DE3884922T2 - Verfahren zur Herstellung von thermostabilen alpha-Amylasen durch Kultivierung von überproduzierenden Mikroorganismen. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von thermostabilen alpha-Amylasen durch Kultivierung von überproduzierenden Mikroorganismen.Info
- Publication number
- DE3884922T2 DE3884922T2 DE19883884922 DE3884922T DE3884922T2 DE 3884922 T2 DE3884922 T2 DE 3884922T2 DE 19883884922 DE19883884922 DE 19883884922 DE 3884922 T DE3884922 T DE 3884922T DE 3884922 T2 DE3884922 T2 DE 3884922T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- ncib
- medium
- culture
- amylase
- production
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 title claims description 27
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 14
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 9
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 claims 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 14
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 14
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 14
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 3
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- -1 starch Chemical class 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920002245 Dextrose equivalent Polymers 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
- Die Aufgabe dieser Erfindung ist ein industrielles Verfahren zum Erhalten des Enzyms α-Amylase mittels thermophiler Mikroorganismen, die das Enzym bei Temperaturen im Bereich von 50 bis 70ºC überproduzieren, insbesondere wenn die Kulturmedien Maisquellwasser und Ammoniumchlorid enthalten.
- Die Verwendung von Amylasen in Stärkeabbauverfahren ist ein klassisches Verfahren, das für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt worden ist, wie etwa zur Herstellung von Oligosaccharid-, Maltose- und Glukose-reichen Sirups. Insbesondere sind α-Amylasen Enzyme, an denen ein offenkundiges wirtschaftliches Interesse an ihrer Verwendung bei der Umwandlung von Stärke in wasserlösliche Zucker besteht, insbesondere an ihrer Umwandlung in Glukose.
- Das industrielle Verfahren zur Stärkehydrolyse erfordert die Verwendung von energetischen Bedingungen mit Temperaturen im Bereich zwischen 105 und 115ºC, um die vollständige Gelatinisierung der Körner zu erreichen. Diese Betriebsbedingungen haben zur Selektion verschiedener Bazillus-Arten geführt, welche thermostabile α-Amylasen produzieren. Im britischen Patent Nr.1,296,839 von NOVO oder im spanischen Patent Nr. 526,406, U.S Nr.4,642,288 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 843068636 von CEPSA sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von thermostabilen α-Amylasen aus Kulturen verschiedener Bazillus-Arten beschrieben worden. Die von diesen Mikroorganismen produzierten Enzyme sind besonders interessant zur Verwendung in Stärkeverflüssigungsverfahren. Sie sind viel stabiler als die früheren α-Amylasen, die aus verschiedenen Bazillus-Varianten erhalten wurden. Das Produktionsniveau dieser Stämme ist jedoch niedrig und deshalb ist es wesentlich, sowohl eine Selektion von überproduzierenden Mutanten durchzuführen, als auch ein geeignetes Kulturmedium zusammenzustellen.
- So wurde entdeckt, daß der Bacillus sp.-Stamm NCIB 11866, der im spanischen Patent Nr. 526,406, der U.S Nr. 4,642,288 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 843068636 von CEPSA beschrieben ist, zur Mutation durch verschiedene mutagene Mittel fähig ist, welche die kommerzielle Produktion der thermostabilen α-Amylase des Ausgangsstamms ermöglicht. Diese Mutanten können daneben in Maisquellwassser und ammoniumchloridreichen industriellen Kulturmedien kultiviert werden.
- Die kommerzielle Produktion von thermostabilen α-Amylasen von den Bacillus sp.-Stämmen NCIB 11886 und 11887, wie sie im spanischen Patent Nr. 526,406, der U.S. Nr. 4,642,288 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 843068636 von CEPSA beschrieben sind, erfordert die vorherige Gewinnung von überproduzierenden Mutanten ebenso wie ein spezifisches Kulturmedium und geeignete Reinigungs- und Abtrennungsbedingungen.
- Um überproduzierende Mutanten zu erhalten, wurden die Bacillus sp.-Stämme NCIB 11886 und 11887 verschiedenen mutagenen Behandlungen unter Bedingungen, für die die größte Wirkung gefunden wurde, unterzogen. Die am meisten verwendeten mutagenen Mittel waren N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NG) und ultraviolettes Licht (UV). Alle Behandlungen Wurden mit exponentiellen Kulturen durchgeführt. Die Eignung der Verwendung von exponentiellen Kulturen für die mutagene Behandlung beruht auf der anerkannt höheren Wirksamkeit vieler mutagener Mittel, insbesondere von NG, auf bakterielle Kulturen in der exponentiellen Phase. Die Isolierung von Zellen, welche die Behandlung überleben, wird in einem festen Kulturmedium in Petrischalen vorgenommen. Mit einem stärkereichen Medium können überproduzierende Mutanten direkt identifiziert werden, da sie Amyl-Lyse-Höfe um die Kolonien bilden. Die Größe dieser Höfe zeigt die Fähigkeit der Kolonie zur Synthese von α-Amylase an.
- Die Wahl eines leistungsfähigen Selektionsmediums ist wesentlich für die Entwicklung eines Mutageneseprogramms. Das Verfahren muß spezifisch, einfach und leistungsfähig sein. Zahlreiche Kulturmedien ermöglichen den Nachweis einer α-Amylaseaktivität, vorausgesetzt, daß sie Stärke enthalten. Aber angesichts der Notwendigkeit, eine große Zahl von Kolonien pro Platte zu untersuchen und Unterschiede der Enzymproduktivität zu unterscheiden, haben wird ein spezifisches Kulturmedium entwickelt. Dieses Medium enthält neben Stärke auch Glukose, wodurch die Größe der Amyl-Lyse-Höfe sehr deutlich verringert ist, ohne das Wachstum der Kolonien zu beeinträchtigen.
- Die mutagenen Behandlungen des Bacillus sp.-Stamms NCIB 11886 führten zur Isolierung von 4700 Kolonien gemäß den oben erwähnten Bedingungen. Unter diesen wurde der Bacillus sp.-Stamm NCIB 12563 isoliert, da er einen signifikant größeren Amyl-Lyse-Hof aufwies als die übrigen. Dieser Stamm ist hinterlegt bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DE, Schottland.
- Die α-Amylase-überproduzierende Eigenschaft des Stamms NCIB 12563 ist in zahlreichen flüssigen Kulturmedien sowohl im Erlenmeyerkolben als auch in Bioreaktoren bestätigt worden. Im allgemeinem liegt die Produktivität des Stamms NCIB 12563 zwei- bis vierfach höher als die des Ausgangsstamms. In allen Fällen wurde die Aktivität des α-Amylase-Enzyms gemäß der Arbeitsvorschrift bestimmt, die im spanischen Patent Nr. 526,406, U.S. Nr. 4,642,288 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 843068636 von CEPSA beschrieben ist:
- Eine 4%-(Gewicht/Volumen)-Lösung von Stärke in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 5,7, mit einer NaCl-Konzentration von 0,006 M wird auf etwa 50ºC erwärmt. Ebenso wird die Kulturbrühe, deren Aktivität bestimmt werden soll (die vorschriftsgemäß in der gleichen Brühe wie die Stärke verdünnt ist) auf die gleiche Temperatur erwärmt. Danach werden 0,5 ml der zu untersuchenden Enzymsuspension und 0,5 ml der Stärkesuspension, die beide zuvor erwärmt worden waren, in ein Reagenzglas gegossen. Das Gemisch wird 5 Minuten lang bei 50ºC unter Rühren mit einem Magnetrührer inkubiert. Die Reaktion wird durch einen plötzlichen Temperaturabfall und die Zugabe von 0,1 ml Bernfelds-Reagens angehalten. Dieses Reagens wurde wie folgt hergestellt: eine Lösung von 16 g NaOH in 200 ml H&sub2;O (in diesem gesamten Patent wurde in allen Fällen destilliertes Wasser verwendet) wird in 300 ml fast siedendes Wasser gegossen, dann werden 10 g 3,5-Dinitrosalicylsäure und 300 g Rochelle-Salz (Natriumkaliumtartrat) zugegeben und das Gemisch wird bis zur vollständigen Auflösung der Reagenzien erwärmt und schließlich bis zu einem Liter aufgefüllt. Die zu untersuchenden Proben werden dann 5 Minuten lang in ein heftig siedendes Wasserbad gegeben. Nachdem dieser Zeitraum verstrichen ist, werden die Proben gekühlt und 10 ml H&sub2;O zugegeben. Schließlich wird die Absorption jeder Probe bei 540 nm gegen einen Standard bestimmt, welcher mit H&sub2;O und Bernfelds Reagens hergestellt wurde.
- Die CEPSA-α-Amylase-Einheit ist definiert als die Menge von reduzierenden Zuckern in mg, gemessen als Maltose, die pro Minute unter den oben angegebenen Testbedingungen sich ergibt. Somit gilt:
- CEPSA-α-Amylase-Einheiten/ml Brühe =
- = mg entstandene Maltose/ml xDxd/t
- worin D: Verdünnung der Kulturbrühe
- d: Verdünnung des Reaktionsmediums selbst
- d: Reaktionszeit (min).
- Deshalb sollten die Einheiten der Absorption bei 540 nm von jeder Probe in mg reduzierende Zucker, gemessen als Maltose, umgerechnet werden. Zu diesem Zweck werden einige Maltosestandardlösungen mit Konzentrationen im Bereich zwischen 0,5 und 5,0 mg/ml hergestellt, und ihr tatsächlicher Gehalt an reduzierenden Zuckern wird durch das Bernfeld-Reagens bestimmt. Eine Eichgerade wird so erhalten, welche die Absorption bei 540 nm mit dem Gehalt an reduzierendem Zucker, gemessen bezogen auf Maltose, in Beziehung setzt. Aus dieser Gerade wird der wirkliche Gehalt an reduzierenden Zuckern in jeder Probe durch Interpolation bestimmt, nachdem die A540, die den Zuckern entspricht, welche in der Stärke oder der Kulturbrühe vorhanden sind, jeweils von dem Meßergebnis abgezogen worden ist. Dies will heißen, daß:
- (A&sub5;&sub4;&sub0;)wirklich = (A&sub5;&sub4;&sub0;)gemessen - (A&sub5;&sub4;&sub0;)Stärke - (A&sub5;&sub4;&sub0;)Brühe
- Der Stamm NCIB 12563 behält die thermophilen Eigenschaften des Ausgangsstamms bei, der in dem spanischen Patent Nr. 526,406, U.S. Nr. 4,642,288 und der europäischen Patentanmeldung Nr. 843068636 von CEPSA beschrieben ist, was es möglich macht, daß er bei Temperaturen zwischen 50 und 70ºC und vorzugsweise zwischen 56 und 62ºC kultiviert wird. Die Kulturdauer kann somit merklich kurz sein, zwischen 16 und 30 Stunden, was diesen Mutanten und ihren Derivaten großes kommerzielles Interesse verleiht.
- Die verwendeten Kulturmedien bestehen aus einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und Salzen. Die Hauptkohlen stoffquellen, die verwendet werden, sind komplexe Polysaccharide wie Stärke, oder Produkte, die aus ihrer teilweisen Hydrolyse herrühren. Zum Kultivieren von NCIB 12563 haben sich Maltodextrine mit einem D.Ä. (Dextroseäquivalent) im Bereich zwischen 5 und 20% und vorzugsweise zwischen 10 und 15% als besonders brauchbar erwiesen. Die verwendeten Mengen schwanken zwischen 1 und 4% Gew./Vol. und vorzugsweise zwischen 2 und 3%. Als Stickstoffquelle sind verschiedene organische und anorganische Nährstoffe verwendet worden. Unter den ersteren befinden sich Hefeextrakte, sojabohnenmehl und Maisquellwasser, unter den letzteren verschiedene Ammoniumsalze.
- Einer der herausragenden Aspekte der vorliegenden Erfindung ist die Entdeckung der positiven Wirkung der gleichzeitigen Zugabe von Maisquellwasser und Ammoniumionen zu dem Kulturmedium. Das Maisquellwasser wird in Konzentrationen von 2 bis 12% und vorzugsweise von 4 bis 5% zugegeben. Was die Ammoniumionen betrifft, werden sie in Form von Amoniumchlorid in Konzentrationen von 1 bis 10 g/l und vorzugsweise von 2 bis 4 g/l zugegeben. Diese Ammoniumionenzufuhr kann auf andere Weise durchgeführt werden. somit ist es möglich, Ammoniumhydroxid in der alkalischen Behandlung zu verwenden, falls gewünscht wird, das Maisquellwasser durch ein üblicherweise eingesetztes Verfahren vorzubehandeln.
- Somit wird gemäß der Erfindung der Stamm NCIB 12563 in dem geeigneten Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert. Für diesen Zweck werden gerührte Erlenmeyerkolben oder gewöhnlich Bioreaktoren verwendet. In diesem Fall umfaßt die übliche Belüftung 1,4 Luftvolumina pro Volumen des Mediums pro Minute.
- Das vom Stamm NCIB 12563 hergestellte Enzym wird aus der Kulturbrühe durch einen fest-flüssig-Abtrennungsschritt gewonnen. Diese Abtrennung kann sowohl durch Filtration als auch durch Zentrifugation ausgeführt werden. Das gewonnene Enzym wird dann entweder mit gleichzeitiger Reinigung oder ohne diese konzentriert. Wenn nur beabsichtigt ist, das Enzym zu konzentrieren, wird die zentrifugierte oder filtrierte Brühe unter Vakuum eingedampft. Wenn neben dem Konzentrieren gewünscht wird, die α-Amylase zu reinigen, kann die zentrifugierte oder filtrierte Brühe unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder Ultrazentrifugation fraktioniert werden.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne einen einschränkenden Charakter zu haben. Es ist offensichtlich, daß Änderungen und Abwandlungen, die Fachleuten bekannt sind, vorgenommen werden können.
- Der Stamm NCIB 11886 ist mutiert worden, um α-Amylase-überproduzierende Stämme zu erhalten. Kulturmedien, die verwendet worden sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1. Kulturmedien Lösliche Stärke D.Ä. 15% Maltodextrin Glukose Hefeextrakt Protease-Pepton Maisquellwasser Trizmabase Bakteriologischer Agar
- 10 ml des Kulturmediums AM-79 werden, nachdem sie zuvor auf 56ºC erwärmt worden waren, in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben mit einer Kolonie des Stammes NCIB 11886 beimpft, und es wird über Nacht bei 56ºC mit kreisförmiger Bewegung mit 230 Upm inkubiert. Die daraus hervorgehende Kultur in der stationären Phase wird hundertfach in 10 ml des AM-79-Mediums unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben verdünnt und wird kultiviert, bis die exponentielle Wachstumsphase halb beendet ist, d.h. 6 Inkubationsstunden lang. Fig. 1 zeigt das Wachstum des Stamms NCIB 11886 in AM-79- Kulturmedium. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml sollte auf der Ordinatenachse abgelesen werden, und die Kulturdauer in Stunden auf der Abszissenachse.
- 5 ml der exponentiellen Kultur werden zentrifugiert, und die daraus hervorgehenden Zellen werden in 5 ml AM-79-Medium, das auf 56ºC vorgewärmt war, resuspendiert.
- Für die NG-Behandlung werden 100 ug des mutagenen Mittels zu der Zellsuspension zugegeben und es wird bei 56ºC 20 min lang inkubiert. Der Stamm NCIB 12563 wurde Später durch Aussäen in AM-8-Medium-haltige Petrischalen aufgrund seiner hohen Amyl-lytischen Aktivität isoliert.
- Die Überproduktion der Mutante NCIB 12563 bezogen auf den Ausgangsstamm NCIB 11886 wurde in komplexen flüssigen Kulturmedien in Erlenmeyerkolben überprüft.
- Zu diesem Zweck werden 10 ml eines AM-79-Kulturmediums, welches auf 56ºC vorgewärmt worden war, in einem 50 ml-Erlenmeyerkolben mit einer Kolonie des Stammes NCIB 12563 beimpft, und es wird bei 56ºC mit kreisförmiger Bewegung mit 230 Upm inkubiert. Aliguote Teile werden zu verschiedenen Zeitpunkten der Inkubation entnommen, um die Produktion der α-Amylase zu bestimmen. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß die überproduzierende Mutante NCIB 12563 etwa viermal mehr α-Amylase produziert als der Ausgangsstamm NCIB 11886. Tabelle 2. α-Amylase-Produktion der Stämme NCIB 11886 und 12563 in AM-79-Flüssigmedium in Erlenmeyerkolben Kulturdauer (Std) STAMM
- Die Überproduktion der Mutante NCIB 12563 bezogen auf den Ausgangsstamm NCIB 11886 ist in komplexen flüssigen Medien in Bioreaktoren überprüft worden.
- Dazu wurden 100 ml einer AM-79-Kultur, vorgewärmt auf 56ºC, in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit einer Kolonie des Stamms NCIB 12563 beimpft, und es wird bei 56ºC mit kreisförmiger Bewegung mit 230 Upm über Nacht inkubiert. Die daraus hervorgehende stationäre Kultur wird 25fach in AM-96- Kulturmedium in einem 2 l-Bioreaktor verdünnt (Nutzvolumen: 1125 ml). Die Bioreaktorkultur wird bei 56ºC mit einer Belüftung von 1,3 Vol./Vol./min., einer Bewegung mit 1750 Upm und einem pH, der durch Zugabe von 10% NaOH oberhalb von 7,2 gehalten wurde, inkubiert. Aliquote Teile werden zu verschiedenen Zeitpunkten der Inkubation entnommen, um die Produktion von α-Amylase zu bestimmen. Figur 2 zeigt die Produktion von α-Amylase durch die Stämme NICB 11886 (Kurve A) und NCIB 12563 (Kurve B), wobei die CEPSA-α-Amylase-Einheiten pro ml auf der Ordinatenachse und die Kulturdauer in Stunden auf der Abszissenachse dargestellt sind. Wie ersichtlich ist, produziert die überproduzierende Mutante NCIB 12563 zweimal mehr α-Amylase als der Ausgangsstamm, wobei die maximale Produktion bei der gleichen Mutationszeit erreicht wird: 36 Std.
- Die Produktion von α-Amylase durch den überproduzierenden Stamm NCIB 12563 wird möglich in einfachen industriellen Kulturmedien.
- Eine NCIB 12563-Kolonie wird dafür in einem 500 ml-Kolben mit 100 ml AM-79-Medium wie in Beispiel 3 beschrieben wachsen gelassen. Ein zweiter Kolben mit AM-79 wird dann mit einem 5%-Volumen der ersteren Kultur beimpft und wird 8 Std lang unter identischen Bedingungen inkubiert. Ein 2 l-Bioreaktor, der AM-138-Medium enthält, wird mit dieser Kultur beimpft. Ein 10%-Volumen wird für diese Beimpfung verwendet. Die Bioreaktorkultur wird unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: pH 6,8 und 58ºC. Die Entwicklung des gelösten Sauerstoffs ist frei, mit einer Bewegung mit 1250 Upm und einer Belüftung mit 1,4 Vol./Vol./min. Luft. Nach vier Stunden Kulturdauer wird ein aliquoter Teil davon entnommen, um mit einem 4% Vol./Vol. einen 15 l-Bioreaktor zu beimpfen. Letzterer enthält ebenfalls AM-100-Medium, und es wird bei 58ºC und pH 6,8 kultiviert. Die Entwicklung des gelösten Sauerstoffs ist frei, die Bewegung wird mit 650 Upm durchgeführt und die Belüftung beträgt 1,4 Vol./Vol./min Luft. Nach 20 Std Kultivieren werden 1100 E/ml erhalten.
- Die Konzentrierung und Reinigung von NCIB 12563-Amylase kann durch Fraktionieren mit organischen Lösungsmitteln ausgeführt werden. Eine Kulturbrühe wie die in Beispiel 4 erhaltene wird dafür verwendet. Diese Brühe wird in einer Scheibenzentrifuge wie der Westfalia Modell SAOOH-205 mit einem Fluß von 30 l/h zentrifugiert. Der Überstand wird mit Aceton bei 4ºC gefällt, wobei die Fraktion zwischen 44 und 60 Vol./Vol. Aceton gewonnen wird. Das Produkt enthält 87% der anfänglichen α-Amylase.
- Die Konzentrierung der thermostabilen α-Amylase von NCIB 12563 kann durch Verdampfen unter Vakuum bei hohen Temperaturen ausgeführt werden. Eine Kulturbrühe wie die in Beispiel 4 erhaltene wird dafür verwendet, sie wird wie in Beispiel 5 beschrieben zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wird durch Verdampfung unter vermindertem Druck konzentriert.
- Die Konzentrierung wird ausgeführt, indem die Verdampfungstemperatur bei 60ºC gehalten wird. Der Überstand wird bis zum Sechsfachen aufkonzentriert. Die Gesamtausbeute aus der Kulturbrühe beträgt 95%.
Claims (5)
1. Verfahren zum Erhalten von thermostabilen α-Amylasen
durch Kultivieren des überproduzierenden
Mikroorganismus Bacillus sp. NCIB 12563 bei hohen Temperaturen und
in einem geeigneten kommerziellen Medium zum
Produzieren des Enzyms.
2. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch
gekennzeichnet, daß des Kultivieren in einem geeigneten
Medium bei Temperaturen zwischen 50 und 70ºC und
vorzugsweise zwischen 55 und 62ºC durchgeführt wird.
3. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch
gekennzeichnet, daß des Kultivieren des Mikroorganismus
Bacillus sp. NCIB 12563 in einem Medium durchgeführt
wird, welches Maisquellwasser und Ammoniumchlorid als
Stickstoffquellen enthält.
4. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch
gekennzeichnet, daß das Kultivieren in einem Medium
durchgeführt wird, welches zwischen 2 und 12 % und
vorzugsweise zwischen 4 und 5 % Maisquellwasser und
zwischen 0,1 und 1,0 % und vorzugsweise zwischen 0,2
und 0,4 % Ammoniumchlorid enthält.
5. Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch
gekennzeichnet, daß die produzierte α-Amylase aus dem
Kulturmedium gewonnen, konzentriert und gereinigt wird.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES8703510A ES2007758A6 (es) | 1987-12-07 | 1987-12-07 | Un procedimiento para la obtencion de alfa-amilasas termoestables, por cultivo de microorganismos superproductores a altas temperaturas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3884922D1 DE3884922D1 (de) | 1993-11-18 |
| DE3884922T2 true DE3884922T2 (de) | 1994-02-10 |
Family
ID=8253610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19883884922 Expired - Fee Related DE3884922T2 (de) | 1987-12-07 | 1988-11-28 | Verfahren zur Herstellung von thermostabilen alpha-Amylasen durch Kultivierung von überproduzierenden Mikroorganismen. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0320685B1 (de) |
| DE (1) | DE3884922T2 (de) |
| DK (1) | DK680188A (de) |
| ES (1) | ES2007758A6 (de) |
| FI (1) | FI89077C (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RS51172B (sr) * | 2005-12-29 | 2010-10-31 | Gnosis S.P.A. | Proces za pripremanje vitamina k2 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4473645A (en) * | 1983-03-30 | 1984-09-25 | Nabisco Brands, Inc. | Process for producing thermally stable alpha-amylase |
| ES8602115A1 (es) * | 1983-10-11 | 1985-11-01 | Espanola Petrol | Procedimiento para producir -amilasas termoestables por cultivo de microorganismos a altas temperaturas |
-
1987
- 1987-12-07 ES ES8703510A patent/ES2007758A6/es not_active Expired
- 1987-12-17 FI FI875567A patent/FI89077C/fi not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-11-28 EP EP19880119794 patent/EP0320685B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-28 DE DE19883884922 patent/DE3884922T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-06 DK DK680188A patent/DK680188A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK680188D0 (da) | 1988-12-06 |
| EP0320685B1 (de) | 1993-10-13 |
| DK680188A (da) | 1989-06-08 |
| FI89077C (fi) | 1993-08-10 |
| DE3884922D1 (de) | 1993-11-18 |
| FI875567A (fi) | 1989-06-08 |
| FI89077B (fi) | 1993-04-30 |
| EP0320685A1 (de) | 1989-06-21 |
| ES2007758A6 (es) | 1989-07-01 |
| FI875567A0 (fi) | 1987-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3587623T2 (de) | Enzymatische Hydrolyse von körniger Stärke direkt bis zu Glukose. | |
| DE68909625T2 (de) | Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, Verfahren zu ihrer Herstellung und für das Verfahren nützlicher Mikroorganismus. | |
| JPH0217159B2 (de) | ||
| DE69532106T2 (de) | Maltose Phospharylase, Trehalose Phophorylase, Plesiomonasstamm, und Herstellung von Trehalose | |
| JPS58165786A (ja) | クロストリジウム・アセトブチリカムのブタノールおよびアセトン高生産性突然変異体の創製方法 | |
| EP0140610B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von thermostabilen alpha-Amylasen durch Züchtung von Mikroorganismen bei erhöhten Temperaturen | |
| JPS6027384A (ja) | セルラ−ゼの製造方法 | |
| EP0082814A1 (de) | Mikroorganismen des Genus Pseudomonas und Verfahren zum Abbau von Methylgruppen-haltigen Verbindungen in wässrigen Lösungen | |
| DE3027380A1 (de) | Herstellung eines cephalosporins durch fermentierung | |
| DE3884922T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von thermostabilen alpha-Amylasen durch Kultivierung von überproduzierenden Mikroorganismen. | |
| DE2717333C2 (de) | Hitze- und säurebeständige alpha-Amylase | |
| EP0145798B1 (de) | Bacillus subtilis DSM 2704 und Verfahren zur Herstellung von Alpha-Amylase | |
| DE2811303B2 (de) | Enzymatisch* Komplexe, die zur Umwandlung racemischer Hydantoine in optisch aktive Aminosäuren geeignet sind, sowie deren Anwendung | |
| DE3527649A1 (de) | Mikroorganismus einer neuen art der gattung streptomyces | |
| DE4316646B4 (de) | Lävansucraseenzym, Verfahren zu dessen Herstellung, Mikroorganismen, die es produzieren und Zusammensetzungen, die es enthalten | |
| DE2733273A1 (de) | Endonucleasen und verfahren zu ihrer herstellung | |
| DE3689181T2 (de) | Thermostabile Tryptophanase, Verfahren zu deren Herstellung und thermostabile Tryptophanase erzeugender Mikroorganismus. | |
| KR100523528B1 (ko) | 키티나아제를 생산하는 신규한 셀룰로모나스 gm13 속 균주 | |
| DE68907490T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Glukose-Isomerase. | |
| DE4018695C2 (de) | Neue Cyclodextrinase, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung | |
| DE2107461A1 (de) | Verfahren zum Herstellen von alkali schem Dextranase Enzym | |
| DE3332639C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose | |
| US3956064A (en) | Deoxyribonuclease and process for its preparation | |
| JP3032817B2 (ja) | キシログルカンオリゴ９糖の大量製造方法 | |
| JPH02286083A (ja) | β―グルコシダーゼ及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |