RU2001103C1 - Штамм бактерий BACILLUS LICHENIFORMIS - продуцент термостабильных амилолитических ферментов - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи  различные отрасли народного хоз йства в р де производств, где примен ютс  амилолитические ферменты, а именно в спиртовом, крахмало-паточном, пивоваренном, текстильном производствах где требуютс  ферменты , устойчивые к повышенным температурам. Сущность изобретени : штамм бактерий Bacillus lichenrformis ВКПМ В-2986 выделен из естественной почвенной ассоциации, продуцирует в определенных услови х не менее трех термостабильных амилолитических ферментов, активных при диапазоне значений рН 5,0 - 10,0, активен при 30 - 100° С с максимальной активностью ферментов в культуральной жидкости при 90 - 95° С термостабилен при 90°С в водных растворах рН 6,0 - 8,5 в течение 40 мин. Активность а-амилазы 1,78 ед/мл/мин. пуллуланазы 0,68 ед/мл/мин, а-глю- козидазы 3.49 ед/мл/мин. 4 табл.

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к производству амилолитических ферментов при помощи микробиологического синтеза.

Амилолитические ферменты наход т широкое применение в различных област х народного хоз йства и используютс  в больших количествах дл  разжижени  и/или превращени  крахмала и крахмалосодер- жащего растительного сырь  в такие продукты , как и мальтодекстрины, сахарные сиропы, декстрозу, мальтозу и глюкозу. Особенности технологических процессов в р де производств, где примен ютс  амилолити- ческие ферменты, а именно в спиртовом, крахмало-паточном, пивоваренном, текстильном производствах, требуют использовани  ферментных препаратов, устойчивых к повышенным температурам. При ферментативной конверсии крахмала в глюкозу, мальтозу, фруктозу дл  целей пищевой промышленности обычно требуетс  несколько ферментов: альфа- и бета-амилаза , гидролизующие альфа-1,4-глюкозидные св зи с образованием мальтозы и олиго- мальтодекстринов: глюкоамилаза, расщепл юща  альфа-1,4- и, с меньшей скоростью. альфа-1,6-глюкозидные св зи с образованием глюкозы; альфа- 1,4-глюкозидаза (маль- таза), разрывающа  альфа-1,4-св зь в молекуле мальтозы.

Глубокий гидролиз крахмала также необходим в спиртовой крахмало-паточной и текстильной промышленности. Дл  достижени  этой цели обычно используют вначале альфа-амилазу (при температуре 70-80°С и рН 6,0-6,5), затем раствор охлаждают, подкисл ют и добавл ют другой фермент - глюкоамилазу или бета-амилазу. При этом в молекуле крахмала часть глюкозидных св зей (альфа-1,6-св зи) остаютс  недоступными действию этих ферментов. Непродуктивные энергетические затраты (при снижении температуры гидролизуемо- го материала), а также значительное увеличение концентрации ионов (при изменении рН), затрудн ющие очистку конечного продукта , представл ют собой существенные недостатки такого процесса амилолиза. Избежать этих двух недостатков можно при использовании комплексов амилолитических ферментов различной специфичности (естественных или созданных искусственно ), работающих в одинаковых физико-химических услови х. Дл  более полной конверсии сырь  весьма важно, чтобы в таких препаратах содержалс  также фермент, способный к гидролизу альфа-1,6-глюкозид- ных св зей в молекуле крахмала и мальтоо- лигодекстринов, а именно один из

деветв щих ферментов (пуллуланаза или изоамилаза).

При промышленном использовании амилолитических ферментов необходимы

5 ферменты термостабильные, так как проведение процесса разваривани  и гидролиза крахмала в режиме 80-100°С  вл етс  предпочтительным , а также полезным с точки зрени  уменьшени  времени реакции и снижени  опасности микробного загр знени . Дл  подавл ющего большинства продуцентов амилолитических ферментов характерен предпочтительный биосинтез одного из ферментов. Способность к образованию

5 комплекса внеклеточных амилолитических ферментов, особенно термостабильных, обнаруживаетс  очень редко. В этой св зи можно назвать р д термофильных анаэробов из рода Clostrldlum. Так, штамм CI.

0 thermonydrosulfurlcum. Другой синтезирует термостабильную пуллуланазу и глюкоамилазу 1. Несколько анаэробных термофилов из рода Clostrldlum осуществл ет биосинтез амилазы и пуллуланазы 2,3, либо аль5 фа-амилазы и глюкоамилазы активных при высокой температуре 4.

Наиболее близким к за вл емому  вл етс штаммClostrldlum thermohydrosulfuricum E 101-69 5, образу0 ющий комплекс амилолитических ферментов при росте на полусинтетической среде следующего состава, г/л: крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; триптон 10; м сной экстракт 3; КН2РСм 6,8; К2НРСМ ЗНаО 11,4;

5 FeSCM7H200,1;CaCl22H200,1;BDHO,001. Комплекс содержит альфа-амилазу, поллу- ланазу и альфа-глюкозидазу, при совместном действии которых амилоза и пуллулан расщепл ютс  до глюкозы.

0 Недостатком способа получени  препарата амилолитических ферментов из термофильного клостриди   вл етс  прежде всего то, что дл  использовани  в СССР этот штамм недоступен. Сложности культивиро5 вани  анаэробов в заводских услови х делают этот микроорганизм практически непригодным в качестве промышленного продуцента.

Устранение этих недостатков и упроще0 ние способа получени  термостабильных амилолитических ферментов достигаетс  путем использовани  отечественного продуцента - аэробной споровой палочки из рода Bacillus вид B.llchenlformls, предпоч5 тительно ВКПМ В--2986.

За вл емый штамм Bacillus llchenlformls ВКПМ В-2986 продуцирует в определенных услови х не менее трех термостабильных амилолитических ферментов,

активных при одних и тех же значени х рН

активных при одних и тех же значени х рН и температуры, что позвол ет рассматривать этот штамм как продуцент ферментов, составл ющих естественный комплекс, перспективный дл  одновременной обработки крахмала или крахмалосодержащего сырь  с целью его глубокого гидролиза.

Штамм ВКПМ В-2986 выделен из естественной почвенной ассоциации, воздействию мутагенных факторов не подвергалс . Микроорганизм непатогенен, а культураль- на  жидкость, полученна  при глубинном культивировании штамма, нетоксична.

Морфологи : микроорганизм, предлагаемый в качестве продуцента термостабильных амилолитических ферментов, имеет вид одиночных палочек размером 0, х 2,0-3,0 мк, редко встречаютс  короткие цепочки; клетки подвижные, окраска по Грамму положительна ; у 23-24-часу роста в жидких средах по в- л ютс  споры, имеющие центральное положение и овальную форму.

При росте на агаризованных органических средах штамм дает обильный рост, колонии непрозрачные, шероховатые, врастают в агар. Стара  агарова  культура имеет коричневатый оттенок.

При культивировании в м со-пептонном бульоне наблюдаетс  обильный рост клеток, раствор становитс  мутным, к 16-18-часу роста по вл етс  красновато-коричневый оттенок.

Выращивание культуры на агаризованных средах, содержащих казеин или микробные клетки, сопровождаетс  обильным ростом и образованием зон гидролиза вокруг колоний.

Культуральные и биохимические свойства: штамм ВКПМ В-2986 растет при 18- 36°С (температурный оптимум 45°С) при значени х рН среды 5,0-9,5 (оптимальное значение рН 6,5-7.5) в аэробных услови х. Микроорганизм способен расти на средах, содержащих 7% NaCI.

Культура предлагаемого микроорганизма сбраживает с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, раффинозу маннозу, маннит, сорбит, глицерин, декстрин, гликоген без выделени  газа, глюкозу ферментирует анаэробно; восстанавливает нитраты до нитритов, образует тирозиназу, катала- зоположительный. образует сероводород, утилизирует лимонную кислоту, восстанавливает лакмусовое молоко, разжижает желатин , вызывает гемолиз, быстро гидролизует казеин и крахмал. Штамм способен расти на средах с аммонийными сол ми в качестве единственного источника азота, а также на среде, содержащей в качестве источника углеродного и азотного питани  дрожжевые клетки (прессованные

пекарские дрожжи или БВК). На основании указанных свойств в соответствии с определителем Берги штамм идентифицирован как Bacillus licheniformis.

Штамм хранитс  в течение 19 лет при

4°С на кос ках с агаризованной средой следующего состава, г/л: сухие пекарские дрожжи 20; КН2Р04 2; MgSCM 7 Н20 1; вода водопроводна  до 1 л. Пересев культуры

0 осуществл етс  не реже одного раза в два мес ца.

Энгимологи : штамм В.licheniformis ВКПМ В-2986 при росте на среде известного состава синтезирует широкий набор вне5 клеточных ферментов, в том числе амилолитические. Дл  роста культуры и биосинтеза амилолитических ферментов источником углерода могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, мальтоза, кукурузна  и друга  зернова  мука или их экстракты , дрожжевые клетки. Источником азота служат гептон, дрожжевой экстракт, м сной экстракт, дрожжевые клетки, мочевина , аммонийный азот. Синтезированные

5 штаммом амилолитические ферменты про вл ют альфа-амилазную, пуллуланазную и альфа-глюкозидазную активности, гидроли- зу  разветвленные и линейные альфа-глю- каны.

0Комплекс амилолитических ферментов

характеризуетс  следующими свойствами: способен гидролизовать крахмал, растворимый крахмал, амилопектин, гликоген, пуллулан, амилозу, а также расщепл ть син5 тетический хромогенный субстрат-п-нптро- фенил-альфа-О-глюкопиранозид;

благодар  наличию деветв щей активности (пуллуланазной) осуществл ет разрыв не только альфа-1,4-, но и альфа-1,6-глюко0 зидных св зей в молекуле крахмала и декстринов с образованием количества глюкозы и низкомолекул рных мальтоолч- госахаридов;

активен в диапазоне значений рН 5,05 10,0 с двум  заметными пиками активности (при рН 6,0 и рН 8,5);

активен при 30-100°С с максимальной активностью ферментов в виде культураль0 ной жидкости при 90-95°С; термостабилен, а именно способен сохран ть без изменений активность при 90°С в водных растворах (рН 6,0-8.5) в течение 40 мин, в присутствии ионов кальци (0,001 М)2 ч; при

5 температуре 100°С в присутствии ионов кальци  (0,01 М) активность не мен етс  в течение 20 мин.

Таким образом, штамм ВКПМ В-2986 осуществл ет биосинтез термостабильных

щг-лочестойких амилолитических ферментов , активных в одних и тех же физико-хими- ческих услови х, что позвол ет рекомендовать этот штамм в качестве продуцента ферментов, составл ющих естественный амилолитический комплекс.

Способ получени  термостабильных амилолитических ферментов с помощью за вл емого штамма состоит из двух стадий.

Стади  1. Выращивание инокулюма. Получение посевного материала (инокулюма ) осуществл ли на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: сухие пекарские дрожжи 20; КН2РСм 2; MgSCM 7 Н20 1; вода водопроводна  до 1 л. Среду стерилизовали в течение 20 мин при 0,75 атм. Материал дл  засева колб получали путем смыва культуры B.lichenlformls ВКПМ В-2986, хран щейс  на скошенной агаризованной среде того же состава, как указано ранее. Культивирование проводили р колбах объемом 500 мл, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке (220 об/мин) при 45°С в течение 18-20 ч.

Стади  2. Биосинтез амилолитических ферментов. В 0,5-литровые колбы, содержащие определенный обьем среды известного состава, вносили инокулюм в количестве 3- 5% к объему среды и вели культивирование на качалке (220 об/мин) при определенной температуре в течение 72-168 ч. Начина  с 24 ч роста культуры каждые 24 ч отбирали пробы и определ ли в культуральной жидкости способность гидролизовать крахмал, амилопектин, амилозу, гликоген, пуллулан и пар ч-ни1 .лзфенил-альфа-О-глюкопираноз ид(ПНФГ), т.е. активность р да ферментов превращени  крахмала.

Активность культуральной жидкости или ее фильтрата по отношению к естественным субстратам определ ли по увеличению количества редуцирующих Сахаров (стандарт - глюкоза) в инкубационной смеси , содержащей исследуемый материал (0,1 мл), субстрат (0,1 мл 1%-ного раствора) и 0,05 М Трис-НСЬбуфер рН 8.5 до общего объема 2 мл. Реакцию проводили в течение 10 мин при 90°С. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое обусловливало образование 1 мкмол глюкозы в услови х опыта за 1 мин.

Редуцирующие сахара определ ли по методу Нельсона-Шомоди.

Активность альфа-глюкозидэзы (маль- тазы)определ ли по способности гидролизовать хромогенный субстрат пзра-нитрофенил-альфа-О-глюкопираноз ид о реакционной смеси, содержащей 0,1 мл исследуемого материала. 0,1 мл 0,1%-ного раствора субстрата и 0,1 мл 0,05 М ТрисHCI-буфера рН 8,5. Реакцию останавливали, прилива  2 мл 1 М Ма2СОз. За единицу активности принимали такое количество фермента , которое обусловливало образование

одного мкмол пара-нитрофенола за 1 мин в услови х опыта. О количестве отщепленного пара-нитрофенола судили по интенсивности развившейс  окраски, учитываемой при 410 нм.

0 Использование за вл емого штамма В.licheniformis ВКПМ В-2986 в качестве продуцента комплекса термостабильных амилолитических ферментов может быть проиллюстрирован следующими примера5 ми.

П р и м е р 1. Выращивание инокулюма осуществл ли по способу, описанному ранее . Дл  биосинтеза амилолитических ферментов штаммом ВКПМ В-2986 в качестве

0 ферментационной использовали среду следующего состава, г/л: крахмал растворимый 40; сухие пекарские дрожжи 30; КНаРСм 4; MgS04 7 Н20 2; СаЗСм 2,5; вода водопроводна  до 1 л. Среду стерилизовали 20 мин при

5 0,5 атм. Простерилизованную среду засевали инокулюмом в количестве 5% к ее объему и инкубировали в течение 120 ч при 42°С на качалке. Каждые 24 ч определ ли активность амилолитических ферментов в культу0 ральной жидкости. Полученные данные представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Выращивание инокулюма осуществл ли по способу, описанному ранее . В качестве ферментационной исполь5 зовали среду следующего состава, г/л: кукурузна  мука 120; кукурузный экстракт 20; (NN4)280/1 3; мочевина 4,5; мел 5; рН 7,2-7,4. Среду обрабатывали коммерческим препаратом альфа-амилаза (0,5 ед/г крах0 мала, исход  из того, что в муке содержитс  72% крахмала) при 50°С в течение 1 ч, а затем среду стерилизовали обычным способом .

Стерильную среду засевали 5% иноку5 люма и инкубировали на качалке в 0,5-литровых колбах, содержащих 50 мл среды, при 42° в течение 7 сут, отбира  пробы дл  определени  активности каждые 24 ч (начина  с 48 ч роста). Результаты представлены в

0 табл. 2.

П р и м е р 3. Выращивание инокулюма проводили в жидкой среде, как указано ранее . Ферментационные колбы объемом 0,5 л содержали по 0,1 л среды следующего

5 состава, г/л: крахмал растворимый 40; сухие пекарские дрожжи 20; КН2РСМ 2; МдЗСм v7H2U 1: СаЗСм 5; вода водопроводна  до 1 л. Простерилизованную среду засевали инокулюмом в количестве 3% к ее объему и инкубировали в течение 96 ч при 28, 37, 42,

46 и 54°С на качалке. Через каждые 24 ч отбирали пробы и определ ли активность ферментов превращени  крахмала в фильтрате культуральной жидкости. Максимальные значени  амилолитической активности культуры, выращиваемой при различной температуре, представлены в табл. 3.

Таким образом, за вл емый штамм B.lichenifoirmis ВКПМ В-2986 при культивировании на питательных средах известного состава осуществл ет биосинтез не менее 3 аминолитических ферментов, про вл ющих альфа-амилазную, пуллуланазную и альфа- глюкозидазную активности при одних и тех же значени х рН и температуры и демонстрирующих высокую термостабильность. При этом альфа-амилазна  и альфа-глюко- зидазна  активности за вл емого штамма были заметно выше таковых прототипа - штамма Clostridium thermohydrosulfuricum Е 101-39 (9). В табл. 4 приведены сравни0

тельные данные по амилолитической активности (максимальные значени ) за вл емого штамма и штамма-прототипа при глубинном культивировании в оптимальных дл  каждого из них услови х.

За вл емый штамм в большей степени пригоден дл  промышленного использовани , нежели штамм-прототип, так как он культивируетс  в аэробных услови х и на среде простого состава,

(56) LAppl. Environ. Mlcroblol.-1985.-49.- Р.1168-1173.

2.Agr.Blol. Chem.-1976.-40.-Р. 1515- 1522.

3.Appl. Microbiol. Blotechnol.-1987.27- Р.192-1988.

4.Патент Великобритании № 2145094, кл. С 12 N9/34, 1985.

5. J.Gen. Microbiol. 1987, 133, p. 883- 890.

Таблица 1

Динамика амилолитической активности штамма B.lichenlformls ВКПМ В-2986 в услови х

примера 1

- не определ ли (здесь и в последующих таблицах)

Таблица 2

Динамика амилолитической активности штамма B.llchenlformls ВКПМ В-2986 в услови х примера 2

Вли ние температуры выращивани  на амилолитическую активность штамма

B.licheniformis ВКПМ В-2986

Таблица 4

Сравнение активности ферментов превращени  крахмала штаммов B.llchenlformls ВКПМ

В-2986 и Cl.thermohydrosulfurlcum E 101-39

Таблица 3

Примечание. единицы активности прототипа (9) приведены в соответствие с использованными в насто щей разработке (мкмол глюкозы в мин на мл культуральной жидкости );

- мальтазна  активность прототипа (9) выражена через активность по ПНШГ в соответствии с единицами, указанными в каталоге фирмы Sigma Blochemlcals Organic Compounds... 1991, P.639, M. 3145.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АМИЛОЛИТИЧЕ- СКИХ ФЕРМЕНТОВ

   Продолжение табл. 4

   5 Штамм бактерий Bacillus llchenlformls ВКПМ В-2986-продуцент термостабильных амилолитических ферментов,