KR20140134801A - 신규 트라우스토키트리드〔Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ〕 계 미세조류 트라우스토키트리움〔Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ〕ｓｐ．ＬＡ６〔ＫＣＴＣ１２３８９ＢＰ〕및 이를 이용한 바이오오일의 생산방법 - Google Patents

신규 트라우스토키트리드〔Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ〕 계 미세조류 트라우스토키트리움〔Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ〕ｓｐ．ＬＡ６〔ＫＣＴＣ１２３８９ＢＰ〕및 이를 이용한 바이오오일의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 Thraustochytrid 계 미세조류 및 이를 이용한 바이오오일 생산방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오오일 생산능을 가지는 Thraustochytrid 계 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP) 및 상기 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일, 특히 오메가(omega)-3 불포화 지방산 함량이 전체 바이오오일의 30 중량% 이상인 바이오오일의 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규 트라우스토키트리드〔Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ〕 계 미세조류 트라우스토키트리움〔Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ〕ｓｐ．ＬＡ６〔ＫＣＴＣ１２３８９ＢＰ〕및 이를 이용한 바이오오일의 생산방법{Novel microalgae Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP), and producing method for bio-oil by using thereof}
본 발명은 신규 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계 미세조류 및 이를 이용한 바이오오일(bio-oil)의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오오일 생산능을 가지는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) sp. LA6 (KCTC 12389BP) 및 상기 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일, 특히 오메가(omega)-3 불포화 지방산의 함량이 전체 바이오오일의 30 중량% 이상인 바이오오일의 생산방법에 관한 것이다.
불포화 지방산(unsaturated fatty acid)은 고도 불포화 지방산(highly unsaturated fatty acid 또는 poly unsaturated fatty acid(PAUF)) 이라고도 불리우며, 특히 인체에 유용한 불포화 지방산은 오메가-3(ω-3)와 오메가-6(ω-6)인데, 오메가-3 류는 3번째 탄소에 이중결합을 포함하며, 오메가-6 류는 6번째 탄소에 이르기까지 이중결합을 가지지 않는다. 이러한 오메가-3 불포화 지방산의 대표적인 예로는 메틸 말단으로부터 세번째 탄소로부터 시작되는 6개의 이중 결합을 가진 22개의 탄소쇄 길이를 가지며 "22:6n-3"으로 표시되는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 20:5n-3"으로 표시되는 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic aicd, EPA), 22:5n-3으로 표시되는 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic aicd, DPA) 및 16:3n-3으로 표시되는 α-리놀렌산(linolenic acid) 등이 매우 유용한 오메가-3 불포화 지방산 종류로 알려져 있으며, 오메가-6 류에는 20:4n-6으로 표시되는 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA) 등이 있다.
상기와 같은 불포화 지방산은 체내에서 매우 중요한 역할을 수행하는데, 오메가-3 불포화 지방산은 동맥경화증 및 관상심장질환을 예방하고, 염증성 상태를 완화시키고, 또한 종양세포의 성장을 지연시키는 역할을 수행하며, 오메가-6 불포화 지방산은 인체에서 구조적 지질로서 작용할 뿐만 아니라 프로스타글란딘, 류코트리엔 및 옥시리핀(oxylipins)과 같은 염증에서의 수많은 인자들의 전구체로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 특히, 도코사헥사엔산(DHA)은 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있으며 인간이나 동물의 망막, 정액 및 두뇌조직에 풍부하게 존재한다. 특히 DHA는 두뇌 지방의 60%를 구성하고 있는 필수 지방산으로, 도코사헥사엔산은 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)과 함께 유아의 두뇌, 눈, 신경체계의 건강한 발달을 위해 중요한 것으로 알려져 있으며, 암부터 관절염에 걸친 수많은 질병과 심혈관 질환 및 정신적인 장애의 예방과 치료에 효과가 있음이 보고되고 있으며, 최근에는 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다.
이러한 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산은 인체 내에서 매우 중요한 기능을 수행하므로 국제보건기구(WHO)는 2000 칼로리 식사 섭취를 기준으로 매일 약 2.2 내지 4.4g에 상당하는 오메가-3 불포화 지방산으로부터 1일 섭취 에너지의 1 내지 2%를 커버하도록 권장하고 있으며, 각국의 공인 기관들에서는 DHA를 하루 1 g 이상 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다. 때문에 DHA는 건강기능성 식품 등 다양한 제품으로 상용화되고 있으며, 의약품 원료로도 활용 가능성 높아 DHA의 상업적 가치는 매우 높다고 할 수 있다.
하지만, 이러한 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산은 인체 내에서는 자연적으로 합성되지 않으므로 주로 식품을 통해서 섭취하여야만 하는 어려움이 있다.
기존에는 식물성 오일, 해양 동물 오일(marine animal oil), 어유 (fish oils) 및 오일시드(oilseeds) 등을 통해 이를 섭취하여 왔으며, 대표적으로는 어류에 포함된 어유(fish oils)의 직접 섭취 방식을 통해 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산을 공급받았는데, EPA 및 DHA를 고함량 포함하는 어류는 고등어, 청어 및 연어 등이며, 대구류(cod), 북대서양산 대구(haddock) 등의 몇몇 어류는 간에 대부분의 지방을 비축한다. 그럼에도 불구하고, 최상의 공급원은 참치, 고등어, 정어리, 청어 및 송어 등의 냉수어이다. 그러나, 어유로부터 DHA를 효율적으로 공급받기 위해서는 어류를 생으로 먹거나 끓여서 먹는 것이 바람직하고, 나아가서는 복부를 따라 그리고 지느러미 둘레의 아가미 뒤쪽의 껍질을 먹을 필요가 있는데, 그 이유는 이들 부분에는 오일의 대부분이 축적되어 있기 때문이다. 하지만, 어유는 신속하게 부패하며, 부패한 어류는 비린내가 나므로 그다지 식욕을 돋구지 못한다는 단점이 있고, 어유의 중금속 및 유기화학 물질에 의한 오염 문제가 심각하며, 특히 인체에 충분한 양의 어유를 획득하기 위해서는 다량의 어류를 필요로 하기 때문에 현실적으로 이러한 요구를 경제적이고 산업적인 규모로 충족시키기는 매우 어려운 실정이다.
이러한 문제점을 해결하고자, 조류를 포함한 다양한 미생물 배양에 의한 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 생산방법에 대한 연구가 진행되어 왔다. 특히 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 류라 불리는 미세-종속영양균에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이들은 난균류(oomycetes) 및 라비린툴리드류(labyrinthulids)와 함께 스트라메노필라 킹덤(Stramenophila kingdom)로 분류된 비광합성(non-photosynthetic), 종속영양 미생물 군이다. 쉬조키트리움(Schizochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속(屬)의 구성 종들은 그들의 높은 지질함량 및 높은 레벨의 DHA로 인해 산업상 이용을 위해 잠재적인 오메가-3 공급원으로서 각광받고 있다. 트라우스토키트리드는 부생균류(saprobe)로서, 혹은 경우에 따라 기생 생물로서 공급되는 미세 종속영양균의 관용명이다. 트라우스토키트리드 류는 남극 대륙, 북해, 인도, 일본 및 오스트레일리아로부터 분리된 균주와 함께 넓은 지리학적 분포를 가진다. 이들은 살아있는 식물에서 드물게 발견되고 식물 항균제에 의해 억제되는 것으로 보인다. 이들 군의 구성 종은 때로는 거대 조류 및 수생 맨그로브(Mangrove) 잎 등의 죽은 토착성뿐만 아니라 이지성 식물 소재에 풍부하게 존재한다. 이들은 통상 연안 및 심해를 비롯한 원양 수주(water column) 및 침전물에 존재한다.
이미 해양 미세조류의 일종인 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속 미생물에 의한 오메가-3 불포화 지방산의 생산방법은 60년대 말부터 알려져 있었으며(Ellenbogen B. B. et al., , Comp. Biochem. Physiol., 29, 805-811(1969)), 가장 앞선 기술을 보유하고 있는 것으로 평가되는 마르텍(Martek)사는 쉬조키트리움속 미생물인 쉬조키트리움(Schizochytrium) sp. ATCC 20888 및 쉬조키트리움(Schizochytrium) sp. ATCC 20889를 이용하여 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 방법을 개발하였다(US 5,130,242B 및 US 5,340,742B). 또한, 산토리(Suntory)사는 도코사헥사엔산 생산성이 우수한 미생물로 쉬조키트리움 리마시눔 SR21(Schizochytrium limacinum SR21)을 보고한 바 있다(JP 1997-000284A, US 6,582,941B).　
지금도 다수의 연구가 진행되고 있지만, 여전히 높은 생산성 및 공정 효율성, 특히 환경친화적으로 바이오오일을 대량생산할 수 있는 능력을 가지는 새로운 미세조류에 대한 요구는 절실한 상황이다.
본 발명의 목적은 높은 불포화 지방산 생산성을 가지며, 배양 및 정제 등의 공정 효율성을 제고함으로써 경제적으로 바이오오일을 생산할 수 있는 신규 미세조류를 제공하는 것이며, 본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미세조류를 이용한 바이오오일 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 하구서식시, 습지 및 갯벌 등 14개의 지역(sites)에서 채취한 샘플을 기반으로 다양한 성능을 시험한 결과, 신규 Thraustochytrid 계 미세조류인 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 이용하면 가장 효율적이고 경제적으로 오메가-3 및 추가적으로 오메가-6 불포화 지방산을 생산할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
이에 따라 본 발명은 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산 생산능을 가지는 신규 Thraustochytrid 계 미세조류인 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 제공한다.
본 발명에 따른 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)이 생산하는 바이오오일은 오메가(omega)-3 불포화 지방산의 함량이 전체 바이오오일의 30 중량% 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공되는 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)은 배양 후 침전이 잘 일어나서 기존에 침전을 위해 사용되는 산 또는 알칼리성 응집제(flocculant)를 사용할 필요가 없으므로 경제적이면서 환경친화적인 공정 운전이 가능하며, 배양 중에 자가 용해(autolysis)가 거의 일어나지 않기 때문에 회분식(batch) 배양 방식 뿐 아니라, 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양으로도 고농도 배양이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 자가 용해가 거의 일어나지 않기 때문에 세포 용해물(cell lysates)에 의한 거품(foam)이 거의 발생하지 않아 소포제(antifoaming agent) 사용이 필요하지 않고, 공급 또는 발생되는 가스(gas)의 흐름이 원활하고, 반응기 내에 압력이 높아질 위험성이 적어 공정 안전성 및 안정성이 제고될 수 있다는 장점이 있다.
본 발명은 또한, 상기 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)를 배양하여 오메가-3 및 추가적으로 오메가-6 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로 상기 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 이용한 오메가-3을 포함하는 바이오 오일의 생산방법은 하기 단계를 포함하여 이루어진다.
(1) Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 배양하는 단계;
(2) 배양된 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 회수하고, 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계;를 포함하며,
추가적으로
(3) 분리된 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 정제하는 단계.
를 포함할 수 있다.
이하 각 단계를 보다 상세히 설명한다.
상기 단계 (1)에서의 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 배양은 회분식(batch), 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양 방식에서 선택된 형태로 진행될 수 있으며, 유가식 배양 또는 연속식 배양 방식을 사용하는 것이 바람직하다.
단계 (1)에서 유가식 또는 연속식 배양을 통해 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 배양하기 위해서는 탄소원(carbon source)을 공급하는 것이 바람직하다. 이때 사용될 수 있는 탄소원은 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)이 이용하여 성장할 수 있는 탄소원이라면 제한없이 사용가능하며, 포도당(글루코스 : glucose), 푸룩토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 글리세롤(glycerol), 바이오 디젤 폐기물인 조 글리세롤(crude glycerol) 등이 바람직하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 글루코스가 가장 바람직하다. 탄소원은 적절한 농도가 유지될 수 있도록 연속식 또는 유가식으로 공급되는 것이 바람직하며 필요에 따라 pH-stat 또는 DO-stat 등의 방법이 사용될 수 있고, 각 탄소원의 농도를 실시간으로 측정하여 필요시 공급하는 방식 등도 이용될 수 있다. 또한, Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 성장을 위해 필요한 영양 성분이 배지(medium) 내에 포함될 수 있는데, 각종 질소원(nitrogen source), 인원(phosphate source) 및 기타 성분 등이 포함될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이며, 복합배지(complex medium) 또는 한정배지(defined medium) 등이 사용될 수 있다는 점 또한 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 질소원으로는 효모 추출물(Yeast extract), corn steep liquor, beef extract, malt extract, peptone, tryptone 등의 유기질소원이나 ammonium acetate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea 등의 무기질소원도 사용가능하다.
특히, 염분 농도를 적절한 농도 수준으로 설정하여 그 범위 내에서 조업을 진행하는 것이 바람직하다.
단계 (1)에서 유가식 또는 연속식 배양을 통해 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 배양하는 동안 pH 및/또는 온도를 미리 설정한 범위에서 유지하여 주는 것이 바람직하다. 배양 중에 pH 및/또는 온도를 일정하게 유지하는 방법은 당업계에서 잘 알려진 방법을 사용할 수 있는데, 냉각수를 이용한 cooling jacket를 이용하는 방법, pH controller를 이용하여 산 또는 염기를 자동 공급하는 방법 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 단계 (1)에서 상기 유가식 또는 연속식 배양을 통한 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 배양은 적절한 공기의 공급(aeration) 및 교반(agitation) 하에서 이루어지는 것이 바람직하다. 공기의 공급속도 및 교반 속도는 통상의 기술자가 공정 조건에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 보다 구체적으로 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)은 호기성이며 교반에 의한 전단응력에 약한 특성이 있어서 교반속도는 50~300 rpm, 바람직하게는 100~300 rpm에서 선택될 수 있고, 공기의 공급속도는 0.5~5 vvm, 바람직하게는 1~3 vvm에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단계 (1)의 배양을 통해 생산되는 바이오오일에서 오메가-3 불포화 지방산의 함량은 전체 바이오오일의 30 중량% 이상, 바람직하게는 40 중량% 이상, 가장 바람직하게는 50 중량% 이상이다.
단계 (2)에 따라 배양된 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 회수하고, 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계는 단계 (1)에서의 배양이 완료된 후, 세포 침전을 유발하는 단계를 포함한다. 침전을 유발하는 단계는 배양이 완료된 배양액을 적절한 시간 동안 방치하는 것만으로도 충분하다. 이는 앞서 설명한 바와 같이 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)은 별다른 응집제의 사용없이도 빠른 시간 내에 침전이 일어날 수 있기 때문으로, 침전제의 사용이나 원심분리 공정 등이 추가적으로 필요하지 않다는 장점이 있다. 구체적으로 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP) 배양액을 약 1~60 분, 바람직하게는 약 5~40 분, 보다 바람직하게는 약 10~30 분간 방치하여 중력에 의해 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 침전이 일어나도록 할 수 있다.
Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 침전이 완료되면 펄스 전자장(pulsed electric field)을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 삼투압을 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 등을 통해 세포의 파쇄를 유도할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 헥산(hexane) 등의 유기 용매(solvent)를 이용하여 세포 파쇄 및 오일 추출을 하는 방법도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 특히, 삼투압을 이용한 세포 파쇄 후, 상기 펄스 전자장(pulsed electric field)을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 및 유기 용매를 이용한 세포 파쇄 방법에서 선택된 어느 하나의 파쇄기술을 사용할 경우 세포 파쇄 효과를 높일 수 있다.
세포 파쇄가 진행되면 오일층(oil phase)과 세포 파쇄물을 포함하는 물층(aqueous phase)의 상분리가 일어나게 되는데, 세포 파쇄가 완료된 후, 오일층만을 회수하고, 이후 단계 (3)에 따른 정제 단계를 통해 최종 바이오오일 제품을 수득할 수 있게 된다.
단계 3)에 따른 바이오오일의 정제 단계는 -5~0 ℃에서 5-20 시간 동안 방치하여 응고되는 유분을 제거하는 단계, bleaching clay 및/또는 활성탄을 이용한 탈색(bleaching) 단계, 필터링(filtering) 단계 및 탈취(deodorizing) 단계에서 선택된 하나 이상의 단계를 포함하여 이루어지며, 바람직하게는 상기 단계가 순차적으로 수행될 수 있다.
필터링은 기공 크기 0.5~1 μm의 기공크기를 가지는 필터를 이용하여 수행되는 것이 바람직하며, 탈취 단계는 감압증기탈취 공정을 통해 이루어지는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 신규 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)은 배양 후 침전이 잘 일어나서 기존에 침전을 위해 사용되는 산 또는 알칼리성 응집제(flocculant)를 사용할 필요가 없어 경제적이면서 환경친화적인 공정 운전이 가능하며, 배양 중에 자가 용해(autolysis)가 거의 일어나지 않기 때문에 회분식(batch) 배양 방식 뿐 아니라, 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양으로도 고농도 배양이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 자가 용해가 거의 일어나지 않기 때문에 세포 용해물(cell lysates)에 의한 거품(foam)이 거의 발생하지 않아 소포제(antifoaming agent) 사용이 필요하지 않고, 공급 또는 발생되는 가스(gas)의 흐름이 원활하고, 반응기 내에 압력이 높아질 위험성이 적어 공정 안전성 및 안정성이 제고될 수 있다는 장점이 있다.
따라서, 신규 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)을 이용하여 보다 경제적이고 환경친화적으로 바이오 오일을 생산할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 신규 Thraustochytrid 계 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 고체배양 및 현미경 관찰 사진을 나타내는 도면.
(A) 고체배양 사진
(B) 현미경 관찰 사진
도 2는 신규 Thraustochytrid 계 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 배양 시간에 따른 세포 농도, 바이오오일 농도 및 오메가-3 지방산 분율을 나타내는 도면.
도 3은 신규 Thraustochytrid 계 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 시간에 따른 침전정도를 나타내는 도면.
(A) Thraustochytrium sp. (ATCC 26185)
(B) Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP))
도 4는 신규 Thraustochytrid 계 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 배양액을 10 분간 방치한 후의 침전된 모습을 나타내는 도면
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 미세조류의 분리
하구서식지, 습지 및 갯벌 등 14개의 지역에서 채집한 샘플을 pine pollen baiting법을 이용하여 Thraustochytrid 계 미세조류를 분리하였다. 채집한 샘플 50 ml에 송화가루를 뿌리고 3 주 배양하였다. 얻어진 배양액 200 ㅅl를 효모추출물(yeast extract) 1 g/L, 펩톤(peptone) 1 g/L, 포도당(glucose) 10 g/L 및 아가(agar) 15 g/L가 함유된 고체배지에 도말한 후, 25 ℃에서 5 일간 배양하였다. 얻어진 콜로니들을 4회 계대배양하여 순수 분리하고, 각 콜로니들을 50 ml 액체배지(yeast extract 3 g/L, glucose 15 g/L)를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 250 mL 진탕배양기(shaking incubator)에서 6일 배양한 후, 균체를 회수하여 동결건조기로 건조하였다. 건조된 균체를 4% 황산-메탄올 용액 3 ml에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산 에스테르를 200 ㅅl의 헵탄으로 추출하여 기체크로마토그래피로 지방산 조성을 분석하였다.
분리된 콜로니 중에서 전체 지방산 중 30 중량% 이상의 오메가-3 지방산을 가지는 균체를 선별하고, 이중에서 세포 응집이 자발적으로 잘 일어나는 미세조류를 분리하였으며 최종적으로 이를 LA6 라고 명명하였다(도 1 참조).
실시예 2. 18S DNA 분석을 통한 동정(identification)
최종 선별된 LA6의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 Thraustochytrid 계 미세조류 18s rRNA 유전자 증폭용 프라이머 F: 5'-TAGTGATTAACCTGGTTGATCC-3'(서열번호 2)와 R: 5'-TCCTTGTTACGACTTCACCTT-3'(서열번호 3)을 이용하여 PCR법으로 18s rRNA유전자 DNA를 증폭하였다. 증폭된 반응액은 염 제거 후 제노텍㈜에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며, 서열번호 1에 나타내었다. NCBI (미국 국립생물정보센터) Blast를 통해 검색한 결과 LA6은 새로운 Thraustochytrium 계 미세조류인 것으로 확인되었으며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2013년 3월 22일자로 Thraustochytrium sp. LA6, 기탁번호 KCTC 12389BP로 기탁하였다.
실시예 3. Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 성장 및 바이오오일 생산 특성 분석
실시예 1에서 분리된 신규 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 성장 및 바이오오일 생산 특성을 조사ㅇ분석하였다.
포도당 30 g/L, 효모추출물(Yeast Extract) 6 g/L, 해수 천일염 25 g/L를 첨가한 배지에서 전배양한 미세조류 균체를 포도당 60 g/L, 효모추출물(Yeast Extract) 6g/L, 해수 천일염 25 g/L를 첨가한 3 L의 배지(5L jar fermentor)에 접종하여 28℃에서 100 rpm, 1 vvm, pH 7의 조건으로 회분식 발효를 수행하면서 12시간 간격으로 균체를 회수하여 균체성장과 오일 및 DHA함량을 조사하였다. 그 결과 72 시간만에 배지내의 포도당을 모두 소모하였으며 이때 24 g/L의 균체가 수득되었다(도 2참조). 수득한 균체로부터 유기용매를 사용하여 미세조류 내 오일을 추출한 결과 미세조류 건조중량 대비 오일의 함량은 53 중량%이었고 오일 대비 오메가-3의 함량은 52 중량% 이었다. 오메가-3는 DHA, DPA 및 EPA의 합으로 산출되었다.
균체량은 12시간 간격으로 1 ml의 배양액을 1회당 3번 회수하여 각각의 시료를 원심분리법으로 균체를 분리한 뒤 0.8% 생리식염수로 2회 세척하고 60℃에서 12시간 동안 건조하여 중량을 측정하였고, 3번의 평균을 1회의 균체량으로 기록하였다.
오메가-3 오일 조성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 건조균체 1g에 20ml의 헥산(Hexane)을 첨가하고 15분 동안 흔들어 섞은 용액에 황산과 메탄올 혼합용매(4:96) 3 ml을 첨가하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, 헥산 200 ㅅl를 첨가하였다. 여기에 물 1 ml을 첨가하고 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 헥산층을 분리, 수득하여 기체크로마토그래피법으로 측정하였다.
실시예 4. Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 침전 특성 분석
실시예 1에서 분리된 신규 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)의 침전특성을 분석하기 위해 대조군으로 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)와 가장 상동성이 높은 미세조류 Thraustochytrium sp. (ATCC 26185)를 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양 받아 사용하였다.
Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP) 및 Thraustochytrium sp. (ATCC 26185)를 각각 포도당 60 g/L, 효모추출물(Yeast Extract) 6 g/L, 해수 천일염 25 g/L를 첨가한 3 L의 배지(5L jar fermentor)에서 28℃에서 100 rpm, 1 vvm, pH 7의 조건으로 72시간동안 회분식 배양하였다.
배양이 완료된 배양액을 회수한 뒤, 각각의 미세조류가 배양액에 고르게 퍼지도록 흔들어 유리 실린더에 옮기고 0, 10, 20, 30분 동안 중력에 의해 미세조류가 침전되는 양상을 관찰하였다. 그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 30분 동안 방치시킨 후, 왼쪽의 대조구인 Thraustochytrium sp. (ATCC 26185) 균체는 배양액에 고르게 퍼져있는 반면 오른쪽의 실험구인 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP) 균체는 모두 완전히 침전됨을 확인하였다. 또한 배양액을 약 10분 정도 방치하면Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP)은 침전이 상당부분 이루어짐을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 통상의 기술자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12389BP 20130322
<110> SK Innovation Co., Ltd. SK Global Chemical Co., LTD. <120> Novel microalgae Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP), and producing method for bio-oil by using thereof <130> P13-B069 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1710 <212> DNA <213> Thraustochytrium sp.LA6 KCTC 12389BP <400> 1 cctacgctcg tctcaaagat taagccatgc atgtgtaagt ataagcgatt atactgtgaa 60 actgcgaacg gctcattata tcagttataa tttcttcggt agtttcttta catggatacc 120 tgcagtaatt ctggaattaa tacatgctgt aagggcccga ctgcttgcgg gagggccgca 180 cttattagaa ttgaagccaa ctttattggt gagtcatgat aatttcgcag atcgctcttt 240 tgagcgatga atcgtttgag tttctgcccc atcagttgtc gacggtagtg tattggacta 300 cggtgactat aacgggtgac ggggagttag ggctcgactc cggagaggga gcctgagaga 360 cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgtaaatta cccaatgtgg actccacgag 420 gtagtgacga gaaatatcaa tgcggggcgc ttcgcgtctt gctattggaa tgagagcaat 480 gtaaaaccct catcgaggat caactggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt 540 ccagctccag aagcgtatgc taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaatttctg 600 gcgtgggagc cctggccttt gcgcgaatgc gctctgtttg ctgtgtggct cctctgccat 660 cctcgccagc cttttggttg gcgtcattca ctgtaattaa agcagagtgt tccaagcagg 720 tcgtacgatc tggatgttta ttatgggatg atcagatagg actcgggtgc tattttgttg 780 gtttgcacat ctgagtaatg attaatagga acagttgggg gtattcgtat ttaggagcta 840 gaggtgaaat tcttggattt ccgaaagacg aactacagcg aaggcattta ccaagcatgt 900 tttcattaat caagaacgaa agtctgggga tcgaagatga ttagatacca tcgtagtcta 960 gaccgtaaac gatgccgact tgcgattgcg gggcgtttgt attggaccct cgcagcagca 1020 catgagaaat caaagtcttt gggttccggg gggagtatgg tcgcaaggct gaaacttaaa 1080 ggaattgacg gaagggcacc accaggagtg gagcctgcgg cttaatttga ctcaacacgg 1140 gaaaacttac caggtccaga cataggtagg attgacagat tgagagctct ttcttgattc 1200 tatgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg atttgtctgg ttaattccgt 1260 taacgaacga gacctcggcc tactaaatag cgacgggtat ggcgacatac ctgggtctgc 1320 ttcttagagg gacatgttcg gtttacgagc aggaagttcg aggcaataac aggtctgtga 1380 tgcccttaga tgttctgggc cgcacgcgcg ctacactgat gggttcaacg ggtcttttcg 1440 ctgctcgcag cgagttgctt tgccggaagg catggctaat cctttcaacg ctcatcgtgc 1500 tggggctaga tttttgcaat tattaatctc caacgaggaa ttcctagtaa acgcaagtca 1560 tcagcttgca ttgaatacgt ccctgccctt tgtacacacc gcccgtcgca cctaccgatt 1620 gaacggtccg atgaaaccat gggatgacct tttgagcgtt tattcgcgat ggaggtcaga 1680 actcgggtga atcttattgt ttagaggaag 1710 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tagtgattaa cctggttgat cc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tagtgattaa cctggttgat cc 22

Claims (14)

  1. 신규 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP).
  2. 제1항에 있어서, 바이오오일 생산능을 가지는 것을 특징으로 하는 신규 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP).
  3. 제2항에 있어서, 생산된 바이오오일에서의 오메가-3 불포화 지방산 함량이 전체 바이오오일의 30 중량% 이상임을 특징으로 하는 신규 미세조류 Thraustochytrium sp. LA6 (KCTC 12389BP).
  4. (1) 제1항에 따른 미세조류를 배양하는 단계; 및
    (2) 배양된 미세조류를 회수하고, 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  5. 제4항에 있어서, 생산된 바이오오일에서 오메가-3 불포화 지방산 함량이 전체 바이오오일의 30 중량% 이상임을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  6. 제4항에 있어서, 단계 (1)에서의 배양은 회분식, 유가식 또는 연속식 배양 방식에서 선택되는 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  7. 제4항에 있어서, 단계 (2)에서의 배양된 미세조류를 회수하고, 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계는 세포 침전을 유발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  8. 제7항에 있어서, 세포 침전을 유발하는 단계 이후, 세포 파쇄 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포 파쇄는 펄스 전자장(pulsed electric field)을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 삼투압을 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 및 유기 용매를 이용한 세포 파쇄 방법에서 선택된 하나 이상의 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  10. 제9항에 있어서, 세포 파쇄는 삼투압을 이용한 세포 파쇄를 수행한 후, 펄스 전자장을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 및 유기 용매를 이용한 세포 파쇄 방법에서 선택된 하나 이상의 방법이 추가로 수행되는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  11. 제8항에 있어서, 세포 파쇄 단계 이후, 바이오오일을 포함하는 오일층(oil phase)과 세포 파쇄물을 포함하는 물층(aqueous phase) 중에서 오일층만을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (2) 단계 이후에
    (3) 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오오일을 정제하는 단계;
    를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  13. 제11항에 있어서, 단계 (3)의 바이오오일 정제 단계는 응고되는 유분을 제거하는 단계, bleaching clay 및 활성탄에서 선택된 하나 이상을 이용한 탈색(bleaching) 단계, 필터링(filtering) 단계 및 탈취(deodorizing) 단계에서 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 탈취단계는 감암증기탈취 공정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 생산방법.
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