KR100656987B1

KR100656987B1 - 에어로모나스 속 GJ-18 균주를 이용한 키틴으로부터N-아세틸-β-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스의생산

Info

Publication number: KR100656987B1
Application number: KR1020040063358A
Authority: KR
Inventors: 박노동; 국주희; 정우진; 김영철
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2004-08-03
Publication date: 2006-12-13
Also published as: KR20060012537A

Abstract

본 발명은 에어로모나스 속 GJ-18 (Aeromonas sp, GJ-18) 균주를 이용하여 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민 (N-acetyl-D-glucosamine)을 효율적으로 생산하는 방법, 그리고 키틴과 에어로모나스 속 GJ-18 조효소의 반응시 온도를 조절함으로써 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스 (N,N'-diacetylchitobiose)를 선택적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 키티나아제에 의하여 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민을 높은 수율로 생산할 수 있으며, 간단히 반응온도만을 조절함으로써 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스를 선택적이고 효율적으로 생산할 수 있다.

에어로모나스 속 GJ-18, 키틴, N-아세틸-D-글루코사민, N,N'-디아세틸키토비오스.

Description

에어로모나스 속 GJ-18 균주를 이용한 키틴으로부터 N-아세틸-β-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스의 생산{Production of N-acetyl-β-D-glucosamine and N,N'-diacetylchitobiose from chitin using Aeromonas sp. GJ-18}

도 1은 본 발명에 따른 에어로모나스 속 GJ-18 균주의 전자현미경 사진

도 2는 본 발명에 따른 에어로모나스 속 GJ-18 균주의 16rRNA 부분염기서열

도 3은 본 발명에 따른 에어로모나스 속 GJ-18 균주의 키티나아제 생산 및 세포성장곡선

도 4는 환원당 생성에 미치는 온도의 영향

도 5는 키티나아제 생산에 미치는 반응 pH의 영향

도 6은 반응온도별 N-아세틸-D-글루코사민의 생성수율

도 7은 효소농도와 N-아세틸-D-글루코사민 생산의 상관관계

도 8은 효소농도에 따른 N-아세틸-D-글루코사민의 생산수율

도 9는 본 발명에 따른 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 조효소에 의한 키틴 가수분해물의 박층크로마토그래피 분석결과

도 10은 온도에 따른 키틴 효소가수분해물의 고성능 액체크로마토그래피 부석결과

도 11은 온도별 키틴 단당 및 올리고당의 생산수율

본 발명은 신규한 에어로모나스 속 (Aeromonas sp.) 균주 GJ-18을 이용하여 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

키틴(chitin)은 지구상에서 섬유소 (cellulose) 다음으로 풍부한 천연고분자 물질로서 N-아세틸-D-글루코사민의 β-1,4 결합을 기본단위로 하는 중합체이다. 이 중합체는 갑각류의 껍질, 곤충의 외골격, 균류의 세포벽의 주성분으로 알려져 있다. 이 중합체의 유도체들의 유용성이 규명되면서 화공, 환경, 의약, 의료, 농업, 식품분야에 신소재로 그 용도를 넓혀가고 있으며 키틴은 무독성이고 다양한 기능성때문에 젤, 구슬, 섬유, 필름, 콜로이드 등의 조제가 가능하기 때문에 상처치료제, 인공피부, 수술봉합사, 기능성비료나 사료로 이용되고 있으며 항감염효과나 항암효과도 보고되고 있다.

특히 키틴분해산물인 N-아세틸-D-글루코사민과 키틴 올리고당은 항암작용[Carbohydr. Res., Suzuki, K. et al., Antitumor effect of hexa-N-acetylchitohexaose and chitohexaose, 151, 403-408 (1986)], 항균작용[Appl. Environ. Miocrobiol., Amako, K. et al., Effect of chitin and its soluble derivatives on survival of Vibrio cholerae 01 at low temperature, 53, 603-605 (1987)] 등을 나타낸다고 보고되어 있고, 키틴의 단량체인 N-아세틸-D-글루코사민은 특히 퇴행성 골관절염에 치료효과가 뛰어난 것으로 보고되어 있다[Clinical Therapeutics, Talent, J.M. et al., Pilot study of oral polymeric N-acetyl-D-glucosamine as a potential treatment for patients with osteoarthritis, 18, 1184-1190 (1996)].

현재 대부분의 키틴 올리고당은 진한 염산으로 가수분해하여 생산하고 있으나 이는 환경오염의 위험과 인체에 유해한 부반응물질을 생성할 가능성이 높다. 우리나라 식품공전에는 키틴을 효소로 분해시킨 올리고당만을 식품첨가물이나 건강식품용 소재로서 이용하도록 규정되어 있으나 대부분 염산으로 분해시킨 산분해 올리고당이 이용되고 있어 어려움이 있다.

최근 화학적 제조법의 단점을 보완 또는 대체하고자 키틴을 효소적으로 가수분해하여 키틴 단당 및 올리고당을 얻고자 하는 연구가 시도되고 있다. 키틴분해효소는 세균, 곰팡이, 고등식물 등에서 다양하게 발견되며, 특히 미생물 유래의 키티나아제에 많은 관심이 집중되고 있어 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) [Enzyme Microb. Technol., Chen, H.C. ef al., Purification and characterization of an exo-N,N'-diacetylchitobiohydrolase-like enzyme from Cellulomonas flavigena NTOU 1, 20, 191-197 (1997)] , 바실러스 속(Bacillus sp.) [Biotechnol. Lett., Barboza-Corona, J.E. et al., Selection of chitinolytic strains of Bacillus thuringiensis, 21, 1125-1129 (1999)], 세라시아 속(Serratia sp.) 속 [Carbohydr. Res., Giuliano, B. et al., Enhanced enzymatic hydrolysis of langostino shell chitin with mixtures of enzymes from bacterial and fungal sources, 338, 1823-1833 (2003)], 에어로모나스 속(Aeromonas sp.) [Biosci. Biotech. Biochem., Hiraga, K. et al, Isolation and characterization of chitinase from a flake-chitin degrading marine bacterium, Aeromonas hydrophila H-2330, 61, 1, 174-176 (1997)] 등에서 키티나아제가 보고되었다. 하지만 키틴의 효소적 가수분해방법을 산업적으로 응용하기 위해서는 보다 선택적이고 높은 수율로 키틴 단당 및 올리고당을 생산하는 키티나아제의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명의 목적은 높은 키티나아제 활성을 갖는 에어로모나스 속(Aeromonas sp.) 균주를 분리하여 제공하고, 이 균주가 생산하는 효소에 의해 키틴의 단당인 N-아세틸-D-글루코사민을 효율적으로 생산하는 방법을 제공함에 있다. 또한, 반응온도를 달리함으로써 상기 균주가 생산하는 조효소에 의해 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스가 선택적이고 효율적으로 생산 될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민을 효율적으로 생산할 수 있는 균주를 분리하기 위해 해안 토양 시료를 분리원으로 하여 여러종의 키티나아제 생산균주를 분리하고 이 중 가장 높은 키티나아제 활성을 나타내는 균주인 에어로모나스 속 GJ-18 균주를 선발하여 이 균주가 생산하는 조효소에 의해 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민을 높은 효율로 생산하는 방법, 그리고 반응온도를 조절함으로써 선택적이고 효율적으로 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하고자 하나 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 의하여 한정되어지는 것은 아니다.

(실시예 1) 키틴분해효소 생성균의 분리 및 배양

키틴분해효소를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 우리나라 남해안의 갯벌토양에서 채취한 시료 약 1 g을 0.85% 염화나트륨 용액 (saline buffer) 100 mL에 현탁하여 잘 혼합한 다음 30분간 진탕배양한 후 현탁액 1 mL을 1% 팽윤키틴(swollen chitin)이 함유된 분리용 액상배지 50 mL에 접종하여 7일간 진탕배양하고 각 플라스크로부터 배양액 100㎕씩을 취하여 분리용 한천배지에 평판도말하고 37℃에서 5일간 배양하면서 콜로니(colony) 주변에 투명환(clear zone)을 형성하는 균주를 1차로 분리하였다. 이들 중 투명환 형성이 크고 선명한 콜로니를 선별하여 분리용 한천배지에 최종 접종하여 이들 중에서 키티나아제 활성이 우수한 30여종의 균주를 분리하였다. 이들 분리된 균주들을 키틴배지[팽윤키틴 1%, 염화나트륨(NaCl) 1%, 트립신(trypsin) 1%]에 접종하여 5일간 배양한 후 원심분리하여 배 양상등액의 키티나아제활성을 측정하였다. 키티나아제 효소활성 측정은 기질인 1%팽윤키틴 1.8 mL에 효소 0.2 mL을 가하여 잘 혼합한 뒤 37℃ 진탕항온수조(shaking water bath)에서 2시간 배양한 후 1N 수산화나트륨(NaOH) 0.2 mL을 넣어 반응을 정지시키고 원심분리하여 생성된 환원당의 양을 Schales 방법으로 정량하였다. 이와 같은 조건에서 시간당 1μmol의 N-아세틸-D-글루코사민을 생성하는 효소의 양을 1 unit로 정의하였다. β-아세틸헥소사미니다아제(β-acetylhexosaminidase) 활성의 측정은 p-니트로페닐-N-아세틸글로코사미니드(p-nitrophenyl-N-acetylglucos aminide)를 기질로 하여 측정하였으며, 분당 1μmol의 p-니트로페놀을 생성하는 효소의 양을 1 unit로 정의하였다. 팽윤키틴은 다음과 같이 조제하였다. 게껍질로부터 얻은 키틴 20 g에 85% 인산(H₃PO₄)용액 100 mL을 넣어 충분히 녹인 다음 하룻밤방치하고 여기에 증류수를 가하였다. 생성된 침전을 충분한 양의 증류수로 pH가 5∼5.5가 될때까지 계속 반복 수세한 다음 1N 수산화나트륨 용액으로 pH 7.0으로 맞추었다. 분리된 균주들로부터 얻어진 배양 상등액의 키티나아제 활성과 β-아세틸헥소사미니다아제활성을 상기 방법으로 비교하여 효소활성이 높은 균주 GJ-18을 최종선발하였다.

(실시예 2) 분리된 균주의 동정

토양으로부터 분리한 키티나아제 생산균주 GJ-18 균주의 형태학적, 생리생화학적 특성을 버기의 방법 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)에 따라 조사하고, 16S rRNA의 염기서열을 분석하여 분리된 균주를 동정하였다. 주사전자현 미경(Scanning Electron Microscope, SEM, Hitachi S-2400)을 이용하여 크기, 형태등을 관찰하였으며 그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이 이는 그람 음성의 간균이었다.

이의 생리생화학적 특성을 표 1에 나타내었다. 이는 카탈라아제(catalase) 반응과 옥시다제(oxidase) 반응에서 양성을 나타냈으며, 유레아제(urease) 반응에서 음성을 나타냈다.

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[표 1] GJ-18 균주의 형태적, 생리생화학적 특성

또한, GJ-18 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위하여 분리된 GJ-18 균주를 LB 액체배지에서 24시간동안 진탕배양한 후 세포를 회수하여 genomic DNA를 분리하였다. 본 발명 균주의 16S rRNA는 정방향 프라이머(forward primer)로 5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3'를 사용하고 역방향 프라이머로 5'-CCCACTGCCTCCCGTAAGGAGT-3'를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의해 클로닝하였다. 분석된 GJ-18의 16S rRNA 부분염기서열(partial nucleotide sequence data)로 NCBI에 있는 Blast search를 이용하여 상동성(sequence homology)을 비교한 결과, 338의 nucleotides 중 335개가 일치하여 에어로모나스 속 Tf234 (Aeromonas sp. Tf234) 균주와 99%의 유사성을 나타냈다(도 2). 이상의 결과로부터 GJ-18 균주는 에어로모나스 속 GJ-18(Aeromonas sp. GJ-18)으로 동정되었으며, 이를 한국농용미생물보존센터에 수탁하였다(수탁번호 Aeromonas sp. GJ-18 KACC 91106).

(실시예 3) 에어로모나스 속 GJ-18 균주에 의한 키티나아제 생산

에어로모나스 속 GJ-18 균주를 1% 팽윤키틴, 1% 염화나트륨, 1% 트립신이 함유된 키틴배지에 접종하여 180 rpm, 37℃에서 7일간 배양하면서 세포성장과 키티나아제 생산을 조사하였다. 도 3에 제시한 바와 같이 효소활성은 배양 5일째에 최대치를 나타내었으며, 그 이후 감소되었다.

(실시예 4) 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 키티나아제에 의한 N-아세틸-D-글루코사민의 생산

(실시예 4-1) 반응온도와 pH에 따른 키틴의 가수분해효율 조사

반응온도에 따른 N-아세틸-D-글루코사민 생산성 조사를 위해 기질인 팽윤키틴(3%, 1 mL)에 조효소 1 mL (1.4 U)와 0.2M 아세트산 완충용액(pH 5.5) 1 mL을 첨가하여 잘 혼합한 후 20℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃의 8가지 배양온도에서 5일간 진탕배양한 후 생성된 환원당 양을 측정하였다. 조효소로는 에어로모나스 속 GJ-18 균주를 키틴배지에서 5일간 배양(37℃, 180 rpm)하여 원심분리한 배양상등액을 셀룰로스 막 (cellulose membrane)으로 2일간 투석한 것을 사용하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 반응온도가 45℃일 때 가장 높은 키틴 가수분해효율을 나타냈다. 반응온도 50℃에서는 가수분해율이 낮아졌으며 60℃에서는 매우 낮은 분해율을 나타내었다. 이들 결과로부터 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 조효소에 의한 키틴 가수분해의 최적온도는 40℃ 또는 45℃임을 확인할 수 있었다.

또한, 반응 pH를 3.0-8.0까지 6가지로 조정하여 40℃에서 24시간 동안 배양한 후 키티나아제 생산성을 조사하였다. 그 결과 반응 pH 5.0에서 가장 높은 키티나아제 생산성을 보였으며, pH 6.0, 8.0에서는 최대 키티나아제 생산과 비교하여 약 80%, 65%의 생산성을 나타냈다(도 5).

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(실시예 4-2) 반응온도에 따른 N-아세틸-D-글루코사민의 생산성 조사

키틴과 에어로모나스 속 GJ-18 조효소의 반응온도에 따른 N-아세틸-D-글루코사민의 생산성을 조사한 결과를 도 6에 나타내었다. 생성된 N-아세틸-D-글루코사민의 양은 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 분석하여 측정하였다. 즉, 키틴을 조효소와 반응시킨 반응액을 100℃에서 5분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 다음 원심분리(10,000 rpm, 10분)한 후 상등액을 0.2 ㎛ 필터에 통과시켜 HPLC에 주입하였다. 분석조건은 다음과 같이 실시하였다: 컬럼(Column), NH2P-50 4E (Shodex); 이동상, 아세토니트릴-물(acetonitrile:water) 70:30(v/v); 검출, 210 nm; 유속, 1 mL/분, 분석결과 반응온도 40℃와 45℃에서 N-아세틸-D-글루코사민의 생성수율이 높았으며 배양시간이 경과함에 따라 N-아세틸-D-글루코사민의 생성양도 증가하였다. 50℃에서는 N-아세틸-D-글루코사민의 생성수율이 현저히 떨어졌으며 55℃에서는 더욱 낮 아졌다. 따라서 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 조효소에 의한 키틴 가수분해 및 N-아세틸-D-글루코사민 생산의 최적온도는 40℃ 또는 45℃임이 확인되었다.

(실시예 4-3) 기질/효소농도에 따른 N-아세틸-D-글루코사민의 생산성 조사

기질에 대한 효소의 농도를 달리하여 반응시켰을 때 생산되는 N-아세틸-D-글루코사민의 수율을 조사하였다. 팽윤키틴(최종농도: 1%)에 0.5∼10 U 범위의 조효소를 넣고 9일간 진탕배양(40℃, pH 5.5)하면서 반응시간에 따른 N-아세틸-D-글루코사민의 생성수율을 측정하였다. 기질에 대한 효소 농도가 높아질수록 비례적으로 N-아세틸-D-글루코사민의 생성수율이 증가하였다(도 7).

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10 U의 효소로 가수분해한 경우 반응 5일째까지는 N-아세틸-D-글루코사민 생산양이 급격히 증가하였으나 그 이후로는 서서히 증가하였으며, 반응 5일째와 10일째의 수율은 각각 83%, 98%였다. 8 U 가수분해의 경우도 10 U 처리와 비슷한 수준으로 높은 N-아세틸-D-글루코사민 생산율을 나타냈다(도 8).

(실시예 5) 에어로모나스 속 GJ-18 균주에 의한 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스의 선택적 생산방법

상기 실시예 4에서 얻어진 효소 가수분해 반응생성물을 박층크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)로 분석하였다. 박층크로마토그래피 분석시 전개용매로는 n-프로판올:물:암모니아수 (n-propanol:water:ammonia water) 70:30:1(v/v) 혼합용액을 사용하였고 발색시약으로 아닐린-디페닐아민 시약(aniline-diphenylamine reagent)을 사용하여 TLC 판에 분무한 후 130℃에서 5분간 가열하여 발색시켰다. 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 조효소에 의한 키틴 가수분해물의 박층크로마토그래피 분석결과 반응온도 45℃ 이하에서는 주요 가수분해 생성물이 N-아세틸-D-글루코사민임을 확인할 수 있었으며, 키틴 2당과 3당도 소량 검출되었다. 반면 반응온도 50℃ 이상에서의 가수분해 생성물은 주요 생성물이 N,N'-디아세틸키토비오스임을 확인할 수 있었다(도 9).

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HPLC 분석결과도 TLC 분석결과와 유사한 결과를 나타냈으며, 도 10에서 보는 바와 같이 45℃ 이하에서는 주요 가수분해 생성물이 N-아세틸-D-글루코사민이었으며, 반응온도 50℃ 이상에서는 가수분해 생성물은 주요 생성물이 N,N'-디아세틸키토비오스임을 재확인할 수 있었다.

또한, 45℃와 55℃의 가수분해 반응 상등액을 HPLC로 분석하여 정량한 결과 도 11에서 보는바와 같이 45℃에서의 가수분해산물은 N-아세틸-D-글루코사민이 주성분으로써 생성된 총 가수분해산물의 93.7 %를 차지했으며, 55℃에서의 가수분해산물은 N,N'-디아세틸키토비오스가 주성분이었으며 생성된 총 가수분해산물의 85.9%를 차지하였다.

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이상의 결과 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 키티나아제는 최소한 2가지 이상의 엑소키티나아제 즉, N-아세틸-D-글루코사미니다아제와 N,N'-디아세틸키토비오하이드로라아제를 포함하는 것으로 확인되었다.

상기 설명한 바와 같이 본 발명에서 얻어진 에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 키티나아제는 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민을 높은 수율로 생산하며, 반응온도에 따라 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스를 선택적 으로 각각 생산하는 것이 확인되어, N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

키티나아제를 생산하는 에어로모나스 속 GJ-18 균주 (KACC 91106)
에어로모나스 속 GJ-18 균주 (KACC 91106)를 키틴이 함유된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 키티나아제의 제조방법
제1항에 있어서, 키티나아제는 N-아세틸-D-글루코사미니다아제와 N,N'-디아세틸키토비오하이드로라아제가 포함된 것임을 특징으로 하는 에어로모나스 속 GJ-18 균주 (KACC 91106)
에어로모나스 속 GJ-18 균주가 생산하는 조효소를 이용하여 반응온도 45℃ 이하에서 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민을 생산하는 단계 또는 반응온도 50℃ 이상에서 키틴으로부터 N,N'-디아세틸키토비오스를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 반응온도에 따른 키틴으로부터 N-아세틸-D-글루코사민과 N,N'-디아세틸키토비오스의 선택적 생산방법.