JP3032817B2 - キシログルカンオリゴ9糖の大量製造方法 - Google Patents

キシログルカンオリゴ9糖の大量製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、分子内に1,2-β-
ガラクシド結合を有するタマリンド種子由来のキシログ
ルカンオリゴ9糖の製造方法に関する。このキシログル
カンオリゴ9糖は、医薬や農薬の開発研究に有用であ
る。
【0002】
【従来の技術】糖鎖生物学の進展は、オリゴ糖鎖のもつ
生物活性を次々と明らかにしつつあり、糖鎖を含む化学
物質が新しい機能をもつ医薬品や農薬として利用できる
日がそこまで来ている。こうした研究の進展により、生
物活性をもつオリゴ糖鎖には末端グリコシド結合として
1,2-β-ガラクトシド結合を含むものが比較的多く存在
し、この構造が生物活性の発現に何らかの役割を担って
いるものと推定されるようになってきた。そこで、末端
に1,2-β-ガラクトシド結合をもち、かつ構造が明らか
で純度の高いオリゴ糖の製造手段の開発が望まれるよう
になってきた。
【0003】タマリンド種子由来のキシログルカンをエ
ンド-1,4-β-グルカナーゼ処理して得られるキシログル
カンオリゴ9糖は、末端グリコシド結合として、1個の
1,6-α-キシロシドと2個の1,2-β-ガラクトシド結合を
もつ特異な構造の9糖であることが知られている。タマ
リンド種子由来のキシログルカンが食品の増粘多糖とし
て大量に利用されていることから、これを原料とする高
純度のオリゴ9糖の製造手段を確立できれば、末端に1,
2-β-ガラクトシドを含む高純度のオリゴ糖を大量に供
給することが可能となり、新しい医薬や農薬の開発研究
に利用できる。また、大量に供給されることにより、糖
鎖を含む様々な化学物質の合成原料として利用すること
ができ、糖質工学の新しい展開が期待される。
【0004】従来、高純度のキシログルカンオリゴ9糖
は、タマリンド種子より調製されるキシログルカンを、
エンド-1,4-β-グルカナーゼいわゆるエンド型セルラー
ゼにより酵素分解し、その分解産物中からゲル濾過クロ
マトグラフィーあるいはアミン結合型シリカを用いた順
相クロマトグラフィーなどの、カラムクロマトグラフィ
ーを用いて分別する方法により調製されていた。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】カラムクロマトグラフ
ィーの手法では、純度の高いオリゴ糖を調製できる反
面、大量に調製するためには多くの時間と大型のクロマ
トグラフ装置が必要であり、設備費やランニングコスト
が大きくなるという欠点がある。本発明は、上記のよう
な問題点を有するカラムクロマトグラフィーを用いず
に、高純度のキシログルカンオリゴ9糖を大量に製造す
る方法を提供することを目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者はキシログルカンの酵素分解物について、
有機溶媒を用いた分別沈殿法など大量処理に適した精製
法を各種試みたが成功するに至らず、さらに微生物の多
様性に着目して、特異な糖資化能をもつ微生物の探索
と、それを利用してオリゴ糖を精製する生物的分別手法
の検討へと進んだ。そして、本発明者は、タマリンド種
子由来のキシログルカンをエンド-1,4-β-グルカナーゼ
で処理することにより生成するオリゴ糖の混合物に、天
然界より分離した各種微生物を接種し、培養物中のオリ
ゴ糖の消長を指標に、キシログルカンオリゴ9糖のみを
残存させる特異な糖資化能を有する微生物のスクリーニ
ングを重ねた。その結果、ゲオトリカム属菌と同定され
た糸状菌の一菌株M128株が、適当な培養条件のもとで、
タマリンド種子由来のキシログルカンをエンド-1,4-β-
グルカナーゼで処理することにより生成する重合度7,8,
9からなる3種類の主たるオリゴ糖のうち、オリゴ7糖
および8糖を選択的に資化し、オリゴ9糖を培養物中に
残存させることを見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
【0007】即ち、本発明は、タマリンド種子由来のキ
シログルカンに、エンド-1,4-β-グルカナーゼを作用さ
せ、キシログルカンの繰り返し構造単位に由来するオリ
ゴ糖鎖の混合物を生じさせ、続いて、該混合物に、ゲオ
トリカム属に属し、キシログルカンオリゴ7糖及び8糖
を選択的に資化し得る能力を有する微生物を接種して培
養し、オリゴ9糖以外のオリゴ糖を選択的に消費させた
後、培養物よりオリゴ9糖を回収することを特徴とする
キシログルカンオリゴ9糖の製造方法である。
【0008】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、タマリンド種子由来のキシログルカンに、エ
ンド-1,4-β-グルカナーゼを作用させ、キシログルカン
の繰り返し構造単位に由来するオリゴ糖の混合物を生じ
させる工程と、該混合物に、ゲオトリカム属に属し、キ
シログルカンオリゴ7糖及び8糖を選択的に資化し得る
能力を有する微生物を接種して培養し、オリゴ9糖以外
のオリゴ糖を選択的に消費させた後、培養物よりオリゴ
9糖を回収する工程とから構成される。
【0009】キシログルカンは、タマリンド種子から常
法に従い調製することも可能であるが、市販品を使用し
てもよい。エンド-1,4-β-グルカナーゼには、各種起源
のものが知られているが、タマリンド種子由来のキシロ
グルカンに作用し、これを繰り返し構造単位にまで分解
する能力のあるものであれば、どのような起源の酵素も
利用できる。ただし、市販酵素標品中には繰り返し構造
単位をさらに分解し、単糖単位にまで分解を進める酵素
が混在しているものがあり、こうした酵素標品を利用す
る場合には望ましくない酵素活性を、公知の分別手法を
用いてあらかじめ除去しておく必要がある。
【0010】エンド-1,4-β-グルカナーゼを作用させる
条件は、酵素の起源に応じて決めればよく、例えば、糸
状菌起源の酵素を用いた場合は、キシログルカン濃度を
5〜15%、エンド-1,4-β-グルカナーゼ濃度を0.1 〜0.
5 単位/ml 、反応時のpHを5.0付近、反応時の温度を45
〜55℃、反応時間を4〜72時間とするのが好ましいが、
これらの条件に限定されるわけではない。
【0011】エンド-1,4-β-グルカナーゼの作用により
生じるオリゴ糖の混合物をそのままあるいは適度に希釈
してオリゴ糖濃度を1〜15%程度に調製した後、これに
微生物を接種し、培養する。微生物としては、ゲオトリ
カム属に属し、キシログルカンオリゴ7糖及び8糖を選
択的に資化し得る能力を有するものであれば、特に限定
されないが、ゲオトリカムsp.M128 株又はその変異株を
用いるのが好ましい。
【0012】ゲオトリカムsp.M128 株の菌学的性質は以
下の通りである。 生育: ポテト-デキストロース寒天培地上での生育
は、25℃, 7日間で直径36mmに達する。集落は白色粉状
で緻密である。最初菌糸状に生育し後に酵母様を呈す
る。 胞子形成様式: 分生子柄は認められず分節胞子のみを
形成する。
【0013】以上の菌学的性質について、後藤昭二他
[日本農芸化学会誌 49巻 第10号pp519-525 (1975)]
を参照した結果、本菌はゲオトリカム属に属する糸状菌
である考えるのが妥当であり、本菌株をゲオトリカムs
p. M128株(Geotrichum sp. M128)と命名した。本菌株
はFERM P-16454として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。
【0014】培養に際しては、培地に微生物の生育に必
要な栄養素を添加することが望ましい。添加する栄養素
は、特に限定されないが、培養終了時に培養上清中にオ
リゴ9糖のみが残存するような組成及び濃度とすること
が好ましい。具体的な栄養素としては、窒素源および生
育因子として酵母エキス、無機塩類としてリン酸カリウ
ム及び硫酸マグネシウムを例示することができる。酵母
エキスの添加量は、仕込みのオリゴ糖鎖の重量に対して
8〜10%とするのが好ましいが、培養上清中にオリゴ9
糖のみを収率よく残存させることができる範囲であれ
ば、これに限定されるわけではない。リン酸カリウム及
び硫酸マグネシウムの添加量は、通常用いられる濃度の
半分以下、すなわち培地重量に対して、リン酸二水素カ
リウムとして0.1 %、硫酸マグネシウム・7水和物とし
て0.02%を添加すれば十分である。使用する培地の一例
としては、リン酸二水素カリウム0.1 %、硫酸マグネシ
ウム・7水和物0.02%、および5〜15%のキシログルカ
ンオリゴ糖鎖混合物とオリゴ糖鎖の約10%の酵母エキス
から構成される培地を挙げることができる。
【0015】微生物の接種後、25〜30℃で1〜4日間好
気的に培養して微生物を生育させ、オリゴ9糖以外の糖
鎖を消費させる。培養終了後、培養液を遠心分離して菌
体を分離し、キシログルカンオリゴ9糖を含む上清に得
る。キシログルカンオリゴ9糖は、例えば、上清を少量
の活性炭で脱色後、濃縮して凍結乾燥あるいはエタノー
ル沈殿を行うことにより、粉末状に回収される。このよ
うにして得られた該オリゴ糖標品には、オリゴ9糖以外
に通常少量の8糖および塩類を含むことがある。塩類
は、混合型のイオン交換樹脂を添加するなど、公知の方
法で容易に除去することができる。また、混在する8糖
は通常10%以下であり、培養時間を長くすることによ
り完全に除去することも可能である。
【0016】上記した本発明の工程により、従来のカラ
ムクロマトグラフィーを用いず、効率よく純度の高いキ
シログルカンオリゴ9糖を多量に製造できる。次に実施
例をもって本発明をさらに詳細に説明する。
【0017】
【実施例】
〔実施例1〕タマリンド種子由来のキシログルカン調整
品として大日本製薬製グリロイド3Sを用い、この150g
を10リットルの水に溶解したのち遠心分離して不溶物を
のぞいた。遠心上清に対して等量のエタノールを添加
し、不溶化したキシログルカンを濾過により回収し精製
キシログルカンを得た。収量は107gであった。
【0018】〔実施例2〕トリコデルマ属菌由来の市販
エンド型セルラーゼ製剤として、ヤクルト生化学社製
「セルラーゼONOZUKA R-10」を用い、この1gを1リッ
トルの10mMの酢酸緩衝液(pH 5.0)に溶解し45℃に保温
した。これに実施例1で調製したタマリンド種子由来の
キシログルカン100gを徐々に添加・溶解後、45℃で48時
間反応させ完全に加水分解した。反応液の一部をLichur
osorb NH2カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
で分析した結果を図1に示す。図中Aはオリゴ7糖、Bは
オリゴ8糖、Cはオリゴ9糖の溶出位置をそれぞれ示し
ている。図から明らかなように、キシログルカンは繰り
返し構造単位に由来する重合度7,8,9の3種類の主要な
オリゴ糖鎖に完全に分解された。
【0019】〔実施例3〕実施例2で得られたキシログ
ルカンオリゴ糖鎖混合物1リットルに対して、リン酸二
水素カリウム1g 、硫酸マグネシウム・7水和物0.2g、
酵母エキス9g を添加し、121 ℃ 15分間加圧滅菌した
のち、ゲオトリカムsp.M128 株(FERM P-16454)を接種
し、30℃で68時間培養した。培養終了後、培養液を遠心
分離し菌体を除去した上清について、実施例2と同様に
高速液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を図
2に示す。図中Bはオリゴ8糖のまたCはオリゴ9糖の溶
出位置を示す。図2に示したように、オリゴ7糖と8糖
のピークは消失し、オリゴ9糖のみが残存していること
が示された。
【0020】〔実施例4〕実施例4で得られた培養上清
約1リットルに10gの活性炭を加え攪拌したのち、セラ
イトを濾過助剤として吸引濾過をして培養上清の脱色を
行った。これをロータリーエバポレータにより100ml ま
で減圧濃縮し、濃縮液を2リットルのエタノールに添加
してオリゴ9糖を沈殿物とした。吸引濾過により沈殿物
を回収し、減圧乾燥してエタノールを除去しキシログル
カンオリゴ9糖の白色粉末34.6g を得た。高速液体クロ
マトグラフィーを用いた純度検定で、純度91%であっ
た。
【0021】
【発明の効果】本発明によれば、特異な糖資化能を有す
る微生物を用いることにより、高純度のキシログルカン
オリゴ9糖を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】キシログルカンオリゴ糖鎖混合物をLichrosorb
NH2カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析
したクロマトグラムを示す。
【図2】実施例3で得られた培養液の上清をLichrosorb
NH2カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析
したクロマトグラムを示す。

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 タマリンド種子由来のキシログルカン
    に、エンド-1,4-β-グルカナーゼを作用させ、キシログ
    ルカンの繰り返し構造単位に由来するオリゴ糖鎖の混合
    物を生じさせ、続いて、該混合物に、ゲオトリカム属に
    属し、キシログルカンオリゴ7糖及び8糖を選択的に資
    化し得る能力を有する微生物を接種して培養し、オリゴ
    9糖以外のオリゴ糖を選択的に消費させた後、培養物よ
    りオリゴ9糖を回収することを特徴とするキシログルカ
    ンオリゴ9糖の製造方法。
  2. 【請求項2】 接種する微生物がゲオトリカムsp.M128
    株又はその変異株であることを特徴とする請求項1に記
    載のキシログルカンオリゴ9糖の製造方法。
  3. 【請求項3】 微生物を培養する培地中に酵母エキスを
    添加することを特徴とする請求項1又は請求項2に記載
    のキシログルカンオリゴ9糖の製造方法。
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JP3837497B2 (ja) * 2002-03-25 2006-10-25 独立行政法人産業技術総合研究所 新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法
JP2018140968A (ja) * 2017-02-28 2018-09-13 日本食品化工株式会社 1,6−アンヒドロ−β−D−グルコフラノース含有糖質の製造方法

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