JPS58165786A - クロストリジウム・アセトブチリカムのブタノールおよびアセトン高生産性突然変異体の創製方法 - Google Patents
クロストリジウム・アセトブチリカムのブタノールおよびアセトン高生産性突然変異体の創製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏ）＋ｒＬｙｌｉｃｕｍ
）のブタノ−。
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏ）＋ｒＬｙｌｉｃｕｍ
）のブタノ−。
ルおよびアセト□ン高生産性突然変異体およびそ 、
１の創製方法に関する。
１の創製方法に関する。
酢酸ブタノール醗酵は古くより知られているか、これに
よって各種の糖質より工業的に関心のある生産物、すな
わちブタノール、アセトンおよびエタノールの混合物（
以下、ＡＢＥと称する）の生産が可能であり、これは主
要生成物たるｎ−ブタメールを得る特に効果的な手段と
なっている。代用燃料の組成に含まれるこの化合“物の
この取得径路の利点が、また、最近明らかになったアン
スティテユ・フランセ・デユーベトロール（Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔＦｒａｒ？ａｉｓｄＵＬＰｅｔｒｏｌｅ）のフラ
ンス特許出願第７８０１２８２２号および第第１巻Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１（１７９年第］、８７〜
２０９頁）およびＳ、Ｃ，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ ％ＥｆＣ
，Ｑ−１Ｄｕｎｎ （Ｉｒ＋ｒｌｕｓもｒｉａ１頁）の
総合論文に示す如く、形成される生産処物の濃度の相対
的な低さであったか、これは一般に最良の条件下におい
て全８度２０９／ｌ。
よって各種の糖質より工業的に関心のある生産物、すな
わちブタノール、アセトンおよびエタノールの混合物（
以下、ＡＢＥと称する）の生産が可能であり、これは主
要生成物たるｎ−ブタメールを得る特に効果的な手段と
なっている。代用燃料の組成に含まれるこの化合“物の
この取得径路の利点が、また、最近明らかになったアン
スティテユ・フランセ・デユーベトロール（Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔＦｒａｒ？ａｉｓｄＵＬＰｅｔｒｏｌｅ）のフラ
ンス特許出願第７８０１２８２２号および第第１巻Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１（１７９年第］、８７〜
２０９頁）およびＳ、Ｃ，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ ％ＥｆＣ
，Ｑ−１Ｄｕｎｎ （Ｉｒ＋ｒｌｕｓもｒｉａ１頁）の
総合論文に示す如く、形成される生産処物の濃度の相対
的な低さであったか、これは一般に最良の条件下におい
て全８度２０９／ｌ。
種類別ではｎ−ブタ／−ルｌ Ｏ〜］、 ３ ！／ｌ。
７セ） ：／４〜７９／１１エタ／−／ｌ、０〜２ ！
／ｌを超えないものである。
／ｌを超えないものである。
本発明の目的は、適切な条件下において培養すれば、母
菌株より得られるものより遥かに高いＣ２０９／、ｅを
超える）ＡＢＥ濃度を得ることを可能にする如き、クロ
ストリジウム・アセ述することである。このような突然
変異体をここではＡＢＥ高生産性変異体と名付ける。
菌株より得られるものより遥かに高いＣ２０９／、ｅを
超える）ＡＢＥ濃度を得ることを可能にする如き、クロ
ストリジウム・アセ述することである。このような突然
変異体をここではＡＢＥ高生産性変異体と名付ける。
突然変異体創製の常用技法の利用は、り・投の厳格な嫌
気性にある。事実、微生物の菌株の単離、選択および精
製の場合に微生物学において用いる基礎技法である固体
栄養培養基」―における正常ｔλコロニーの発育は、実
施する操作間において酸素の如何なる痕跡をも除去する
ことを目標とするように、特別の配慮を行って始めて得
ることができるのである。従って、操作は予め還元した
培地を以て嫌気性「グローブボッＢｌａｃｋｓｌ）ｕｒ
ｇ、 Ｖａ、 第’ｌ ４４頁）の記載する条件下にお
いて実施されて来た。
気性にある。事実、微生物の菌株の単離、選択および精
製の場合に微生物学において用いる基礎技法である固体
栄養培養基」―における正常ｔλコロニーの発育は、実
施する操作間において酸素の如何なる痕跡をも除去する
ことを目標とするように、特別の配慮を行って始めて得
ることができるのである。従って、操作は予め還元した
培地を以て嫌気性「グローブボッＢｌａｃｋｓｌ）ｕｒ
ｇ、 Ｖａ、 第’ｌ ４４頁）の記載する条件下にお
いて実施されて来た。
いくつかの突然変異体創製技法か」−に述べた如き条件
下において用いられて来た。一方において、いくつかの
突然変異誘起剤、なかんずくエチルメチルスルホン酸エ
ステル（ＥＭＳ）およびＮ−メチル−Ｎ”−纂’ｌｉ
ニーＮ−−）口νグアニジン（ＮＧ）、ＩＣＲ１９１、
亜硝酸、ニトロキノリンＮ−オキシドか試みられて来た
。
下において用いられて来た。一方において、いくつかの
突然変異誘起剤、なかんずくエチルメチルスルホン酸エ
ステル（ＥＭＳ）およびＮ−メチル−Ｎ”−纂’ｌｉ
ニーＮ−−）口νグアニジン（ＮＧ）、ＩＣＲ１９１、
亜硝酸、ニトロキノリンＮ−オキシドか試みられて来た
。
他方において、これらの突然変異誘起剤の使用を種々に
変化せしめて来た。この分野において最も普通に用いら
れる技法は、細菌懸濁液を、与えられた濃度において一
定の時間の間検討済の突然変異剤に曝露して、これを液
体培養基中において突然変異せしめることである。次い
てゝ細菌懸濁液を遠心分離し、洗浄して、変異誘起剤を
除去し、次にこれを再度培養に付し、この懸濁液を固体
栄養培地（ペトリ皿）上に展開して生存微生物の個々の
コロニーを取り、次いでこれらのコロニーのうちから所
望の特性を示す突然変異体を選択するのである。突然変
異創製時間および変異誘起剤の濃度を変化せしめること
によって、微生物の検討下の個体群に起る突然変異率と
死亡率を変化せしめ、最も有利な突然変異率を与える条
件を選択する。この周知の技法はその専門書において、
特にＪ、Ｈ，ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、 ＣＯＩ（ＩＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｌ＋ｏｒ、 １
９７２年第１２５頁）の記載するところである。
変化せしめて来た。この分野において最も普通に用いら
れる技法は、細菌懸濁液を、与えられた濃度において一
定の時間の間検討済の突然変異剤に曝露して、これを液
体培養基中において突然変異せしめることである。次い
てゝ細菌懸濁液を遠心分離し、洗浄して、変異誘起剤を
除去し、次にこれを再度培養に付し、この懸濁液を固体
栄養培地（ペトリ皿）上に展開して生存微生物の個々の
コロニーを取り、次いでこれらのコロニーのうちから所
望の特性を示す突然変異体を選択するのである。突然変
異創製時間および変異誘起剤の濃度を変化せしめること
によって、微生物の検討下の個体群に起る突然変異率と
死亡率を変化せしめ、最も有利な突然変異率を与える条
件を選択する。この周知の技法はその専門書において、
特にＪ、Ｈ，ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、 ＣＯＩ（ＩＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｌ＋ｏｒ、 １
９７２年第１２５頁）の記載するところである。
検刷済のすべての突然変異誘起剤を以てしても、この技
法は極めて低率の突然変異体を創製するのみであったし
、如何なる場合においてもＡＢＥを高度に生産する変異
体は創製し得なかった。
法は極めて低率の突然変異体を創製するのみであったし
、如何なる場合においてもＡＢＥを高度に生産する変異
体は創製し得なかった。
おける突然変異の創製と、求める突然変異体のｎ−ブタ
ノールを含む固体栄養培養基上において、例えばペトリ
皿においてクロストリジウム・アセトブチリカムの成育
中の液体培養の展開を行った。突然変異誘起剤の濃度勾
配を得るために、ある一点、たとえば、各々のペトリ皿
の中心部に、突然変異誘起剤、好ましくはニトロソグア
ニジン（ＮＧ）を配置し、かくて変異誘起剤の漸進的な
拡散によって求める濃度勾配を作り出した。高度にＡＢ
Ｅを生産する突然変異体の選択を行うために、該変異体
がＡＢＥ生産試験にさらに増大するブタノールの蓄積に
耐えるはずであるという仮定の下に、ブタノールに耐性
を有する突然変異体を探索する。従って上述のペトリ皿
に、１枚の皿から他の皿へと相違して行きかつ漸次増大
して行く濃度を以てｎ−ブ制する濃度である。クロスト
リジウム・アセトブチリカムのインキュベーション条件
として知られている条件下におけるインキュベーション
の後に、これらのペトリ皿はｎ−ブタノールに対して耐
性を有する突然変異体の分離コロニーを創製した。これ
らの変異体のＡＢＥ生産能力を調べたところ、その大部
分がＡＢＥを高度に生産するものであるんとを認めた。
ノールを含む固体栄養培養基上において、例えばペトリ
皿においてクロストリジウム・アセトブチリカムの成育
中の液体培養の展開を行った。突然変異誘起剤の濃度勾
配を得るために、ある一点、たとえば、各々のペトリ皿
の中心部に、突然変異誘起剤、好ましくはニトロソグア
ニジン（ＮＧ）を配置し、かくて変異誘起剤の漸進的な
拡散によって求める濃度勾配を作り出した。高度にＡＢ
Ｅを生産する突然変異体の選択を行うために、該変異体
がＡＢＥ生産試験にさらに増大するブタノールの蓄積に
耐えるはずであるという仮定の下に、ブタノールに耐性
を有する突然変異体を探索する。従って上述のペトリ皿
に、１枚の皿から他の皿へと相違して行きかつ漸次増大
して行く濃度を以てｎ−ブ制する濃度である。クロスト
リジウム・アセトブチリカムのインキュベーション条件
として知られている条件下におけるインキュベーション
の後に、これらのペトリ皿はｎ−ブタノールに対して耐
性を有する突然変異体の分離コロニーを創製した。これ
らの変異体のＡＢＥ生産能力を調べたところ、その大部
分がＡＢＥを高度に生産するものであるんとを認めた。
適切な濃度を以てブタノールをペトリ皿内で用いると、
多数の突然変異体かこのようにしてクロストリジれた。
多数の突然変異体かこのようにしてクロストリジれた。
一般的にいえば、この技法は再現可能であることを示し
た。しかしながら、クロストリジウム・アセトブチリカ
ムの若干の菌株は十分にきちんとした輪郭および判然と
した輪郭を有する分離コロニーを自然には生成しない。
た。しかしながら、クロストリジウム・アセトブチリカ
ムの若干の菌株は十分にきちんとした輪郭および判然と
した輪郭を有する分離コロニーを自然には生成しない。
この後者の場合、突然変異体を創製するには、上に述べ
た如き操作にたやすく適合するために、判然とした輪郭
を有するコロニーを形成する自然発生変異体の分離が必
要であった。
た如き操作にたやすく適合するために、判然とした輪郭
を有するコロニーを形成する自然発生変異体の分離が必
要であった。
ＡＢＥを高度に生産する突然変異体の分離について」−
に記載した技法の有効性の理由は完全にはわかっていな
い。嫌気室において実施し得る操作しか含んでいないこ
の技法は、高度の嫌気生活条件に一層よく適合している
ものと考えることができる。また、選定した選別（ふる
い）試験としてのブタノール耐性試験は、ＡＢＥを高度
に生産する突然変異体の選択のための適当なふるいであ
ると認められるが、このことはこ（７）２−）（７）性
質力結び伺゛０゛１も′Ｄ”ｒあ６０とを示 、）
している。用いる突然変異誘起剤の重要性に関しては、
変異誘起剤は等しい機能を有するものではすく、例えば
、同一条件下において、ＥＭＳの使用によっては、ニト
ロソグアニジンを用いて得る結果より明らかに好しくな
い結果を得ることに留意しなければならない。従って、
本発明の目的たる突然変異体は、選別試験として、特殊
突然変異創製プロトコールによるブタノール耐性を用い
て得たものである。これらの突然変異体はクロストリジ
ウム・アセトブチリカムの種々の母菌株、とりわけ実験
室において自然環境より予め分離した菌株より得ること
かできたものである。これらはブタノール（およびその
低溶媒）に対する耐性ならびに母菌株のものより高度の
溶媒（ブタノールおよびアセトン）の生産をその特賞と
している。
に記載した技法の有効性の理由は完全にはわかっていな
い。嫌気室において実施し得る操作しか含んでいないこ
の技法は、高度の嫌気生活条件に一層よく適合している
ものと考えることができる。また、選定した選別（ふる
い）試験としてのブタノール耐性試験は、ＡＢＥを高度
に生産する突然変異体の選択のための適当なふるいであ
ると認められるが、このことはこ（７）２−）（７）性
質力結び伺゛０゛１も′Ｄ”ｒあ６０とを示 、）
している。用いる突然変異誘起剤の重要性に関しては、
変異誘起剤は等しい機能を有するものではすく、例えば
、同一条件下において、ＥＭＳの使用によっては、ニト
ロソグアニジンを用いて得る結果より明らかに好しくな
い結果を得ることに留意しなければならない。従って、
本発明の目的たる突然変異体は、選別試験として、特殊
突然変異創製プロトコールによるブタノール耐性を用い
て得たものである。これらの突然変異体はクロストリジ
ウム・アセトブチリカムの種々の母菌株、とりわけ実験
室において自然環境より予め分離した菌株より得ること
かできたものである。これらはブタノール（およびその
低溶媒）に対する耐性ならびに母菌株のものより高度の
溶媒（ブタノールおよびアセトン）の生産をその特賞と
している。
また、衝だ突然変異体は、培養の終末におい変異体にお
いては、自然のままの菌体におけるよりは小さいという
方向において、母菌株と異なる胞子形成性を示すことも
認められた。
いては、自然のままの菌体におけるよりは小さいという
方向において、母菌株と異なる胞子形成性を示すことも
認められた。
以下に記載する実施例は突然変異体創製のプロトフール
および実験室において分離した菌株（ＩＦＰ９０３株）
にしてもキクイモ（Ｔｏｐｉｎａｍｂｏｕｒ）の汁にお
いての醗酵に用いたものの場合における、その特徴指示
を例示するものである。突然変異体の創製および性能は
個々の糖質基質の使＼ 用に結び付いているものではなく、クロストり各種の糖
、特にブドー糖、果糖、蔗糖、澱粉、セロビオース、キ
シロースおよびトウモロコシの輩の如きリグノセルロー
ス質の加水分解生成物を用いて認められた。
および実験室において分離した菌株（ＩＦＰ９０３株）
にしてもキクイモ（Ｔｏｐｉｎａｍｂｏｕｒ）の汁にお
いての醗酵に用いたものの場合における、その特徴指示
を例示するものである。突然変異体の創製および性能は
個々の糖質基質の使＼ 用に結び付いているものではなく、クロストり各種の糖
、特にブドー糖、果糖、蔗糖、澱粉、セロビオース、キ
シロースおよびトウモロコシの輩の如きリグノセルロー
ス質の加水分解生成物を用いて認められた。
ブチリカムの１菌株であると同定せしめたその特徴は下
記に示す通りである。上に記載する方式によって得る、
実施例１に例示する突然変異体は、」二連の如く、胞子
形成率が母菌株より低糠 いということを除いて、母菌株と同じ分離学」二の特級
を示している。
記に示す通りである。上に記載する方式によって得る、
実施例１に例示する突然変異体は、」二連の如く、胞子
形成率が母菌株より低糠 いということを除いて、母菌株と同じ分離学」二の特級
を示している。
９０３株の持参形態；非移動性の、分離した、妬
末端の丸い桿梃、ダラム陽性、しばしば亜項生（ｓｕｌ
〕もｅｒｍｉｎａｌ）、時には項生（ｔｅｒｍｉｎａｌ
）の卵形の胞子を有する膨大した胞子裏。
〕もｅｒｍｉｎａｌ）、時には項生（ｔｅｒｍｉｎａｌ
）の卵形の胞子を有する膨大した胞子裏。
用したミラーの記載するＰＹ培地）、ガスによって極め
て混濁 ＰＹブイヨン：ガスなしで少し混濁 ゲロース（ＰＹ−グルコース）：直径１〜２胴の白色用
３Ｑのコロニー、老化とともに黄色になる。
て混濁 ＰＹブイヨン：ガスなしで少し混濁 ゲロース（ＰＹ−グルコース）：直径１〜２胴の白色用
３Ｑのコロニー、老化とともに黄色になる。
成育は厳格な嫌気性条件下において行われる。
用いられる糖質は主としてブタノールとアセトン（およ
び少量のエタノール）に変換される。
び少量のエタノール）に変換される。
揮発性の酸（酢酸および酪酸）かさら・に少量形成され
る。形成されるガスは炭酸ガスと水素より成っている。
る。形成されるガスは炭酸ガスと水素より成っている。
炭水化物およびその他の炭素含有基質
シロース、サリシン〜ガラクトース、ブドー糖、β−メ
ケルグルコシド、澱粉、蔗糖、マンニトール上において
ガスおよび酸の形成を伴って旺盛 、）に成育。
ケルグルコシド、澱粉、蔗糖、マンニトール上において
ガスおよび酸の形成を伴って旺盛 、）に成育。
イノシトール、エスクリン、久−メチルグルコシド上で
は、ガスおよび酸の生成を伴うが、成育はそれほど旺盛
ではない。
は、ガスおよび酸の生成を伴うが、成育はそれほど旺盛
ではない。
ソルビト−ル、ラムノース上では、ガスおよび酸をほと
んど生成せず成育もほとんど旺盛ではない。
んど生成せず成育もほとんど旺盛ではない。
工りトリトール、アラビノース、リボーゼ、グリセロー
ル、ペクチンは利用されず。
ル、ペクチンは利用されず。
蛋白質
凝固乳、カゼインは利用されず、血清は利用されず、ゼ
ラチンは利用されず 脂質 レシチナーゼ 結果は陰性 トリブチリン 培養を生ぜず その他の特饗 溶血：陰性、尿素：陰性または極めて弱い陽性されず、
インドール：形成されず、アセトイン：生成されず。
ラチンは利用されず 脂質 レシチナーゼ 結果は陰性 トリブチリン 培養を生ぜず その他の特饗 溶血：陰性、尿素：陰性または極めて弱い陽性されず、
インドール：形成されず、アセトイン：生成されず。
Ｆｒｅｄ、Ｗ、Ｈ，ＰｅｔｅｒｓｏｎおよびＨ２Ｃ，Ｈ
ａｓｔｉｎｇｓ、Ｊｏｕｒｎａ１類するに到るものであ
る。
ａｓｔｉｎｇｓ、Ｊｏｕｒｎａ１類するに到るものであ
る。
以下余白
実施例１
タノール耐性を有する突然変異体創製プロトコール
クロストリジウム・アセトブチリカムの１菌株（ＩＦＰ
９０３株）を完全な培養基、既に引用したミラーの記載
するＰＹ培地−二で１夜嫌気室内において成育せしめた
。炭素源は１０！／ｌの割合のブドー糖であった。
９０３株）を完全な培養基、既に引用したミラーの記載
するＰＹ培地−二で１夜嫌気室内において成育せしめた
。炭素源は１０！／ｌの割合のブドー糖であった。
菌株は翌朝新鮮なＰＹ培地１０ｍ１中において再度成育
せしめた。同じ日、ゲロース培地のペトリ皿をｎ−ブタ
ノールＩＩ！につき５．７．１０および１２ｇと漸増す
る濃度を以て嫌気室内において調製した。菌株の成育（
８時間）後、培養０．１ ｍｌを各ペトリ皿上に展開し
た。１５分後、ニトロソグアニジンの結晶１個を各ペト
リ皿の中心部に置いた。ぺ） ＩＪ皿は嫌気室内におい
て３日間３２℃においてインキュベートした。
せしめた。同じ日、ゲロース培地のペトリ皿をｎ−ブタ
ノールＩＩ！につき５．７．１０および１２ｇと漸増す
る濃度を以て嫌気室内において調製した。菌株の成育（
８時間）後、培養０．１ ｍｌを各ペトリ皿上に展開し
た。１５分後、ニトロソグアニジンの結晶１個を各ペト
リ皿の中心部に置いた。ぺ） ＩＪ皿は嫌気室内におい
て３日間３２℃においてインキュベートした。
ＩＩ！について５．７およびＩＯＦのブタノールを含む
ペトリ皿上においてニトロソグアニジンの一部阻害作用
を認めることができた。
ペトリ皿上においてニトロソグアニジンの一部阻害作用
を認めることができた。
１１につき１２Ｌ！−のブタノールを含むペトリ皿上に
は生育を全く認めなかった。ＩＡ’につき５および７２
を含むぺＩ−ＩＪ皿上では、菌株の一様の成育が毒性域
を超えて認められていた。１１につき１０２を含むペト
リ皿では、耐性を有する突然変異体が環（ａｕｒｅｏｌ
ｅ ）を形成していたので、そのうち１１個を１１につ
”き１０ｇのｎ−ブタノールを含むぺ） ＩＪ皿
上 １を連続２回通過せしめて精製した。ｎ−ブタ
ノールのこの濃度を以てしては、用いた実験条件下にお
けるペトリ皿」二に自然のままの菌株の成育は全く認め
られていなかった。
は生育を全く認めなかった。ＩＡ’につき５および７２
を含むぺＩ−ＩＪ皿上では、菌株の一様の成育が毒性域
を超えて認められていた。１１につき１０２を含むペト
リ皿では、耐性を有する突然変異体が環（ａｕｒｅｏｌ
ｅ ）を形成していたので、そのうち１１個を１１につ
”き１０ｇのｎ−ブタノールを含むぺ） ＩＪ皿
上 １を連続２回通過せしめて精製した。ｎ−ブタ
ノールのこの濃度を以てしては、用いた実験条件下にお
けるペトリ皿」二に自然のままの菌株の成育は全く認め
られていなかった。
２）最低阻害濃度（ＭＩＣ）の決定
ブタノールに対する耐性は、以下に記載した実験で示す
如く、生成する突然変異体の重要な特徴である。この実
験においては、ある種の操作は嫌気室において容易に実
施し得ないものであるので、その際は、嫌気室で調製し
た予め還元した培地を室外で用いる。上記の常用の培地
は少し異なったプロトコールに従って調製する。培地を
調製し、還元指示剤レザズリンを嫌気室外で加える。次
いで、レザズリンが変色するに到るまで培地を加熱し、
それから培地を嫌気室内に入れる。培地はブチルゴムの
栓をした小さいガラスびん内に配て密封する。それから
、ガラスびんを嫌気室より出し、これを滅菌後そのまま
で用いればよい。事実、これを以て嫌気性雰囲気中の培
地が出来るが、その還元状態はレザズリンの色によって
調節される。
如く、生成する突然変異体の重要な特徴である。この実
験においては、ある種の操作は嫌気室において容易に実
施し得ないものであるので、その際は、嫌気室で調製し
た予め還元した培地を室外で用いる。上記の常用の培地
は少し異なったプロトコールに従って調製する。培地を
調製し、還元指示剤レザズリンを嫌気室外で加える。次
いで、レザズリンが変色するに到るまで培地を加熱し、
それから培地を嫌気室内に入れる。培地はブチルゴムの
栓をした小さいガラスびん内に配て密封する。それから
、ガラスびんを嫌気室より出し、これを滅菌後そのまま
で用いればよい。事実、これを以て嫌気性雰囲気中の培
地が出来るが、その還元状態はレザズリンの色によって
調節される。
この予め還元した培地に注射器を以てブチルゴム栓を通
して菌を植える。すべての試料採取もすべての添加もこ
の方式によって行う。
して菌を植える。すべての試料採取もすべての添加もこ
の方式によって行う。
この予め還元した培地は、とりわけクロストリジウム−
アセトブチリカムの突然変異体の種々の菌株および母菌
株のブタノールについての最低阻害濃度（ＭＩＣ）を測
定するのに役立った。この生成物はかなり揮発性である
が、密封ガラスびん内では蒸発を行わず、かくてＭＩＣ
の正確な測定ができる。
アセトブチリカムの突然変異体の種々の菌株および母菌
株のブタノールについての最低阻害濃度（ＭＩＣ）を測
定するのに役立った。この生成物はかなり揮発性である
が、密封ガラスびん内では蒸発を行わず、かくてＭＩＣ
の正確な測定ができる。
用いてガラスびん内に加える。同様にして、試験すべき
菌株を１２時間の培養０．１−の割合を以て培地５ ｍ
ｌを入れたガラスびん内へ入れる。３２℃において２４
時間インキュベートした後、ＭＩＣを読取る。
菌株を１２時間の培養０．１−の割合を以て培地５ ｍ
ｌを入れたガラスびん内へ入れる。３２℃において２４
時間インキュベートした後、ＭＩＣを読取る。
結果は表１に要約した通りである（ＭＩＣとしては、あ
る生成物の与えられた菌株に対する毒性を測定するか、
このＭＩＣは細菌の成育がもはや認められなくなる如き
この生成物の最初の濃度に相当する）。
る生成物の与えられた菌株に対する毒性を測定するか、
このＭＩＣは細菌の成育がもはや認められなくなる如き
この生成物の最初の濃度に相当する）。
以下余白
表 １
かくて、一般に、突然変異した菌株はこの母菌株よりも
ブタノールに対して耐性が太きいことがわかる。
１）また下記の実験は、
得られたｎ−ブタノールに耐性を有する突然変異体か母
菌株よりＡＢＥを一層多く生産することを立証している
。
ブタノールに対して耐性が太きいことがわかる。
１）また下記の実験は、
得られたｎ−ブタノールに耐性を有する突然変異体か母
菌株よりＡＢＥを一層多く生産することを立証している
。
３）創製した突然変異体による溶媒の生成溶媒の排出は
、１１につき（ＮＨ４）２８０４３り、Ｋ２ＨＰＯ４０
，５９、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０１０”？、ＭｎＣＪ２−
４．Ｈ２Ｏ１０ｍ９、（ＮＩ（４）Ｍｏ７０２４ ＊Ｈ
２０ｌ Ｑｖｒｇ、ＣａＣＯ３３９、酵母抽出物４グ、
ブドー糖６（ｌを含む水性合成培養基１０ｒｎｌを入れ
た管の中で測定した。従って用いた基質はブドー糖であ
った。瑣養は標準的な滅菌条件下において、嫌気生活（
嫌気室における操作および３２℃で３日間のインキュベ
ート）として行った。
、１１につき（ＮＨ４）２８０４３り、Ｋ２ＨＰＯ４０
，５９、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０１０”？、ＭｎＣＪ２−
４．Ｈ２Ｏ１０ｍ９、（ＮＩ（４）Ｍｏ７０２４ ＊Ｈ
２０ｌ Ｑｖｒｇ、ＣａＣＯ３３９、酵母抽出物４グ、
ブドー糖６（ｌを含む水性合成培養基１０ｒｎｌを入れ
た管の中で測定した。従って用いた基質はブドー糖であ
った。瑣養は標準的な滅菌条件下において、嫌気生活（
嫌気室における操作および３２℃で３日間のインキュベ
ート）として行った。
結果は下記表２に示す通りである。
以下余白
表２ クロストリジウム・アセトブチリカムＩＦＰ９０
３株および突然変異体による溶媒の生産 実施例２ 生産 クロストリジウム・アセトブチリカムの自然のままの菌
株（ＩＦＰ９０３）および創製した突然変異体を容量６
１のＢ ｉ ｏＬＡＦ ｉ ＴＴＥ型醗酵槽に、２倍に
稀釈したキクイモのしぼり汁を硫酸を以て化学的に加水
分解し、次いで石灰を以てｐＨ７に中和したものより成
る培養基４１を入れて培養を行う。この培養基はその他
に（ＮＨ４）２ＳＯ４３ｆｌ ／’！およびＣａＣＯ３
５！ ／ ｌを含んでいる。醗酵活性は容量計数器上の
ガス放出量およびガスクロマトグラフィーによって測定
した最終培地（ｍｉｌｉｅｕ ｆｉｎａｌ） の溶媒
組成を用いて測定する。表３は自然のままの菌株および
生産性の高い４種の突然変異体の標準的な滅菌条件下お
よび嫌気生活（加熱して空気を除去し、不活性雰囲気中
に維持した培地）として行った、３４℃における３６時
間の醗酵後に得た結果をまとめたものである。
３株および突然変異体による溶媒の生産 実施例２ 生産 クロストリジウム・アセトブチリカムの自然のままの菌
株（ＩＦＰ９０３）および創製した突然変異体を容量６
１のＢ ｉ ｏＬＡＦ ｉ ＴＴＥ型醗酵槽に、２倍に
稀釈したキクイモのしぼり汁を硫酸を以て化学的に加水
分解し、次いで石灰を以てｐＨ７に中和したものより成
る培養基４１を入れて培養を行う。この培養基はその他
に（ＮＨ４）２ＳＯ４３ｆｌ ／’！およびＣａＣＯ３
５！ ／ ｌを含んでいる。醗酵活性は容量計数器上の
ガス放出量およびガスクロマトグラフィーによって測定
した最終培地（ｍｉｌｉｅｕ ｆｉｎａｌ） の溶媒
組成を用いて測定する。表３は自然のままの菌株および
生産性の高い４種の突然変異体の標準的な滅菌条件下お
よび嫌気生活（加熱して空気を除去し、不活性雰囲気中
に維持した培地）として行った、３４℃における３６時
間の醗酵後に得た結果をまとめたものである。
表 ３
菌株ＩＦＰ９０３および９０４は１９８２年３月４日Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。これらはそれぞ
れＡＴＣＣ受託番号３９０５７および同３９０５８を受
けている。
ｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した。これらはそれぞ
れＡＴＣＣ受託番号３９０５７および同３９０５８を受
けている。
第１頁の続き
■Ｉｎｔ、 Ｃ１，３識別記号 庁内整理番（Ｃ１
２Ｎ １５１００ −Ｃ１
２Ｒ１／１４５） ６７６０−４Ｅ
（剤発 明 者 フランソワーズ・ファイヨールフラン
ス国オ・ド・セーヌ県マ ラコフ（９２２４０）リュ、オツシ ュ８５−３番地 １．７ｆｇ＋発 明 者 レミー・マルシャルフランス
国イブリース県シャド ウ（７８４００）リュ・デ・コルミ ニ７０番地
２Ｎ １５１００ −Ｃ１
２Ｒ１／１４５） ６７６０−４Ｅ
（剤発 明 者 フランソワーズ・ファイヨールフラン
ス国オ・ド・セーヌ県マ ラコフ（９２２４０）リュ、オツシ ュ８５−３番地 １．７ｆｇ＋発 明 者 レミー・マルシャルフランス
国イブリース県シャド ウ（７８４００）リュ・デ・コルミ ニ７０番地
Claims (8)
- （１）ｎ−ブタノールおよびアセトンの高生産性を有し
旦つｎ−ブタノールに対し向上した耐性を有するクロス
トリジウム・アセトブチリカム突然変異体ＩＦＦ！９０
４ （ＡＴＣＣ受託番号３９，０５８）。 - （２）ｎ−ブタノールおよびアセトンの高生産性を有し
旦つｎ−ブタノールに対し向上した耐性を有するクロス
トリジウム・アセトブチリカム突然変異体の創製方法で
あって、嫌気性条件下において、 クロストリジウム−アセトブチリカムの菌株の水性培養
をｎ−ブタノールを含む固体培養基の表面に展開するこ
、と、 該培養基の表面に突然変異誘起剤を配置すること、 得られた培養基を前記菌株の発育条件下に置き、しかし
て 形成される突然変異体のコロニーの少なくとも一部を回
収すること、 より成り、培養基中のｎ−ブタノールの濃度が、突然変
異誘起剤の不存在下においては出発菌株の実質的な発育
がそれ以上ではもはや認められないような濃度に少なく
とも等しく、突然変異誘起剤の存在下においては、それ
以上では発育コロニーが全く形成されないような濃度よ
り低いものである方法。 - （３）突然変異誘起剤がＮ−メチル−汀−二ｌ−ｏ −
Ｎ−ニトロソグアニジンである、特許請求の範囲第２項
記載の方法。 - （４） 回収した突然変異体を、これ以下では未変異
の菌株がもはや発育しないような最低濃度より高いが、
これ以下では変異体かもはや発育しないような最低濃度
より低い濃度のｎ −ブタノールを含む培養基において
、少なくとも１回置度培養に付することによってこれを
特徴する特許請求の範囲第２または３項記載の方法。 - （５）突然変異誘起剤の拡散が培養基の表面に該誘起剤
の濃度勾配を確実に作り出すように、突然変異誘起剤を
培養基の表□面に配置する、特許請求の範囲第２〜４項
のうちのいずれか１項記載の方法。 - （６）用いる菌株かＩＦＰ９０３株（ＡＴＣＣ寄託番号
３９，０５７）である、特許請求の範囲第２〜５項のう
ちのいずれか１項記載の方法。 - （７） ブタノールおよびアセトンの混合物生産のた
めの醗酵剤として使用される突然変異体を創製する特許
請求の範囲第２〜６項のうちのいずれか１項記載の方法
。 - （８）、突然変異体がＩＦＰ９０４（ＡＴＣＣ受託番号
３９，０５８）である、特許請求の範囲第７項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8203980 | 1982-03-08 | ||
| FR8203980A FR2523153A1 (fr) | 1982-03-08 | 1982-03-08 | Obtention de mutants de clostridium acetobutylicum a haute productivite de butanol et d'acetone, mutants obtenus et utilisation de ces mutants pour la production conjointe de butanol et d'acetone |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58165786A true JPS58165786A (ja) | 1983-09-30 |
| JPH0526460B2 JPH0526460B2 (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=9271812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58038125A Granted JPS58165786A (ja) | 1982-03-08 | 1983-03-08 | クロストリジウム・アセトブチリカムのブタノールおよびアセトン高生産性突然変異体の創製方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4757010A (ja) |
| EP (1) | EP0088656B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58165786A (ja) |
| AT (1) | ATE16509T1 (ja) |
| DE (1) | DE3361193D1 (ja) |
| ES (1) | ES8401130A1 (ja) |
| FR (1) | FR2523153A1 (ja) |
| IN (1) | IN160986B (ja) |
| TR (1) | TR21410A (ja) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4737459A (en) * | 1984-09-18 | 1988-04-12 | Michigan Biotechnology Institute | Regulation and enhancement of enzyme production |
| US5192673A (en) * | 1990-04-30 | 1993-03-09 | Michigan Biotechnology Institute | Mutant strain of C. acetobutylicum and process for making butanol |
| JPH05244935A (ja) * | 1990-10-18 | 1993-09-24 | Intevep Sa | ラクトース又は未加水分解ホエーで培養するときキサンタンガムを生産する Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ 突然変異株 |
| US5210032A (en) * | 1992-01-21 | 1993-05-11 | Trustees Of The Boston University | Degeneration-resistant solventogenic clostridia |
| CA2289968C (en) | 1997-05-14 | 2004-01-06 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | A method of producing butanol using a mutant strain of clostridium beijerinckii |
| US20050089979A1 (en) * | 2003-09-18 | 2005-04-28 | Ezeji Thaddeus C. | Process for continuous solvent production |
| US7659104B2 (en) | 2006-05-05 | 2010-02-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation |
| US7541173B2 (en) * | 2006-06-15 | 2009-06-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation |
| US20100036174A1 (en) * | 2006-10-31 | 2010-02-11 | Lourina Madeleine Raamsdonk | Butanol production in a eukaryotic cell |
| US20090081715A1 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-26 | Cobalt Technologies, Inc., A Delaware Corporation | Engineered Light-Emitting Reporter Genes |
| KR20100095012A (ko) * | 2007-12-24 | 2010-08-27 | 리라이언스 라이프 사이언시스 프라이빗. 리미티드 | 고수율 바이오부탄올의 생산 방법 및 정량 |
| WO2009126795A2 (en) | 2008-04-09 | 2009-10-15 | Cobalt Technologies, Inc. | Immobilized product tolerant microorganisms |
| WO2010046928A2 (en) * | 2008-10-16 | 2010-04-29 | Praj Industries Limited | High energy biofuel composition and fermentation process for the production thereof |
| RU2405826C2 (ru) | 2008-12-29 | 2010-12-10 | Дэвон Инвестмент Лимитед | Способ получения органических растворителей, установка для его осуществления, продукт, полученный описанным способом |
| WO2010115054A2 (en) | 2009-04-01 | 2010-10-07 | Xylofuel, Llc | Process to produce organic compounds from synthesis gases |
| WO2010151706A1 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Cobalt Technologies, Inc. | Integrated system and process for bioproduct production |
| RU2458118C1 (ru) * | 2011-02-17 | 2012-08-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Штамм бактерий clostridium acetobutylicum - продуцент н-бутанола |
| RU2455350C1 (ru) * | 2011-03-05 | 2012-07-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ н-БУТАНОЛА |
| WO2013072919A1 (en) * | 2011-08-01 | 2013-05-23 | Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. | Butanol fermentation using acid pretreated biomass |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB278307A (en) * | 1926-10-01 | 1927-10-27 | Commercial Solvents Corp | Improvements in art of butyl-acetonic fermentation |
| GB1021721A (en) * | 1962-10-05 | 1966-03-09 | Cons Lab Inc | Improvements in or relating to the production of metabolites by micro-organisms |
| JPS5435288A (en) * | 1977-08-23 | 1979-03-15 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| US4352880A (en) * | 1979-09-17 | 1982-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Diffusion bioassay for the quantitative determination of mutagenicity |
-
1982
- 1982-03-08 FR FR8203980A patent/FR2523153A1/fr active Granted
-
1983
- 1983-02-18 DE DE8383400339T patent/DE3361193D1/de not_active Expired
- 1983-02-18 EP EP83400339A patent/EP0088656B1/fr not_active Expired
- 1983-02-18 AT AT83400339T patent/ATE16509T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-03-04 ES ES520294A patent/ES8401130A1/es not_active Expired
- 1983-03-08 IN IN282/CAL/83A patent/IN160986B/en unknown
- 1983-03-08 TR TR21410A patent/TR21410A/xx unknown
- 1983-03-08 JP JP58038125A patent/JPS58165786A/ja active Granted
-
1985
- 1985-12-19 US US06/810,841 patent/US4757010A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US4757010A (en) | 1988-07-12 |
| DE3361193D1 (en) | 1985-12-19 |
| EP0088656A1 (fr) | 1983-09-14 |
| FR2523153B1 (ja) | 1984-08-10 |
| ES520294A0 (es) | 1983-12-01 |
| ATE16509T1 (de) | 1985-11-15 |
| TR21410A (tr) | 1984-05-29 |
| IN160986B (ja) | 1987-08-29 |
| EP0088656B1 (fr) | 1985-11-13 |
| FR2523153A1 (fr) | 1983-09-16 |
| ES8401130A1 (es) | 1983-12-01 |
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