FI89077B - Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur - Google Patents

Description

1 89077

Menetelmä termostabiilien a-amylaasien saamiseksi viljelmällä superproduktiivisia mikro-organismeja korkeissa lämpötiloissa 5 Tämän keksinnön päämäärä on teollinen prosessi a- amylaasientsyymin saamiseksi käyttäen termofiilisiä mikro-organismeja, jotka huipputuottavat entsyymiä 50°C - 70°C välillä olevissa lämpötiloissa, varsinkin kun viljelyalusta sisältää maissin liotusnestettä ja aramoniumkloridia.

10 Amylaasien käyttö tärkkelyksen hajottamisprosesseis- sa on klassinen menetelmä, jota on käytetty lukuisiin tarkoituksiin, kuten oligosakkaridin, maltoosin ja glukoosi-rikkaiden siirappien tuottamiseen. Erityisesti a-amylaasit ovat yleisesti tunnettuja kaupallisesti hyödynnettäviä ent-15 syymejä, joita käytetään muuttamaan tärkkelystä vesiliukoisiksi sokereiksi, erityisesti näiden sokereiden muuttamiseen glukoosiksi.

Tärkkelyksen hydrolyysin teollinen prosessi vaatii granuloiden täydellisen gelatinisaation saavuttamiseksi 20 voimakkaiden olosuhteiden käyttämistä lämpötilojen vaihdellessa 105°C - 115°C välillä. Kyseiset käyttöolosuhteet ovat johtaneet erilaisten, termostabiileja a-amylaaseja tuottavien Bacillus-lajien valikoimiseen. NOVOn GB-paten-tissa nro 1 296 839 tai ES-patentissa nro 526 406, US-pa-25 tenttinro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa nro 843 066 636 on kuvattu erilaisia prosesseja termostabiilien a-amylaasien tuottamiseksi eri Bacillus-lajien viljelmistä. Näiden mikro-organismien tuottamat entsyymit ovat erityisen miellyttäviä käytettäessä tärkkelyksen liuotusprosesseissa. 30 Ne ovat paljon stabiilimpia kuin aikaisemmat, eri Bacillus-muunnoksista saadut α-amylaasit. Noiden kantojen tuottotaso on kuitenkin matala ja siksi on välttämätöntä saada aikaan huipputuottavien mutanttien selektio kuten myös laatia sopiva kasvatusalusta.

35 Tässä on havaittu, että ES-patentissa nro 526 406, US-patentissa nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuk- 2 89077 sessa nro 843 068 636 kuvattu Bacillus sp. kanta NCIB 11 886 kykenee mutatoitumaan eri mutageenisilla agensseil-la, jotka sallivat parentaalikannan termostabiilin a-amy-laasin kaupallisen tuotannon. Sitä paitsi näitä kantoja 5 voidaan viljellä maissin liotusneste- ja ammoniumkloridi-rikkaissa teollisuusviljelyalustoissa.

ES-patentissa nro 526 406/ US-patentissa nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa nro 843 068 636 kuvattujen Bacillus sp. kantojen NCIB 11 886 ja 11 887 10 termostabiilien a-amylaasien kaupallinen tuotanto vaatii ensin huipputuottavien mutanttien kuin myös viljelyalustan ja sopivien puhdistus- ja talteenotto-olosuhteiden aikaansaamisen.

Huipputuottavien mutanttien aikaansaamiseksi Bacillus 15 sp. kannat NCIB 11 886 ja 11 887 on alistettu erilaisille mutageenisille käsittelyille tehokkaimmissa löydetyissä olosuhteissa. Useimmin käytetyt mutageeniset agenssit ovat olleet N-metyyli-N'-nitro-N-nitroso-guanidiini (NG) ja ultraviolettivalo (UV). Kaikki käsittelyt on tehty ekspo-20 nentiaalisilla viljelmillä. Eksponentiaalisten viljelmien käytön sopivuus mutageenikäsittelyssä juontaa alkunsa havaitusta, monien mutageenisten agenssien, varsinkin NG:n, korkeammasta tehokkuudesta eksponentiaalivaiheessa oleviin bakteeriviljelmiin. Käsittelystä eloonjääneiden solujen 25 eristys tehdään kiinteässä viljelyalustassa Petri-maljoissa. Tärkkelysrikkaalla alustalla huipputuottavat mutantit voidaan havaita suoraan, koska ne tekevät amylolyysikehät pesäkkeiden ympärille. Näiden kehien koko osoittaa pesäkkeen a-amylaasisynteesikyvyn.

30 Sopivan selektioalustan valinta on välttämätöntä mutageneesiohjelman kehittämiselle. Menetelmän täytyy olla spesifinen, yksinkertainen ja tehokas. Lukuisat viljely-alustat sallivat a-amylaasiaktiviteetin havaitsemisen edellyttäen, että ne sisältävät tärkkelystä. Mutta havaitak-35 semme suuren määrän pesäkkeitä/malja ja erottaaksemme entsyymin tuottokyvyn eroja, olemme kehittäneet spesifisen 3 89077 viljelyalustan. Tämä alusta sisältää glukoosia erillään tärkkelyksestä, minkä vuoksi amylolyysikehien koko pienenee havaittavasti vaikuttamatta pesäkkeen kasvuun.

Bacillus sp. kannan NCIB 11 886 mutageenikäsittely 5 johti yllä mainituissa olosuhteissa 4 700 pesäkkeen eristykseen. Niiden joukosta eristettiin Bacillus sp. kanta NCIB 12 563, koska sillä oli merkittävästi suurempi amylo-lyysikehä kuin muilla. Kyseinen kanta on tallennettu kokoelmaan National Collection of Industrial Bacteria, Torrey 10 Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DE, Scotland.

Kannan NCIB 12563 a-amylaasin huipputuotto-ominai-suus on vahvistettu monessa nesteviljelyalustassa sekä er-lenmeyerissä että fermentorissa. Yleisesti kannan NCIB 15 12 563 tuottokyky on 2 - 4 kertaa korkeampi kuin lähtö- kannan. Kaikissa tapauksissa a-amylaasientsyymin aktiviteetti määritettiin seuraten protokollaa, joka on kuvattu ES-patentissa nro 526 406, US-patentti nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa nro 843 068 636: 20 4 % (w/v) tärkkelysliuosta 0,02M fosfaattipuskuris sa, pH 5,7, jossa oli NaCl konsentraationa 0,006M, lämmitetään noin 50°C:een. Samalla tavoin viljelylihaliemi, jonka aktiviteetti on tarkoitus määrittää (asianmukaisesti laimennettu samaan lihaliemeen kuin tärkkelys), lämmitetään 25 samaan lämpötilaan. Myöhemmin 0,5 ml tutkittavaa entsyy- misuspensiota ja 0,5 ml tärkkelyssuspensiota, molemmat etu-käteen lämmitettyjä, kaadetaan koeputkeen. Seosta inkuboi-daan 5 minuuttia 50°C:ssa magneettisekoittajalla. Reaktio lopetetaan nopealla lämpötilan alentamisella ja lisäämällä 30 0,1 ml Bernfeldin reagenssia. Kyseinen reagenssi valmistet tiin seuraavasti: 16 g NaOH/200 ml HjO liuos (läpi tämän patentin kaikissa tapauksissa käytettiin tislattua vettä) kaadetaan 300 ml:aan lähes kiehuvaa vettä, sitten lisätään 10 g 3,5-dinitrosalisyylihappoa ja 300 g Rochellen suolaa 35 (natriumkaliumtartraattia) ja seosta lämmitetään, kunnes 4 89077 reagenssit ovat täydellisesti liuenneet ja lopuksi täytetään tilavuus litraksi. Tutkittavat näytteet laitetaan sitten voimakkaasti kiehuvaan vesihauteeseen 5 minuutiksi.

Tämän ajan jälkeen näytteet jäähdytetään ja lisätään 10 ml 5 vettä. Lopuksi jokaisen näytteen adsorptio määritetään vedellä ja Bernfeldin reagenssilla tehtyä standardia vastaan 540 nm:llä.

CEPSA α-amylaasiyksikkö määritetään pelkistyneiden sokereiden, mitattuna maltoosina, mg määränä, joka saadaan 10 minuutissa yllä spesifioiduissa koeolosuhteissa. Näinollen, CEPSA amylaasiyksiköt/nl lihalientä = maltoosisaanto mg/mlxDxd t 15 jossa, D = viljelylihaliemen laimennos d = reaktioalustan oma laimennos t = reaktioaika (minuutteja).

Näin ollen jokaisen näytteen 540 nm adsorbanssiyk-siköt pitää muuttaa mg:ksi pelkistyneitä sokereita maltoo-20 sinä mitattuna. Tätä tavoitetta varten valmistetaan muutamia maltoosistandardeja, joiden konsentraatiot vaihtelevat välillä 0,5 - 5,0 mg/ml/ml ja niiden todellinen pelkistyneiden sokereiden pitoisuus määritetään Bernfeldin reagenssilla. Näin saadaan standardisuora, joka suhteuttaa adsorb-25 tion 540 nm:ssä pelkistyneiden sokereiden pitoisuuteen mal-toosin suhteen mitattuna. Jokaisen näytteen todellinen pelkistyneiden sokereiden pitoisuus määritetään kyseiseltä suoralta interpoloimalla, kun tärkkelyksessä tai viljely-lihaliemessä läsnäolevien sokereiden A540 on vähennetty mit-30 tauksesta jokaisessa tapauksessa. Tämä tarkoittaa, että: ^A540^todellinen -^A540^mitattu~ ^A540^tärkkelys" ^A540^lihaliemi

Kanta NCIB 12 563 säilyttää ES-patentissa nro 526 406, US-patentissa nro 4 642 288 ja CEPSAn EP-patenttihakemuksessa numero 843 068 636 kuvatun parentaalikannan termofiiliset 5 89077 ominaisuudet, mikä mahdollistaa sen viljelyn 50°C - 70°C välillä olevissa ja mieluummin 56°C - 62°C välillä olevissa lämpötiloissa. Viljelyaika voi näin olla huomattavan lyhyt, 16 - 30 tunnin välillä, joka antaa näille mutanteille ja 5 niiden johdannaisille korkean kaupallisen hyödyn.

Käytetty viljelyalusta sisältää hiilenlähteen, typenlähteen ja suoloja. Eniten käytetyt hiilenlähteet ovat monimutkaisia polysakkarideja, kuten tärkkelys tai sen osittaisen hydrolyysin tuloksena syntyneitä tuotteita.

10 NCIB 12 563 kannan viljelyssä maltodekstriinit, joiden D.E. (dekstroosi ekvivalentti) vaihtelee välillä 5 - 20 % ja mieluummin välillä 10 - 15 %, ovat osoittautuneet erityisen käyttökelpoisiksi. Käytetyt määrät vaihtelevat välillä 1 - 4 % w/v ja mieluummin välillä 2 - 3 %. Typenlähteenä 15 on käytetty erilaisia orgaanisia ja epäorgaanisia ravinteita. Edelliseen kuuluu hiivauutteet, soijapapujauho ja maissin liotusneste. Jälkimmäiseen kuuluu erilaisia ammonium-suoloja.

Yksi tämän keksinnön huomattavia puolia on havainto 20 maissin liotusnesteen ja ammoniumionien yhtäaikaisen viljelyalastaan lisäämisen aiheuttamasta positiivisesta vaikutuksesta. Maissin liotusnestettä lisätään konsentraationa 2 - 12 % ja mieluummin 4 - 5 %. Ammoniumioneja puolestaan lisätään ammoniumkloridin muodossa konsentraatioina 1 - 25 10 g/1 ja mieluummin 2-4 g/1. Tämä ammoniumionien anto voidaan suorittaa muilla tavoilla. Näin ollen, jos maissin liotusnestettä halutaan esikäsitellä millä tahansa tavallisesti käytetyllä menetelmällä, on mahdollista käyttää ammo-niumhydroksidia alkalikäsittelyssä.

30 Kantaa NCIB 12 563 viljellään sopivassa alustassa aerobisissa olosuhteissa. Sekoituksella olevia erlenmeye-reitä tai tavallisesti fermentoreita käytetään tähän tarkoitukseen. Tässä tapauksessa tavallinen ilmastus on 1,4 tilavuutta ilmaa/tilavuus alustaa/minuutti.

35 Kannan NCIB 12 563 tuottama entsyymi otetaan talteen viljelylihaliemestä kiinteä-neste erotusvaiheella. Tämä erotus voidaan tehdä sekä suodatuksella että sentrifugaa- 6 89077 tiolla. Talteenotettu entsyymi konsentroidaan sitten joko samanaikaisella puhdistuksella tai ei. Jos tarkoitus on vain konsentroida entsyymi, sentrifugoitu tai suodatettu lihaliemi haihdutetaan vakuumissa. Jos konsentroinnin li-5 saksi halutaan puhdistaa α-amylaasi, sentrifugoitu tai suodatettu lihaliemi voidaan fraktioida käyttäen orgaanisia liuottimia tai ultrasentrifugaatiota.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä olematta rajoittavia. On selvää, että alan tuntevien tekemiä muutok-10 siä ja modifikaatioita voidaan saattaa käytäntöön.

Esimerkki 1

Kanta NCIB 11 886 on mutantoitu, jotta saadaan a-amylaasia huipputuottavia kantoja. Käytetyt viljelyalustat on esitetty taulukossa 1.

15 Taulukko 1. Viljelyalustat AM-8_AM-7 9_AM-138

Liukoinen tärkkelys 40,0 g/1 5,0 D.E. 15 % maltodekstriini 20,0 20 Glukoosi 35,0

Hiivauute 5,0

Proteaasi-peptoni 10,0

Maissin liotusneste 45,0

Trizma emäs 17,8 25 NH4C1 3,0 KC1 0,5 0,5

MgCl2.6H20 3,2 3,2

CaCl2 1,0 1,0

MnS04 0,5 0,5 30 Bakteriologinen agar 20,0 pH 7,5 7,2 6,8 10 ml etukäteen 56°C:een lämmitettyä AM-79 viljely-alustaa inokuloidaan 50 ml erlenmeyerissä kannan NCIB 11 886 pesäkkeellä ja sitä inkuboidaan yli yön 56°C:ssa orbitaali-35 sella sekoituksella 230 kierrosta minuutissa. Tuloksena syntynyt stationäärivaiheen viljelmä laimennetaan 100 kertai- 7 89077 sesti 10 ml:aan AM-79 alustaa samoissa olosuhteissa kuin on kuvattu yllä ja viljellään, kunnes ollaan eksponentiaalisen kasvuvaiheen puolivälissä, nimittäin 6 inkubaatio-tuntia. Kuvio 1 esittää kannan NCIB 11 886 kasvun AM-79 5 viljelyalustassa. Elävien solujen määrä/ml luetaan ordi- naatta-akselilta ja viljelyaika tunteina abskissa-akselilta.

5 ml eksponentiaalista viljelmää sentrifugoidaan ja solut resuspensoidaan 5 ml:aan 56°C:een esilämmitettyä AM-79 alustaa.

10 NG-käsittelyä varten 100 ,ug kyseistä mutageenista

O

agenssia lisätään solususpensioon ja sitä inkuboidaan 56 C:ssa 20 minuuttia. Kanta NCIB 12 563 eristettiin myöhemmin sen korkean amylolyysiaktiviteetin johdosta kasvattamalla AM-8 alustaa sisältävillä Petri-maljoilla.

15 Esimerkki 2

Mutantin NCIB 12 563 ylituotanto verrattuna paren-taalikantaan NCIB 11 886 on tarkistettu erlenmeyerissä kompleksisissa nesteviljelyalustoissa.

Tätä tarkoitusta varten 10 ml 56°C:een esilämmitet-20 tyä AM-79 viljelyalustaa inokuloidaan 50 ml:n erlenmeyerissä kannan NCIB 12 563 peräkkeellä ja sitä inkuboidaan 56°C:ssa orbitaalisella sekoituksella 230 kierrosta minuutissa. Otetaan pieniä nestemääriä inkubaation eri aikoina a-amylaasin tuoton määrittämiseksi. Taulukon 2 tulokset 25 osoittavat, että huipputuottava mutantti NCIB 12 563 tuottaa noin neljä kertaa enemmän α-amylaasia kuin parentaali-kanta NCIB 11 886.

Taulukko 2

Kantojen NCIB 11 886 ja 12 563a-amylaasituotto AM-79 30 nestealustassa erlenmeyerissä.

Viljelyaika(tunteja)

Kanta 24_48 NCIB 11 886 216U/ml 213U/ml NCIB 12 563 917U/ml 878U/ml 8 89077

Esimerkki 3

Mutantin NCIB 12 563 ylituotanto verrattuna paren-taalikantaan NCIB 11 886 on tarkistettu fermentoreissa kompleksisissa nestealustoissa.

5 Sen vuoksi 100 ml 56°C:een esilämmitettyä AM-79 viljelyalustaa inokuloidaan 500 ml:n erlenmeyerissä kannan NCIB 12 563 pesäkkeellä ja sitä inkuboidaan 56°C:ssa orbi-taalisella sekoituksella 230 kierrosta minuutissa yli yön. Tuloksena syntynyt stationääriviljelmä laimennetaan 25 ker-10 taisesti AM-79 viljelyalustaan 2 litran fermentorissa (käyttökelpoinen tilavuus 1 125 ml). Fermentoriviljelmää inkuboidaan 56°C:ssa ilmastuksella 1,3 v/v/minuutti, sekoituksella 1 750 kierrosta minuutissa ja pH pidetään 7,2 yläpuolella 10 % NaOH lisäyksellä. Otetaan pieniä nestemääriä inkubaa- 15 tion eri aikoina α-amylaasin tuoton määrittämiseksi. Kuvio

2 esittää kantojen NCIB 11 886 (käyrä A) ja NCIB (käyrä B) α-amylaasin tuoton, ordinaatta-akselilla on esitetty CEPSA α-amylaasiyksiköt/ml ja viljelyaika tunteina abskissa-akse-lilla. Kuten voidaan nähdä, huipputuottava mutantti NCIB

20 12 563 tuottaa kaksi kertaa enemmän α-amylaasia kuin paren- taalikanta saavuttaen maksimituoton samassa inkubaatioajässä, 36 tunnissa.

Esimerkki 4

Huipputuottavan kannan NCIB 12 563 α-amylaasin tuot-25 to tulee mahdolliseksi yksinkertaisessa teollisuusviljely-alustassa.

Sen vuoksi NCIB 12 563 pesäkettä kasvatetaan 500 ml:n pullossa 100 ml:ssa AM-79 alustaa, kuten on kuvattu esimerkissä 3. Toinen AM-79 pullo inokuloidaan sitten 5 %:n tila-30 vuudella edellistä viljelmää ja sitä inkuboidaan 8 tuntia identtisissä olosuhteissa. AM-138 alustaa sisältävä 2 litran fermentori inokuloidaan tällä viljelmällä. Tähän inoku-laatioon käytetään 10 % tilavuutta. Fermentoriviljelmää kasvatetaan seuraavissa olosuhteissa: pH 6,8 ja 58°C. Livenneen 35 hapen kehitys on vapaa, kun sekoitus on 1 250 kierrosta minuutissa ja ilmastus on 1,4 v/v/minuutti.

9 89077 4 tunnin viljelyn jälkeen siitä otetaan 4 % v/v nestemäärä 15 litran fermentorin inokulointia varten. Jälkimmäinen sisältää myös AM-138 alustaa ja sitä viljellään 58°C:ssa ja pH:ssa 6,8. Livenneen hapen kehitys on vapaa, kun 5 sekoitus on 650 kierrosta minuutissa ja ilmastus on 1,4 v/v/minuutti. 20 tunnin viljelyn jälkeen saadaan 1 100 u/ml.

Esimerkki 5 NCIB 12 563 kannan a-amylaasin konsentroiminen ja 10 puhdistus voidaan tehdä fraktioimalla orgaanisilla liuottimilla. Tätä tarkoitusta varten käytetään sellaista vil-jelyalusta, joka saatiin aikaan esimerkissä 4. Kyseinen alusta sentrifugoidaan levysentrifuugissa, kuten Westfa-lia Equipment Mod. SAOOH-205, virtauksella 301/tunti. Super-15 natantti presipitoidaan asetonilla 4°C:ssa ottaen talteen fraktiot välillä 44 - 60 v/v asetonia. Tuote sisältää 87 %:ia alkuperäisestä a-amylaasista.

Esimerkki 6

Kannan NCIB 12 563 termostabiilin α-amylaasin kon-20 sentrointi voidaan tehdä haihduttamalla vakuumissa korkeissa lämpötiloissa. Tätä tarkoitusta varten käytetään sellaista viljelyalustaa, joka saatiin aikaan esimerkissä 4, se sentrifugoidaan kuten on kuvattu esimerkissä 5 ja saatu supernatantti konsentroidaan haihduttamalla alennetussa pai-25 nessa.

Konsentrointi tehdään pitämällä haihdutuslämpötila 60°C:ssa. Supernatantti konsentroidaan 6 kertaisesti. Lopullinen saanto viljelyalusta on 95 %.