KR101832431B1 - 산으로 전처리한 바이오매스를 이용한 부탄올 발효 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587 돌연변이 균주에 의한 부탄올 생산에 사용되는 재생가능한 원료로 자트로파 씨앗 깻묵, 퐁가미아 씨앗 깻묵, 바나나 줄기와 같은 산으로 전처리한 바이오매스를 사용하는 것을 제시한다. 균주를 개선하여 보다 나은 부탄올 내성과 생산성을 얻기 위해 화학적 돌연변이를 유발시킨다. 본 발명은 최초로 산으로 전처리한 자트로파 씨앗 깻묵을 사용하여 단일 비연속 발효에서 수율이 높은 부탄올을 생산하는 효과적인 공정을 보고했다.

Description

산으로 전처리한 바이오매스를 이용한 부탄올 발효{BUTANOL FERMENTATION USING ACID PRETREATED BIOMASS}
본 발명은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259의 변이주(mutant strain)를 이용하여 부탄올 내성이 강화된 바이오매스로부터 수율이 높은 부탄올 생산을 위한 효율적인 공정에 관한 것이다.
인류는 수 세대 동안 석유로 만든 연료를 사용해 왔다. 그러나 최근 화석 연료의 가용성에 대한 비관적인 시나리오, 석유 자원 고갈의 위험 전세계를 지배하는 엄격한 환경 법규 현실화에 대한 자각으로 대체 에너지원에 대한 연구가 활발해지고 있다(Herrera et al.,2004; Li et al. 2010). 그 결과 차량의 엔진을 특별히 개조할 필요 없이 석유로 만든 연료(가솔린, 디젤)을 완전히 대체할 수 있거나 석유 연료와 일정 비율을 혼합하여 사용할 수 있는 몇 가지 대체 연료가 연구되고 있다.
그 외 대체 연료 중에서, 부탄올은 사회의 필요를 충족시켜 줄 수 있는 가솔린을 대체할 수 있는 뛰어난 연료로 최고의 선택이 될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 바이오부탄올은 분명히 가솔린을 대체할 수 있는 보다 우수한 연료이며 안전하기 때문에 다른 산업에서도 선호되고 있다. 부탄올은 재생 가능한 에너지 이기 때문에, 지금은 이른바 악명 높은 "탄소" 및 기타 탄화수소, 입자, 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 크실렌(BTEX)의 형태로 된 해로운 배기물과 기타 유해한 요소들을 감소시키는데 도움이 된다(Sharma et al., 2010).
부탄올 또는 부틸 알코올(생물학적으로 생산될 경우 생산될 경우 바이오부탄올이라고도 함)은 4 카본 구조(carbon structure)와 C4H10O의 분자식을 가진 일차 알코올이다. 부탄올은 주로 용제, 화학합성의 중간체, 연료로 사용된다. 현재 발효에 의한 생산 방식의 환경적인 면과 재생가능 특성을 중요시하여 미생물을 사용하여 발효를 통해 부탄올 및 에탄올과 같은 연료를 생산하는데 관심이 모아지고 있다. 부탄올은 에탄올보다 발열량이 높은 뛰어난 연료이다(Qureshi and Blascher,2000). 부탄올은 에너지량도 더 높다(갤런 당 부탄올 110,000 Btu, 에탄올 84,000 Btu). 부탄올은 증발이 에탄올의 1/6, 가솔린의 1/13.5 밖에 안 된다. 따라서 에탄올은 철토, 바지선 또는 트럭을 통해 운송해야 하지만 부탄올은 기존의 연료 수송관을 통해 운송이 가능하다(Jones and Woods, 1986).
부타올은 중요한 산업용 용제이며, 에탄올보다 나은 연료 증량제가 될 수 있다. 현재 화학제품으로 나온 부탄올의 가격은 갤런 당 $3.75으로 매년 전세계 시장 규모는 3억7천만 갤런 정도 된다. 녹색 부탄올을 저렴한 바이오매스로 값싸게 생산할 수만 있게 된다면, 부탄올에 대한 시장의 수요는 극적으로 증가할 것이라 예상된다. 부탄올은 연료 이외에도 다양한 화학적 및 섬유 공정에서와 유기 합성에서 용제 및 화학적 중간체로 사용될 수 있다. 부탄올은 또한 페인트 희석제 및 기타 도장재의 용제로 사용된다. 이런 용도의 부탄올은 레커와 환경 중에서 경화되는 에나멜에서 비교적 느리게 증발하는 잠복성 용제로 사용될 수 있다. 부탄올은 유압유 및 브레이크 오일과 같은 용도로 사용하기에도 적합하다(Mutschlechner et al, 2000). 부탄올은 방향제의 베이스로도 사용할 수 있으나 부탄올 자체에서 알코올 냄새가 많이 난다는 단점이 있다.
1950년대 이후, 미국의 대부분의 부탄올은 화석 연료로부터 상용으로 생산되었다. 가장 많이 사용되는 공정은 프로펜(propene)에서부터 시작된다. 프로펜은 히드로포밀화(hydroformylation)를 통해 부탄알(butanal)을 형성한 후 수소로 인해 부탄올로 줄어든다. 부탄올은 옥수수, 곡물, 나뭇잎, 농업 폐기물 및 기타 바이오매스를 발효하여 생산한다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)을 이용한 발효작용을 통해 공업용 부탄올과 아세톤을 생산하기 시작한 것은 1916년부터다. 루이 파스퇴르의 제자 카임 위즈만(Chime Wizemann)은 아세톤을 만드는 미생물을 분리해냈다. 1920년대까지는 주로 아세톤을 얻으려고 했는데, 발효를 거치면 아세톤 1파운드당 부탄올이 2파운드 생산되었다. 하지만 자동차 페인트 산업이 점점 발전하면서 상황은 바뀌어 1927년이 되자 부탄올이 주로 찾는 상품이 되고 아세톤은 부산물이 되었다.
발효를 통한 부탄올 생산은 1940년대부터 시작해 1950년대 내내 감소했는데, 주된 이유는 석유화학제품의 가격이 옥수수, 당질 등 녹말 및 설탕 기질의 가격보다 더 낮아졌기 때문이다. 노동집약적인 비연속 발효 시스템의 비용과 낮은 생산량도 다른 한 요인이었다. 발효를 통한 아세톤과 부탄올 생산은 1950년대 후반에 중단되었다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰에 의한 아세톤 부탄올 에탄올(ABE) 발효는 가장 오래된 공업용 발효들 중 하나로 알려져 있다. 이 발효법은 생산 규모 면에서 효모에 의한 에탄올 발효 다음으로 두 번째로 컸고, 지금껏 알려진 가장 큰 생명공학 공정들 중 하나다. 그러나 실제의 발효 과정은 매우 복잡하고 통제가 어려웠다. ABE 발효는 1950년대 이후로 계속 감소되었고, 현재 거의 모든 부탄올은 석유화학적 방법으로 생산된다. 전형적인 ABE 발효의 경우, C 아세토부틸리쿰에 의해 부티르산, 프로피온산, 젖산, 아세트산이 먼저 생산되고, 배양 pH가 낮아지고 대사에 의한 “버터플라이” 시프트를 거치면서 부탄올, 아세톤, 아이소프로판올, 에탄올이 형성된다. 전통적인 ABE 발효의 경우, 포도당에서 얻는 부탄올의 양이 적어, 대개 약 15퍼센트이고 25퍼센트를 넘는 경우가 거의 없다.
부탄올 생산에는 부탄올의 독성과 발효 미생물의 억제라는 문제가 있기 때문에 발효액에서 부탄올 역가가 낮아진다(Ezeji 등, 2007). 부탄올 생산은 심각한 생산물 억제 때문에 제한적이었다. 부탄올 농도 1퍼센트는 세포 성장과 발효 과정을 상당히 억제할 수 있다. 따라서 종래의 ABE 발효에서 부탄올 농도는 대개 1.3퍼센트 미만이다. 부탄올은 2퍼센트라는 낮은 농도에서도 생물 기관에 크게 유독하다(Jones & Wood, 1986). 이 독성은 아마 부탄올이 형질막에 작용하여 막투과성, 용질운반, 양성자구동력 유지, 형태 유지, 내재 막 단백질의 작용 등 많은 생리적 과정을 붕괴시킬 수 있기 때문일 수 있을 것이다. 여러 클로스트리듐 종에서 부탄올 내성 수준을 향상시키려는 노력이 현재 이루어지고 있으며 다양한 정도의 성과를 얻고 있다(Evan & Wang, 1988). 최근 부탄올 생산에 대한 관심이 높아지면서 배양액에 대한 부탄올 독성을 줄이거나 없애는 전략들을 포함하여, ABE 발효를 재검토하게 되었다.
지난 20여 년 동안 ABE 발효를 통한 부탄올 생산을 향상시키려는 많은 공학적 시도들이 이루어졌다. 예를 들어, 세포 밀도와 반응기 생산성을 높이기 위한 세포 재생 및 세포 고정화, 생산물 억제를 최소화하기 위한 추출 발효 등이다. 그러나 많은 노력에도 불구하고 지금까지 ABE 발효를 위해 밝혀진 최선의 결과는 아직 미미하다. ABE 발효 공정 최적화는 오랫동안 업계의 목표가 되어오고 있다.
부탄올은 현재 전세계적으로 화학적 방법을 통해 연간 약 14억 갤런 수준으로 생산되고 있다. 부탄올을 저렴한 바이오매스로 값싸게 생산할 수만 있게 된다면, 부탄올에 대한 시장의 수요는 극적으로 증가할 것이라 예상된다. 그러므로, 목질 섬유소 작물 등 재생 가능한 에너지원을 이용한 부탄올 생산 공정 개발이 힘을 얻고 있다(Qureshi 등, 2010).
미국 특허 4,521,516은 연속 배양 반응기에서 포자 형성 균주를 배양하여 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 새로운 무포자성 균주를 생산하는 방법을 제공한다. 배양은 배지에 부탄올과 아세톤이 축적되지 않을 수 있는 비율의 희석액으로 한다. 무포자성 균주를 얻을 때까지 이 희석 배수에서 배양하는 것을 계속한다.
미국 특허 5,192,673은 포자산생성 C. 아세토부틸리쿰 ATCC 4259를 배양하여 이 친주를 에탄 메탄 술폰산염으로 처리하여 생물학적으로 순수한 무포자성 돌연변이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰을 생산하는 방법을 제공한다. C. 아세토부틸리쿰 ATCC 55025로 표기하는 이 돌연변이종은 개선된 ABE 발효 과정에 유용하며, 높은 농도의 부탄올과 총 용제를 생산한다. 그러나 이 발효는 세 개의 연속된 발효 단계를 포함하고 있어 비용이 높고 시간이 많이 드는 단점이 있다.
US6358717은 클로스트리듐 베이예린키이(Clostridium beijerinckii)의 돌연변이 균주를 이용한 발효 과정을 통해 많은 양의 부탄올을 생산하는 방법을 제공한다. 이 돌연변이종은 초고도의 녹말 분해(hyperamylolytic) 균주로 포도당/녹말이 풍부한 배지에서 높은 역가의 부탄올을 생산할 수 있다. 그러나, 이 균주의 용제 내성에 대한 주장은 없다.
미국 특허 4,757,010와 유럽 특허 출원 EP00111683은 부탄올 내성이 증가한 향상된 클로스트리듐 균주를 제공한다. JP03058782은 발효된 중간체인 부탄올과 부탄올 생산가능성에 아날로그 저항을 가진 클로스트리듐 박테리아 속 돌연변이 클로스트리?? 파스튜리아눔 CA101 스톡(FERM P-10817)을 제공한다. 미국 특허 4,539,293은 클로스트리듐 속인 두 미생물의 공생배양을 보여준다. 두 미생물 중 하나는 부티르산 생산을 돕고, 다른 하나는 부탄올 형성을 돕는다. 일본 특허 출원 JP63157989는 다른 균주인 클로스트리듐 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum) 이형 1-53(FERM P-9074)을 탄소원, 질소원, 다른 무기 염류를 담은 액체 배지에서 섭씨 28-33도, 약산성 pH, 산소가 없는 상태에서 2-4일 배양하여 부탄올을 생산하는 방법을 제공한다.
미국 특허 4,777,135은 탄화플루오르를 담은 배지에 부탄올을 생산하는 미생물들을 산소가 없는 상태에서 배양하는 발효를 통해 부탄올을 생산하는 방법을 설명한다. 이 공정은 탄화플루오르가 환경적으로 안전하지 않기 때문에 상업적 규모로 실행할 수 없다.
미국 특허 4,605,620은 탄수화물과 인산염을 포함한 배지를 이용한 부탄올 생산 공정을 제공한다. 여기서 인산염은 총 1.0-0.4 mmole로 실험했다. 이 공정은 인산염 제한 배지가 필요하므로 한계가 있다.
미국 특허 4,560,658은 탄소를 포함한 화합물과 클로스트리듐 아세토부틸리쿰을 발효시켜 부탄올을 생산하는 공정을 제공한다. 이때 발효는 용해된 일산화탄소 농도가 충분히 높은 수성 배지에서 시켰다. 그러나, 일산화물를 사용하는 공정은 환경적인 면에서 좋지 않다.
미국 특허 4,520,104는 탄수화물과 클로스트리듐 아세토부틸리쿰을 발효시켜 부탄올을 연속적으로 생산하는 공정을 제공한다. 이 공정은 높은 희석 배수로 연속적으로 접종물을 생산하는 방법과 발효액을 부탄올을 흡수하는 물질을 통해 발효액을 순환시키는 방법을 결합한 공정으로 장시간 동안 발효 반응기에서 활발한 세포군 유지시킬 수 있는 방법이다. 이 공정은 발효액에서 생성되는 부탄올을 제거하여 부탄올의 독성이 세포에 영향을 주지 않게 하기 위하여 고안되었다.
일본 특허 JP62278989는 부탄올을 생산하는 균주를 휴지 상태(resting state)로 유지시키고, 탄소원을 세포에 추가해 짧은 시간에 아세톤과 부탄올을 생산하고, 부탄올을 생산하는 균주를 회수하여 농축시킨 후, 열충격을 가하여, 발효탱크에 넣는, 아세톤과 부탄올 생산을 위한 발효 공정을 제공한다. 이 공정에는 열 충격이 필요하다. 열충격은 클로스트리듐 포자들을 활성화시키기 위한 것으로 흔히 사용된다.
일본 특허 신청은 혐기성 섬유소 분해균을 제공한다. 즉, 클로스트리듐 셀로비오파룸(Clostridium cellobioparum) ATCC 15832나 루미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus) ATCC 27211, 그리고 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoper-butylacetonicum) 등을 나무나 폐지나 펄프 등 섬유소를 함유한 물질을 주요 탄소원으로 포함한 배지에 넣고, 섭씨 25-45도, 4-9pH, 산소가 없는 상태에서 2-20일 배양해 산소와 부탄올을 포함한 화합물을 얻는다. 이 공정은 시간이 많이 소요되는 공정으로 완료되는 데는 약 20일이 소요되기 때문에, 대규모로 실행할 수 없다.
일본 특허 63269988은 부탄올 발효 방법을 개시한다. 이 특허의 방법은 효모를 발효 탱크에서 자가분해시키고 증식시킨 다음, 부탄올을 생산하는 균주에 접종한다. 발효 탱크 안의 공간은 무산소 상태가 되고 효모 증식에 의해 온도가 높아지면서 부탄올 발효가 일어난다. 자가분해가 비효율적일 경우 효모에 의해 발효액이 오염될 수 있다.
US20050233031은 발효 과정에서 식물에서 얻은 물질을 처리하여 설탕을 함유한 수용액을 얻는 단계를 포함하는 부탄올 생산 공정을 제공한다. 이 공정은 여러 단계를 거치므로 번거롭고 장황하다.
일본 특허 JP 200535328801은 음식 찌꺼기, 일본 증류주 찌꺼기 및 물을 조합하여 배양액을 준비하고, 이 배양액에서 부탄올 발효를 실행하여 부탄올을 생산하는 방법을 제공한다. 일본 증류주의 사용은 일본에서 수행된 생산 실험에만 국한된다.
프랑스 특허 FR2550222는 두 단계 공정을 제공한다. 첫 단계에서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰을 식종하고, 두 번째 단계에서 효모를 식종하면 에탄올이 생산된다. 두 번째 단계는 첫 단계의 발효 배지의 pH가 최소값에 이르면 시작한다. 이 발명은 특히 사탕무와 예루살렘 아티초크 주스에서 부탄올, 아세톤, 에탄올을 생산하는 경우에 사용된다.
인도 특허출원 2544/MUM/2007은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 10132으로 많은 양의 부탄올을 생산하는 공정을 제공한다. 이 공정은 다양한 공정 변수 조작을 통한 배치 프로세스(batch process)를 이용하면 더 짧은 시간에 완료할 수 있다. 이 공정은 또한 바이오매스를 이용하는 부탄올 생산에도 적용할 수 있다. 상기 공정은 상업적인 배지를 필요로 하나 본 발명에서는 산으로 전처리한 원료와 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 돌연변이 균주를 이용하여 향상된 부탄올 내성으로 더 많은 부탄올을 생산할 수 있다.
논문에 따르면, 바이오부탄올 합성을 위해 흔히 사용되는 원료들은 옥수수(Zea mays), 바나나 줄기(Musa sapientum), 자트로파(Jatropha curcas), 카라냐(Pongamia pinnata)이다(Liang 등, 2010, Pfromm 등, 2010). 그러나, 옥수수, 사탕수수 등의 식용작물을 이용하게 되면 식품을 연료로 사용하는 것에 대한 저항이 생길 수 있다. 이러한 상황을 피하기 위해 먹지 못하면서도 바이오 부탄올 합성에 적합한 원료를 찾는 것이 필수적이다.
바이오부탄올 생산에 이용 가능한 많은 원료 중에서 자트로파와 카라냐가 가장 적절한 것으로 밝혀졌다. 이런 원료들의 장점은 척박한 환경에 강하고, 약 3년이라는 짧은 기간에 수확할 수 있고, 50-100년 동안 생산할 수 있고, 동물들이 먹지 않으며, 다양한 기후 조건과 토양 종류에 적응성을 가지고, 가뭄에 잘 견디고, 땅과 물을 놓고 식용작물과 경쟁하지 않는다는 것이다.
본 발명은 환원당을 최대한 추출하기 위해 셀롤로오스 구조가 헝클어지도록 산으로 전처리한 자트로파 씨앗 깻묵 및 퐁가미아 씨앗 깻묵 등과 같은 목질계 바이오매스를 이용하는 방법을 제공한다. 가수분해한 설탕과 AnS 배지 구성들을 이용해 바이오부탄올을 생산했다.
본 발명은 또한 섬유소가 풍부한 바이오매스, 즉 바나나 줄기를 이용하는 방법도 제공한다. 바나나 줄기는 미리 산으로 처리해 설탕을 배출시킨 다음 그 설탕을 가수분해하여 바이오부탄올을 생산한다.
미생물을 이용한 발효를 통해 부탄올을 생산하는 보고서들이 종종 있긴 했지만, 부탄올 생산을 위한 경제적으로 실행 가능한 생합성 공정을 개발되어야만 한다(Jesse 등, 2002).
부탄올 생산에는 부탄올의 독성과 발효 미생물의 억제라는 문제가 있기 때문에 발효액에서 부탄올 역가가 낮아진다. 경제적 분석에 따르면, 부탄올 역가를 12g/L에서 19g/L로 상승시킬 경우 분리 비용은 절반으로 줄어든다(Papoutsakis, 2008). 보통, 발효에서 부탄올의 최종 역가는 피드백 저해 때문에 13g/L을 넘지 않는다(Jones & Wood, 1986). 이 수준을 넘으면, 부탄올이 박테리아 세포에 유독한 영향을 미치고 막유동성과 기능에 장애가 발생한다(Volherbst- Schneck 등, 1984).
부탄올 독성 효과를 방지하기 위해, 내성이 있는 균주들(tolerant strains)은 GroEL 같은 특정 열충격 단백질들(HSPs)을 과발현하고(Thomas 등, 2003, 2004), 포화지방산을 더 많이 함유함으로 지질조성을 바꾼다. 이 반응은 '유사 점성 적응(homeoviscous adaptation)'으로 알려져 있는데, 환경에 의한 물리적 변화를 상쇄하고, 세포가 세포막의 적절한 점성과 표면 이온 환경을 유지해 세포가 최적으로 기능하도록 한다고 여겨지고 있다(Baer 등, 1987).
논문(Nishino & Yamaguchi, 2004)에 따르면, 로다민 6G(rhodamine 6G)는 P-글라이코프로틴(P-glycoproteins) 기질이고, 박테리아 세포들에서 나오는 특정 독성 화합물의 에너지 의존성 유출에 영향을 준다. 그러므로 세포 안 용제 유출 펌프의 존재는 박테리아 세포 안의 로다민 6G 축적으로 확인된다(Lazaroaie, 2009). 본 발명의 발명자들은 상기 논문들을 참조하여 부탄올 생산을 위해 사용된 용제 내성 돌연변이 균주와 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 야생형 균주를 분석했다.
발효 과정 동안 발생하는 부탄올의 억제 효과를 극복하기 위해 탈기(gas stripping) 등의 기법들이 이용되어 왔다(Ezeji 등, 2007). 그러나, 이 공정은 결과에 일관성이 없고 에너지 소비가 높다는 문제가 있다. 본 발명에서는 화학적 돌연변이 유발을 통해 미생물의 부탄올 내성을 향상시켜 부탄올의 억제 효과를 극복했다.
선행기술에 인용된 이전 발명들의 단점을 방지하기 위해서, 부탄올의 생산 수율이 향상된 공정이 필요하게 되었다. 이 점에서 본 발명은 클로스트리듐 돌연변이 균주를 위한 이상적인 배양 조건 개발에 초점을 맞추었기 때문에 부탄올 내성이 향상되고 부탄올 수율이 높아진다.
본 발명의 목적은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 용제 내성 돌연변이를 이용하여 미리 처리한 바이오매스에서 높은 수율의 부탄올을 생산하는 효율적인 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 돌연변이를 이용하여 부탄올 생산을 증가시키기 위한 최적의 발효 조건을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 화학적 돌연변이 유발을 통해 균주를 즉석에서 만들어 부탄올 내성과 생산을 향상시키는 것이다.
본 발명의 목적은 최적의 발효 조건으로 미생물의 부탄올 내성을 향상시키는 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 높은 수율의 부탄올 발효를 위한 배양 조건을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 단일 비연속 발효 조건에서 부탄올 수율을 증가시키는 공정을 제공하는 것이다.
이 발명의 목적은 산으로 미리 처리한 다양한 바이오매스를 이용한 바이오부탄올 생산 공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 비용 효과적이고 공업적으로 규모의 조정이 가능한 부탄올 생산 공정을 제공하는 것이다.
첫 번째 실시예에서 본 발명은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 용제 내성 돌연변이를 이용하여 바이오매스로 높은 수율의 부탄올을 생산하는 효율적인 공정을 제공하는 것에 관한 것이다. 특별히 본 발명의 목적은 부탄올 내성이 커진 미생물 돌연변이 균주가 만들어지는 최적의 배양 조건을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 부탄올 생산의 규모를 공업적으로 조정할 수 있는 비용 효과적인 공정을 제공하는 것이다.
두 번째 실시예는 생성된 부탄올을 제거하지 않은 채 단일 비연속 공정 (batch process)에서 높은 수율(최대 19 g/L)의 부탄올을 생산하는 것에 관한 것이다. 이 공정에는 영양물을 첨가하는 추가적인 단계가 필요한 배치 공급 단계도 없고 높은 수율을 얻는데 필요한 용제 제거 단계도 없다. 연속 발효 방식을 사용하여 오염의 가능성이 증가하게 되는 공공 영역에서 보고된 많은 공정과 달리 본 발명은 단일 비연속 방식으로 완료할 수 있는 공정을 포함한다. 배지를 신중하게 최적화하여 즉석에서 화학적 돌연변이 유발을 통해 발효액에서 그러한 높은 수율의 부탄올을 생산하고 견뎌낼 수 있는 돌연변이 균주를 만들어낸다. 따라서 이 모든 요소들로 때문에 본 발명은 더욱 비용 효과적인 공정이 된다. 또한 본 발명의 발명자들은 15L 규모의 공정을 성공적으로 시연할 수 있었다.
본 발명의 세 번째 실시예는 균주의 화학적 돌연변이 유발을 통해 부탄올 내성을 증가시키는 공정을 제공한다. 바람직한 일 실시예에서 본 발명은 최적의 배지에서 약 3.5% 부탄올 농도에 대한 내성을 제공한다. 그리고 조건은 본 발명에서 제공하는 바와 같이 증가된 부탄올 수율을 제공하는 공정을 위한 것이다. 본 발명에서 부탄올의 내성이 높아지는 가장 가능성 있는 이유는 공정 최적화를 통해 상기에 언급된 한계를 완화하는 물리화학적 조건을 갖춘 최종 환경이 조성되기 때문이라는 것이다. 예를 들면, 최적의 조건 하에서 산화화원전위, 삼투성, 전자류를 바뀔 수 있다. 부탄올 내성과 생산에 필요한 일련의 효소를 활성화하거나 최적화된 조건 아래에서 유도할 수 있다. 배양균은 최적화 공정 동안 높은 부탄올 수준까지 적합하게 조정할 수 있다.
네 번째 실시예는 본 발명의 측면 중에서 다양한 바이오매스를 사용하여 바이오부탄올을 평가하는 과정을 제공한다. 바람직한 일 실시예에서 자트로파와 퐁가미아 씨앗 깻묵과 바나나 줄기를 사용했다. 산 가수분해로 전처리한 깻묵과 줄기를 사용한 바이오부탄올의 수율도 연구했다.
본 발명의 마지막 실시예는 큰 규모로 규모를 확대할 수 있는 공정을 제공하는 것에 관한 것이다.
다음 도면들은 본 명세서의 일부를 구성하며 이들 하나 이상의 도면들을 본 명세서에 제시된 구체적인 실시예에 대한 설명과 함께 참조하여 발명에 대해 더 잘 이해할 수 있도록 본 개시의 특정 측면들을 더 자세히 설명하기 위해 포함된 것이다.
도 1. 본 발명의 다양한 농도의 부탄올에서 B90으로 지정된 돌연변이 균주의 내성과 성장.
야생형 균주 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259는 배지에서 최대 1.5% 부탄올까지 견딜수 있지만 그 이상을 넘으면 성장이 중지되는 반면 돌연변이 균주 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587(B90)은 AT 배지에서 최대 3.5%(v/v) 부탄올까지 견딜 수 있다. 이런 수준의 부탄올에서의 성장은 용제의 독성으로 인해 극도로 느리고 빈약하다. 더 높은 온도 즉 3.8% 및 4%에서는 성장하지 않았다.
도 2. 야생형 균주(A)와 돌연변이 균주(B) 지방산 조성 비교
야생형 및 용제 내성 돌연변이 균주의 전체 지질을 추출하여 GC로 분석하였다. 야생형 균주와 비교했을 때 돌연변이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587의 지질 조성이 변한 것이 발견되었다. GC 곡선(도 2B)은 미량의 불포화지방산과 함께 용제 내성 균주에 포화지방산, 즉 미리스틱(C14:0) 및 팔미트산(C16:0)이 존재하여 전체 지방산의 약 50%의 지방산을 구성한다는 것을 보여준다. 반면, 야생형에서는 불포화지방산, 올레산(C18:1)이 풍부하여 전체 지방산의 약 75%를 구성하였고 포화지방산은 그 양이 상당히 낮았다(C16:0, 11%)(도 2A).
도 3. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 야생형(A)과 용제 내성 돌연변이종(B)에서의 로다민 G의 축적.
연구하는 중에 유독한 염료 로다민 6G이 포함된 플레이트에 24시간 동안 배양 후 돌연변이 균주에 분홍색 군체로 보이는 세포내에 로다민 6G가 많이 축적된 것을 볼 수 있었다. 반면 야생형 군주의 군체는 염료가 비교적 낮게 축적되어 분홍색이 옅었다. 이러한 결과는 돌연변이 균주에서는 부탄올과 같은 유독한 합성물에 대한 내성 메커니즘이 존재함을 나타낸다.
도 4. 표준 부탄올(A)과 발효액(B)의 HPLC 크로마토그램 .
이 공정은 7%(w/v) 자트로파 씨앗 깻묵과 2% 글로코스를 사용하여 20L 생물 반응기에서 15L 수준까지 크기를 늘인다. 72시간 만에 18.6 g/L의 부탄올 역가를 얻었다.
도 5. 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해를 통한 부탄올 생산 확대에 대한 프로파일.
최초의 당은 44 g/L 였고 마지막의 당은 4 g/L였다(도 5). 산성화 단계가 약해지고 용제화 단계가 시작될 때 전형적인 버터플라이 시프트를 관찰할 수 있었다.
정의:
본 명세서에 사용되는 부탄올 또는 바이오부탄올이라는 용어는 n-부탄올을 말한다.
본 문서에 사용되는 부탄올 내성이라는 용어는 배지에 2.5-3.5% 부탄올이 존재하는 가운데 살아남아 성장할 수 있는 박테리아의 능력을 말한다.
클로스트리듐 아세토부틸리쿰이라는 용어는 혐기성 발효에서 아세톤 및 에탄올과 함께 부탄올을 생산하는 능력을 가진 박테리아를 말한다.
본 면세서에 사용된 수율(yield)이라는 용어는 g/L로 나타낸 발효액에서 생산되는 부탄올의 양을 말한다.
돌연변이 균주라는 용어는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587을 가리킨다. 이 돌연변이 균주는 부다베스트 조약에 따라 찬디가르 Microbial Type Culture Collection에 맡겨두었다.
성장 및 성장과 관련된 분자의 생산에 영향을 미치는 중요한 요소들 중 하나는 pH 이다. 본 발명에서 부탄올 생산은 다양한 pH에서 실험되었다. 본 발명에서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 돌연변이를 위한 최적의 pH는 6.5이다. 이 pH 값은 Robson과 Jones(1982)의 발견에 따른 것으로 이들은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 P262은 5.0-6.5의 pH 범위 이내에서 양호한 수준의 용제가 생산된다는 것을 보여주었다. 유사하게 Bielbl(1999)은 클로스트리디움 베이저링키 NCIMB8052는 pH 5.0 이하에서보다 pH 5.5에서 훨씬 더 잘 성장하고 용제 생산이 높다는 것을 보여주었다.
성장 및 성장과 관련된 분자의 생산에 영향을 미치는 다른 중요한 요소는 온도이다. 본 발명에서는 돌연변이 MTCC 5587의 경우, 최적의 성장 온도에서 보다 높은 수율로 부탄올이 생산되었다. 이러한 결과는 클로스트리디움 sp.에 의해 생산되는 용제에서 30℃와 33℃에서 31%로 매우 일정한 수율을 보인 것과 대조적으로 37℃에서 감소(최대 23%)한다고 보고한 McCutchan와 Hickey(1954)의 앞선 연구 결과와 대조된다.
영양이라는 요소 중에 탄소원은 세포 성장과 생체 분자 생산과 관계된 매우 중요한 요소 중 하나라는 것은 기정의 사실이다(Samulov 등,1991). 본 발명에서 사용된 주요 탄소원은 바이오매스를 가수분해한 후에 얻은 당이었다. 그러나 세포 성장과 부탄올의 생산을 더욱 향상시키기 위해 다양한 농도의 포도당(0-2%) 를 가수분해물에 추가했다. 결과는 산으로 미리 처리한 자트로파 씨앗 깻묵(7%)의 가수분해물에 포도당(2%)를 첨가하면 125ml의 산소가 없는 유리병에서 120시간 만에 최대 14.3 g/L의 부탄올 생산을 유지시킨다. 그러나 포도당을 첨가하지 않았을 때는 매우 낮은 역가의 부탄올(4.2g/L)이 생산되었다. 이런 결과는 옥수수 침지액(CSW) 배지만 적합한 물질이 아니며 포도당(6%)를 첨가하면 성장과 부탄올 생산을 도울 수 있다고 보고한 Parekh 등(1998)의 연구결과와 일치한다. 용제 생산의 시작과 유지에 미치는 영양분 제한의 효과도 몇몇 다른 연구자들이 연구하였다. 예를 들면, Long 등(1984)은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 P262을 사용한 비연속 발효에서, 탄소원의 농도를 제한한 결과 산(acids)만 생산되었다고 보고했다. 그 외에도 자트로파 씨앗 깻묵은 포르볼에스테르가 있기 때문에 유독한 것으로 알려져 있다. 따라서, 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물만으로는 유기체의 성장과 부탄올 생산에 도움이 되지 않을 수 있다.
이미 설명한 바와 같이, 부탄올의 독성 역시 부탄올 생산에 영향을 미치는 중요한 요소이며, 이런 부탄올의 독성은 막투과성, 용질운반, 양성자구동력 유지, 형태 유지, 내재 막 단백질의 작용을 포함한 여러 생리적 과정을 붕괴시킬 수 있는 형질막에 대한 국부화로 인한 것이다. 용제 내성 박테리아는 변형된 생체막 지질 조성, 세포 내부의 용제 농도를 활발하게 감소시키는 유출계(efflux system), 용제의 저하, 또는 열충격 단백질과 같은 과발현 스트레스 단백질을 포함하는 세포 적응에 의한 반응들을 피한다(HSPs)(Tomas et al, 2003, 2004).
본 발명에서 용제 제거나 발효액의 희석을 사용하지 않고 단일 단계 공정에 의해 역가가 높은 부탄올을 얻는 데 매우 중요한 역할을 하는 요소 중 하나는 돌연변이 균주의 용제에 견디는 능력이다. 내성에서 작용하는 메커니즘을 연구하기 위해, 전체 지질 중 지방산 조성을 측정하였다. 야생형 C18:1에 비해 돌연변이종의 포화지방산 C14:0와 C16:0의 비가 높다는 것은 생존을 위해 자극으로 인해 변형이 일어났다는 것을 나타낸다.
Baer 등(1987)은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824의 돌연변이 SA-1는 증가된 포화 지방산을 합성하여 부타올의 영향과 싸우는 메커니즘을 발달시킨다고 보고했다.
다른 연구 결과는 돌연변이 균주는 야생형에 비하여 더 많은 양의 로다민 6G를 축적할 수 있다는 것이었다. 이러한 사실은 유독한 합성물 즉 n-부탄올에 대한 내성 메커니즘이 존재한다는 것을 나타내며, 이런 결과는 그람음성 박테리아의 유기 용제 저항과 관련된 메커니즘에 대한 Lazaroaie의 보고서(2009) 내용과도 일치한다.
본 발명에 사용된 돌연변이 클로스트리듐 균주는 3.5% 부탄올에 대한 내성을 보였다. 돌연변이 클로스트리듐 균주가 부탄올에 대해 이렇게 높은 내성을 가지게 된 가장 가능성 있는 이유는 화학적 돌연변이 유발로 클로스트리듐 균주의 유전적 변형이 일어났고 그로 인해 공공의 영역에서 인용된 공정의 문제점을 극복할 수 있는 최종적인 물리화학적 조건을 조성하는 공정 최적화가 일어났기 때문일 수 있다. 예를 들면, 야생형 균주는 거의 어떤 부탄올도 생산하지 못하는데 반해 돌연변이 균주는 최적화되지 않은 조건의 영양이 풍부한 복합 배지에서 4-5 g/L의 부탄올을 만들어 내었다. 그리고 다음으로, 표 1에 표시된 바와 같이 자트로파 씨앗 깻묵을 포함한 배지에서 최적화했을 때, 돌연변이종은 부탄올을 14.3 g/L 만들어 내어 생산량이 3배가 증가하였다.
상기에서 설명한 조건을 사용한 부탄올 생산을 위한 다양한 바이오매스 활용에 관한 연구가 더 진행되었다. 특히 연구된 바이오매스는 자트로파 씨앗 깻묵, 퐁가미아 씨앗 깻묵 및 바나나 줄기였다. 세 가지 바이오매스 모두 산 가수분해하였고 전체 환원당 수준을 디니트로살리실산법으로 측정하였다.
기름이 제거된 자트로파 씨앗 깻묵과 퐁가미아 씨앗 깻묵을 건조하여 고운 가루로 분쇄하였다. 다양한 농도의 미세하게 분쇄한 깻묵을 100℃가 넘는 온도에서 1-3시간 동안 1-3% HCl 또는 H2S04 로 처리했다. 산 처리한 슬러리를 면거즈로 거른 다음 여과액을 NaOH으로 중화시켰다. 이런 산으로 전처리된 여과액에 AnS 배지를 보충했다. 배지의 pH는 농축한 H2S04이나 NaOH을 사용하여 6-7 사이로 조정했다. 유일 탄소원으로 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물을 사용했을 때, 7% 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물이 든 병에서 부탄올 역가는 최대 4.2 gL로 매우 좋지 않았다. 유사하게 7% 퐁가미아 씨앗 깻묵 가수분해물만 사용했을 때도 역가는 2.4 g/L였다. 이런 결과는 성공적인 부탄올 발효가 일어나려면 추가의 탄소원을 보충해야 된다는 것을 보여준다. 증가된 양의 포도당을 첨가하면 그에 따라 자트로파와 퐁가미아 가수분해물에서 역가가 증가하였다(표 1과 표 2). 120시간만에 포도당 2%가 함유된 7% 자트로파 가수분해물이 함유된 AnS 배지에서 14.3 g/L의 부탄올 역가가 생산되었다(표 1). 반면 2% 포도당과 7% 퐁가미아 가수분해물로는 8.7 g/L의 부탄올이 생산되었다(표 2).
바나나 줄기에 대한 실험도 이루어졌다. 바나나 줄기를 잘게 잘라서 햇볕에 건조시켜 미세한 분말로 만들었다. 다양한 농도의 미세하게 분쇄한 깻묵을 100℃가 넘는 온도에서 1-3시간 동안 1-3% HCL 또는 H2S04 로 처리했다. 산 처리한 슬러리를 면거즈로 거른 다음 여과액을 NaOH으로 중화시켰다. 이런 산으로 전처리된 여과액에 AnS 배지를 보충했다. 배지의 pH는 농축한 H2S04이나 NaOH을 사용하여 6-7 사이로 조정했다. 바나나 줄기 가수분해물로는 추가의 탄소원 보충없이 부탄올을 생산할 수 있었고 10% 가수분해물 농도에서 9.1 g/L의 역가를 얻었다. 그러나 바나나 줄기 가수분해물과 함께 2 % 포도당을 더했을 때는 부탄올 역가가 18.0 g/L까지 증가하였다(표 3).
본 발명에서 사용된 자트로파 씨앗 깻묵과 퐁가미아 씨앗 깻묵과 같은 원료는 리그닌이 풍부하게 함유되었다. 자트로파 씨앗 깻묵은 29.1%의 리그닌과 15.9%의 섬유소를 포함하고 있다. 리그닌은 페닐 프로판 단위의 복합 폴리머로 서로 다른 화학적 결합에 의해 서로 상호결합되어 있다. 리그닌은 특히 생분해 되기 어렵고 다른 세포벽 구성물질의 생물학적 이용도를 감소시킨다. 리그닌은 식물 세포벽 중에서 가장 다루기 어렵다. 리그닌의 비율이 높을수록 기질의 생물학적 이용도는 낮아진다(Sjostrom, 1993).
한편 바나나 줄기는 셀로로오스 63.9%와 리그닌 12.3%로 이루어져 있다. 섬유소는 다당류이며 쉽게 가수분해된다(Zainol & Rehman,2008). 따라서 원료의 리그닌 성분을 가수분해하기 위한 효율적인 전처리 방법이 필요하다.
본 발명에서는 섬유소 바이오매스 즉 바나나 줄기와 마찬가지로 당의 가수분해를 위해 자트로파 씨앗 깻묵과 퐁가미아 씨앗 깻묵(2%, 5%, 7%, 10% 농도)과 같은 두 가지 목질 섬유소를 산 가수분해했다. 바나나 줄기의 가수분해물(10% 농도)에서 최대의 당을 얻을 수 있었지만 구하기 쉬운 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물에 대해서만 상세한 연구가 이루어졌다. 자트로파 씨앗 깻묵의 농도를 다르게 하여 산 가수분해를 시행했을 때 7% 자트로파 씨앗 깻묵에서 최대(17.2 g/L)의 환원당을 얻을 수 있었다.
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시예들에 대한 설명을 포함하고 있다. 해당 기술 분야에 숙련된 자는 본 발명에 따라 실시예에 개시된 기술을 잘 실행할 수 것이라는 것을 생각할 수 있다. 따라서 그런 실행은 바람직한 방식을 구성하는 것으로 해석되어야 한다. 그러나 해당 기술 분야에 숙련된 자라면, 본 개시의 아이디어에 따라 본 발명의 범위와 아이디어를 벗어나지 않은 범위에서 같거나 유사한 결과를 찾아내고 얻을 수 있는 구체적인 실시예가 될 수 있는 많은 변형들이 있을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1: 유기체와 성장 조건
클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259을 포도당 20, 펩톤 10; 효모 추출물 5.0; K2HP04, 3.0; NaCl, 1.0; (NH4)2S04 , 1.0; CaCl22H20, 0.2; MgCl2.6H20, 0.2; Na2C03, 1.0으로 구성된 혼합물(g/L)이 함유된 무산소 당분(AnS: Anaerobic Sugar) 배지 50ml가 들어있는 125ml 병에서 배양하였다. 그리고 pH는 6.5로 조정하였다.
잔류용제(Headspace)는 미량의 용존산소를 체거하기 위해 추가한 N2와 Na2S.9H20(0.02% (w/v))로 제거하였다. 이 유리병을 부틸 고무캡으로 막고 121℃에서 10분 동안 살균하였다. 살균 배지에 1-3%(v/v)의 종균을 주입하고 132시간 동안 37℃에서 간헐적으로 부드럽게 흔들면서 배양하였다.
실시예 2: 돌연변이 연구
MNNG(1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘)을 사용하여 화학적 돌연변이를 일으켰다. 대체 티오글리콜산(AT) 배지에 천자배양으로부터 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259을 주입했다. 37℃에서 12시간 동안 배양 후 배양균을 거둔 후 원심분리기로 분리했다. 세포 펠릿을 2ml 시트로산염 완충제(pH5.8)로 세척하고 MNNG 100㎕(살균된 증류수로 준비한 저장액 100 mg/ml)에 세포를 추가한 후 30℃에서 70분 동안 배양하였다. 돌연변이가 일어난 세포 덩이를 원심분리기로 분리하고 위에 뜨는 부분은 생물학적 유해물질 용기에 적절한 방식으로 폐기했다. 세포를 AT 액을 두 번 세척하고 1ml AT 액에 재부유시킨다. 돌연변이종을 부탄올 13g/L 이 들어있는 AT 한천 배지로 보호하여 37℃에서 12-16시간 동안 배양했다.
실시예 3: 부탄올 내성 돌연변이종의 내성 및 성장 곡선
1.3% 부탄올까지 견디는 돌연변이종은 보다 높은 농도의 부탄올에 대한 내성을 지니도록 하기 위해 부탄올 1.5%, 1.8%, 2.0%>, 2.5% 및 3.0%(v/v) 를 포함한 AT 한천 배지로 보호했다. AT 한천 배지를 포함한 3.0%> 부탄올에서 성장한 한 돌연변이 종은 다양한 양의 부탄올 즉 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%(v/v) 를 포함한 AT 배지 50ml이 들어있는 밀봉된 125ml 병으로 옮겨졌다. 돌연변이 종의 내성 및 성장 곡선을 시시각각 모니터링했다.
야생형 균주 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259는 최대 1.5% 부탄올에 견디며 그 이상을 넘어서면 성장이 중지되었다. 반면 돌연변이 균주 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587는 AT 배지에서 3.5%(v/v) 부탄올까지 견딘다(도 1). 이런 수준의 부탄올에서의 성장은 용제의 독성으로 인해 극도로 느리고 빈약하다. 더 높은 온도 즉 3.8% 및 4%에서는 성장하지 않았다. 이 돌연변이종은 부다베스트 조약에 따라 찬디가르 Microbial Type Culture Collection에 맡겨두었다.
실시예 4: 지질의 추출과 분석
설명한 것처럼 세포에서 전체 지질을 추출했다(Baer등 1987). 이 지질을 에스테르 교환반응시키고 FAME을 GC로 분석했다.
야생형 및 용제 내성 돌연변이 균주의 전체 지질을 추출하여 GC로 분석하였다. 야생형 균주와 비교했을 때 돌연변이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587의 지질 조성이 변한 것이 발견되었다. GC 곡선(도 2B)은 미량의 불포화지방산과 함께 용제 내성 균주에 포화지방산, 즉 미리스틱(C14:0) 및 팔미트산(C16:0)이 존재하여 전체 지방산의 약 50%의 지방산을 구성한다는 것을 보여준다. 반면, 야생형에서는 불포화지방산, 올레산(C18:1)이 풍부하여 전체 지방산의 약 75%를 구성하였고 포화지방산은 그 양이 상당히 낮았다(C16:0, 11%)(도 2A).
실시예5 : 로다민 6G 축적
하룻밤 동안 배양한 야생형과 용제 내성 돌연변이 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 MTCC 5587을 로다민 6G(100㎍/ml)가 포함된 또는 포함되지 않은 AT 한천에 떨어뜨린 후 무산소 챔버에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 로다민 6G의 축적을 UV 광선 아래에서 모니터링했다(Lazaroaie,2009).
유독한 염료 로다민 6G이 포함된 플레이트에 24시간 동안 배양 후 돌연변이 균주에 분홍색 군체로 보이는 세포내에 로다민 6G가 많이 축적된 것이 발견되었다(도 3). 반면 야생형 군주의 군체는 염료가 비교적 낮게 축적되어 분홍색이 옅었다. 이러한 결과는 돌연변이 균주에서는 부탄올과 같은 유독한 성분에 대한 내성 메커니즘이 존재함을 나타낸다.
실시예 6: 불연속 발효의 공정 최적화
125ml 병 속의 AnS 배지 50ml에서 모든 최적화 실험을 실시했다. 다양한 바이오매스 즉 자트로파 씨앗 깻묵, 바나나 줄기 및 퐁가미아 씨앗 깻묵을 아래에 설명한 것처럼 산 가수분해시켰다. 재현성을 보장하기 위해 모든 실험을 최소한 3회 실시했다.
실시예 7: 다양한 연료의 산 가수분해
a. 자트로파 씨앗 깻묵 및 퐁가미아 씨앗 깻묵
기름이 제거된 자트로파 씨앗 깻묵과 퐁가미아 씨앗 깻묵을 건조하여 고운 가루로 분쇄하였다. 다양한 농도의 미세하게 분쇄한 깻묵을 100℃가 넘는 온도에서 1-3시간 동안 1-3% HCl 또는 H2S04 로 처리했다. 산 처리한 슬러리를 면거즈로 거른 다음 여과액을 NaOH으로 중화시켰다. 이런 산으로 전처리된 여과액에 AnS 배지를 보충했다. 배지의 pH는 농축한 H2S04이나 NaOH을 사용하여 6.5로 조정했다.
b. 바나나 줄기
바나나 줄기를 잘게 잘라서 햇볕에 건조시켜 미세한 분말로 만들었다. 다양한 농도의 미세하게 분쇄한 바나나 줄기를 자트로파와 퐁가미아 씨앗 깻묵과 같은 방법으로 전처리하였다.
세 가지 바이오매스 모두 산 가수분해하였고 감소된 천체 당 수준을 디니트로살리실산법으로 측정하였다. 유일 탄소원으로 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물을 사용했을 때, 7% 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물이 든 병에서 부탄올 역가는 최대 4.2 g/L로 매우 좋지 않았다. 유사하게 7% 퐁가미아 씨앗 깻묵 가수분해물만 사용했을 때도 역가는 2.4 g/L였다. 이런 결과는 성공적인 부탄올 발효가 일어나려면 추가의 탄소원을 보충해야 된다는 것을 보여준다.
증가된 양의 글루코오스를 첨가하면 그에 따라 자트로파와 퐁가미아 가수분해물에서 역가가 증가하였다(표 1과 표 2). 120시간만에 글루코오스 2%가 함유된 7% 자트로파 가수분해물이 함유된 AnS 배지에서 14.3 g/L의 부탄올 역가가 생산되었다(표 1). 반면 2% 글루코오스와 7% 퐁가미아 가수분해물로는 8.7 g/L의 부탄올이 생산되었다(표 2).
바나나 줄기 가수분해물로는 추가의 탄소원 보충없이 부탄올을 생산할 수 있었고 10% 가수분해물 농도에서 9.1 g/L의 역가를 얻었다. 그러나 바나나 줄기 가수분해물과 함께 2 % 글루코오스를 더했을 때는 부탄올 역가가 18.0 g/L까지 증가하였다(표 3).
다양한 비율의 포도당과 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물에서의 부탄올 생산(g/L)
포도당(%) 자트로파 씨앗 깻묵 농도
2% 5% 7% 10%
0 2.0 3.2 4.2 3.9
0.5 5.2 6.4 8.9 8.1
1.0 7.1 8.9 10.8 10.2
1.5 8.5 10.1 12.2 12.0
2.0 9.1 12.8 14.3 13.8
다양한 비율의 포도당과 퐁가미아 씨앗 깻묵 가수분해물에서의 부탄올 생산(g/L)
포도당(%) 퐁가미아 씨앗 깻묵 농도
2% 5% 7% 10%
0 1.4 1.9 2.4 2.0
0.5 3.3 4.0 4.9 4.3
1.0 4.9 5.8 6.2 6.0
1.5 6.0 7.0 8.0 8.1
2.0 6.6 7.9 8.7 8.4
다양한 비율의 포도당과 바나나 줄기 가수분해물에서의 부탄올 생산(g/L).
포도당(%) 바나나 줄기 농도
2% 5% 7% 10%
0 2.7 3.4 5.3 9.1
0.5 5.5 8.9 9.6 10.7
1.0 7.8 11.6 12.4 13.8
1.5 10.3 12.2 15.8 17.8
2.0 11.6 13.7 16.9 18.0
실시예 8: 부탄올과 잔류 당분 측정
RI 검출기를 사용하여 1.5 ml/min의 유량의 이동상일 때 아세토나이트릴과 0.5mM H2S04(1:9)이 있는 PRP 300X 칼럼(Hamilton)에서 HPLC로 부탄올에 대해 배양 상층액을 분석하였다. 부탄올은 7.3분간의 보유시간에 추출한다. 발효 배지의 잔류 당분을 디니트로살리실산법으로 측정하였다(Tasun & Ghen,1970).
실시예 9: 500 ml 무산소 상태의 병에서 일어나는 생산 과정의 확인
최적화된 배지에서의 부탄올 생산을 500ml 병에서 300ml 크기에서 확인했다. 132시간 동안 발효시켜 부탄올 산출을 측정했다. 500ml 병의 300ml 크기의 과정을 확인한 결과 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물 7%와 포도당 2%가 포함된 AnS 배지에서 96시간만에 14.8 g/L 부탄올이 생산되었다.
실시예 10: 15 L까지 공정의 크기 확대
최적화된 조건 아래에서, 20L의 생물 반응기에서 부탄올 생산 크기를 15L의 작업량으로 확대 실시하였다. 150 rpm로 일정하게 교반하면서 37℃에서 108시간 동안 발효시켰다. 최초의 배지의 pH는 6.5로 설정했다. 실리콘 소포제를 첨가하여 거품 발생을 억제했다. N2 가스를 0.5 L/min의 속도로 계속 살균 필터를 통해 밀어넣으면서 실험하는 동안 혐기성 생활(anaerobiosis)을 유지시켰다. 12시간 간격으로 시료를 채취하여 발효액의 잔류 당분, pH, 부탄올 농도를 측정하는 과정을 거쳤다.
이 공정은 7%(w/v) 자트로파 씨앗 깻묵과 2% 글로코스를 사용하여 20L 생물 반응기에서 15L 수준까지 크기를 늘인다. 72시간 만에 18.6 g/L의 부탄올 역가를 얻었다(도 4와 도 5). 최초의 당은 44 g/L 였고 마지막의 당은 4 g/L였다(도 5). 산성화 단계가 약해지고 용제화 단계가 시작될 때 전형적인 버터플라이 시프트를 관찰할 수 있었다.
실시에 11: 아세톤, 부탄올 및 에탄올 비율 측정
ABE 발효 공정 동안 생산된 용제의 비율을 RID 검출기로 유량의 이동상일 때 0.1N H2S04를 사용하여 Rezex 유기산 칼럼에서 HPLC로 분석하였다. Rezex 유기산 칼럼에서의 발효액 분석 결과, 아세톤 : 부탄올 : 에탄올의 비율이 2.6: 6.6: 0.8였고 이것은 전형적인 ABE 발효에서 얻는 비율과 유사했다.
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따라서 저자는 본 발명의 기본적인 신규적 특성을 설명하였으나 본 발명의 범위와 아이디어를 벗어나지 않는 범위에서 그 형태와 세부적인 면에 있어 여러 가지 생략과 대체 및 변경이 가능하다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, 동일한 결과를 얻을 수 있는 실질적으로 동인한 방식으로 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 그런 요소들이나 방법 단계들의 모든 조합은 분명히 본 발명의 범위 내에 들어간다.
Microbial Type Culture Collection MTCC5587 20110331

Claims (28)

  1. 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259 야생 균주의 화학적 돌연변이에 의해 획득되고 상기 야생 균주에 비해 증가된 부탄올 내성을 가지는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주로, 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주의 부탄올 내성이 1.5% 내지 3.5 % (v/v) 범위인, 균주.
  2. 하기 단계를 포함하는, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259의 화학적 돌연변이에 의한, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주를 획득하는 방법:
    대체 티오글리콜산염 (AT:alternate thioglycolate) 배지를 10 내지 14시간 동안 35 내지 40℃ 범위의 온도에서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259 배양체에 접종하는 단계;
    상기 배양체를 원심분리하여 제1 세포 펠릿을 획득하는 단계;
    상기 제1 세포 펠릿을 시트르산염 완충제(citrate buffer)로 세척하는 단계;
    상기 시트르산염 완충제를 디캔팅하고 80 내지 120ul의 MNNG (1-메틸-3-니트로-1-니트로소구아니딘)을 추가한 후, 27 내지 32℃에서 50 내지 90분 동안 배양하여 돌연변이가 일어난 세포 덩이를 획득하는 단계;
    상기 돌연변이가 일어난 세포 덩이를 원심분리하여 제2 세포 펠릿을 획득하는 단계;
    상기 제2 세포 펠릿을 대체 티오글리콜산염 액(broth)으로 1회 이상 세척하여 세포 배양물을 획득하는 단계;
    상기 세포배양물을 부탄올 13g/L이 함유된 AT 한천 배지 상에서 12 내지 16 시간 동안 37℃에서 스크리닝하여 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주를 획득하는 단계.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    부탄올 내성이 상기 야생 균주에 비해 4 내지 5 % (v/v) 범위의 증가된 막 포화 지방산 함량과 연관되는 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
  5. 제1항에 있어서,
    클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주의 부탄올 내성이 야생형과 비교하여 증가된 유독성 화합물에 대한 내성과 연관되는 것으로, 상기 유독성 화합물은 로다민 6G인 것을 특징으로 하는 돌연변이 균주.
  6. 삭제
  7. 강화된 부탄올 내성을 갖는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주를 사용하여, 전처리된 바이오매스로부터 부탄올을 높은 수율로 제조하는 방법으로, 상기 방법은 영양 배지의 존재 하에서의 상기 전처리된 바이오매스의 발효를 포함하고, 상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90 (기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주의 부탄올 내성이 1.5% 내지 3.5 % (v/v) 범위 내인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 바이오매스는 바나나 줄기, 퐁가미아 씨앗 깻묵, 및 자트로파 씨앗 깻묵으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 영양 배지는 당이 보충되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 당은 2% (v/v)의 농도를 가지는 포도당인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 발효는 33℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 전처리된 바이오매스가 1 내지 3% (v/v) 농도의 염산 또는 황산을 사용하여 100℃ 초과 1 내지 5 시간 동안 산 처리되도록 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    산 처리된 바이오매스를 수산화나트륨을 사용하여 중화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 RLS B90(기탁번호: MTCC 5587) 돌연변이 균주의 부탄올 내성은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 4259 야생 균주에 비해 1.5% 내지 3.5% (v/v) 강화된 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제7항에 있어서,
    부탄올의 수율이 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물에 의한 15L 규모에서 최대 19g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제7항에 있어서,
    부탄올의 수율이 바나나 줄기 가수분해물에 의한 50ml 규모에서 최대 18.0g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제7항에 있어서,
    부탄올의 수율이 자트로파 씨앗 깻묵 가수분해물에 의한 50ml 규모에서 최대 14.3g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제7항에 있어서,
    전형적인 ABE(아세톤, 부탄올, 에탄올) 발효에서 획득되는 비율과 유사한 2.6:6.6:0.8의 아세톤:부탄올:에탄올 비율의 용제를 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
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