JPH02252701A - 新規環状イヌロオリゴ糖およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な環状イヌロオリゴ糖およびその製造法
に関するものである。

〔従来の技術〕

数個の糖単位からなる環状化合物としては、従来、α−
１，４結合したグルコース６〜８分子からなるサイクロ
デキストリンが知られている。この環状オリゴ糖は、種
々の物質を包接し、それにより、光や熱に対する安定性
を向上させ、揮発性物質を安定に保持し、さらには水難
溶性物質を易溶性にする・など１．有用な作用を示すか
ら、食品、医薬品、化粧品等の分野で広く用いられてい
る。しかしながら、グルコース以外の糖が環状オリゴ糖
を形成した例はあまり知られておらず、フラクトースの
場合、７ラクト一ス２分子からなるものが報告されてい
るだけで、それ以上の多数分子からなる環状化合物は知
られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明の目的は、従来知られてはいないがその有
用性が大いに期待される多数のフラクトース分子からな
る環状オリゴ糖を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明が提供することに成功した新規環状オリゴ糖は、
ｆ記のように７ラクト一ス６〜８分子がβ二２，１結合
で環状構造を形成してなるものである。

この環状イヌロオリゴ糖は、重合度が８以上のβ２，１
結合フラクトースポリマーに作用してフラクトース６〜
８分子からなる環状オリゴ糖を分子内転移反応により生
じさせる酵素・ｃｙｃｌｏｉｎｕｌｏ−ｏｌｉ（ｏｓｉ
ｃｃｂｉｒｉｄ＊ｒｒｕｃｌａｎｏＬｒａｎｓｆｔｒａ
ｓｅ　（略称：ＣＦＴａｓｅ）または該酵素を菌体外に
産生する微生物をイヌリンに作用させることにより、製
造することができる。

環状イヌロオリゴ糖を製造するにあたり使用する酵素・
ＣＦＴａｓｃを産生する微生物の例としては、バチルス
・サーキュランスＭＩ　Ｎｏ、３１　（＠工研菌寄第９
９４３号）がある。

ＣＦＴａｓｅは、バチルス・サーキュランスＭ２　Ｎｏ
ｊｌ（微工研菌寄第９９４３号）など、この酵素を生産
する能力を有する細菌を、β−２，１−フラクトシド結
合を有するフラクトースポリマーの存在下に培養するこ
とにより、誘導産生させることができる。このとき使用
可能なフラクトースのポリマーとしては、イヌリン、レ
バン、イヌロオリゴ糖類、フラクトオリゴ糖類、レバン
オリゴ糖類、およびこれらを含有する植物抽出物または
微生物培養物などがあるが、特に好ましいのは、イヌリ
ンおよびレバンである。ＣＦＴａｓｅは菌体外に生産さ
れるので、培養液から菌体を除去した後、硫安塩析、限
外ろ過、イオン交換樹脂クロマトグラフィーゲル濾過カ
ラムクロマトグラフィーなど、任意の酵素精製手段で精
製することにより容易に高活性のものを得ることができ
る。

次に、ＣＦＴｘｓｓまたはその生産菌を用いてイヌロオ
リゴ糖を製造する方法について詳述する。

ＣＦＴａｓｅ生産菌をイヌリンに作用させる場合は、イ
ヌリンまたはイヌリン含有植物抽出物を約０．１〜５０
重量％含有させた培地で、温度２０〜３５℃で１〜６日
間、ＣＦ　Ｔ　ａｓｅ生産菌を培養する。培養によりＣ
ＦＴａｓｃが生産され、生産されたＣ　Ｆ　Ｔ　ａｓｔ
の作用により培地中のイヌリンから本発明の環状イヌロ
オリゴ糖が生成するので、培養終了後、培養物から環状
イヌロオリゴ糖を採取する。

精製したＣＦＴａｓｅを用いる場合は、イヌリンまたは
イヌリン含有植物抽出物の水溶液にＣＦ　Ｔ　ａｓｅを
加え、好ましくはｐＨ６〜８（特に好ましくはｐＨ６，
３〜６．８）、温度１０〜７０°Ｃ（特に好ましくは３
５〜５０′Ｃ）で、最高収率が達成されるまで反応させ
ればよい。反応に用いるＣＦＴａｓｅとしては、ＣＦＴ
ａｓｅ生産菌の培養物から菌体を除去しただけの粗酵素
液を用いることもできるし、これを酵素精製の常法によ
り精製した酵素を用いることもできる。また、アルギン
酸カルシウムゲル包括、グルタルアルデヒド処理等の酵
素固定化の常法により固定化したＣ　Ｆ　Ｔ　ａｓｃを
用いてもよい。

酵素反応終了後、反応液から目的物である環状イヌロオ
リゴ糖を採取する手段としては、活性炭カラムクロマト
グラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー
等のクロマトグラフィー処理、種々の膜を用いる膜分離
濃縮などがある。

得られる環状イヌロオリゴ糖は、フラクトース重合度ｎ
が６〜８のものの混合物である。組成は酵素反応の条件
によって窯わり、通常、ｎが６のものが５０〜１００％
、ｎが７のものが０〜５０％、ｎが８のものが０〜２０
％の範囲で変動する。これら３種のオリゴ糖は、いずれ
も包接作用を有するので、多くの用途には、組成のいか
んにかかわらず混合物のままでも使用することができる
。しかしながら、３種の環状イヌロオリゴ塘を分離する
必要があるとき（ジ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー等のクロマトグラフィーによる分離を行う。

本発明による３種の環状イヌロオリゴ糖の構造は、次の
ような事実により確認された（後記実施例１参照）。

■　還元力 還元力をネルソンーソモギ法で測定すると、いずれも還
元力を示さず、非還元糖であることが確認され、環状構
造が支持された。

■　構成糖 ０、ｌＮ−Ｈ，Ｓｏ、により６０℃で２時間加水分解す
るといずれからも単糖類としてはフラクトースのみが得
られ、フラクトースのみからなるものであることが確認
された。

■　”Ｃ−ＮＭＲスペクトル いずれも６本のシグナルが認められるだけであって、環
状構造が支持された。また、イヌリンの１３Ｃ−ＮＭＲ
スペクトルと比較して、β−２，１結合していることが
確認された。

■　分子量 マススペクトルによる分子量測定は、分子量がそれぞれ
９７２．１１３５、および１２９７であることを示し、
フラクトース残基の数が６．７、および８であることが
確認された。

本発明の環状イヌロオリゴ糖は、次のような物理的化学
的性質を有する。

■　味：無味 ■　色：白色粉末 ■　溶解性：室温で水１０ｍ１にＩｇは容易に溶解する
。

■　温度安定性：１％水溶液を１２０’Ｃで１０分間、
沸騰水中で２０分間、７０°Ｃで１時間、加熱したが、
分解されなかった。

■　ｐＨ安定性：　Ｍｅ　Ｉ　１ｙｓｉｎｅ氏緩衝液（
ｐＨ３，３，５〜７゜０）に１％濃度となるように溶解
し、沸騰水中で２０分間、７０°Ｃで１時間、加熱した
が、分解されなかった。

■　微生物分解性： 下記１０種の細菌、酵母、カビについて試験したが、炭
素源として利用されず、分解されなかった。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｏｓＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｂ＋ａ　ｃｏｌｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｘｓ　［１ｕｏｒｅｓｃｓ＋＋５Ｌ
ｉｃＬｏｂｘｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉＬａｃｌｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ａｒａｂｉｎｏｓｕｓＳｘｃｃｈｘｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＰｉｃｈｉｚ　１ａ
ｋａｘａｖａｅ Ｒｈｉｒｏｐｎｓ　ｏｉｇｒｉｃａｎｓｌＪｕｃｏｒ　
ｐｕｓｉｌｌａｓ Ａｓｐｅｒ（ｉｆ！ｕｓ　ｏｒｙｘａｅＡｓｐｓｒ（ｉ
ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ 〔実施例〕 以下、実施例を示して本発明を説明する。

実施例１ イヌリン　１％、酵母エキス０．５％、Ｋ２ＨＰＯ，０
，１％、ＮｌＮ０．０．５％、Ｍｇ５Ｏ，・７１１２０
０．０５％を含むＩＩＨ７，０の培地１００ｍ１を入れ
た５０（ｌａｌ容坂ロコルペン２０本にバチルス・サー
キュランスＭ２　Ｎｏ、３１を植菌し、２８°Ｃで４日
間、振とう培養した。培養終了後、遠心分離して菌体を
除き、培養液上清１８００ｍｌを得ｔこ。

この培養液上清を活性炭−セライトカラム（直径５ｃｍ
、高さ５０　ｃｍ　；活性炭とセライトのｌ＝１混合物
を充填）に通し、オリゴ糖を吸着させた。次いで、カラ
ムに５ａの水を流した後、濃度５％、１０％、１５％、
２０％、２５％、３０％のエタノール含有水容５Ｑを順
次流して吸着物を溶出させると、オリゴ糖は１５％エタ
ノールによる溶出画分に高率で含まれていた。この画分
を減圧濃縮し、乾燥物５．０ｇを得た。

上記乾燥物１．０ｇを少量の水に溶解し、Ｂｉｏ−（ｅ
ｌ　Ｐ４　（ＢＩＯＲＡＤ社）によるゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーを行なった。溶出液は、溶出するオリ
ゴ糖を薄層クロマトグラフィーにより検出しながら１０
ｍ１ごとに採取し、その後、同一オリゴ糖の溶出フラク
ションをまとめて濃縮、乾燥した。

得られた三つのフラクションα−ＣＩ　（２１０ｎｙｘ
）、β−ＣＩ（３０ｍｇ）およびγ−（１（Ｌｏｍｇ）
は、いずれも高速液体クロマトグラフィーで１ピークの
ものであった。

これらのオリゴ糖は還元性を示さず、また、０、ｌＮＨ
２ＳＯ４による６０°Ｃ・２時間の加水分解で生成する
単糖類はフラクトースのみであった。

α−ＣＩをＤ２０に溶解し、内部標準としてジオキサン
を用いて”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、６
１．４　ｐｐｍ（Ｃ−１）、１０３．７　ｐｐｍ（Ｃ−
Ｄ、７９．Ｏｐｌｌｍ（Ｃ−３）、７５　、２　ｐｐｍ
（Ｃ−４）、８２　、３　ｐｐｍ（Ｃ−５）、６３．３
ｐｐｍ（Ｃ−６）の６本のシグナルしか検出されなかっ
た。また、文献（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｖｏｌ、７Ｊ　ｐ、４５−５７）記載のイヌ
リンの”Ｃ−ＮＭＲと比較することにより、σ−ＣＩは
フラクトースがβ−２，１結合で環状構造を形成してい
ることが確認された。さらに、α−ＣＩの完全メチル化
体をメチル化アルジトールアセテートとしてＧＣ−マス
スペクトル分析した結果も、上記結合様式を支持した。

β−ＣＩおよびγ−ＣＩの１３Ｃ−ＮＭＲもσ−ＣＩの
場合とほぼ同一のスペクトルを示し、αＣ■同様、フラ
クトースがβ−２，１結合で環状構造を形成しているこ
とが確認された。

さらに、マススペクトル分析の結果、ａ−Ｃ！はヘキソ
ース分子６個、β−ＣＩはヘキソース分子７個、γ−Ｃ
Ｉはヘキソース分子８個にそれぞれ相当する分子量のも
のであることが確認された。

以上の結果より、α−ＣＩはフラクトース６分子が、β
−ＣＩはフラクトース７分子が、γ−ＣＩはフラクトー
ス８分子が、それぞれβ−２，１結合で環状構造を形成
している化合物であることを確認した。

実施例２ 実施例１の場合と同一条件でバチルス・サーキュランス
ＭＸ　Ｎｏ、３１株を培養し、培養終了後、遠心分離し
て培養液から菌体を除き、培養上清１．８αを得た。

この上清ｌＱを粗酵素液として２％イヌリン水溶液ｌｌ
に加え、ｐＨ６，５，４５°Ｃで、４日間反応させた。

次いで１００℃で１０分間加熱して、酵素を失活させＩ
こ　。

以下、実施例１と同様に処理して、α−ＣＩ４．７４ｇ
１β−Ｃ１１，０４ｇ、γ−ＣＩ０．２２ｇを得た。得
られた各環状イヌロオリゴ糖の性質は、実施例１で示し
た値と一致した。

実施例３ 実施例２により得られた環状イヌロオリゴ糖について、
α−トコフェロールに対する包接作用を調べた。

５０％メタノールを溶媒とする０、２％環状イヌロオリ
ゴ糖溶液に０．１％σ−トコフェロール溶液（溶媒：メ
タノール）５０１を加え、よく混合、撹拌した後、１夜
放置した。溶媒を減圧下除去し、乾燥した後、蒸留水５
ｍｌを加え、よく混合、撹拌し、メンブレンフィルター
（０，４５μｍ）で不溶物を除いてから、２９４鱈の吸
光度・ＯＤｚ＊４を測定した。０Ｄｚｓ４は、環状イヌ
ロオリゴ糖に包接されて水に溶けたα−トコフェロール
の量に比例する。

結果を表１に示す。

〔発明の効果〕

本発明による環状イヌロオリゴ糖は、包接作用を有する
ので、難水溶性物質の可溶化、光や熱に対して不安定な
物質の安定化、矯味、矯臭、揮発性物質の保持などに有
用なものである。

本発明の環状イヌロオリゴ糖はまた、水への溶解性表１ がよく、非還元糖であるためアミノ酸との褐変反応を起
こさず、味やにおいもない。さらに、通常の使用法にお
いて遭遇する熱、酸、アルカリ等に安定であり、微生物
により資化されにくいなど、きわめて有利な性質を持つ
から、多くの用途に制限なく使用することができるとい
う特長がある。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）フラクトース６〜８分子がβ−２，１結合で環状
   構造を形成してなる新規環状イヌロオリゴ糖。
2. （２）重合度８以上のβ−２，１結合フラクトースポリ
   マーに作用して分子内転移反応によりフラクトース６〜
   ８分子からなる環状オリゴ糖を生じさせる酵素または該
   酵素を菌体外に産生する微生物をイヌリンに作用させる
   ことを特徴とする、フラクトース６〜８分子からなる環
   状イヌロオリゴ糖の製造法。
3. （３）バチルス・サーキュランスＭＺＮｏ、３１（微工
   研菌寄第９９４３号）が産生する酵素をイヌリンに作用
   させる請求項２記載の製造法。