RU2244741C1 - Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков - Google Patents
Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков Download PDFInfo
- Publication number
- RU2244741C1 RU2244741C1 RU2003118988/13A RU2003118988A RU2244741C1 RU 2244741 C1 RU2244741 C1 RU 2244741C1 RU 2003118988/13 A RU2003118988/13 A RU 2003118988/13A RU 2003118988 A RU2003118988 A RU 2003118988A RU 2244741 C1 RU2244741 C1 RU 2244741C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- activity
- protheolytic
- trichophyton
- structural protein
- collagenase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в различных областях промышленности. Способ получения протеолитического препарата включает культивирование штамма-продуцента из числа грибов-дерматофитов видов Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Microsporum canis, Microsporum gypseum. Пригодными являются штаммы грибов, обладающие способностью продуцировать комплекс протеаз структурных белков (склеропротеаз) с общей протеолитической активностью не менее 0,7 Е/мг, в т.ч. коллагеназу 0,1-4,5 Е/мг; кератиназу 0,1-0,5 Е/мг; эластазу 0,5-1,9 Е/мг. Для культивирования используют простые среды, например сусло-агар или сусло-бульон. Продолжительность культивирования 20-24 сут. Изобретение обеспечивает увеличение специфической активности комплекса протеаз структурных белков (склеропротеаз) с увеличением скорости и глубины протеолитического расщепления специфических субстратов (склеропротеинов). 2 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков: коллагена, кератина, эластина. Структурные белки - фибриллярные протеины, склеропротеины - наиболее устойчивы к действию физико-химических факторов и не подвергаются протеолизу пищеварительными ферментами человека и животных. Протеазы структурных белков в отличие от других протеолитических ферментов способны гидролизовать эти белки, характеризующиеся своеобразным составом на уровне первичной структуры, прочными молекулярными и надмолекулярными связями вторичной, третичной и четвертичной структур.
Известны протеазы микробиологического происхождения, позволяющие расщеплять коллаген и кератин, в частности, из микромицетов родов Aspergillus, Penicillium, Keratinomyces; актиномицетов (А. albus, A. griseus), стрептомицетов (S. fraidiospirallis, S. griseus, S. fulvoviridis), бактерий Pseudomonas, Clostridium histolyticum, и др. (1). Известны также коллагеназы грибов Trichophyton schoenleinii, кератиназы Microsporum canis и других дерматофитов (2, 3). Эластазная активность установлена у Trichophyton verrucosum, Microsporum gypseum (4). Однако при наличии относительно широкого спектра потенциальных продуцентов указанных ферментов последние различаются способом воздействия на расщепляемые белки, разной скоростью и продуктивностью реакции с образованием разных комплексов конечных продуктов.
Несмотря на востребованность в разных областях промышленности протеолитических ферментных препаратов, гидролизующих структурные белки, способы их выделения не нашли широкого применения.
В настоящее время с этой целью используют способ получения коллагеназы из краба (5). Способ имеет ограниченные возможности для промышленного производства, а получаемый этим способом фермент дефицитен и дорог.
Известен способ получения протеолитических ферментов для обработки кожевенного сырья, использующий в качестве продуцента Streptomyces lavandulae ВКПМ S-910. Протеолитическая активность культуральной жидкости составляет 40-90 ПЕ/мл по Кунитцу и 3,7-8,7 Е/мл по Ансону, причем коллагеназная активность с нингидрином составляет 4-6 Е/мл, а кератиназная - 0,8-2,0 Е/мл (6).
К недостатку способа следует отнести недостаточно широкую специфичность продуцируемого комплекса в отношении структурных протеинов, а также наличие питательной среды, содержащей пищевой компонент.
Задачей изобретения является изыскание микроорганизмов - продуцентов экзоферментного протеолитического комплекса, имеющего высокую коллагеназную, а также явно выраженную кератиназную и эластазную активности с целью создания препарата, гидролизующего структурные белки.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в увеличении количества протеаз, способствующих гидролизу структурных белков и специфической активности комплекса протеаз структурных белков (склеропротеаз) в культуральной жидкости или поверхностной культуре. При этом достигается оптимизация состава конечного продукта за счет уменьшения содержания балластных белков и его удешевление за счет использования среды простого состава (сусло-агара, сусло-бульона).
Поставленная задача решается путем использования продуцента протеаз структурных белков (склеропротеаз) из числа грибов-дерматофитов. Посевную дозу гриба вносят в жидкую или на плотную питательную среду, культивируют более 20 суток при 28°С, после чего биомассу гриба (мицелий и микроконидии) удаляют. Оставшуюся культуральную жидкость подвергают стерилизующей фильтрации, высушивают лиофильно или предварительно дополнительно очищают традиционными методами и высушивают очищенный продукт. При поверхностном культивировании - с использованием плотной питательной среды - биомассу гриба снимают с поверхности, а оставшуюся агаровую матрицу экстрагируют водой или слабым солевым раствором путем встряхивания с несколькими порциями экстрагента. Полученные экстракты объединяют и также высушивают. Получают протеолитический препарат со степенью очистки Г3х.
Для определения ферментативной активности лиофильно сухих препаратов (Г3х) использовали следующие методы. Определение коллагеназной активности препаратов ферментов проводили с препаратом “азоколл” (изготовитель Calbiochem), кератиназной активности - с препаратом “кератин-азур” (Sigma), эластазной активности - “конго-рот эластин” (Sigma). Для проведения ферментативной реакции берут по 1,5-10 мг субстрата, 1,5-10 мг ферментного препарата, 1 мл Трис-буфера (рН 8,0-8,2). В контрольные пробы вносят только соответствующий субстрат и буфер (без ферментного препарата). Реакцию проводят при 37°С в течение 1 ч (на кератиназную активность - 24 ч), после чего пробы центрифугируют при 6-7 тыс. об/мин в течение 10 мин., и супернатанты фотометрируют при оптимальной длине волны. За единицу кератиназной активности брали изменение оптической плотности при 650 нм на 0,01, осуществляемой 1 мг фермента в 1 ч; за единицу эластазной активности - изменение оптической плотности при 490 нм на 0,01, осуществляемой 1 мг фермента в 1 ч; за единицу коллагеназной активности брали изменение оптической плотности на 0,1 при тех же условиях.
Для определения коллагеназной активности исходных образцов культуральной жидкости и экстрактов агаровой матрицы (фермент степени очистки Гх) в качестве субстрата брали 1%-ную суспензию коллагена, ферментацию проводили при тех же условиях в течение 5 или 17 ч: в пробирки отбирали по 0,1 мл культуральной жидкости; добавляли по 1,9 мл суспензии субстрата. Опытные пробирки выдерживали в термостате, после чего в каждую приливали по 2 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). При постановке контрольных проб реагенты вносили в обратном порядке: фермент, ТХУ, субстрат. Наличие коллагеназной активности устанавливали по накоплению аминного азота, которое определяли нингидриновым методом. За единицу активности принимали количество аминного азота, эквивалентное 1 мкмолю лейцина, освобожденному из субстрата при выбранных условиях ферментации (37°С, рН 8,0) в течение 1 ч.
В качестве продуцентов использовали штаммы грибов-дерматофитов из коллекции ФГУ ВГНКИ.
Пример №1. Во флакон с жидкой питательной средой, например сусло-бульоном, вносят посевную дозу чистой культуры гриба Trichophyton mentagrophytes, штамм 31. Культуру выращивают в термостате при температуре 28°С в течение 20 суток. Затем культуральную жидкость отделяют стерилизующей фильтрацией. Оставшуюся на фильтре культуру обеззараживают автоклавированием. Культуральную жидкость высушивали методом лиофилизации. Выход сухого препарата при этом составляет 10 мг/мл. После высушивания получают препарат с суммарной протеолитической активностью 4,8 Е/мг.
Пример №2. В литровую колбу с плотной питательной средой (сусло-агаром) вносят культуру Т. mentagrophytes штамм 23, культивировали в течение 20 суток при 28°С, после чего выросший газон гриба снимают скребком. Оставшуюся плотную питательную среду обмывают физиологическим солевым раствором и стерильно фильтруют через фильтр Зейтца. К оставшейся агаровой среде добавляют равный объем физиологического раствора хлорида натрия и экстрагируют метаболиты путем встряхивания на шуттель-аппарате в течение 15 мин. Экстракт сливают и также подвергают стерилизующей фильтрации. Экстракцию повторяют еще два раза. Все фильтраты объединяют лиофильно высушивают. Получают препарат с суммарной протеолитической активностью склеропротеаз 3,45 Е/мг.
Пример №3. На жидкой питательной среде выращивают культуру гриба Т. mentagrophytes, штамм 7400 при 28°С в течение 20 суток, после чего испытывают коллагеназную активность в отфильтрованной культуральной жидкости (без предварительного высушивания). Коллагеназная активность культуральной жидкости (Гх) составляет 27,5 Е/мл.
Пример №4. Штамм гриба Т. equinum 51 выращивают на сусло-бульоне в течение 20 суток и подвергают обработке как в примере 1 без высушивания. Фильтрат культуральной жидкости имеет коллагеназную активность, равную 15,1 Е/мл.
Пример №5. Во флакон с жидкой питательной средой (сусло-бульон + бульон Хоттингера) вносят посевную дозу культуры гриба Т. verrucosum, штамм 165 и инкубируют в течение 21 суток при 28°С. Культуральную жидкость освобождают от гриба как в примере №1 и испытывают на содержание ферментов. Коллагеназная активность составляет 39,9 Е/мл.
Пример №6 и 7. Штаммы Т. verrucosum 180 и 149 инкубируют аналогично примеру №1 и испытывают на содержание ферментов в культуральной жидкости. Коллагеназная активность составляет соответственно 13 и 12,4 Е/мл.
После лиофильного высушивания культуральной жидкости штамма 180 получают препарат с суммарной активностью склеропротеаз 7,7 Е/мг.
Примеры №8 и 9. Жидкую питательную среду засевают культурами грибов Microsporum canis, штаммы 68 и 17. Через 21 сутки культивирования отделяют среду роста (культуральные жидкости) и высушивают. Получают два препарата с общей активностью склеропротеаз соответственно 1,05 и 0,77 Е/мг.
Примеры №10 и 11. Штаммы Microsporum canis 3483 и 3498 инкубируют аналогично примеру №1, после чего испытывают на содержание ферментов в культуральной жидкости. Коллагеназная активность составляет соответственно 16,5 и 7,5 Е/мл.
Пример №13. Штамм Microsporum gypseum 6402 высевают на жидкую питательную среду (сусло-бульон) и культивируют 20 суток.
Культуральную жидкость отделяют и лиофильно высушивают как в примере №1. Коллагеназная активность в сухом препарате составляет 0,7 Е/мг.
Полученные результаты приведены в диаграмме на фиг.1 и 2. Значения коллагеназной активности для жидких ферментных препаратов, найденные по литературным источникам (диагр. 2), пересчитаны на 1 ч реакции.
Приведенные диаграммы подтверждают наличие протеолитической активности у всех изучавшихся видов дерматофитов: штаммов рода Trichophyton (Т. verrucosum, Т. equinum, Т. mentagrophytes), и Microsporum (M. canis, M. gypseum) - коллагеназной, кератиназной и эластазной. Диаграмма 2 иллюстрирует высокую коллагеназную активность ферментных препаратов, получаемых от изучавшихся штаммов, в сравнении с активностью препаратов-аналогов. Приведенные результаты показывают возможность использования указанных грибов в качестве продуцентов отдельных протеаз (например, коллагеназы) или комплекса протеаз структурных белков.
Список использованной литературы
1. Грачева И.М. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. Учебное пособие для вузов. M., “Легкая и пищевая промышленность”, 1982, 240 стр.
2. Rippon J.W. Extracellular collagenase from Trichophyton schoenleinii. Journal of bacteriology, 1968, vol. 95, N1, pp.43-46.
3. Daniels G. The digestion of human hair keratin by Microsporum canis Bodin. J. Gen. Microbiol., 1953, vol. 8, pp.289-294.
4. Meevootisom V., Niederpruem D.J. Control of exocellular proteases in dermatophytes and especially Trichophyton rubrum. Sabouradia, 1979, vol. 17, pp.91-106.
5. А.И.Абдулов и др. Получение культуры клеток с помощью коллагеназы крабов. Тезисы докладов ВГНКИ, M., 2001, с.218-219.
6. SU 1778010, 15.01.1993.
Claims (1)
- Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков, характеризующийся тем, что осуществляют культивирование предварительно активированной культуры гриба-дерматофита, выбранной из вида Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton eguinum или Microsporum canis, Microsporum gypseum, отобранной по способности продуцировать коллагеназу, кератиназу и эластазу, выделение, очистку и высушивание с получением препарата, обладающего суммарной протеолитической активностью не менее 0,7 П Е/мг.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003118988/13A RU2244741C1 (ru) | 2003-06-27 | 2003-06-27 | Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003118988/13A RU2244741C1 (ru) | 2003-06-27 | 2003-06-27 | Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003118988A RU2003118988A (ru) | 2004-12-20 |
RU2244741C1 true RU2244741C1 (ru) | 2005-01-20 |
Family
ID=34978093
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003118988/13A RU2244741C1 (ru) | 2003-06-27 | 2003-06-27 | Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2244741C1 (ru) |
-
2003
- 2003-06-27 RU RU2003118988/13A patent/RU2244741C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RIPPON J.W. Extracellular collagenase from Trichophyton schoenleinii Journal of bacteriology, 1968. v.95, №1. p.43-46. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JPH01502079A (ja) | 新規プロテアーゼ | |
Tang et al. | Screening and isolation of an organic solvent-tolerant bacterium for high-yield production of organic solvent-stable protease | |
CN102206616A (zh) | 蜡状芽孢杆菌发酵产磷脂酶c的方法 | |
Odu et al. | Protease production capabilities of Micrococcus luteus and Bacillus species isolated from abattoir environment | |
JPS6322188A (ja) | 新規なl−アミノアシラ−ゼ | |
RU2244741C1 (ru) | Способ получения протеолитического препарата для гидролиза структурных белков | |
US4014860A (en) | Plasminostreptin (enzyme inhibitor) and method for producing it from streptomyces | |
Singhania et al. | Isolation, identification and screening of alkaline protease from thermophilic fungal species of Raipur | |
Varbanets et al. | Marine actinobacteria–producers of enzymes with Α-l-rhamnosidase activity | |
North | A bacterial factor induces changes in cysteine proteinase forms in the cellular slime mould Dictyostelium discoideum | |
Ajamani et al. | Mathematically optimized production, purification and characterization of penicillin G acylase from soil bacterial isolates AA17A and AA17B | |
KR100511048B1 (ko) | 바실러스 리케니포르미스 gn-m10 변이주 및 이를 이용한 프로테아제의 생산방법 | |
RU2193063C2 (ru) | Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа | |
RU2077577C1 (ru) | Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы | |
Umar et al. | Production of Fibrinolytic Enzyme by Soil Actinobacteria: Production of Fibrinolytic Enzyme by Soil Actinobacteria | |
KR790000956B1 (ko) | 바씰로 펲티다제c의 제조방법 | |
JP2785323B2 (ja) | β―グルコシダーゼ及びその製造法 | |
RU2054479C1 (ru) | Способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов | |
JP2707093B2 (ja) | 新規微生物 | |
CN117778230A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株及其在产蛋白酶中的应用 | |
CN117821257A (zh) | 一株内生真菌帚枝霉f5及其应用 | |
NIHARIKA et al. | ANALYSING THE BIOCATALYTIC ASPECT OF AMYLASE FROM PLANT AND MICROBIAL SOURCES FOR INDUSTRIAL APPLICATION | |
KR19980023443A (ko) | 알칼리성 단백질 분해 효소를 생산하는 미생물 | |
JPH0391478A (ja) | コラーゲン分解酵素の製造方法 | |
FI89077B (fi) | Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070628 |