TWI596209B - 海生疫病菌及以其生產二十碳四烯酸的方法 - Google Patents

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海生疫病菌及以其生產二十碳四烯酸的方法
本發明關於一種生產二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的方法，更明確地，是一種藉由海生疫病菌來生產二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的方法。
多元不飽和脂肪酸(PUFA)係指一群在結構上帶有一個以上之雙鍵鍵結的脂肪酸，其可依據雙鍵的位置再進一步區分為不同的種類，例如omega-3(n-3)脂肪酸、omega-6(n-6)脂肪酸、及omega-9(n-9)脂肪酸等。已知許多常見的多元不飽和脂肪酸對於人體的健康是有助益的，比如說，二十二碳六烯酸(DHA；22：6(n-3))、二十碳五烯酸(EPA；20：5(n-3))、及二十碳四烯酸(ARA；20：4(n-3))。深海魚類的體內具有許多這些多元不飽和脂肪酸，因此可供給人類經由飲食的方式攝取這些重要的營養成分。然而，隨著世界人口增加，過度捕撈造成漁獲量顯著的下降，海洋生態面臨嚴峻的考驗，因此，領域中的學者開始研究自其他生物取得及生產這些對人體健康有益的多元不飽和脂肪酸。微生物具有容易掌控的優點，因此是領域中主要的研究目標，其中微藻、真菌、及破囊壺菌是目前研究已知具有生產二十碳五烯酸及二十碳四烯酸的價值的生物。
海生疫病菌屬(Halophytophthora)是一種異營且特定生長於河口區域的微生物。海生疫病菌屬是紅樹林葉上的早期共生生物，其將複雜的大分子有機物質分解為小分子而因此有助於紅樹林生長環境的養份循環。目前已知海生疫病菌屬包含14種：Halophytophthora avicenniae、Halophytophthora bahamensis、Halophytophthora batemanensis、Halophytophthora elongata、Halophytophthora epistomia、Halophytophthora exoprolifera、Halophytophthora kandeliae、Halophytophthora masteri、Halophytophthora mycoparasitica、Halophytophthora operculata、Halophytophthora polymorphica、Halophytophthora porrigovesica、Halophytophthora spinosa(Halpphytophthora spinosa var spinosa及Halophytophthora spinosa var lobata)、及Halophytophthora vesicula；其中又以Halophytophthora vesicula最為常見。由於海生疫病菌屬與另一種已知可以生產EPA及ARA的微生物：腐黴菌在演化上接近，因此本發明假設海生疫病菌屬具有生產EPA及ARA的可能性，期能提供生產EPA及ARA的另一個選擇。
本發明之一目的為提供一生產EPA及ARA的另一個選擇，以讓EPA及ARA這一類對人類健康有益的多元不飽和脂肪酸的取得更加多元，而得以取得成本。
本發明之又一目的為提供使用海生疫病菌生產EPA及ARA方法，以提高海生疫病菌的經濟價值。
為達到上述目的，本發明提供一種生產二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的方法，其包含：自一海生疫病菌中分離取得 二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸。
較佳地，前述方法於進行前述分離之前，先以一培養步驟培養前述海生疫病菌，前述培養步驟包含：使前述海生疫病菌培養於一液體培養基中4至10天；其中前述培養基為：PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。
較佳地，前述方法於進行前述分離之前，先以一培養步驟培養前述海生疫病菌，前述培養步驟包含：使前述海生疫病菌培養於一固體培養基中4至10天以取得一海生疫病菌菌落；及使前述菌落培養於一液體培養基中4至10天；其中前述固體培養基及/或液體培養基為：PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。
較佳地，前述培養基的含鹽量為1.0至3.5重量百分濃度，前述重量百分濃度係以前述培養基的總重量為基礎。
較佳地，前述培養基的pH值為5至9的環境。
較佳地，前述海生疫病菌係培養於10至35℃的環境。
較佳地，前述PYGS培養基包含：1至5g/L的葡萄糖；1至5g/L的酵母萃取物；1至5g/L的蛋白腖；及1至3.5體積百分比的海水；其中前述濃度單位係以前述PYGS培養基的總體積為基礎。
較佳地，前述二十碳五烯酸的生產量為0至8mg/L/天數；其中前述天數係指前述海生疫病菌於前述液體培養基中的天數。較佳地，前述二十碳四烯酸的生產量為0.05至9mg/L/天數；其中前述天數係指前述海生疫病菌於前述液體培養基中的天數。
較佳地，前述海生疫病菌為：Halophytophthora avicenniae、Halophytophthora polymorphica、Halophytophthora spinosa、Halophytophthora vesicula、或其組合。
較佳地，前述海生疫病菌為：Halophytophthora spinosa，且前述海生疫病菌之培養中實質上不包含二十碳五烯酸。
較佳地，前述海生疫病菌於中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC930163。
本發明又提供一種生產二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的海生疫病菌，其係選自於在中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC930161、BCRC930162、及BCRC930163所代表之菌株所組成之群組。
較佳地，前述海生疫病菌係由以下步驟篩選所得：(a)取得一紅樹林葉；(b)將前述紅樹林葉培養於海水中以取得一游動孢子囊；(c)將前述游動孢子囊培養於一PYGS培養基。
較佳地，前述步驟(b)中的海水為1至3.5體積百分濃度的無菌海水。
較佳地，前述PYGS培養基包含：1至5g/L的葡萄糖；1至5g/L的酵母萃取物；1至5g/L的蛋白腖；及1至3.5體積百分比的海水；其中前述濃度單位係以前述PYGS培養基的總體積為基礎。
較佳地，前述海生疫病菌在中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC930163，且其並不會生產出二十碳五烯酸。
綜上所述，本發明證實海生疫病菌具有生產二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的經濟價值。此外，本發明篩選所得之BCRC930163海生疫病菌更具有僅生產二十碳四烯酸而不生產 二十碳五烯酸的特性，因此可特定應用於二十碳四烯酸的生產。
第一圖為本發明之分離株的ARA生產比例。
第二圖為本發明之分離株的EPA生產比例。
第三圖為本發明之IMB144、IMB145、IMB157、及IMB162分離株於最適條件下的平均菌重。
第一圖及第二圖中的「a,b,c,d,e」係標示具統計意義的數據群，其係以單因子變異數分析法(One-Way ANONA)依據杜氏事後檢定(Tukey Test)來進行統計分析。分析結果推定為具有統計上差異的數據即標記以不同的英文字母來加以區分。
本發明提供一種生產二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的方法。
在本發明的一個面向中，前述方法包含：自一海生疫病菌中分離取得二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸。前述海生疫病菌可係自野外採集而得、自研究單位取得共享的菌株、或為商業上可購得之菌株。更明確地說，前述方法係自一海生疫病菌之群體中分離取得二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸。
可行地，前述方法係自一海生疫病菌之培養中分離取得二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸。前述「海生疫病菌之培養」包含培養中的海生疫病菌菌體、培養基、或其組合。海生疫病菌在不同生長階段有不同的外型(morphology)，較佳地，前述菌體係指菌絲體(mycelia)。
在本發明的一個實施態樣中，於進行前述分離之前，先以一培養步驟培養前述海生疫病菌，前述培養步驟包含：使前述海生疫病菌培養於一培養基中4至10天；其中前述培養基為：PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。
在本發明的另一個實施態樣中，於進行前述分離之前，先以一培養步驟培養前述海生疫病菌，前述培養步驟包含：(A)一活化步驟，其係使前述海生疫病菌培養於一固體培養基中4至10天以取得一海生疫病菌菌落；及(B)一增殖步驟，其係使使前述菌落培養於一液體培養基中4至10天；其中前述固體培養基及/或液體培養基為：PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。前述培養天數可依據欲取得之菌體量、培養基的新鮮度等參數加以斟酌。
若無特別指明，本文中所述「培養基」包含固體培養基及/或液體培養基(培養液)。前述固體培養基及/或液體培養基可為PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。前述PYGS培養基包含1至5g/L的葡萄糖；1至5g/L的酵母萃取物；1至5g/L的蛋白腖；及1至3.5體積百分比的海水(較佳地，是2至3體積百分比的海水)；其中前述濃度單位係以前述PYGS培養基的總體積為基礎。在可行實施態樣中，前述固體培養基另包含10至20g/L的洋菜膠。在可行實施態樣中，前述固體培養基及/或液體培養基可進一步包含0.1至1g/L的抗生素。
在本發明的較佳實施態樣中，較佳地，前述固體培養基及/或液體培養基的含鹽量為1.0至3.5重量百分濃度，前述重量百分濃度係以前述培養基的總重量為基礎；pH值為5至9；且前述培養進行於10至35℃的環境(更佳地，係20至30℃)。
自前述海生疫病菌之培養中分離取得二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸的方法無需特別限制，可採用領域中所習知的純化技術來進行。舉例來說，以超臨界二氧化碳萃取來分離取得二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸。
另一方面，在本發明的一個可行實施態樣中，係自野外分離取得前述海生疫病菌，其分離方法為：(a)取得一紅樹林葉；該紅樹林葉的品種無需特別限制，舉例來說，可取自台灣嘉義好美里、台灣台北社子島、或台灣台北八里。(b)將前述紅樹林葉洗淨並裁切為適當大小之後，培養於適當溫度的海水中以取得一游動孢子囊；前述適當溫度的範圍為20至30℃；前述海水的濃度為2至3體積百分濃度，且較佳為經過滅菌處理的無菌海水。(c)將前述游動孢子囊培養於一PYGS培養基，並培養於10至35℃中；前述PYGS培養基包含：1至5g/L的葡萄糖；1至5g/L的酵母萃取物；1至5g/L的蛋白腖；及1至3.5體積百分比的海水；其中前述濃度單位係以前述PYGS培養基的總體積為基礎；更佳地，前述PYGS培養基包含：2至4g/L的葡萄糖；2至4g/L的酵母萃取物；2至4g/L的蛋白腖；及2.5至3.0體積百分比的海水。
在一較佳實施態樣中，本發明所揭露之菌株/方法對於二十碳五烯酸的生產量為0至8mg/L/天數；對於二十碳四烯酸的生產量為0.05至9mg/L/天數；其中前述天數係指前述海生疫病菌於前述液體培養基中的天數。換言之，隨著培養天數越多，整體培養中所產出的二十碳五烯酸及二十碳四烯酸便會越多。
以下實施例將更清楚的描述本發明的研發過程及各項特點，須留意的是，下述實施例僅適用於示範性地說明本發明的 特點，而不應對本發明的權利範圍產生限制。
實施例一：採集並辨識本發明之海生疫病菌
本實施例將紀錄本發明之海生疫病菌自野外採集及辨識的過程。
自野外採集淡黃綠色的紅樹林葉(來源包括台灣嘉義好美里、台灣台北社子島、及台灣台北八里)，並將採集而得的紅樹林葉維持於冷盒中運送至實驗室(國立海洋大學，基隆，台灣)。以水將葉片上的雜質清除，接著以無菌海水(2.5%(v/V))浸潤。然後，將該些葉片裁切為約1平方公分的大小，並培養於室溫下的無菌海水(2.5%(v/v))中等待游動孢子囊形成。接著，挑出個別游動孢子囊並置於PYGS固體培養基(4g/L的葡萄糖；4g/L的酵母萃取物；4g/L的蛋白腖；12g/L的洋菜膠；2.5體積百分比的海水；0.5g/L的盤尼西林G鈉鹽；及0.5g/L的硫酸鏈絲菌素)，培養於25℃的環境。本實施例共取得10株菌株，並藉由外觀辨識及18S與ITS序列分析來加以辨識。
關於外觀辨識的部分，將該些菌株分別培養於VF9培養基(含有50%商業可取得之營養液(Evergreen 579)；0.3% Na2CO3；12g/L的洋菜膠；及2.5體積百分比的海水)一個禮拜。接著將長成的菌落挖下並培養於無菌海水(2.5%(v/v))以誘發孢子形成。然後，可依據Nakagiri(2002)的研究成果來辨識該些菌株的游動孢子囊的外型特徵。
關於採用分子分析來辨識，將PYGS固體培養基上的菌絲體取下，並加入液態氮於研缽中將其磨碎。接著使用DNeasy Plant DNA Extraction套組(Qiagen)萃取出基因組DNA，並使用引子組(如下表二中所示)及聚合酶連鎖反應來放大核 rRNA(nuclear rRNA)。聚合酶連鎖反應的反應條件如下：20ng DNA；0.2μM之各引子；0.2mM之dNTP；2.5mM的MgCl2及1.25U的Taq聚合酶(Invitrogen)；溫度循環：95℃ 2分鐘、35個循環之95℃ 1分鐘、54℃ 1分鐘、及72℃ 1.5分鐘、最後在於72℃下10分鐘。將所得PCR產物進行定序，並於NCBI公開資料庫上進行比對，確認所取得之10株菌株如表一所示，並將其中編號IMB146、IMB157、IMB162寄存於中華民國食品工業發展研究所菌種中心，其寄存編號分別為：BCRC930161、BCRC930162、及BCRC930163。
實施例二：培養本發明之海生疫病菌並分析其中所含之二十碳五烯酸及/或二十碳四烯酸
首先，將所得之分離株分別培養於PYGS固體培養基上一個禮拜(4g/L的葡萄糖；4g/L的酵母萃取物；4g/L的蛋白腖；12g/L的洋菜膠；2.5體積百分比的海水；0.5g/L的盤尼西林G鈉鹽；及0.5g/L的硫酸鏈絲菌素；含鹽量2.5重量百分濃度；溫度25℃；pH 6.75)。然後，將菌落移置於PYGS液體培養基中再培養1個禮拜(4g/L的葡萄糖；4g/L的酵母萃取物；4g/L的蛋白腖；12g/L的洋菜膠；2.5體積百分比的海水；0.5g/L的盤尼西林G鈉鹽；及0.5g/L的硫酸鏈絲菌素；含鹽量2.5重量百分濃度；溫度25℃；pH 6.75)。接著，將培養中的菌絲體裝入離心小管，以16,249g的離心力於25℃下離心10分鐘。移除上清液之後，以無菌去離子水清洗，並重複離心步驟。視情況重複清洗及離心步驟後，將離心小管放置於-80℃下隔夜進行冷凍乾燥，以供後續脂肪酸組成分析(Fatty Acid Composition Analysis)之用。
為了進行脂肪酸組成分析，取用30mg的每一樣本，並與75μL的氯仿溶液混合；其中添加1mg C19：0脂肪酸作為內標準(internal standard；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)，並以5mL的氯仿/甲醇溶液(2：1,v/v)萃取之。以旋轉蒸發器(40℃)乾燥該萃取物，並使其重新溶解於乾淨的氯仿中，然後移至10mL的反應瓶中，以氮氣流乾燥之。
接著使樣本進行皂化/酯化反應，將每一樣本與2mL 0.5N的NaOH甲醇溶液混合，再於90℃水浴中加熱15分鐘。於冷卻至室溫後，使其與2mL 0.7N HCl甲醇溶液及1mL 14%三氟 化硼甲醇溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)混合，並再次於90℃水浴中加熱15分鐘後，冷卻至室溫。接著，添加3mL之飽和NaCl水溶液及2mL正己烷並使其混合均勻。將上層水層移入4mL的棕色瓶中，以氮氣流乾燥之，再用Parafilm®將瓶口塞住，存放於-20℃中供後續分析使用。
使用裝載有320單一節四級桿式質譜儀(Varian,Palo Alto,CA,USA)及Supelco SP-2380毛細管柱(30m×0.25mm i.d.；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的CP-380氣相化學層析裝置來分析脂肪甲基酯(FAME)樣本。分別將注入器及交界面的溫度設定為250℃及270℃，並且，管柱的溫度係設定為以15℃/min的升溫速率自50℃提升至150℃，然後再以3℃/min的升溫速率自150℃提升至250℃。該承載氣體的線性速度為38.0cm/min。使用自Sigma-Aldrich購得之由C20：2n-6、C20：4n-6、C22：2n-6、C22：3n-3、及C22：5n-6製得之甲基酯以及FAME標準混合物(Supelco 18919-1AMP)作為辨識樣本中所含之脂肪酸的標準物。各樣本中所測得之脂肪酸係以C19：0脂肪酸內標準為基準，計算其波峰涵蓋的面積來定量，並以相對總脂肪酸含量的百分比來呈現。實驗結果請參第一圖、第二圖及表三。
本實施例所做實驗的培養天數為7天，由表三可知，10個分離株於7天之分別的平均菌重為0.707g/L至2.510g/L。生長速度最快，即，含有最高之平均菌重的菌株為編號IMB157。此外，編號IMB157也是EPA生產量最高的菌株。ARS生產量最高的菌株為編號IMB162。總和而言，本發明之10個海生疫病菌分離株於ARA的生產量為0.54至7.41mg/L/day，於EPA的生產量則為0至6.64mg/L/day。由此實驗結果可知，雖然海生疫病菌於ARA或EPA的生產量未必高於領域中習知用於生產不飽和脂肪酸的微生物，但從第一圖及第二圖中分別顯示之ARA及EPA佔總脂肪酸的比例看來，絕大多數本發明之分離株生產ARA或EPA的比例都在10%上下，顯示海生疫病菌可以應用於特定的生產這兩種具營養價值的不飽和脂肪酸，因此提供了領域中另一個生產不飽和脂肪酸的選擇。
值得注意的是，本發明之編號IMB162菌株實質上不生產EPA，且產出之ARA所佔比例高達四分之一。這意味著編號IMB162菌株可特定地應用於生產ARA，而減少生產製程中純化分離ARA的步驟，對於商業規模的大量生產將非常有利。
實施例三：培養本發明之海生疫病菌的最適條件分析
由前述實施例二中的實驗結果可知，EPA及ARA生產量最高的兩株分離株，編號IMB157及IMB162，恰好即是生長速度最快的兩株分離株(一週菌重分別為2.510g/L及2.333g/L)，且菌重與EPA及ARA生產量的相關係數分別為0.77(扣除不生產EPA的IMB162)及0.67，顯見若能控制海生疫病菌於最佳生長條件，即可獲得生產EPA及/或ARA的最適條件。
本實施例中操控海生疫病菌之培養中的含鹽量、pH值、及 溫度等參數。換言之，依據前述實施例二中所述的培養步驟來培養本發明所得之10株分離株，藉由調整培養基中的含鹽量及pH值以及控制培養環境的溫度來測試在哪一種條件範圍下，前述分離株可具有最佳的生長品質。
經實驗測試，下表四及第三圖所列者為本發明之IMB144、IMB145、IMB157、及IMB162分離株的最佳條件(其他分離株的實驗數據未記載於此)。
根據本實施例的實驗結果，最適合海生疫病菌生長及生產EPA及/或ARA的條件為1.0至3.0重量百分濃度的含鹽量、pH值為5至8、及10至30℃。在此條件下，各分離株的生長速度穩定、品質良好且分離株之間的差異不大，顯見這樣的條件適用於所有的海生疫病菌，可運用於商業規模的大量生產作業。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的 定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
中華民國食品工業發展研究所菌種中心、民國102年11月06日、寄存編號為BCRC930161。
中華民國食品工業發展研究所菌種中心、民國102年11月06日、寄存編號為BCRC930162。
中華民國食品工業發展研究所菌種中心、民國102年11月06日、寄存編號為BCRC930163。
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
無

Claims (12)

  1. 一種生產二十碳四烯酸的方法，其包含：自一海生疫病菌中分離取得二十碳四烯酸；其中前述海生疫病菌於中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC930163。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進行前述分離之前，先以一培養步驟培養前述海生疫病菌，前述培養步驟包含：使前述海生疫病菌培養於一液體培養基中4至10天；其中前述培養基為：PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進行前述分離之前，先以一培養步驟培養前述海生疫病菌，前述培養步驟包含：使前述海生疫病菌培養於一固體培養基中4至10天以取得一海生疫病菌菌落；及使前述菌落培養於一液體培養基中4至10天；其中前述固體培養基及/或液體培養基為：PYGS培養基、Cornmeal培養基、Potato Dextrose培養基、或其組合。
  4. 如申請專利範圍第2或3項所述之方法，其中前述培養基的含鹽量為1.0至3.5重量百分濃度，前述重量百分濃度係以前述培養基的總重量為基礎。
  5. 如申請專利範圍第2或3項所述之方法，其中前述培養基的pH值為5至9的環境。
  6. 如申請專利範圍第2或3項所述之方法，其中前述海生疫病菌係培養於10至35℃的環境。
  7. 如申請專利範圍第2或3項所述之方法，其中前述PYGS培養 基包含：1至5g/L的葡萄糖；1至5g/L的酵母萃取物；1至5g/L的蛋白腖；及1至3.5體積百分比的海水；其中前述濃度單位係以前述PYGS培養基的總體積為基礎。
  8. 如申請專利範圍第2或3項所述之方法，其中前述二十碳四烯酸的生產量為0.05至9mg/L/天數；其中前述天數係指前述海生疫病菌於前述液體培養基中的天數。
  9. 一種生產二十碳四烯酸的海生疫病菌，其於中華民國食品工業發展研究所菌種中心的寄存編號為BCRC930163。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之海生疫病菌，其係由以下步驟篩選所得：(a)取得一紅樹林葉；(b)將前述紅樹林葉培養於海水中以取得一游動孢子囊；(c)將前述游動孢子囊培養於一PYGS培養基。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之海生疫病菌，其中前述步驟(b)中的海水為2至3體積百分濃度的無菌海水。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之海生疫病菌，其中前述PYGS培養基包含：1至5g/L的葡萄糖；1至5g/L的酵母萃取物； 1至5g/L的蛋白腖；及1至3.5體積百分比的海水；其中前述濃度單位係以前述PYGS培養基的總體積為基礎。
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TW200533338A (en) * 2004-03-01 2005-10-16 Suntory Ltd Producing method of phospholipids including long-chain polyunsaturated fatty acids as constituents, and use of such phospholipids

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