DE69433102T2

DE69433102T2 - N-Acetyl-D-Glucosamin Deacetylase und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE69433102T2
Application number: DE69433102T
Authority: DE
Inventors: Naoko Osaka-shi Yamano; Ryutarou Osaka-shi Tanaka; Shizu Ikeda-shi Fujishima
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1993-03-12
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2014-03-12
Also published as: USH1453H; EP0614972A2; JPH0763370B2; JPH06261754A; DE69433102D1; EP0614972A3; EP0614972B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase, das die Acetamidgruppe von N-Acetyl-D-glucosamin hydrolysieren kann, um D-Glucosamin und Essigsäure zu erzeugen, die spezifisch auf das Monomer von N-Acetyl-D-glucosamin und nicht auf die Oligomeren einschließlich des Dimeren und der Polymeren einwirkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des obenbeschriebenen Enzyms und zum Hydrolysieren der Acetamidogruppe unter Verwendung der Deacetylase nach der vorliegenden Erfindung.
Beschreibung des Standes der Technik
D-Glucosamin, das deacetylierte Produkt von N-Acetyl-D-glucosamin, ist brauchbar als Arzneimittel, Nahrungsmittel und Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln. Außerdem wurden Oligosaccharide, die aus der D-Glucosamineinheit bestehen, zunehmend beachtet und wurden wichtig, da sie wertvolle physiologische Aktivitäten, wie antibakterielle Aktivität, gegen Pilze gerichtete Aktivität und Antitumoraktivität, haben.
D-Glucosamin wurde bisher aus N-Acetyl-D-glucosamin hergestellt, welches aus gereinigtem Chitin(β-1,4-Poly-N-acetyl-D-glucosamin, erhalten aus der Kutikula [Kruste] eines Krustentieres, wie einer Garnele oder Krabbe durch Entfernung anorganischer Salze, Proteine und Lipide) durch Deacetylierung mit konzentriertem Alkali oder Mineralsäure hergestellt wird.
Die Hydrolyse der N-Acetylgruppe von N-Acetyl-D-glucosamin verläuft jedoch nicht so leicht, und daher sind relativ harte Reaktionsbedingungen erforderlich, um die Hydrolyse zu vervollständigen, wie beispielsweise Erhitzen während einer langen Zeitdauer in einer konzentrierten Säure oder in konzentriertem Alkali, wie einer 30- bis 60%igen Lösung, was zu einer Steigerung der Bildung unerwünschter Nebenprodukte führt, und die Ausbeute des erwünschten D-Glucosamins ist gering. Außerdem erfordert die Beseitigung der verwendeten Säure oder des verwendeten Alkalis zusätzliche Arbeit und Kosten.
Es gab einen Bedarf an Entwicklung milderer Methoden der Deacetylierung von N-Acetyl-D-glucosamin in einer hohen Ausbeute ohne die Bildung unerwünschter Nebenprodukte, und eine biologische Methode unter Verwendung eines Enzyms, das N-Acetyl-Dglucosamin deacetylieren kann, wurde untersucht.
Für biologische Deacetylierungsmethoden wurden mehrere Literaturstellen bekannt, worin Mikroorganismen, die zu Mucor sp., Aerromonas sp. oder Colletotrium sp. gehören, verwendet werden.
Bei einem Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zu Mucor sp. gehört, werden lösliches Glycolchitin und das Pentamere zu 12 bis 14% deacetyliert, doch gibt es keine Beschreibung einer Deacetylase, die nur auf das Monomere von N-Acetyl-D-glucosamin einwirkt (Y. Araki, E. Ito, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56: 669 [1974], Eur. J. Biochem, 55: 71 [1975], Methods Enzymol., 161: 510 [1988], L. L. Davis, S. Bartnicki-Garcia, Biochemistry, 23: 1065 [1984], C. Calvo-Mendez, J. Ruis-Herrera, Exp. Mycol., 11: 128 [1987]).
Ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zu Aeromonas sp. gehört, will festes Chitin von hohem Polymerisationsgrad deacetylieren, und es gibt keine Beschreibung einer Deacetylierung von Monosaccharid (K. Shimahara, H. Iwasaki, Asahi Garasu Kogyo Gijutsu Shoreikai, 41: 299 [1982], C. A. 99: 84876v [1983]).
Es gibt auch keine Beschreibung einer Deacetylierung von Monosaccharid unter Verwendung eines Mikroorganismus, der zu Colletotrium sp. gehört (H. Kauss, W. Jeblick, D. H. Young, Plant Sci. Lett. 28: 231 [1983], H. Kauss, B. Bauch, Methods in Enzymology, 161: 518 [1988]).
Die Datenbank WPI-Woche 9303 Derwent-Veröffentlichungen AN 93-022707 (Agency of Industrial Science & Technology), 4. Dezember 1992 beschreibt die Auffindung von N-Acetyl-Dglucosamindeacetylaseaktivität gegenüber monomeren und oligomeren Formen von N-Acetyl-D-glucosamin in Zellextrakten von Vibrio sp.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Meeresmikroorganismus, der zu Vibrio sp. gehört, ein Enzym erzeugt, welches die Acetylgruppe von N-Aceryl-D-glucosamin abspalten kann und spezifisch auf das Monomer von N-Acetyl-D-glucosamin einwirkt und nicht auf dessen Oligomer oder Polymer.
Das obenbeschriebene Enzym mit einer solchen Substratspezifität war bisher noch niemals bekannt und repräsentiert ein brauchbares funktionelles Enzym.
Zusammenfassung der Erfindung
So betrifft die vorliegende Erfindung ein gereinigtes neues Enzym N-Acetyl-Dglucosamindeacetylase, das aus Vibrio sp. erhältlich ist und die Acetamidgruppe von N-Acetyl-D-glucosamin hydrolysieren kann, um D-Glucosamin und Essigsäure zu erzeugen und folgende physikochemische Eigenschaften hat:

1. Substratspezifität: N-Acetyl-D-glucosasminmonomer, nicht das Oligomer oder Polymer hiervon,
2. optimaler pH-Wert: 7,8 bis 8,2 bei 37°C,
3. stabiler pH-Wert: 6,0 bis 9,0 bei 45°C,
4. optimale Temperatur: 28 bis 39°C,
5. Molekulargewicht: 80 000 bis 150 000, wobei diese N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase mit Hilfe eines Reinigungsverfahrens isoliert wird.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung dieses Enzym, worin das Vibrio sp. Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein 'Verfahren zur Herstellung von N-Acetyl-Dglucosamindeacetylase, wie oben erwähnt, durch Inkubieren eines zu Vibrio sp. gehörenden Miirooganismus, der in der Lage ist, diese Deacetylase in einem Induktionsmedium zu erzeugen, und durch Isolieren der Deacetylase aus Zellen, die von diesem Medium abgetrennt wurden.
Diese Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, wie oben beschrieben, worin der Mikroorganismus vorher in einem Nährmedium inkubiert wird.
Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren, wie oben beschrieben, worin der Mikroorganismus Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Hydrolysieren der Acetamidogruppe von N-Acetyl-D-glucosaminmonomer unter Verwendung der Deacetylase der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Aktivität (%) von N-Acetyl-Dglucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung und dem pH-Wert bei 37°C.
2 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Aktivität (%) von N-Acetyl-Dglucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung und der Temperatur (°C) bei pH 7,8.
3 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Aktivität (%) der N-Acetyl-Dglucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung und dem pH-Wert bei 37°C nach Inkubieren bei 45°C während einer Zeitdauer von 30 min.
4 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Aktivität (%) der N-Acetyl-Dglucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung und der Temperatur (°C) nach Inkubieren bei pH 7,8 bei einer bestimmten Temperatur während einer Zeitdauer von 30 min.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Die physikochemischen Eigenschaften des Enzyms nach der vorliegenden Erfindung sind im einzelnen nachfolgend beschrieben.
1. Wirkung und Substratspezifität
Das Enzym wirkt auf die Acetamidgruppe von N-Acetyl-D-glucosamin ein und hydrolysiert letztere zu D-Glucosamin und Essigsäure und wirkt im wesentlichen nicht auf die Oligomeren einschließlich der Dimeren von N-Acetyl-D-glucosamin ein.
2. Optimaler pH-Wert und stabiler pH-Wert
Der optimale pH-Wert des Enzyms nach der vorliegenden Erfindung variiert weitgehend in Abhängigkeit von dem Ursprung des Mikroorganismus., der zur Erzeugung des Enzyms verwendet wird, ist aber gewöhnlich im Bereich von etwa 4,0 bis 9,0. Beispielsweise ist der optimale pH-Wert des Enzyms, das sich von Vibrio sp. herleitet, im Bereich von 7,8 bis 8,2, kolorime trisch mit der Indol-HCl-Methode bei pH 5,6 bis 10,8 bestimmt. Die verwendete Pufferlösung bei pH 5,6 bis 6,0 ist 100 mM CH₃COOH-CH₃COONa. Bei pH 6,0 bis 9,0 wird 100 mM K₂HPO₄-Na₂HPO₄, und bei pH 9,6 bis 10,8 wird 200 mM Na₂HPO₄NaOH verwendet.
Die relative Aktivität des aus Vibrio sp. erhaltenen Enzyms ist in 1 gezeigt.
Der stabile pH-Wert, worin nicht weniger als 50% der Anfangsaktivität des Enzyms beibehalten wird, bestimmt bei 37°C nach Inkubieren in einem bestimmten Puffer bei 45°C während 30 min, variiert je nach dem Ursprung des zur Herstellung des Enzyms verwendeten Mikrooganismus, liegt aber gewöhnlich im Bereich von 3,0 bis 9,0. Beispielsweise liegt der stabile pH-Wert des aus Vibrio sp. stammenden Enzyms im Bereich von etwa 6,0 bis 9,0. Die relative Aktivität nach einer solchen Inkubation des Enzyms, das aus Vibrio sp. erhalten wurde, ist in 3 gezeigt.
3. Optimaler Temperaturbereich
Die optimale Temperatur für die enzymatische Aktivität variiert weitgehend in Abhängigkeit von dem Ursprung des zur Herstellung des Enzyms verwendeten Mikroorganismus, liegt aber gewöhnlich im Bereich von etwa 10 bis 50°C. Beispielsweise liegt die optimale Temperatur des aus Vibrio sp. erhaltenen Enzyms, bestimmt bei 20 bis 47°C, im Bereich von etwa 28 bis 39°C. Die relative Aktivität des Enzyms, das sich von Vibrio sp. herleitet, ist in 2 gezeigt.
4. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht des Enzyms, bestimmt durch TSK-Gel G-3000 SW (RTM)-Säule, liegt bei 80 000 bis 150 000.
N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung kann durch Inkubieren eines zu Vibrio sp. gehörenden Mikroorganismus erhalten werden. Namentlich ein Mikroorganismus, der zu Vibrio sp. gehört, wird in einem einen Induktor enthaltenden Medium inkubiert. Geeignete Induktoren schließen Chitin, Chitinhydrolysat, N-Acetyl-D-glucosamin und N-Acetyl-D-glucosaminoligomere ein. Diese Induktoren können allein oder in Kombination verwendet werden. Induktoren werden in einer Konzentration von etwa 0,1 g/l oder darüber, vorzugsweise bei 1,0 bis 50 g/l verwendet.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin im einzelnen unter Bezugnahme auf die Herstellung des Enzyms aus einem Mikroorganismus Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) beschrieben. Vibrio sp.-Mikroorganismen sind offenkundig bekannt. Unter ihnen wurde Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) beim Institute for Fermentation, Osaka (IFO), 17 bis 85, Jusohonmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan unter der Zugänglichkeitsnummer IFO 15429 hinterlegt. Die bakteriologischen Eigenschaften von Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) sind in Can. J. Microbiol. Band 31, 711 bis 720 (1985) und Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1, 518 (1957) gezeigt. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology entspricht Vibrio pacini dem Vibrio cholerae non-01.
1. Inkubationsbedingungen
Die Zellen eines Mikroorganismus Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) werden zunächst in einem herkömmlichen Nährmedium inkubiert, welches nicht speziell definiert werden muß. Beispielsweise enthält ein herkömmliches Medium Glucose, Maltose, Xylose, Rohrzucker usw. als eine Kohlenstoffquelle, Hefeextrakt, Peptone, Fleischextrakt, organische Stickstoffquellen, wie Aminosäure, anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid usw. als eine Stickstoffquelle, und Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Calciumchlorid usw. als eine Mineralquelle in geeigneten Kombinationen. Der pH-Wert des Mediums wird zwischen 6,5 und 8,0 durch Zugabe einer geeigneten Säure oder Base eingestellt, und das Medium wird im Autoklaven behandelt. Inkubieren erfolgt aerob bei 25 bis 40°C, vorzugsweise bei 37°C, während 5 bis 24 h unter Rühren oder Bewegen. Die Zellen aus der Kultur, die wie oben inkubiert wurde, werden für die Herstellung von N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung verwendet, indem man diese Zellen in einem Induktionsmedium inkubiert, welches einen Induktor zusätzlich zu einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einer Mineralquelle enthält.
Beispielsweise enthält ein Induktionsmedium 3 g Ammoniumnitrat, 1 g Dikaliumhydrogenphosphat, 20 g Natriumchlorid, 0,5 g Magnesiumsulfat, 0,08 g Calciumchlorid, 50 g N-Acetyl-D-glucosamin in 1 l des Mediums mit pH-7,4.
Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) wird aerob bei 25 bis 40°C, vorzugsweise 37°C, während 1 bis 3 Tagen unter Rühren oder Bewegen inkubiert.
2. Isolierung des Enzyms
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer oder mehrerer herkömmlicher Methoden gewonnen und aus der Kultur gereinigt werden. Beispielsweise wird die so inkubierte Kultur zentrifugiert, um Zellen zu sammeln, und die Zellen werden durch Schalltechnik aufgebrochen, um den Zellextrakt zu ergeben. Der Extrakt wird unter Verwendung von Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie usw. gereinigt. Ein Reinigungsverfahren umfaßt beispielsweise die folgenden Stufen:

1. Die Zellen werden durch die Behandlung mit Ultraschallwellen zerstört und zentrifugiert, um zellfreien Extrakt zu ergeben.
2. Der zellfreie Extrakt wird DEAE-Biogelchromatographie unterzogen und mit 120 mM Phosphatpuffer, der 150 mM NaCl enthält, eluiert.
3. Weiterhin wird einer Hydroxyapatitsäulenchromatographie unterzogen und mit 50 mM Phosphatpuffer eluiert.
4. Eine HPLC wird unter Verwendung von TSK-Gel 3000 SW-Gelfiltrationskolonne unterzogen

Der Anreicherungsgrad des Enzyms bei jeder Reinigungsstufe ist in Tabelle 1 nachfolgend gezeigt, worin die Aktivität nach der Methode, wie nachfolgend beschrieben, bestimmt wurde.
Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, kann nach der Reinigungsstufe 4 ein Enzym mit spezifischer Aktivität von 1,22 Einheiten je Milligramm Protein (Anreicherung 346-fach die Aktivität des Anfangswertes) erhalten werden. Unter Verwendung dieses Enzyms werden die enzymatischen Eigenschaften, wie nachfolgend beschrieben, untersucht.
3. Bestimmung der enzymatischen Aktivität
Eine Enzymlösung (0,1 ml) wird zu 0,3 ml von 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,8) mit einem Gehalt von 0,1 ml eines 1%igen N-Acetyl-D-glucosamins als Substrat zugegeben, und das resultierende Gemisch wird 30 min bei 37°C inkubiert. Die Menge an gebildetem D-Glucosamin wird kolorimetrisch unter Verwendung von Indol-HCl gemäß der Methode von Z. Dische und E. Borenfreund (J. Biol. Chem., 184: 517 [1950]) bestimmt. Eine Einheit des Enzyms wird als die Menge des Enzyms definiert, die 1 μMol D-Glucosamin aus N-Acetyl-D-glucosamin je Minute bei 37°C erzeugen kann.
Wie oben beschrieben, ist N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach der vorliegenden Erfindung ein neues Enzym, welches bisher nicht bekannt war und eine Deacetylierung von monomerem N-Acetyl-D-glucosamin bei milden Bedingungen unter Erzeugung von D-Glucosamin ermöglicht. Aufgrund der Substratspezifität dieses Amins ist es möglich, nur monomeres N-Acetyl-D-glucosamin im Gemisch desselben mit Oligomeren zu deacetylieren. Das deacetylierte Produkt D-Glucosamin ist brauchbar als ein Ausgangsmaterial für die Herstellung vieler Arzneimittel, funktioneller Oligosaccharide usw. und hat einen weiten Anwendungsbereich.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erläutert.
Beispiel
1. Inkubation von Vibrio cholerae non-01-Stamm (IFO 15429)
Vibrio cholerae non-01-Stamm (IFO 15429) wurde in einem Agarplattenmedium, das 0,6 g Ammoniumnitrat, 0,2 g Dikaliumhydrogenphosphat, 2 g Natriumchlorid, 0,12 g Magnesiumsulfat , 0,02 g Calciumchlorid, 10 g Glucose und 3 g Agar je 200 ml des Mediums enthielt, bei pH 7,4 und 37°C während 24 h inkubiert, und die Zellen wurden unter Verwendung eines Spatels gesammelt. Die so erhaltenen Zellen wurden dann aerob unter Schütteln während 24 h in dem folgenden Induktionsmedium inkubiert.
Induktionsmedium: 1,5 g Ammoniumnitrat, 0,5 g Dikaliumhydrogenphosphat, 10 g Natriumchlorid, 0,3 g Magnesiumsulfat, 0,04 g Calciumchlorid und 25 g N-Acetyl-D-glucosamin in 500 ml eines flüssigen Mediums mit pH 7,4.
2. Gewinnung und Reinigung des Enzyms
Die so erhaltene Kultur wurde bei 8000 g während 20 min zentrifugiert, um 11 g feuchte Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden in 40 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und bei 0°C während 10 min (20 sec-Betrieb in Abständen von 20 sec) mit Ultraschall behandelt, sodann zentrifugiert, um einen zellfreien Extrakt zu ergeben, der 1,73 g eines Proteins mit einer spezifischen Aktivität von 0,00358 Einheiten je Milligramm Protein enthielt.
Der zellfreie Extrakt wurde, wie oben erhalten, auf eine Säule aufgegeben, die mit DEAE-Biolgel A gefüllt war, welches mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und mit einer stufenweisen NaCl-Gradienteneluierung eluiert. Unter Verwendung von 150 mM NaCl wurden 68,6 mg eines Proteins mit einer spezifischen Aktivität von 0,0875 U/mg Protein eluiert. Das Eluat wurde weiterhin auf eine Hydroxyapatitsäule aufgegeben und mit einem stufenweise arbeitenden Gradientenphosphatpuffer eluiert. 10 ml eines Eluats mit einem Gehalt von 2,45 mg eines Proteins mit einer spezifischen Aktivität von 0,373 U/mg Protein wurden unter Verwendung von 50 mM Phosphatpuffer eluiert.
Das so erhaltene Eluat (10 ml) wurde auf 0,4 ml durch Ultrafiltration (Ausschlußgrenze 100 000) konzentriert und einer HPLC unter Verwendung von TSK-Gel 3000 SW-Säule unterzogen, um 0,72 mg gereinigtes Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 1,22 U/mg Protein zu ergeben. Der Anreicherungsgrad der Aktivität war 346 mal der Anfangswert, und die Gewinnung des Enzyms war 14,2%. Das Molekulargewicht dieses Enzyms war 80 000 bis 150 000.
3. Substratspezifität des Enzyms
Die Substratspezifität des Enzyms, wie es oben erhalten wurde, wurde unter Verwendung von Monomer und einigen Oligomeren (2 bis 6 Mere) eines N-Acetyl-D-glucosamins (Seikagaku Kogyo Co. Ltd., Japan) und Chitin als Substrat untersucht. Diese Substrate wurden in einer Konzentration von 0,2% zugesetzt, und die enzymatische Reaktion ließ man bei einer Temperatur von 37°C und einem pH-Wert von 7,8 während 1 h stattfinden. Die gebildete Menge von D-Glucosamin wurde unter Verwendung von Indol-HCl gemäß der Methode von Z. Dische und E. Borenfreund (J. Biol. Chem., 184: 5178 [1950]) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Eine Enzymaktivitätseinheit ist als die Menge des Enzyms definiert, die erforderlich ist, um ein μ-Äquivalent der Aminogruppe je Minute bei 37°C zu bilden.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, kann die Bildung von D-Glucosamin aus monomerem N-Acetyl-D-glucosamin erhalten werden, während keines der untersuchten Oligomeren (2-mer bis 6-mer) und Chitin die Bildung von D-Glucosamin zeigen.

Claims

Gereinigte N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase, erhältlich aus Vibrio sp. und in der Lage, die Acetamidgruppe von N-Acetyl-D-glucosamin unter Erzeugung von D-Glucosamin und Essigsäure zu hydrolysieren und welche die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften aufweist: 1. Substratspezifität: N-Acetyl-D-glucosamin-Monomer, nicht das Oligomer oder Polymer davon; 2. optimaler pH-Wert: 7,8 bis 8,2 bei 37°C; 3. stabiler pH-Wert: 6,0–9,0 bei 45°C; 4. optimale Temperatur: 28 bis 39°C; 5. Molekulargewicht: 80 000 bis 150 000, wobei die N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase mittels eines Reinigungsverfahrens isoliert wurde.
Gereinigte N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach Anspruch 1, wobei das Reinigungsverfahren Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie oder Gelfiltrationschromatographie umfaßt.
Gereinigte N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach Anspruch 1, wobei das Reinigungsverfahren das Unterziehen der Deacetylase von Chromatographie und Elution mit 10 mM Phosphatpuffer, welcher 150 mM NaCl enthält, Nydroxylapatit-Säulenchromatographie und Elution mit 50 mM Phosphatpuffer und HPLC unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule umfaßt.
Gereinigte N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach Anspruch 1, wobei Vibrio sp. Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) ist.
Verfahren zur Herstellung von N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase, welche in der Lage ist, die Acetamidgruppe von N-Acetyl-D-glucosamin unter Erzeugung von D-Glucosamin und Essigsäure zu hydrolysieren, und welche die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften aufweist: 1. Substratspezifität: N-Acetyl-D-glucosamin-Monomer, nicht das Oligomer oder Polymer davon; 2. optimaler pH-Wert: 7,8–8,2 bei 37°C; 3. stabiler pH-Wert: 6,0–9,0 bei 45°C; 4. optimale Temperatur: 28 bis 39°C; 5. Molekulargewicht: 80 000 bis 150 000, welches Inkubieren eines Mikroorganismus, der zu Vibrio sp. gehört und in der Lage ist, die Deacetylase herzustellen, in einem Induktionsmedium und Isolieren der Deacetylase aus Zellen, die von dem Medium getrennt sind, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus zuvor in einem Nährmedium inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus Vibrio cholerae non-01 (IFO 15429) ist.
Verfahren zum Hydrolysieren der Acetamido-Gruppe von N-Acetyl-D-glucosamin-Monomer, welches die Durchführung der Hydrolyse unter Verwendung von N-Acetyl-D-glucosamindeacetylase nach Anspruch 1 umfaßt.