비의 헥산/에탄올 혼합용매 25mL를 첨가하고 60℃에서 90분간 부드럽게 교반했다. 용매층을 여과한 후 다시 같은 조작을 추가로 2회 반복했다. 그 후 용매층을 모두 회수하고, 용매를 유거함으로써 원료 인지질 획분을 얻었다. 얻어진 원료 인지질 획분은 실시예 1과 마찬가지로 실리카겔 TCL로, TG 및 PL로 분획하여 지방산의 정성 및 정량을 수행했다. 정성 및 정량의 결과를 표 5에 나타내었다. 또한 표 5에서의 중량은 모두 탈지균체 1g 당의 양을 나타낸다.
[표 5]
탈지균체
 획분 추출된 지방산으로서의 지질(mg) 각 획분의 총 지방산중의 LCPUFA의 비율(%)
 추출된 지질중의 LCPUFA중(mg)
AA DGLA 미드산 LCPUFA 합계
B
 PL 20.2 20.2 2.3 0.0 22.5 4.50
TG 50.2 9.6 1.9 0.0 11.5 5.77
C
 PL 22.2 0.3 45.6 0.0 45.9 10.2
TG 43.0 0.0 35.7 0.0 35.7 15.4
D
 PL 22.3 0.0 0.0 31.1 31.1 6.94
TG 42.0 0.0 0.0 25.8 25.8 10.8
E
 PL 21.5 34.7 3.1 0.0 37.8 8.13
TG 42.5 20.0 2.5 0.0 22.5 9.56
[실시예 4 : 정제한 LCPUFA-PL의 제조]
건조균체 및 탈지균체의 제조예 6, 7에서 얻어진 10g의 탈지균체 F, G 각각에 대해 1:1의 체적 혼합비의 헥산/에탄올 혼합용매 50mL를 넣고 60℃에서 90분간 부드럽게 교반했다. 용매층을 여과한 후 다시 같은 조작을 추가로 2회 반복했다. 그 후 용매층을 모두 회수하여 용매를 유거함으로써 원료 인지질 획분을 얻었다.
얻어진 원료 인지질 획분을, 4℃에서 냉아세톤에 용해시켜 아세톤 불용성분을 회수하는 조작을 2회 조작함으로써 정제 인지질 획분을 얻었다. 정제 인지질 획분에는 중성 지질은 포함되어 있지 않았다. 얻어진 정제 인지질 획분을 실리카겔 TLC에 의해 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 당지질(GL)로 분획하고, 지방산의 정성 및 정량을 수행했다. 전개용매는 클로로포름:메탄올:초산:물=100:75:7:4의 혼합용매를 사용했다.
탈지균체 F로부터 얻어진 정제 인지질의 조성을 표 6에, 탈지균체 G로부터 얻어진 정제 인지질의 조성을 표 7에 나타냈다.
[표 6]
획분
 지방산으로서의 중량비(%) 각 획분의 총 지방산중의 LCPUFA 비율(%)
AA DGLA
PC
PE
PS
PI
GL		 56.2
28.5
10.2
4.4
0.7		 30.0
15.8
15.6
11.6
8.5		 3.1
2.2
1.1
1.9
1.3
[표 7]
획분
 지방산으로서의 중량비(%) 각 획분의 총 지방산중의 LCPUFA 비율(%)
AA DGLA
PC
PE
PS
PI
GL		 60.2
23.1
12.2
3.2
1.3		 17.9
10.0
8.8
9.5
8.5		 2.1
1.7
1.0
0.9
1.1
[실시예 5 : LCPUFA 함유 인지질을 배합한 캡슐의 조제]
젤라틴(니이타(新田) 젤라틴사)과 식품 첨가용 글리세린(카오(花王)사)을 중량비 100:35가 되도록 혼합하여 물을 첨가하고, 50~60℃의 온도 범위에서 용해시켜 점도 2000cp의 젤라틴 피막을 조제했다.
이어서 실시예 2에서 탈지균체 A-2로부터 얻어진 원료 인지질 획분과 비타민E유(에이자이사)를 중량비 100:0.05가 되도록 혼합하여 내용물 1을 조제했다.
또한 실시예 2에서 탈지균체 A-2로부터 얻어진 원료 인지질 획분, 연어알로부터 추출한 정제 인지질 획분(총 지방산 중에 차지하는 DHA의 비율은 25%), 대두유(쇼와산업사), 및 비타민E유를, 중량비 50:50:50:0.05가 되도록 혼합하여, 내용물 2를 조제했다.
이 내용물 1 또는 2를 이용하여, 통상의 방법에 의해 캡슐 성형 및 건조를 수행하여 1알 당 180mg의 내용물을 함유하는 소프트캡슐을 제조했다. 이 소프트캡 슐은 모두 경구섭취에 적합한 것이었다.
[실시예 6 : LCPUFA 함유 인지질을 배합한 음료의 조제]
실시예 2에서 탈지균체 A-2로부터 얻어진 원료 인지질 획분을, 60℃에서 5~30분간, 혼합분산장치(엠테크닉사, 상품명 : 크레아믹스)를 이용하여 물속에서 교반함으로써 물속에 균일하게 분산시켜 리포솜 분산액을 얻었다. 이 리포솜 분산액 내의 인지질의 농도는 0.1~20%로 자유롭게 제어 가능했다.
리포솜 분산액 내의 리포솜의 평균 입경은 약 50~100nm였다. 인지질을 10% 포함하는 리포솜 분산액을, 오렌지쥬스, 탄산수, 커피음료, 밀크, 두유, 또는 포타주 스프 음료에 대해 1/100 용량씩 첨가함으로써 본 발명에 따른 식품으로서의 상기 각 음료를 조제(제조)했다. 이 음료들은 모두 경구섭취에 적합한 것이었다.
또한 발명을 실시하기 위한 최량의 형태의 항에 있어서 이룬 구체적인 실시 형태 또는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술 내용을 자명하게 하는 것으로서, 그러한 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어서는 안 되는 것이며, 본 발명의 정신과 첨부된 특허청구의 범위 내에서, 여러가지로 변경하여 실시할 수 있는 것이다.
본 발명에 따른 인지질의 제조방법은, 상기 지질 생산균으로부터 TG를 주성분으로 하는 유지를 추출한 후에 얻어지는 탈지균체로부터 PL을 추출함으로써 LCPUFA-PL을 효율적으로 제조하는 방법이다. 이 때문에 공급원으로서 배양에 의해 대량으로 생산하는 것이 가능한 지질 생산균을 공급원으로서 효율적으로 이용할 수 있다.
그 결과 이제까지 한정된 공급으로부터 소량 밖에 얻지못하여 공급량도 불안정하고 품질도 반드시 안정되지는 않았던 LCPUFA-PL을, 대량 및 고품질의 제품으로서 안정적으로 공급할 수 있다. 특히 소 뇌를 비롯한 동물 장기에 대해서는, 광우병 등의 전염병의 우려로 인해 실질적으로 이용 곤란한 상황이다. 따라서 본 발명과 같이 안정성이 높은 LCPUFA-PL의 공급원을 안정적으로 확립할 수 있는 것은 매우 의미 깊다.
또한 상기 탈지균체는 충분히 상품가치를 갖는 TG 등의 유지를 균체로부터 추출하는 공정에서 부생하는 것으로서, 이제까지는 일반적인 미생물 발효 잔사와 마찬가지로 겨우 동물 사료로서 이용하거나 또는 폐기할 수밖에 없었다. 이에 대해 본 발명에서는 상기 탈지균체를 LCPUFA-PL의 실질적인 공급원으로 하기 때문에 비교적 저렴한 가격으로 LCPUFA-PL을 제조하는 것이 가능하게 될 뿐 아니라 탈지균체라는 "폐기물"을 효과적으로 이용하는 것이 가능해진다.
또한 본 발명에 의해 제조되는 인지질은, 액상의 LCPUFA 지질을 용매로 한 용액(지질조성물)으로 함으로써 그 취급성을 높일 수 있을 뿐 아니라, 식품으로서 그대로 이용해도 LCPUFA-PL을 효율적으로 흡수시키는 것이 가능해진다. 특히 상기 액상의 LCPUFA 지질로서, 유지 추출공정에서 얻어지는 TG 등의 유지를 이용함으로써 효율적이고 고품질의 지질조성물을 얻을 수 있다.
따라서 본 발명은 LCPUFA-PL을 효율적이고 안정적으로 제조할 수 있으며, 저렴한 가격으로 공급량이나 품질이 안정된 LCPUFA-PL을 제공할 수 있는 효과를 발휘한다.
이상과 같이 본 발명에서는 발효 기술에 의해 LCPUFA-PL을 효율적이고 안정적으로 제조할 수 있다. 따라서 본 발명은 특히 기능성 식품에 관련된 산업에 널리 이용할 수 있을 뿐 아니라 일반 식품, 나아가 의약품 등과 관련된 산업에도 이용할 수 있게 된다.

Claims (36)

  1. 장쇄 고도 불포화 지방산(LCPUFA)을 구성요로서 포함하는 지질을 생산하는 지질 생산균을 출발원료로 하여, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 인지질(LCPUFA-PL)을 제조하는 인지질의 제조방법에 있어서,
    상기 지질 생산균 균체로부터 트리글리세리드(TG)를 포함하는 유지를 추출한 후의 탈지균체로부터, 인지질(PL)을 추출하는 PL 추출공정을 포함하고,
    상기 PL 추출공정에서는, 상기 탈지균체로부터 PL을 추출하기 위한 추출매로서, 헥산 및 에탄올의 혼합용매를 이용하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 PL 추출공정의 전단에서 실시되고, 상기 지질 생산균 균체로부터 TG를 포함하는 유지를 추출함과 아울러 탈지균체를 얻는 유지 추출공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 지질 생산균으로서, 모르티에렐라(Mortierella)속, 코니디오보러스(Conidiobolus)속, 위티움(Pythium)속, 피토프토라(Phytophthora)속, 페니시륨(Penicillium)속, 클라도스포륨(Cladosporium)속, 무코르(Mucor)속, 프자륨(Fusarium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 엔토모프토라(Entomophthora)속, 에키노스포란지움(echinosprangium)속, 및 사프롤레 그니아(Saprolegnia)속으로부터 선택되는 적어도 1종이 이용되는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 지질 생산균으로서 모르티에렐라속이 사용되는 경우, 상기 모르티에렐라속의 균이 모르티에렐라 아속인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 모르티에렐라 아속의 균이 모르티에렐라?알피나(Mortierella alpina)인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 헥산 및 에탄올의 혼합용매에 있어서는, 헥산 : 에탄올의 혼합비가, 체적비로 4:1~0:6의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 유지 추출공정에서는, 가압에 의한 압착추출, 렌더링에 의한 추출, 및 추출매에 의한 추출 중 적어도 어느 하나에 의해, 상기 지질 생산균 균체로부터 유지를 추출하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 추출매로서, 지방족계 유기용매 및 물 중 적어도 어느 하나의 추출액, 또는 초임계 탄산가스를 사용하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서
    상기 지방족계 유기용매로서는 헥산이 사용되는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  14. 제 2 항에 있어서,
    상기 유지 추출공정에서 사용되는 지질 생산균 균체가 건조균체인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 기재된 인지질의 제조방법에 의해 제조되는 인지질.
  16. 제 1 항에 있어서,
    얻어진 인지질 중의 구성요소로서 포함되는 LCPUFA가, 에이코사디엔산, 에이코사트리엔산, 에이코사테트라엔산, 에이코사펜타엔산, 도코사디엔산, 도코사트리엔산, 도코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 도코사헥사엔산,테트라코사디엔산, 테트라코사트리엔산, 테트라코사테트라엔산, 테트라코사펜타엔산, 및 테트라코사헥사엔산으로부터 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 LCPUFA의 분자중에 포함하는 탄소-탄소 이중 결합 중, 적어도 하나가 공역 이중 결합으로 되는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 LCPUFA에는, 아라키돈산 및/또는 도코사헥사엔산이 포함되는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    모든 LCPUFA-PL의 구성요소로서 포함되는 총 지질산 내에 있어서의 아라키돈산의 함유율이 0.3 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  20. 제 16 항에 있어서,
    상기 LCPUFA-PL로서, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산, 및 카르디올리핀으로부터 선택되는 적어도 1종의 글리세로 인지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    LCPUFA-PL로서 적어도 포스파티딜콜린이 포함되어 있음과 아울러,
    모든 포스파티딜콜린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에서의 아라키돈산의 함유율이 15 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    LCPUFA-PL로서 적어도 포스파티딜세린이 포함되어 있음과 아울러,
    모든 포스파티딜세린의 구성요소로서 포함되는 총 지방산 내에서의 아라키돈산의 함유율이 5 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 인지질의 제조방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제 1 항에 기재된 인지질의 제조방법에 있어서의 PL 추출공정을 적어도 포함함과 아울러,
    상기 PL 추출공정에서 얻어진 LCPUFA-PL을 포함하는 PL을, LCPUFA를 구성요소로서 포함하는 액상 지질에 용해시켜 인지질 용액을 조제하는 용액 조제공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 지질조성물의 제조방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    추가로, 상기 유지 추출공정을 포함함과 아울러, 이 유지 추출공정에서 얻어진 유지를 상기 액상 지질로서 사용하는 것을 특징으로 하는 지질조성물의 제조방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    유지 추출공정에서의 유지의 추출량을 억제함으로써, PL 추출공정으로, LCPUFA-PL을 상기 액상 지질에 용해시킨 지질조성물로서 추출하는 것을 특징으로 하는 지질조성물의 제조방법.
  29. 삭제
  30. 제 26 항에 있어서,
    상기 액상 지질에 있어서의 총 지방산 내에 차지하는 LCPUFA의 비율이 11 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 지질조성물의 제조방법.
  31. 제 15 항에 기재된 인지질을 포함하는 지질조성물.
  32. 제 31 항에 있어서,
    영양조성물로서 이용되는 것을 특징으로 하는 지질조성물.
  33. 제 32 항에 있어서,
    캡슐상 또는 정제상으로 가공되어 있는 것을 특징으로 하는 지질조성물.
  34. 제 31 항에 기재된 지질조성물을 함유하는 식품.
  35. 제 34 항에 있어서,
    인지질에 의해 리포솜화된 수중유적형의 분산액을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
  36. 제 34 항에 있어서,
    영양보조식품인 것을 특징으로 하는 식품.
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