JPS63157989A - ブタノ−ルの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はブタノールの製造法に関し、更に詳細には有機
化学工業上有用なブタノールを発酵法によシ製造する方
法に関する。

〔従来の技術〕

現在、ブタノールは専ら石油化学によシ生産されている
。しかし石油資源の減少、入手難に備え、他の資源から
の効率的生産法が種々検討されておシ、微生物の応用も
その一つである。

従来ブタノールをよく生成する微生物としては、クロス
トリジウム・アセトブチリカム、（Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉ
ｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ　）　、クロスト
リジウム・パイゾエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｂｅｊＪｅｒｉｎｃｋＮ　）等が報告されている（「微
生物工業Ｊ３０７Ｐ（昭３１）朝食書店）、（アゾライ
ド・エンピロメンタル・ミクロバイオロゾイ、第４５巻
１１６０Ｐ１９８３年（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　ｅｎ
ｖｌｒｏｍｅｎｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　）
　）０〔発明が解決しようとする問題点〕 しかし、これらはいずれも炭素源として澱粉質や糖質原
料を培地に使用している。これらの澱粉質や糖質原料は
、元来人間の食糧として使用されているものでアシ、資
源として利用するのは好ましくない。従って、食糧と競
合しない未利用資源を炭素源として利用するのが望まし
い。

該未利用資源であるイヌリン等のフラクトースを含んだ
多糖類を炭素源として利用してブタノール発酵をする２
、３の試みが行なわれている。例えばマーシャルらがイ
ヌリンをイヌリナーゼで分解した後、これを炭素源とし
て利用してブタノール生産菌クロストリジウム・アセト
ブチリカム（Ｃｌｏａｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔ
ｙｌｉｃｕｍ　）を培養することによシブタノールを生
産することを報告している（アゾライド・ミクロパイオ
ロゾイ・）２イオテクノロゾイ第２３巻９２Ｐ１９８５
年（ＡｐｐＨｅｄａｎｄ　ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　
ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ）’　〕）　ｃ）　Ｌかしこ
の方法はイヌリンの加水分解工程が必要であるという欠
点を有する。またファンらによって酵素等による多糖類
の分解をさせず釦、直接チョウセンアザミのイヌリンを
炭素源として利用してブタノールを生産することが報告
されている（　Ｐｒｏｃ、Ｐａｃ、Ｃｈｅｍ、Ｅｎｇ、
Ｃｏｎｇ、＋Ｖｏｌｕｍｅ　４　、１４　Ｉ　Ｐ　）が
、この方法は炭素源の濃度が低く（４％）、かつ溶剤生
産性も低く（約０．９４　ｙ　／　１００　ｔｄ程度）
、使用窒素源に対する生成溶剤量、すなわち溶剤転換率
も２３．５％で満足できるものではなかった。

このような状況下で微生物を利用した簡易かつ生産性の
高いブタノールの製造法の開発が求められていた。

〔問題点を解決するための手段〕

斯かる実状に鑑み本発明者らは、種々研究していたとこ
ろ、東京都八丈島の土壌よシ新たに分離した微生物が極
めて高いブタノール生産能を示すことを見い出し、本発
明を完成した。

すなわち、本発明はクロストリジウム・ノ。

ストリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｌｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕ
ｒｉａｎｕｍ　）変種ｌ−５３（微工研菌寄第９０７４
号）を栄養培地中で培養し、該培養液からブタノ−□ル
を採取することを特徴とするブタノールの製造法を提供
するものである。

本発明で使用する微生物クロストリジウム・ＩＱストリ
アヌム変種Ｉ−５３は本発明者らによって新たに分離さ
れたもので、その特徴は次の通シである。

（１）形態的性質 酵母エキス添加・グルコース・ブイヨン培地（以下ＧＢ
Ｙ培地と略記、グルコースｉ、　。

％、肉エキス１．０％、ペゾトン１．０％、塩化ナトリ
ウム０．５％、酵母エキス０．２％、ｐＨ６，０）を用
い、ガス置換型嫌気培養器フォーマ社製モデル１０２４
型（Ｎ２、Ｃｏ、使用）によシ、３０℃で嫌気培養を行
った。

その結果は、次ぎの通シであった。

栄養細胞（２４時間培養）： 端部に円味のある桿状となシ、多くは、単独であるが、
２個連結するものもある。大きさは０．４〜１．３　Ｘ
　Ｚ　７〜１２．７　μである。

胞子嚢細胞： ２４時間を過ぎる頃から一方の末端が膨らんだ細胞が出
現する。

胞子（１２０時間培養）： 卵型で、大きさは、１．０〜１．５　Ｘ　１．３〜２．
０μである。

染色性ニゲラム陽性 運動性：液体培養　ＧＢＹ培地では運動性はない。

（２）培養的性質 （−）　　平板培養 ３０℃でフォーマ社製モデル１０２４型嫌気培養器によ
シ、培養した結果は以下の通シである。

麹汁寒天培地（ｂｒｉｘ　１５　　）　＊僅かに生育し
、ガスを発生する。

グルコース寒天： 僅かに生育する。

？テト・グルコース寒天： 光沢のある粘性をともなった乳白色円形集落をつくる。

加糖ブイヨン寒天培地： １日で乳白色円形集落を作り、２日で集落は拡大し、ガ
スを発生する。３日に至シ、ガスのため亀裂を生じ、ぺ
）　１７皿−面に繁殖する０ トウモロコシ寒天培地： 僅かに生育し、ブタノール臭を発し、ガスの発生も伴う
。

（ｂ）　　画線培養 （ＩＬ）と同一の方法により嫌気培養した。

麹汁寒天培地およびグルコース寒天培地：僅かに生育す
る。

？テト・グルコース寒天培地： １日目で生育し、３日目では菌の表面に多量の粘質物を
形成する。

（ｃ）穿刺培養 嫌気培養装置による培養は行わず通常の培養方法によシ
行った。

ブイヨン寒天培地ニ アロ間で肉眼で認められるほどの繁殖はない。

麹汁寒天培地ニゲルコース寒天培地：ペゾトン添加麹汁
寒天培地いずれも僅かに穿刺に沿って生育する。

グルコース添加ブイヨン寒天培地： ２日で穿刺溝全部にわたって乳白色の集落が、おびただ
しく繁殖し、３日でガス発生によって亀裂を各所に発生
し、その間隙に沿って繁殖する。

（ｄ）　　液体培養 トウモロコシ汁培地： 僅かずつガスを発生し、３日間でほぼ発酵を終了する。

その発酵の程度は、非常に微弱である。

麹汁培地：ブイヨン培地ニゲルコース液培地：いずれも
７日間で全く繁殖が見られない。

グルコース添加ブイヨン汁培地： １日で涌きつき、盛んにガスを発生して対流し、やや濁
シ、３日で菌体は沈降し、３日で発酵を終了する。１０
日目でｐＨ５，９０となる。

（、）　　ゼラチン培地 培養温度を２０℃とした。

麹汁ゼラチン培地：ペゾトン添加麹汁ゼラチン培地ニゲ
ルコースゼラチン培地いずれも１０日目で溶膠しない。

（３）　　生理的性質 （、）　　最適生育条件：ＰＨ５，０、温度３０”Ｃ１
嫌気性（ｂ）　　生育しうる条件：ｐＨ５，０，温度１
５〜４３℃（ｃ）　　ダラム染色：陽性 （ｄ）　　抗酸性：なし く、）　　メチルレッド試験：＠性 （ｆ）　　フォーゲス・グロスカラエル反応：陰性（ｇ
）　　インドール生成：陰性 （ｈ）　　硫化水素：陽性 （ｉ）　　硝酸塩の還元性：なし くｊ）　　カタラーゼ生成：陰性 （ｋ）　　澱粉の加水分解：陰性 （１）　　クエン酸の利用性：なし （ｍ）　　牛乳の凝固性：なし くｎ）　　アンモニウム塩の利用性：有シ（、）　　硝
酸塩の利用性：なし くｐ）　　グルタミン酸の利用性：有シ（ｑ）　　溶血
性：有シ （ｒ）グルコースよシ酸の生成：有シ （諷）好気性血液培地：生育せず （１）　　レシチナーゼ：生成せず （ｕ）　　カシロン酸：生成せず （マ）酪酸：生成する （ｗ）　　エスクリン：加水分解せず （ｘ）　　マルトースよシ酸の生成：有シ（ｙ）　　リ
ノＱ−ゼの生成：なし くｚ）３％食塩耐性：なし く４）　　炭素源の利用性 スビークマン塩類（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ
。

５８．３９５Ｐ　、（１９２３））にペゾトン０．５％
添加した培地に、それぞれの炭素源を添加して利用性を
検討した０ 結果は第１表の通シである。

以下余白 こレラの特徴から「ノ２−ゾエイズ゛・マニュアル・オ
プ・システマチック・バクテリオロゾイ」を参照して本
菌を同定した。

クロストリジウム属に属し、グルコースから酸を生成し
、ゼラチンを液化しない類の菌の中で、まずイヌリンを
資化できるものとして、クロストリジウム・コクレアツ
ム、クロストリジウム・オロチクム、クロストリジウム
・インノクムがあげられる。

しかし、形態的特徴に於いてｌ−５３菌が桿菌であるの
に対し、蛇状の巻き型であるクロストリジウム・コクレ
アツムとは全く異なっている。次ぎに、クロストリジウ
ム・オロチクムは菌の形態的特徴が卵型ないし桿型であ
り、糖の資化性の点でもｌ−５３菌とけ相異点が多い。

更にクロストリジウム・インノクムは分類の鍵であるエ
スクリンの資化性があることから、ｌ−５３菌とは異な
っておシ。

糖の資化性でもかなり異なっている。

エスクリンを資化しない菌としては、クロストリジウム
・グリコリツムとクロストリジウム・ノＱストリアヌム
が挙げられる。クロストリジウム・グリコリツムは糖の
資化性が殆どなく、僅かに資化するものでもフラクトー
スの発酵性は弱く、またソルビトール、キシロースの発
酵も微弱でｌ−５３菌の糖の資化性とは全く異なってい
る。

そこで、クロストリジウム・ＩＱストリアヌムを検討す
ると菌の性状や糖の資化性の点でＩ−５３菌と比較的類
似しておシ、［パージエイズ・マニュアル・オプ・デイ
タミネイチブ・バクテリオロゾイ第８版」によれば、イ
ヌリンの発酵性はあると記載されている。以上の結果か
らｌ−５３菌は、クロストリジウム・／Ｑストリアヌム
の一変種とみるのが妥当であると考えられる。Ｉ−５３
菌とクロストリジウム・）Ｑストリアヌムの性質の比較
を第２表に示した。

第２表 １）：パージエイズ・マニュアルーオン・デイターミネ
イティブ・バクテリオ ロゾイ第８版 ２）：パージエイズ・マニュアル・オン・システマチッ
ク・ノミクテリオロゾイ 第２巻 そこでｌ−５３菌をクロストリジウム・ノＱストリアヌ
ム変種Ｉ　−５３（Ｃｌｏｓｔｒｊｄｉｕｍｐａｓｔｅ
ｕｒｌａｎｕｍ　ｖａｒ、　Ｉ　−５３）と命名し、工
業技術院微生物工業技術研究所へ微工研菌寄第９０７４
号（ＦＩＲＭ　Ｐ−９０７４）として寄託した。

本発明方法によシブタノールを製造するには、通常のク
ロストリジウム属微生物の培養方法に従って前記クロス
トリジウム・、Ｑストリアヌム変種ｌ−５３を培養し、
培養物中に、ブタノールを蓄積せしめ、これを分離う採
取すればよい。

培養のための栄養源としては、各種のものが用いられる
が、炭素源としては、イヌリンのほかグルコース、シュ
ークロース、ナトカ単独または組み合わせてもちいられ
る。

また、窒素源としては、無機または有機のものが用いら
れるが塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素、硝
酸アンモニウム、硝酸ソーダ等、まだ天然窒素源のペゾ
トン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチ
ープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸、ソリュブル・ベジ
タブル・ゾロナイン等が単独または組み合わせて使用可
能であるが、有機及び無機窒素源の併用が好ましい。そ
のほか、食塩、塩化カリウム、炭酸カルシウム、燐酸塩
等の無機塩を加えるほか本菌の生育やブタノールの生産
を促進する有機物または無機物を更に添加してもよい。

培養方法としては、嫌気状態にした液体培養法、特に深
部静置培養法が最も適している。

培養温度は２８〜３３℃、ｐＨはやや酸性で培養するの
が望ましい。液体培養の場合、通常２〜４日の培養でブ
タノールが培養液中に生産される。

かくして得られた培養物中からブタノールを分離収得す
る釦は、蒸留などの一般的な分離精製手段がもちいられ
る。

〔効果〕

一２０＝ クロストリジウム・ノＱストリアヌム変種ｌ−５３は、
ｐＨ４，０で培養できるので、他の菌の汚染が少なくで
きる利点がある。またイヌリン濃度が高くても発酵し、
高いソルベントの生産ができる。

次ぎにブタノール生産菌として知られているクロストリ
ジウム属の９菌株と本発明で用いるクロストリジウム・
ノＱストリアヌム変種ｌ−５３について生成するソルベ
ント量を比較した結果を第３表に示す。

−２クロストリジウム・アセトブチリクム　　　　　　
ＩＡＭ　　１９０１２３、　　クロストリジウム・アセ
トブチリクム　　　　　　ＩＡＭ　　１９０２１４、　
　クロストリジウム・アセトブチリクム　　　　　　Ｉ
ＡＭ　　１０９２２５、　　クロストリジウム・アセト
ブチリクム　　　　　　ＩＡＭ　　１９０２３６、　　
クロストリジウム・アセトブチリクム　　ＩＦＯ１３９
４８７、クロストリジウム・イソゾロピリクム　ＩＡＭ
　　１９１０１８、　　クロストリジウム・イソゾロビ
リクム　ＩＡＭ　　１９１０２９、　　クロストリジウ
ム・インゾロピリクム　ＩＡＭ　　１９２３９なお、上
記比較における培地組成、培養方法及び条件は次ぎの通
）である。

（培地組成） イヌリン（ダリャ、Ｓｉｇｍａ社製）３．０％コーン・
スチーゾ・リカー（日本食品化工社製）１，０硫酸アン
モニウム　　　　　　　　　　　　　０．１炭酸カルシ
ウム　　　　　　　　　　　　　０．５ＰＨ６，０ （培養方法及び条件） 温度３０℃で前記嫌気培養器で３日間培養した。

ンルベント内訳： １）エタノール０．３２ｆ／ｌ、アセトン０．９７ｆ／
ｌ。

ブタノール４６７り／１ ２）エタノール−、アセトン−、ブタノール０．５５　
ｆ／を以上の結果から本願方法のブタノール収量が高い
ことは明らかである。

〔実施例〕

次ぎに実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

実施例１ イヌリン（ダリャ、シグマ社製）３．０％、コーン・ス
チーゾ・リカー（日本食品化工社製）１０％、硫酸アン
モニウム０．１％、炭酸カルシウム０．５％、（ｐＨ６
，０）を含む培地にクロストリジウム・ノＱストリアヌ
ム変種Ｉ−５３を接種し、３０℃で７２時間培養した。

培養液をガスクロマトグラフィにて分析したところ、総
ツルベン）５．９６％、総有機酸５．７６％であった。

実施例２ 各種炭素源３．０％、ポリペプトン０．５％、スビーク
マン塩類（第２リン酸カリウム０．０５％、第１リン酸
カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム０．０２％、塩
化ナトリウム０、０　Ｏ１％、硫酸鉄０．０　Ｏ１％、
硫酸マンガンＯ，ＯＯ１％）を含む培地（ｐＨ６，０）
に、クロストリジウム・ノＱストリアヌム変種ｌ−５３
を接種し、３０℃で１６８時間培養した。実施例１と同
様に分析し、第４表に各炭素源で培養したソルベント生
産量を示した。本菌は特にイヌリンばかりでなく、グル
コース、フラクトースでよくソルベントが生産され、イ
ヌリンでは総ソルベント＆０５　ｙ／ｌでらった。

以下余白 実施例３ イヌリン（ダリャ　シグマ社製）６．４％、硫酸アンモ
ニウム０．１％、炭酸カルシウム０．５％（ｐＨ４０）
に各種有機窒素源ＬＯ％を加えた培地にクロストリジウ
ム・ノＱストリアヌム変種ｌ−５３を接種して発酵試験
を行った。結果を第５表に示す。なお、培養条件は３０
℃７２時間培養である。コーン・スチーゾ・リカーの添
加によって生成するンルベント量が増大した。チリペゾ
トンの添加では有機酸の濃度が上昇した。

以下余白 −３０一 実施例４ 各種炭素源６．４％、コーン・スチーゾ・リカー１．０
％、硫酸アンモニウム０．１％および炭酸カルシウム０
，５％（ｐＨ６，０）を含む培地にクロストリジウム・
ノＱストリアヌム変種１−５３を接種し、３０℃で７２
時間培養した。実施例１と同様に分析した。結果を第６
表に示した。ソルベントはグルコース、フラクトース、
シュークロースでも生産されるが、ダリャ塊茎よシ得ら
れるイヌリンの方が良好であった。同じイヌリンでもキ
クゾシャの根よシ得られたイヌリンは、ダリャの塊茎よ
シ得られるイヌリンに比べて総ソルベントの生産は低か
った。

−３２一 実施例５ イヌリン６．４％、コーン・スチーゾ・リカー３．０％
、炭酸カルシウム０．５％に各濃度の硫酸アンモニウム
を加えた培地（ｐＨ４，０）にクロストリジウム・ノＱ
ストリアヌム変種ｌ−５３を接種し、３０℃で７２時間
培養した。実施例１と同様に分析した結果を第７表に示
した。

硫酸アンモニウムの濃度が高まるに従って総ソルベント
生産性は上昇し、０．３％の添加で最高値に達し、溶剤
転換率が３２．３％であった０ 以下余白 手続補正書（自発） 昭和６２年２月２日 １、　事件の表示 昭和６１年特許願第　３０２５０３　　号２、　発明の
名称 ブタノールの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 名　称　新燃料油開発技術研究組合 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、補正の内容 （１）明細書中、第５頁第６〜７行 「（約０．９４ｆ／１００Ｍ１程度）、使用窒素源」と
おるを ｒ　（０，９４ｒ／ｌ　００ｄ）％使用炭素源」と訂正
する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クロストリジウム・パストリアヌム （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　Ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ
   ）変種 I −５３（微工研菌寄第９０７４号）を栄養培
   地中で培養し、該培養液からブタノールを採取すること
   を特徴とするブタノールの製造法。 ２、栄養培地が炭素源としてイヌリン、窒素源として無
   機及び／または有機窒素化合物を含む培地である特許請
   求の範囲第１項記載のブタノールの製造法。 ３、炭素源が未加水分解イヌリンであり、窒素源が無機
   及び有機窒素化合物である特許請求の範囲第１項又は第
   ２項いずれかの項記載のブタノールの製造法。