KR20110122424A - 신규 유지성 미세조류 ｋｒｓ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법 - Google Patents

신규 유지성 미세조류 ｋｒｓ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytri계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP) 및 상기 미세조류 KRS101을 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미세조류는 포도당 함유 배지에서 배양하였을 때 균체 내에 높은 비율로 바이오오일을 축적하여, 고수율로 바이오오일을 생산할 수 있다.

Description

신규 유지성 미세조류 ＫＲＳ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법 {Novel Fatty Oilic Microalgae KRS101 and Preparing Method for Biooil Using Thereof}
본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytri계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP) 및 상기 미세조류 KRS101을 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법에 관한 것이다.
유채, 대두, 팜과 같은 유지성 식물의 오일을 원료로 하여 제조되는 바이오디젤은 이미 상용화가 이루어진 대표적인 바이오에너지로서 전 세계적으로 그 생산량이 급증하고 있다. 하지만, 생산 비용 측면에서 원료작물의 높은 가격 때문에 바이오디젤은 원유 유래의 디젤 원료에 비해 상대적으로 경쟁력이 취약한 편이다. 따라서 환경, 농업 경제 등 다양한 이점에도 불구하고 정부의 세제 감면 혜택이 없다면 바이오디젤의 시장 경쟁력은 없다고 볼 수 있다. 향후 에너지 고갈에 따른 원유가격의 상승은 바이오디젤에 시장경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대되지만, 한편 최근의 바이오디젤 생산 증가에 따른 원료 작물 가격의 급등은 바이오디젤의 경쟁력을 더욱 악화시키는 새로운 요인으로 대두되고 있다.
바이오디젤의 제조를 위한 바이오오일 원료의 주요한 공급원은 식물성 유지 혹은 미세조류 오일 등 광합성 오일이다. 유지성 식물 및 미세조류의 광합성 오일은 풍부한 태양광을 이용하고 이산화탄소를 재활용을 하는 매우 중요한 장점이 있지만, 시간, 공간, 계절, 기후 등 다양한 환경 요인에 의해 영향을 받는 단점이 있다. 일각에서는 광합성 오일을 원료로 하는 바이오디젤의 보급 확대가 식량 부족 및 원료작물의 대량 재배에 따른 새로운 환경문제를 야기할 수 있기 때문에 그 실효성 자체에 대한 의구심이 제기되고 있는 상황이다.
최근 바이오오일의 대량 생산 방법으로 유기영양 미생물의 발효배양법이 주목을 받고 있다. 폐기물, 부산물 및 잉여 바이오매스 자원으로부터 생산된 미생물 발효오일은 광합성오일과 함께 바이오디젤의 원료로 활용될 것으로 기대된다. Chlorella protothecoides, Yarrowia lipolytica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis 등이 대표적인 유지성 미생물이며, 이들의 발효 공정 연구가 활발하게 진행 중이다.
한편, Thraustochytrid 계열 미세조류는 DHA (docosahexaenoic acid)와 같은 고도불포화지방산 (polyunsaturated fatty acid)을 고농도로 함유하는 유지성 미생물이다. DHA는 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려졌다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 이러한 유용한 생리적 기능에도 불구하고, 인체는 자체적으로 충분한 량의 DHA를 합성할 수 없기 때문에 외부로부터 공급되어야 하는 필수 영양소로 인식되어 세계보건기구를 비롯한 각국의 공인 기관들이 DHA를 하루 1 g 이상 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다. 때문에 DHA는 건강기능성 식품 등 다양한 제품으로 상용화되고 있으며, 의약품 원료로도 활용 가능성 높아 DHA의 상업적 가치는 매우 높다고 할 수 있다. 따라서 DHA를 고농도로 함유하는 Thraustochytrid 미세조류의 발효오일은 DHA를 활용한 고부가가치 산업과 바이오디젤 산업을 연계함으로써, 일반적인 미생물 발효 오일 혹은 광합성 오일과 달리 바이오디젤의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명자들은 미세조류를 이용하여, 높은 수율로 DHA를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 말레이시아 맹글로브지역의 토양에서 채취된 신규 Thraustochytrid계 미세조류를 획득하고, 상기 신규 미세조류가 DHA를 고농도로 함유하고 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고수율로 바이오오일을 생성하는 신규한 미세조류 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미세조류 균주를 이용하여 바이오오일을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytri계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 미세조류 KRS101를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미세조류는 포도당 함유 배지에서 배양하였을 때 균체 내에 높은 비율로 바이오오일을 축적하여, 고수율로 바이오오일을 생산할 수 있다.
도 1은 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101의 현미경 관찰 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101의 분류학적 계통도을 나타낸 것이다.
도 3은 5-L 발효조를 이용한 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101의 회분식 발효 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 5-L 발효조를 이용한 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101의 유가식 발효 배양 결과를 나타낸 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytri계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP)에 관한 것이다.
본 발명의 미세조류 KRS101은 말레이시아 맹그로브지역의 나뭇잎, 토양 시료에서 채취한 것으로, Thraustochytrid 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/L yeast extract, 1 g/L peptone, 10 g/L agar를 300 mg/L Penicillin G와 500 mg/L streptomycin sulfate를 첨가한 천연해수 1 L에 녹임) 에서 배양하여, 순수분리한 후, Thrasustochytrid 미세조류의 전형적인 특징인 유주자 (zoospore)낭을 형성하는 균주를 분리하여 수득하였다.
본 발명에 있어서, 상기 미세조류는 서열번호 1의 18S DNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 바이오오일은 DHA(docosahexaenoic acid)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 DHA는 미세조류 KRS101에 포함된 전체 지방산에서 40%이상을 차지하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 45%이상 더욱 바람직하게는 49% 이상으로 포함될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 미세조류 KRS101의 균체는 고농도의 고도불화지방산을 함유하고 있는 것으로 나타났으며, 특히 DHA의 함량은 전체 지방산의 49.5%에 달하는 것으로 확인되었다.
다른 양태에서, 본 발명의 미세조류 KRS101은 유일 탄소원인 포도당을 다양한 농도로 첨가한 기본배지에서 포도당 60 g/L의 농도에서 가장 높은 균체 성장을 보이는 것으로 나타났으며 (건조 균체량 9.09 g/L), 이때 오일의 함량은 건조균체량의 45% 이었으며, DHA의 함량은 전체지방산의 41.22%인 것으로 확인되었다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 미세조류 KRS101은 유일 질소원인 yeast extract를 다양한 농도로 첨가한 기본배지에서, yeast extract의 농도가 높을수록 우수하였지만, 오일의 함량은 반대로 yeast extract의 농도가 낮을수록 우수한 것으로 나타났다. 또한, DHA 함량은 yeast extract의 농도가 낮을수록 다소 감소하는 것으로 나타났다. 해수염의 농도에 따른 영향을 살펴본 결과, 균체성장, 오일 및 DHA의 함량은 해수염의 농도가 낮을수록 더욱 유리한 것으로 나타났다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 미세조류 KRS101은 포도당 대신에 탄소원으로 fructose, arabinose, xylose, lactose, maltose, sucrose, glycerol, crude glycerol을 60 g/L로 첨가한 경우, 포도당에 비해 다소 감소하기는 하였지만 여전히 KRS101 균주는 균체 성장이 가능하였으며, 특히 바이오디젤 폐기물인 crude-glycerol을 탄소원으로 이용하였을 때는 순수 글리세롤에 비해 보다 우수한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 미세조류 KRS101은 Yeast extract 대신에 유기질소원으로 corn steep liquor, beef extract, malt extract, peptone, tryptone을 10 g/L의 농도로 첨가해준 경우, 균체 성장이 가능하였으며, 특히 corn steep liquor에서는 yeast extract와 유사한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다. 또한 ammonium acetate (2.34 g/L), ammonium nitrate (1.22 g/L), ammonium sulfate (2.0 g/L), sodium nitrate (2.58 g/L), urea (0.9 g/L)를 첨가하여 다양한 무기질소염의 영향을 살펴본 결과, ammonium acetate와 urea에서 가장 우수한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다. 한편, sodium acetate(15.48 g/L), sodium bicarbonate (15.86 g/L), sodium carbonate(10.0 g/L), sodium citrate (27.8 g/L), sodium nitrate (16.0 g/L), sodium sulfate (13.4 g/L)를 첨가하여 비염소성 염의 영향을 살펴본 결과, 모두에서 KRS101 균주가 양호한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 미세조류 KRS101를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 배양은 유가식 또는 회분식 배양인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 미세조류 KRS101을 포도당 60g/L, corn steep liquor 10g/L, ammonium acetate 5g/L, KH2PO4 3 g/L, 해수염 15g/L를 첨가한 배지에서 회분식 발효를 수행한 결과, 배양 72시간째에 첨가한 포도당을 완전히 소모하였으며, 이때 건조 균체량, 오일 및 DHA의 함량은 각각 24.8 g/L, 31.2 %, 36.7%이었으며, 오일과 DHA의 생산량은 각각 7.8 g/L와 2.9 g/L인 것으로 나타났으며, 동일한 조건으로 KRS101의 유가식 발효 배양을 수행한 결과, 60시간째에 최대의 균체 성장을 보였으며, 이때 건조균체량과 오일 및 DHA 함량은 각각 50.2 g/L, 43.5%, 40.3% 이었으며, 오일과 DHA의 생산량은 각각 21.9 g/L와 8.8 g/L로 매우 우수한 것으로 나타났다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 신규 DHA 함유 유지성 미세조류의 분리, 동정
말레이시아 맹그로브지역의 나뭇잎, 토양 시료를 50ml falcon tube를 이용하여 채취하고, 생리식염수 10ml을 가하여 현탁한 후 적당히 희석하여 Thraustochytrid 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/L yeast extract, 1 g/L peptone, 10 g/L agar를 300 mg/L Penicillin G와 500 mg/L streptomycin sulfate를 첨가한 천연해수 1 L에 녹임) (Burja et al. 2006)에 도말하였다. 28℃에서 200rpm으로 2-4일간 배양하여 얻어진 콜로니들을 B1 배지에 재접종하여 순수분리한 후 현미경으로 관찰하여 Thrasustochytrid 미세조류의 전형적인 특징인 유주자 (zoospore)낭을 형성하는 30개의 콜로니를 분리하였다(도 1).
분리한 30개의 콜로니들을 50 mL marine broth (Sigma-Aldrich) (250-mL 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120rpm으로 3일간 배양한 후, 균체를 회수하여 60℃에서 12시간 동안 감압원심분리기로 건조하였다. 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 3 mL에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.6 mL의 핵산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 균체에는 고농도의 고도불화지방산이 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 특히 DHA의 함량은 전체 지방산의 49.5%에 달하는 것으로 나타났다. 조사한 30개의 콜로니가 유사한 지방산 조성을 보이는 것으로 확인되었다.
신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 지방산 조성
Fatty acids 14:0 15:0 16:1 16:0 17:0 18:3 18:2 18:1 20:5 22:5
(n6)		 22:6 22:5
(n3)
Marine - 17.39 - 8.89 3.1 - 0.93 - 2.18 8.12 49.59 0.86
Basal 2.73 14.09 0.43 24.60 2.72 0.26 - 0.91 0.48 10.00 39.49 0.35
분리한 콜로니의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 전형적인 Phenol-chloroform법으로 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 Thraustochytrid 미세조류 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P1, 서열번호 2)와 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P2, 서열번호 3) 을 이용하여 PCR법으로 18S rRNA 유전자 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭은 EF Taq polymerase(Takara)(2.5 U), polymerase buffer, dNTP 혼합물(각 1 mM), 각 프라이머(100 pmol) 1μl, 주형 DNA 500ng을 함유하는 PCR 반응용액(50μl)을 준비한 후, 유전자 증폭기(Takara, Japan)로 96℃ 30초, 43℃ 1분, 72℃ 3분 조건으로 30회간 수행하였다. PCR 반응액을 1% 아가로즈겔에서 전기 영동하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하고 pGEM-TEasy 벡터(Promega, USA)를 이용하여 대장균 DH5α으로 형질도입하였다. 형질 전환된 재조합 대장균들로부터 플라스미드 DNA를 추출(Qiagen, USA)하고, 제한효소 EcoRI을 처리하여 원하는 크기의 DNA 단편이 클로닝된 것을 확인하였으며, 염기서열을 결정하였다 (서열번호 1 GenBank accession number HM126528). 염기서열 상동성 분석 결과, Aurantiochytrium mangrovei와 Aurantiochytrium sp. BL1과 각각 99.3% 및 98.9%의 상동성을 보이는 새로운 Thraustochytrid계열 미세조류로 확인되어 KRS101로 명명하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 4월 22일자로 기탁하였다(KCTC11686BP).
실시예 2 : 신규 미세조류의 균체성장 및 DHA 함유 오일 생산 능력 분석
실시예 1에서 분리한 신규 Thraustochytrid 계열 KRS101 균주의 균체 성장 및 DHA 함유 오일 생산 능력을 다양한 영양원 조건에서 조사하였다.
기본배지로는 탄소원 포도당 60 g/L, 질소원 Yeast extract 1 g/L, 인공해수염 6 g/L을 함유한 배지를 사용하였다. 단일콜로니를 기본배지 15 mL을 이용하여 28℃에서 120 rpm으로 3일간 전배양한 후 배양액 1 mL을 다양한 농도의 탄소원, 질소원 및 해수염을 함유한 함유한 배지에 각각 접종하여 28℃에서 120 rpm으로 3일간 배양하였다. 원심분리법으로 회수한 균체를 PBS 버퍼 (phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척한 후 60℃에서 12시간 건조하여 건조균체중량을 측정하였다.
DHA 함유 오일함량은 수정된 Bligh-Dyer법 (Burja et al., 2007)을 의하여 분석되었다. 건조 균체량 125 mg에 Chloroform 6.25 mL, methanol 12.5 mL, 50 mM K2HPO4 버퍼 (pH 7.4) 5 mL을 가하여 28℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응한 후 Chloroform 6.25 mL, K2HPO4 버퍼 6.25 mL을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 30분 동안 방치하여 수층과 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 Chloroform 층을 조심스럽게 옮긴 후 80℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.
총 오일함량 (%, 오일 g /건조균체량 100 g) = (WL-WD)xVCx100/VPxWS
WL: 알루미늄 접시의 무게
WD: 알루미늄 접시 + 지질의 무게
VC: Chloroform의 총 부피
VP: 알루미늄 접시에 옮긴 Chloroform의 부피
WS: 사용한 균체의 무게 (건조중량)
한편, 오일중에 함유된 DHA의 함량은 기체크로마토그래피법으로 측정하였다. 적당량의 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 용액 3 mL에 현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응하여 지방산에스테르를 생성한 다음 핵산 0.6 mL로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, marine broth와 비교해 기본배지에서 KRS101을 배양한 경우에 marine broth에 배양한 경우에 지방산의 조성이 약간 변화하는 양상을 보였지만, 여전히 DHA를 비롯한 고도불포화지방산이 고농도로 생성되는 것으로 나타났다.
유일 탄소원인 포도당을 다양한 농도로 첨가한 기본배지에서 KRS101 균주를 배양한 결과, 표 2에서 보인 바와 같이 60 g/L의 농도에서 가장 높은 균체 성장을 보이는 것으로 나타났으며 (건조 균체량 9.09 g/L), 이때 오일의 함량은 건조균체량의 45% 이었으며, DHA의 함량은 전체지방산의 41.22%인 것으로 조사되었다.
신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 오일 및 DHA 함량에 대한 포도당 농도의 영향
Concentration
(g L-1)		 Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
5 4.49 8.50 44.08
20 8.22 35.85 40.13
40 7.38 36.75 41.19
60 9.09 45.00 41.22
100 5.57 28.10 38.76
160 6.19 27.45 40.57
한편, 유일 질소원인 yeast extract를 다양한 농도로 첨가한 기본배지에서 KRS101 균주를 배양하였을 때, 표 3에서 나타난 바와 같이, 균체 성장은 yeast extract의 농도가 높을수록 우수하였지만, 오일의 함량은 반대로 yeast extract의 농도가 낮을수록 우수한 것으로 나타났으며, 최대 건조균체량의 70%까지 오일의 함량이 증가하였다. 반면 DHA 함량은 yeast extract의 농도가 낮을수록 다소 감소하는 것으로 나타났다.
신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 오일 및 DHA 함량에 대한 yeast extract 농도의 영향
Concentration
(g L-1)		 Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
2 6.28 70.00 32.66
4 6.50 53.25 35.15
6 6.12 51.90 39.55
8 7.68 48.00 38.74
10 8.96 43.80 39.38
해수염의 농도에 따른 영향을 살펴본 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 균체성장, 오일 및 DHA의 함량은 해수염의 농도가 낮을수록 더욱 유리한 것으로 나타났다.
신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 오일 및 DHA 함량에 대한 해수염 농도의 영향
Concentration
(g L-1)		 Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
2 7.62 50.80 41.87
6 7.75 45.00 37.77
15 7.87 40.35 35.06
30 6.19 14.65 34.94
40 6.37 14.20 36.17
50 7.27 13.20 35.25
실시예 3 : 신규 DHA 함유 유지성 미세조류의 다양한 영양원 이용 능력
신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101 균주의 다양한 영양원 이용 능력을 조사하였다. 기본배지에 다양한 탄소원, 질소원 혹은 비해수염을 첨가하여 상기와 같은 방법으로 배양하여 균체 성장과 오일 및 DHA의 함량을 조사하였다.
포도당 대신에 탄소원으로 fructose, arabinose, xylose, lactose, maltose, sucrose, glycerol, crude glycerol을 60 g/L로 첨가한 경우, 표 5에 나타난 바와 같이, 포도당에 비해 다소 감소하기는 하였지만 여전히 KRS101 균주는 균체 성장이 가능하였다. 특히 바이오디젤 폐기물인 crude-glycerol을 탄소원으로 이용하였을 때는 순수 글리세롤에 비해 보다 우수한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다.
다양한 탄소원을 이용한 신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 DHA 함유 오일 생산
Carbon sources Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
Fructose 10.15 15.30 37.25
Arabinose 3.00 8.90 43.88
Xylose 3.38 8.50 43.90
Lactose 4.41 9.00 46.55
Maltose 4.15 6.50 52.36
Sucrose 4.27 21.80 48.25
Pure glycerol 5.60 9.40 37.56
Crude glycerol 7.32 8.50 43.38
Yeast extract 대신에 유기질소원으로 corn steep liquor, beef extract, malt extract, peptone, tryptone을 10 g/L의 농도로 첨가해준 경우, 표 6에 나타난 바와 같이, KRS101은 균체 성장이 가능하였으며, 특히 corn steep liquor에서는 yeast extract와 유사한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다. 또한 ammonium acetate (2.34 g/L), ammonium nitrate (1.22 g/L), ammonium sulfate (2.0 g/L), sodium nitrate (2.58 g/L), urea (0.9 g/L)를 첨가하여 다양한 무기질소염의 영향을 살펴본 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, ammonium acetate와 urea에서 가장 우수한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다.
다양한 유기질소원을 이용한 신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 DHA 함유 오일 생산
Organic nitrogen sources Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
Corn steep liquor 9.44 15.30 37.25
Beef extract 3.00 8.90 43.88
Malt extract 3.38 8.50 43.90
peptone 4.41 9.00 46.55
Tryptone 7.32 8.50 43.38
다양한 무기질소원을 이용한 신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 DHA 함유 오일 생산
Inorganic nitrogen sources Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
Ammonium acetate 9.52 55.40 43.00
Ammonium nitrate 5.99 32.10 47.06
Ammonium sulfate 6.04 19.80 49.34
Sodium nitrate 6.00 63.50 28.25
Urea 10.28 57.70 29.78
한편 sodium acetate (15.48 g/L), sodium bicarbonate (15.86 g/L), sodium carbonate (10.0 g/L), sodium citrate (27.8 g/L), sodium nitrate (16.0 g/L), sodium sulfate (13.4 g/L)를 첨가하여 비염소성 염의 영향을 살펴본 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 모두에서 KRS101 균주가 양호한 균체 성장을 보이는 것으로 나타났다.
다양한 비염소성 염을 이용한 신규 Thraustochytri 계열 미세조류 KRS101의 균체성장과 DHA 함유 오일 생산
Carbon sources Dry cell weight
(g L-1)		 Lipid
(% DCW)		 DHA
(% TFA)
Sodium acetate 6.70 20.30 45.65
Sodium bicarbonate 6.29 4.30 4.23
Sodium carbonate 5.15 5.74 7.21
Sodium citrate 3.20 15.80 39.19
Sodium nitrate 7.43 29.00 28.25
Sodium sulfate 7.53 21.30 40.30
실시예 4 :　발효조를 이용한 신규 분리 미세조류의 배양을 통한 DHA 함유 오일의 생산
상기의 영양원 요구 특성을 분석한 결과를 토대로 최적의 배지 조성을 선정한 후 5-L 발효조를 이용한 KRS101 균주의 발효배양을 수행하였다.
포도당 60g/L, corn steep liquor 10g/L, ammonium acetate 5g/L, KH2PO4 3 g/L, 해수염 15g/L를 첨가한 배지에서 전배양한 균체를 3 L의 동일배지 (5-L jar fermentor)로 이식하여 28℃에서 300rpm, 3vvm, pH 7의 조건으로 회분식 발효를 수행하면서 12시간 간격으로 균체를 회수하여 균체 성장과 오일 및 DHA 함량을 조사하였다. 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 배양 72시간째에 첨가한 포도당을 완전히 소모하였으며, 이때 건조 균체량, 오일 및 DHA의 함량은 각각 24.8 g/L, 31.2 %, 36.7%이었으며, 오일과 DHA의 생산량은 각각 7.8 g/L와 2.9 g/L인 것으로 나타났다.
한편 동일한 조건으로 KRS101의 유가식 발효 배양을 수행한 결과, 도 4에서 보인 바와 같이 배양 60시간째에 최대의 균체 성장을 보였으며, 이때 건조균체량과 오일 및 DHA 함량은 각각 50.2 g/L, 43.5%, 40.3% 이었으며, 오일과 DHA의 생산량은 각각 21.9 g/L와 8.8 g/L로 매우 우수한 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11686BP 20100422
<110> Korea Institute Bioscience and Biotechnology <120> Novel Fatty Oilic Microalgae KRS101 and Preparing Method for Biooil Using Thereof <130> P10-B109 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1779 <212> DNA <213> Thraustochytrid KRS101 <400> 1 TACCTGGTTG ATCCTGCCAG TAGTCATATG CTCGTCTCAA AGATTAAGCC ATGCATGTGT 60 AAGTATAAGC GATTGTACTG TGAGACTGCG AACGGCTCAT TATATCAGTA ATAATTTCTT 120 CGGTAGTTTC TTTTATATGG ATACCTGCAG TAATTCTGGA AATAATACAT GCTGTAAGAG 180 CCCTGTATGG GGCTGCACTT ATTAGATTGA AGCCGATTTT ATTGGTGAAT CATGATAATT 240 GAGCAGATTG ACATTTTTGT CGATGAATCG TTTGAGTTTC TGCCCCATCA GTTGTCGACG 300 GTAGTGTATT GGACTACGGT GACTATAACG GGTGACGGAG AGTTAGGGCT CGACTCCGGA 360 GAGGGAGCCT GAGAGACGGC TACCATATCC AAGGATAGCA GCAGGCGCGT AAATTACCCA 420 CTGTGGACTC CACGAGGTAG TGACGAGAAA TATCGATGCG AAGCGTGTAT GCGTTTTGCT 480 ATCGGAATGA GAGCAATGTA AAACCCTCAT CGAGGATCAA CTGGAGGGCA AGTCTGGTGC 540 CAGCAGCCGC GGTAATTCCA GCTCCAGAAG CATATGCTAA AGTTGTTGCA GTTAAAAAGC 600 TCGTAGTTGA ATTTCTGGCA TGGGCGACCG GTGCTTTCCC TGAATGGGGA TTGATTGTCT 660 GTGTTGCCTT GGCCATCTTT CTCATGCTGT TATTGGTATG AGATCTTTCA CTGTAATCAA 720 AGCAGAGTGT TCCAAGCAGG TCGTATGACC GGTATGTTTA TTATGGGATG ATAAGATAGG 780 ACTTGGGTGC TATTTTGTTG GTTTGCACGC CTGAGTAATG GTTAATAGGA ACAGTTGGGG 840 GTATTCGTAT TTAGGAGCTA GAGGTGAAAT TCTTGGATTT CCGAAAGACG AACTAGAGCG 900 AAGGCATTTA CCAAGCATGT TTTCATTAAT CAAGAACGAA AGTCTGGGGA TCGAAGATGA 960 TTAGATACCA TCGTAGTCTA GACCGTAAAC GATGCCGACT TGCGATTGTT GGGTGCTTTA 1020 TTAATGGGCC TCAGCAGCAG CACATGAGAA ATCAAAGTCT TTGGGTTCCG GGGGGAGTAT 1080 GGTCGCAAGG CTGAAACTTA AAGGAATTGA CGGAAGGGCA CCACCAGGAG TGGAGCCTGC 1140 GGCTTAATTT GACTCAACAC GGGAAAACTT ACCAGGTCCA GACATAGGTA GGATTGACAG 1200 ATTGAGAGCT CTTTCATGAT TCTATGGGTG GTGGTGCATG GCCGTTCTTA GTTGGTGGAG 1260 TGATTTGTCT GGTTAATTCC GTTAACGAAC GAGACCTCGG CCTACTAAAT AGTGCGTGGT 1320 ATGGCAACAT AGTACGTTTT TAACTTCTTA GAGGGACATG TCCGGTTTAC GGGCAGGAAG 1380 TTCGAGGCAA TAACAGGTCT GTGATGCCCT TAGATGTTCT GGGCCGCACG CGCGCTACAC 1440 TGATGGGTTC ATCGGGTTTT AATTCTGATT TTTGGAATTG AGTGCTTGGT CGGAAGGCCT 1500 GGCTAATCCT TGGAACGCTC ATCGTGCTGG GGCTAGATTT TTGCAATTAT TAATCTCCAA 1560 CGAGGAATTC CTAGTAAACG CAAGTCATCA GCTTGCATTG AATACGTCCC TGCCCTTTGT 1620 ACACACCGCC CGTCGCACCT ACCGATTGAA CGGTCCGATG AAACCATGGG ATGTTTCTGT 1680 TTGGATTAAT TTTTGGACAG AGGCAGAACT CGGGTGAATC TTATTGTTTA GAGGAAGGTG 1740 AAGTCGTAAC AAGGTTTCCG TAGGTGAACC TGCGGAAGG 1779 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atgaacatca aaaa 14 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgaacatca aaaa 14

Claims (7)

  1. 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytri계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP).
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1의 18S DNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 KRS101(KCTC11686BP).
  3. 제1항에 있어서, 바이오오일은 DHA(docosahexaenoic acid)인 것을 특징으로 하는 KRS101(KCTC11686BP).
  4. 제3항에 있어서, DHA는 미세조류 KRS101에 포함된 전체 지방산에서 40%이상을 차지하는 것을 특징으로 하는 KRS101(KCTC11686BP).
  5. 제1항의 미세조류 KRS101를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 바이오 오일은 DHA(docosahexaenoic acid)인 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 배양은 유가식 또는 회분식 배양인 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법.
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