JPH02286083A - β―グルコシダーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規β−グルコシダーゼ及びその製造法に関す
る。β−グルコシダーゼは、安価なグルコース源となり
つるセルロースの中間加水分解物であるゼロオリゴ糖を
加水分解し、グルコースを生成する酵素であるが、本発
明ではこの用途に極めて適した性質を有するβ−グルコ
シダーゼを好熱性バチルス属に属する微生物を用いて製
造する。

［従来技術］ β−グルコシダーゼは他のセルラーゼと共にバイオマス
（セルロース資源）の酵素法による糖化を行なう酵素の
一つである。一連のセルロース分解酵素の中でβ−グル
コシダーゼは、セルロース分解の中間生成物であるセロ
オリゴ糖をグルコースに分解する最終ステップを担う重
要な酵素である。

ところで、セルロース性物質は強固な結晶構造をとり、
かつリグニン、ヘミセルロースなどとの複合体を形成し
ている。従って、そのままではセルラーゼが作用しにく
いためアルカリ処理等の前処理を行なう（特開昭５８−
９８０９３号など）、アルカリ前処理物は、セルラーゼ
の作用ｐ）Ｉ範囲に調整するため大量の水による洗浄を
行なうが、この洗浄水は排水処理の対象となり、できる
だけ減少させることが望ましい。

従りて、アルカリ性でも活性を有するβ−グルコシダー
ゼを含むセルラーゼをセルロースの糖化に使用すること
により排水量を減少でき産業上非常に有益である。

アルカリ性で活性を有するセルラーゼは以下のごとく開
発されている。アルカリセルラーゼＡ（特公昭５０−２
８５１５号）、アルカリセルラーゼ３０１Ａ（特開昭５
８−２２４６８６号）、ストレプトマイセス属の生産す
るセルラーゼ（特開昭６１−１９４８３号）、アルカリ
セルラーゼＫ（特開昭６３−１０９７７６号）などであ
る。これらはセルラーゼ活性の中でも長鎖のセルロース
をセロオリゴ糖に分解するＣＭＣａｓｅ。

Ａｖｉｃｅｌａｓｅ活性は高いがβ−グルコシダーゼ活
性は非常に低い、従って、セルロースを完全にグルコー
スにまで分解するにはアルカリ性で活性を有するβ−グ
ルコシダーゼが別途必要となる。

［発明が解決しようとする課Ｍ］ アルカリ性で活性を有するβ−グルコシダーゼにはムコ
ール属（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ａｈｅｉ　ＹＨ−１０）の生
産するβ−グルコシダーゼ（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｖ、。

４５、５７１〜５７７、（１９８１））がある。このβ
−グルコシダーゼは耐熱性がありアルカリ性でも活性を
有するが、酵素の給源が糸状菌であり、固体培養法を採
るため、特殊な装置を必要とし、製造法のスケールアッ
プが容易でない、また、微生物の培養に４〜５日という
長時間を要するなどの欠点がある。

その他のβ−グルコシダーゼでは、サーマス属（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ　ｓｐ、）の生産するβ−グルコシダーゼ（Ａ
ｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ、、２９．５５〜６０゜（１９８８））は耐熱性を有
し、培養に要する時間も短いが、アルカリ性での活性範
囲が不十分である。

そこで、１）アルカリ性で活性を有し、２）微生物の培
養及びスケールアップが容易で、３）短時間に生産でき
るβ−グルコシダーゼが望まれている。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上述の問題点を解決するべく鋭意検討を重
ね、多くの土壌より微生物を分離し、アルカリ性で活性
を有し、培養及びスケールアップが容易で、短時間に生
産できるβ−グルコシダーゼ生産菌株の検索を行なった
。その結果、好熱性バチルス属に属する微生物、バチル
ス・ステアロサーそフィラス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｌｆｕｓ）ＴＢ−６３６（以
下、ＴＢ−１３３６菌と称する）が目的とするβ−グル
コシダーゼを生産することを見いだし、かかる知見に基
づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明はセロオリゴ糖を加水分解しグルコー
スを生成する作用を有し、アルカリ性域で作用し、かつ
微生物の培養及びスケールアップが容易で、短時間に生
産できるβ−グルコシダーゼを提供するものであり、さ
らに好熱性バチルス属に属し、該β−グルコシダーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にβ
−グルコシダーゼを生成せしめ、これを採取することを
特徴とするβ−グルコシダーゼの製造法を提供するもの
である。

本発明に用いるβ−グルコシダーゼ生産菌としては好熱
性バチルス属に属し、上記したβ−グルコシダーゼを生
産しうる好熱性微生物であればよい。したがって、ＴＢ
−４３ｆｉ菌のほかに、その自然的または人為的変異株
ならびにこれら菌株の遺伝子を移された各種生物も本発
明のβ−グルコシダーゼ生産能を有するかぎり、本発明
に使用することができる。

次に、ＴＢ−１＋３６菌の菌学的性質を示す。なお、こ
の菌学的性質の検討には「微生物の分離と同定」（長谷
用武治編著、東京大学出版会）及び「微生物同定法」　
（衛生技術会）に記載されている方法、培地組成を用い
た。

［形態的所見］（５５℃、１８時間培！り１、細胞の形
状及び大きさ：　０．２５〜０．３μｍ　Ｘ　Ｏ，６Ｘ
１．Ｏｕｌの桿菌 ２、多形性：なし ３、運動性：なし ４、胞子：円筒形の内生胞子を細胞中央ないし先端に形
成する。胞子のうは膨れる。

５、ダラム染色：陽性 ６、抗酸性；なし ７、カプセル：なし ８、異染顆粒：なし ［生育状態］（５５℃、１８時間培養）１、肉汁寒天平
板培養 形状：円形 周縁：金縁ないしやや波状 隆起：扁平 光沢：あり 表面：平滑 色調：半透明 ２、肉汁寒天斜面培地 生育度：不良 形状：やや広がる ３、肉汁液体培地 表面生育：なし 濁度：透明 沈漬：微量 着色、脱色：なし ４、肉汁ゼラチン穿刺培！！（ゼラチンは３０％添加、
５５℃で適時培養後、冷却して同化状態を判定） 生育しない。

５、肉汁寒天穿刺培養 形状：表面生育のみ 表面生育：不良 ６、リドマスミルク リドマス退色なく、ｐＨ不変化、ミルクの凝固、液化な
し ［生理学的性質］（５５℃、１〜２日培養）１、硝酸塩
の還元の有無；なし ２、ＭＲテスト：陰性 ３、ＶＰテスト：陰性 ４、インドールの生成：なし ５、硫化水素の生成：なし ６、デンプンの加水分解；あり ７、クエン酸の利用：なし ８、アンモニウム塩の利用：ナシ ９、色素の生成：なし １０、オキシダーゼ活性；あり １１、カタラーゼ活性：あり １２、生育９Ｈ：５．５〜８．５、 至適ｐＨ範囲：５，５〜７．０ １３、生育温度：３３〜５５℃、 至適生育温度範囲；４２〜５５℃ １４１．嫌気性培地における発育性：なし１５、サブロ
ー・デキストロース寒天培地における発育性：なし １Ｂ、アジ化ナトリウム０．０２％含有培地、５５℃培
養下における発育性：なし １７、リゾチームｏ、ｏｏｔ％存在化における発育性（
４５℃で試験）：なし １Ｂ、フェニルアラニンの脱アミノ反応：なし１９、塩
化ナトリウムの耐性：２．５％で増殖するが、４．５％
では増殖せず。

２８、ビタミンの要求性の有無：あり ２１、チロシン分解性；なし ［炭素源の利用性］ フラクトース、Ｄ−グルコース、イノシトール、Ｄ−キ
シロース、アラビノース、シュークロース、Ｄ−ガラク
トース、Ｄ−マンニトールを資化して増殖し、酸を生成
する。

以上の微生物の蘭学的諸性質から、パージエイズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（
Ｂｅｒ３ｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（１９８４）の
分類方法にしたがって検索すると、前記ＴＢ−６３６菌
はバチルス・ステアロサーモフィラスと大略一致したが
、運動性がない点、ゼラチンを分解しない点で公知菌株
と異なっていた。更に、標準菌株バチルス・ステアロサ
ーモフィラス！＾Ｍ　１１００１．１１００２．１１０
０３．１１００４゜１２８４３　　（東京大学応用微生
物研究所保管味）はいずれも後述の培養方法でβ−グル
コシダーゼを生産しなかつた。

以上の事項から明らかな通り、ＴＢ−６３６菌は公知の
菌株と区別されるため、これを新菌株として設定するこ
とが適当であると結論された。

ＴＢ−６３８菌は工業技術院微生物工業技術研究所に徴
工研菌寄第１０５２３号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５２３）
として寄託されている。

本発明のβ−グルコシダーゼ生産能を有する微生物を栄
養培地に培養し、培養物中に該β−グルコシダーゼを生
成せしめ、これを採取することによって目的とするβ−
グルコシダーゼが得られる。

本発明に使用する栄養培地としては、炭素源。

窒素源、無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微
量栄養素を程よく含有するものであれば天然及び合成培
地のいずれでもよい。

炭素源としては通常微生物培養に用いられる糖、例えば
デンプン、マルトース、シュークロース、グルコースな
どを使用できるが、β−グルコシド結合を有する糖、す
なわち、セロビオースなどのセロオリゴ糖、ラミナリボ
ース、ラミナリン、サリシンなどを主炭素源として用い
ることにより本酵素をより効果的に話導生産することが
できる。

炭素源以外の成分はペプトン、肉エキス、酵母エキス、
麦芽エキス、大豆蛋白加水分解物、綿実粕などの有機窒
素化合物、さらにはビタミンなどの微量栄養物等を適宜
含む培地を用いればよい。

培養法としては固体培養、液体培養のいずれでも可能で
あるが、工業的には通気攪拌培養がもっとも適している
。

培養は３３〜５５℃の範囲で行なうことができるが、４
２〜５５℃の範囲が好適である。ｐＨは中性ないし弱酸
性が望ましい。

酵素の生成は条件によって変わってくるが、通常は４時
間から２４時間であり、β−グルコシダーゼの生成が確
認されたとき、好ましくは生成が最大に達したときに培
養を停止する。

培養物中からのβ−グルコシダーゼの採取は適宜既知の
方法を組み合わせて実施すればよい０例えば培養終了後
、培養物中から菌体を遠心分離などにより分離する。そ
して、菌体外のβ−グルコシダーゼを取得する場合は、
先の遠心上澄液をそのまま使用すればよく、菌体内のβ
−グルコシダーゼを取得する場合は、先の遠心分離した
菌体から適当な手段でβ−グルコシダーゼを抽出し、さ
らに遠心分離などによってこの抽出液を処理して不溶性
成分を除去した清澄液を使用すればよい。

得られた酵素溶液は塩析、透析、さらには各種クロマト
グラフィー（イオン交換法、ゲル濾過法、疎水クロマト
法など）によって精製し、かくて純度の極めて高いβ−
グルコシダーゼを取得することができる。

次に、本発明のβ−グルコシダーゼの性質を示す、なお
、標品としては後記実施例１で得られた酵素を使用した
。

β−グルコシダーゼ活性は、　　０．５Ｍ　　グリシン
−ＮａｏｈＭｉｉＥ液（ｐＨ８，０）、５ｍＭ　　ｐ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドと酵素を含む全容
２Ｗ＋１を３７℃テ１５分間反応させて、２　ｍｊノ０
．２　Ｍ　Ｎａ２Ｃｏ。

を加えて反応を停止し、生成したｐ−ニトロフェノール
量を４０ｏｎＩ１１での吸光度により求めた。この条件
で１分間あたり１μ履０！のｐ−ニトロフェノールを生
成させる酵素量を１　ｕｎｉｔとした。

（１）作用及び基質特異性 ｕｎｉｔの当該酵素標品および０．５Ｍグリシン−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０）を含む全容積２ｍ１ｌの反応
液を３７℃で１時間反応させ、生成したグルコースをグ
ルコースオキシダーゼを用いた比色定量法で測定するこ
とによって求めた。表中の数字はＰ−ニトロフェニル−
β−グルコシドを基質としたときの活性を１００として
各基質の相対活性で表示した。

表から明らかなように、本酵素はβ−１，４結合を有す
るセロオリゴ環及びβ−１，３結合を有するラミナリボ
ースによく作用するが、β−１，６結合を有するゲンチ
オビオースには作用しない。

（２）至適ｐＨ 本発明の酵素標品を第１図に示した各ｆｉｐＨの緩？ｌ
ｉ液に０．１６ｍ　ｕｎｉｔ／ｍｉ）となるよう溶解し
て反応させた。基質に５ｎ＋Ｍｐ−二トロフェニルーβ
−Ｄ−グルコシドを用い、相対活性は３７℃で１５分間
反広径生成したｐ−ニトロフェノール量を４００ｎｍに
おける吸光度を測定して求めた。用いた緩衝液はｐｌ（
４〜６．５は０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ７〜ｌＯはグリ
シン−ＮａＯＨ緩衝液である。

本酵素の最大活性を示すｐＨでの活性を１００とし、・
各ｐ）Ｉにおける相対活性を第１図に示す。図から明ら
かなように、本発明の酵素標品は作用ｐＨ範囲が広く、
ｐｌ１５〜８で殆ど１００％の活性を示した。

（３）安定ｐＨ 本発明の酵素標品を第２図に示す種々のｐＨの１１衝液
に溶解し３７℃″ｔ”を時間保持した。次いで、５＋ｓ
Ｍｐ−二トロフェニルーβ−Ｄ−グルコシド、０．５Ｍ
　グリシン−１ｔａＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０）となるよ
う酵素溶液を加えて反応液を調製し酵素活性を測定した
。試験開始時（すなわち無処理）の活性を１００とした
場合の各ｐＨ処理における残存活性を第２図に示す。

本酵素はｐＨ５〜ｌＯの間で活性を完全に維持した。

（４）至適温度 本発明の酵素標品０．３２ｍ　ｕｎｉｔを５ｍＭ　　ｐ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドを含む０．５Ｍ
グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８，０）　２　ｍＲに
添加し、第３図に示した温度範囲で反応させた。最大活
性を示す温度での活性を１００とし、各温度における相
対活性を第３図に示す。

本酵素の至適温度は５５℃付近であることが判明した。

（５）熱安定性 酵素標品０．３２ｍ　ｕｎｌｔを０，５Ｍ　グリシン−
ＮａＯＨＡＩ　？ｉ液（ｐＨ８，０）　２　ｍＡ’に溶
解し、第４図に示す温度範囲で１時間あるいは２４時間
保持した後、３７℃として残存活性を測定した。

無処理の酵素活性を１００として、各温度における相対
活性を第４図に示す。

本酵素は２４時間３７℃で保持した場合全く失活せず、
１時間５０℃で保持した場合でも１００％活性を維持し
た。

（６）金属の影響 １　ｆｌＩＭのＦｅ”、　Ｆｅ”、　Ｐｂ”は若干の阻
害効果を与え、ｌｌ１１ＭのＨｇ　３　＊で完全に阻害
された。

（７）分子量 ゲル濾過法による本酵素の分子量は約７４，０００であ
る。

本発明のβ−グルコシダーゼはアルカリ性側でも活性を
有するものであるが、固体培養によってムコール属（＾
ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、、　４５．５７１
〜５７７　、　（１９８１））から生産されるアルカリ
性に至適ｐＨを有するβ−グルコシダーゼは分子量が２
２８，０００付近である点で本発明の酵素と異なる。

また、高度好熱菌のサーマス属（Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏ
−ｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、ｕ、　５５〜
６０．　（１９８８））の生産するβ−グルコシダーゼ
は至適作用温度が８０〜８５℃であり、ｐＦ１８．０で
の残存活性が約６０％である点で本発明のβ−グルコシ
ダーゼとは異なる。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例！ セロビオース０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス
０．５％　、　ＫＨ２ＰＯ４０，３％、　Ｍ＊ＨＰＯ４
０，１％。

ＭｇＳＯ４０，０２％及び水道水からなる培地３ｆｔを
ＳｊＬ容のジャー・ファーメンタ−に入れ、常法により
殺菌後ｐＨを６．０に調整し、バチルス・ステアロサー
モフィラスＴＢ−６３６（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５２３）
菌を種菌として接種して、５０℃、　５００ｒｐｍ、通
気量１１ｔ／Ｒの条件で１５時間の通気攪拌培養を行な
った。

培養終了後、遠心分離により菌体を除去した上溝液につ
いてβ−グルコシダーゼ活性を測定した結果、約１　ｕ
ｎｉｔ／ｍｊ！であった。

この上清液に８０％飽和となるように硫安を徐々に加え
て塩析を行ない、遠心分離により少量の沈殿物を得た。

この沈殿物を１．５　Ｍ硫安を含む２８ｍＭのＴｒｉｓ
−ＨＣＲ（ｐＨ７，０）１１ｍ液に再溶解し、ついで同
緩衝液によりあらかじめ平衡化したＰｈｅｎｙｌＴｏｙ
ｏｐｅａｒｌのカラムに添加した。引き続き同緩衝液と
硫安を含まない緩衝液とを用いてグラジェント溶出を行
ない、β−グルコシダーゼ活性画分を集めた。この活性
画分を常法に従い透析し、さらに１０ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣ１’緩衝液（ｐｌ（８，０）により平衡化したＤ
ＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌのカラムに添加し、同１！
ｆｆｉ液とＩＭのＮａＣｊ！を含む同緩衝液とを用いグ
ラジェント溶出を行ない、溶出液を分画しβ−グルコシ
ダーゼ活性画分を集めた。そして、　０．２Ｍ　　Ｎａ
Ｃｊを含む１０！ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ２ｉｌｌ衝液（
ｐＨ８，０）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ　ＨＷ−
５５５ｕｐｅｒｆｉｎｅのカラムに先の活性画分を添加
してゲル濾過クロマトグラフィーを行ない、活性画分を
集めて精製標品を得た。この精製標品は電気泳動的に単
一物として確認され、前記した酵素活性測定法により測
定したところ３．６ｕｎｉｔ／Ｂ　（蛋白）という結果
が得られた。なお、蛋白量はＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ、
　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、。

１９３、２６５（１９５１））を用いて測定した。精製
酵素の収率は培養上溝中の全酵素活性を１００とすると
１３％であった。

［発明の効果］ 本発明のβ−グルコシダーゼは［）８５〜８に至適ｐ）
Ｉを有するのでアルカリ性側でも良好に作用し、好熱性
微生物に由来するため安定性にすぐれるなどの性質を有
している。また、本酵素の給源が好気性好熱性細菌であ
ることより通気攪拌培養の一つである深部液体培養を採
用することができ、製造法のスケールアップが容易で短
時間で効率良く製造できる。

したがって、本発明のβ−グルコシダーゼは各種工業用
途等に有用であり、例えばアルカリ前処理を行なったセ
ルロース物質の酵素的糖化に有効に利用できるものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のβ−グルコシダーゼの至適ｐＨを、第
２図は該β−グルコシダーゼの安定ｐＨ範囲を、 第３図は該β−グルコシダーゼの作用至適温度を、 第４図は該β−グルコシダーゼの安定温度範囲をそれぞ
れ示すものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の理化学的性質を有するβ−グルコシダーゼ。 １）作用 ゼロオリゴ糖を加水分解しグルコースを生成する。 ２）作用ｐＨ及び作用至適ｐＨ 作用ｐＨは３．５〜１０、作用至適ｐＨは５〜８である
   。 ３）安定ｐＨ ３７℃で一時間放置したときの安定ｐＨは５〜１０であ
   る。 ４）作用温度範囲及び作用至適温度 ２８〜８０℃の広い温度範囲で作用し、５５℃付近に作
   用至適温度を有する。 ５）熱安定性 ２４時間３７℃で保持した場合全く失活せず、１時間５
   ０℃で保持した場合でも失活しない。 ６）分子量（ゲル濾過法） 約７４，０００
2. （２）好熱性バチルス属に属し請求項１記載の酵素的性
   質を有するβ−グルコシダーゼを生産する能力のある微
   生物を栄養培地に培養し、培養物中に該β−グルコシダ
   ーゼを生成せしめ、これを採取することを特徴とするβ
   −グルコシダーゼの製造法。
3. （３）好熱性バチルス属に属するβ−グルコシダーゼ生
   産能を有する微生物がバチルス・ステアロサーモフィラ
   スＴＢ−６３６（ＦＥＲＭＰ−１０５２３）である請求
   項２記載の方法。