JPH06277085A - 低分子量分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
低分子量分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法Info
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- JPH06277085A JPH06277085A JP7046593A JP7046593A JPH06277085A JP H06277085 A JPH06277085 A JP H06277085A JP 7046593 A JP7046593 A JP 7046593A JP 7046593 A JP7046593 A JP 7046593A JP H06277085 A JPH06277085 A JP H06277085A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 分岐β−１，３−グルカンを選択的に加水分
解して分岐β−１，３−グルカンの基本構造を保持した
まま低分化できる方法および分岐ラミナリオリゴ糖の製
造方法を提供すること。 【構成】 ３重らせん構造を有する分岐β−１，３−グ
ルカンの高次構造を少くとも部分的にランダム状態に導
いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作
用させて低分子化させることを特徴とする低分子量分岐
β−１，３−グルカン及び／又は３から８糖の分岐ラミ
ナリオリゴ糖の製造方法。
解して分岐β−１，３−グルカンの基本構造を保持した
まま低分化できる方法および分岐ラミナリオリゴ糖の製
造方法を提供すること。 【構成】 ３重らせん構造を有する分岐β−１，３−グ
ルカンの高次構造を少くとも部分的にランダム状態に導
いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼを作
用させて低分子化させることを特徴とする低分子量分岐
β−１，３−グルカン及び／又は３から８糖の分岐ラミ
ナリオリゴ糖の製造方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗腫瘍活性を有する低
分子量の分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオ
リゴ糖の製造方法、特に分岐β−１，３−グルカンの３
重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐β−１，３
−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖を製造する方法に
関する。
分子量の分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオ
リゴ糖の製造方法、特に分岐β−１，３−グルカンの３
重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐β−１，３
−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖を製造する方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】低分子量β−１，３−グルカン及びラミ
ナリオリゴ糖には、有用な生化学的や医薬的性質を有す
ることが報告されているように、これらの糖には幅広い
用途が期待されている。具体的には、このような有用な
性質として、例えば、分岐β−１，３−グルカンは強い
免疫賦活作用を有し、抗腫瘍効果（臨床免疫１７（Supp
l. 9）２００〜２１７，１９８５），抗ウィルス効果
（近大医誌，第６巻３号３８７〜３９１，１９８１），
傷の修復効果（JOURNAL OF THE RETICULOENDOTHELIAL S
OCIETY27（１）.,１９８０）など広範な活性を有するこ
とが知られている。また、それら多糖の構成単位である
分岐オリゴ糖には、ラットの成長と腸内細菌糞に対する
影響（土橋昇、渡辺智子ら、千葉県立衛生短期大学紀要
Vol７、No.２ P３３−４１（１９８８））や植物エリ
シター活性の増加、硫酸化ラミナリオリゴ糖の低副作用
抗エイズ効果（生島直也、東海林忠生ら、高分子学会予
稿集 Vol39、No８ P２７５７−２７５９（１９９０））
等が知られている。また、これらの分岐オリゴ糖はその
多糖の構造解析や生理活性の発現メカニズムの解明など
基礎的研究への応用面で有効である。これらラミナリオ
リゴ糖の調製は、β−１，３−グルカンまたは分岐β−
１，３−グルカンの酸による部分加水分解や酵素（ J.F
erment Technol Vol 63 No１P６１−６６（１９８
５））による加水分解等により得られることが知られて
いる。また、グルコースホスホリラーゼの転移反応（ A
gric Biol Chem Vol 55 No５ P１４３１−１４３２（１
９９１））や有機合成法によって得られることも知られ
ている。
ナリオリゴ糖には、有用な生化学的や医薬的性質を有す
ることが報告されているように、これらの糖には幅広い
用途が期待されている。具体的には、このような有用な
性質として、例えば、分岐β−１，３−グルカンは強い
免疫賦活作用を有し、抗腫瘍効果（臨床免疫１７（Supp
l. 9）２００〜２１７，１９８５），抗ウィルス効果
（近大医誌，第６巻３号３８７〜３９１，１９８１），
傷の修復効果（JOURNAL OF THE RETICULOENDOTHELIAL S
OCIETY27（１）.,１９８０）など広範な活性を有するこ
とが知られている。また、それら多糖の構成単位である
分岐オリゴ糖には、ラットの成長と腸内細菌糞に対する
影響（土橋昇、渡辺智子ら、千葉県立衛生短期大学紀要
Vol７、No.２ P３３−４１（１９８８））や植物エリ
シター活性の増加、硫酸化ラミナリオリゴ糖の低副作用
抗エイズ効果（生島直也、東海林忠生ら、高分子学会予
稿集 Vol39、No８ P２７５７−２７５９（１９９０））
等が知られている。また、これらの分岐オリゴ糖はその
多糖の構造解析や生理活性の発現メカニズムの解明など
基礎的研究への応用面で有効である。これらラミナリオ
リゴ糖の調製は、β−１，３−グルカンまたは分岐β−
１，３−グルカンの酸による部分加水分解や酵素（ J.F
erment Technol Vol 63 No１P６１−６６（１９８
５））による加水分解等により得られることが知られて
いる。また、グルコースホスホリラーゼの転移反応（ A
gric Biol Chem Vol 55 No５ P１４３１−１４３２（１
９９１））や有機合成法によって得られることも知られ
ている。
【０００３】従来の分岐β−１，３−グルカンの分解方
法として、酸加水分解法、超音波照射法（Carbohydrate
Research,８９（１９８１）１２１−１３５）、高速噴
射法（ Agric.Biol.Chem. ４８（４）９１５〜９２１，
１９８４）、γ線照射法（日本農芸化学会誌６６巻１１
号 １６３３〜１６４０，１９９２）及び酵素加水分解
法など各種の方法が知られている。これらのうち超音波
照射法、高速噴射法、γ線照射法では高分子体の低分子
化には有効であるが、通常これらの低分子化方法では多
糖の高次構造は破壊される場合が多く、もとの多糖がも
っている三重らせん高次構造を保持した分子量２０万か
ら１万の低分子量体を調製するのは非常に困難である。
また、オリゴ糖の調製には長時間の処理が必要であり、
短期間の処理では物理的に困難である。酸加水分解法で
は分岐β−１，３−グルカンが無秩序に加水分解される
ので、特定の分岐オリゴ糖を得るのが難しい。酵素加水
分解では得られるオリゴ糖は主にグルコース，ラミナリ
ビオース，ゲンチビオースであり、それ以上の重合度を
持つオリゴ糖や分岐オリゴ糖の調製は非常に困難であ
る。従って、これまでの低分子化方法では特定の３重ら
せん構造を有する低分子量β−１，３−グルカンおよび
特定の結合を有する分岐オリゴ糖を大量に調製すること
が困難であるため、このような低分子量グルカンおよび
分岐ラミナリオリゴ糖の性質やこれらの糖を用いた構造
研究などに関する基礎的研究は殆ど行われていないのが
実情であり、これらの糖の簡便で効率のよい製造方法の
開発が望まれている。
法として、酸加水分解法、超音波照射法（Carbohydrate
Research,８９（１９８１）１２１−１３５）、高速噴
射法（ Agric.Biol.Chem. ４８（４）９１５〜９２１，
１９８４）、γ線照射法（日本農芸化学会誌６６巻１１
号 １６３３〜１６４０，１９９２）及び酵素加水分解
法など各種の方法が知られている。これらのうち超音波
照射法、高速噴射法、γ線照射法では高分子体の低分子
化には有効であるが、通常これらの低分子化方法では多
糖の高次構造は破壊される場合が多く、もとの多糖がも
っている三重らせん高次構造を保持した分子量２０万か
ら１万の低分子量体を調製するのは非常に困難である。
また、オリゴ糖の調製には長時間の処理が必要であり、
短期間の処理では物理的に困難である。酸加水分解法で
は分岐β−１，３−グルカンが無秩序に加水分解される
ので、特定の分岐オリゴ糖を得るのが難しい。酵素加水
分解では得られるオリゴ糖は主にグルコース，ラミナリ
ビオース，ゲンチビオースであり、それ以上の重合度を
持つオリゴ糖や分岐オリゴ糖の調製は非常に困難であ
る。従って、これまでの低分子化方法では特定の３重ら
せん構造を有する低分子量β−１，３−グルカンおよび
特定の結合を有する分岐オリゴ糖を大量に調製すること
が困難であるため、このような低分子量グルカンおよび
分岐ラミナリオリゴ糖の性質やこれらの糖を用いた構造
研究などに関する基礎的研究は殆ど行われていないのが
実情であり、これらの糖の簡便で効率のよい製造方法の
開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、分岐β−
１，３−グルカンを選択的に加水分解して分岐β−１，
３−グルカンの基本構造を保持したまま低分化できる方
法および分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
１，３−グルカンを選択的に加水分解して分岐β−１，
３−グルカンの基本構造を保持したまま低分化できる方
法および分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、分岐β−１，
３−グルカンの高次構造である３重らせん構造をランダ
ム構造にすると、これまで殆ど反応しなかったエンドタ
イプのβ−１，３−グルカナーゼに対する基質親和性が
増加し、該グルカナーゼがβ−１，３−結合のある一部
分を特異的に効率よく加水分解し、分岐β−１，３−グ
ルカンの３重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐
β−１，３−グルカンを製造することができ、同時に特
定の構造を持つ３糖以上の分岐ラミナリオリゴ糖を短時
間でしかも大量に製造できるとの知見によりなされたの
である。すなわち、本発明は、３重らせん構造を有する
分岐β−１，３−グルカンの高次構造を少くとも部分的
にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ−１，３
−グルカナーゼを作用させて低分子化させることを特徴
とする低分子量分岐β−１，３−グルカンの製造方法及
びこの反応において副生する分岐ラミナリオリゴ糖の製
造方法を提供する。
３−グルカンの高次構造である３重らせん構造をランダ
ム構造にすると、これまで殆ど反応しなかったエンドタ
イプのβ−１，３−グルカナーゼに対する基質親和性が
増加し、該グルカナーゼがβ−１，３−結合のある一部
分を特異的に効率よく加水分解し、分岐β−１，３−グ
ルカンの３重らせん高次構造を保持した低分子量の分岐
β−１，３−グルカンを製造することができ、同時に特
定の構造を持つ３糖以上の分岐ラミナリオリゴ糖を短時
間でしかも大量に製造できるとの知見によりなされたの
である。すなわち、本発明は、３重らせん構造を有する
分岐β−１，３−グルカンの高次構造を少くとも部分的
にランダム状態に導いた後、エンドタイプのβ−１，３
−グルカナーゼを作用させて低分子化させることを特徴
とする低分子量分岐β−１，３−グルカンの製造方法及
びこの反応において副生する分岐ラミナリオリゴ糖の製
造方法を提供する。
【０００６】本発明に使用できる基質は、β−１，３−
グルカン類で特に制限はなく、自然界に存在するものは
勿論のこと、培養により得られるグルカンも任意に用い
られ、例えばシゾフィラン、カードラン、パラミロン、
スクレログルカンなどで分離精製したもの以外に培養ブ
ロスでも利用することが出来る。また、本発明に使用で
きる酵素は、市販のエンドタイプのβ−１，３−グルカ
ナーゼ活性を有する酵素は勿論のこと培養により得られ
るエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有す
るものであれば利用できる。市販のエンドタイプのβ−
１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素としては、例え
ば、生化学工業（株）のザイモリアーゼ(Zymolyaze-100
T(Zase))や同20Ｔ、ケイアイ化成（株）のKitalase、天
野製薬（株）の溶菌酵素YL−15などをあげることができ
る。
グルカン類で特に制限はなく、自然界に存在するものは
勿論のこと、培養により得られるグルカンも任意に用い
られ、例えばシゾフィラン、カードラン、パラミロン、
スクレログルカンなどで分離精製したもの以外に培養ブ
ロスでも利用することが出来る。また、本発明に使用で
きる酵素は、市販のエンドタイプのβ−１，３−グルカ
ナーゼ活性を有する酵素は勿論のこと培養により得られ
るエンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ活性を有す
るものであれば利用できる。市販のエンドタイプのβ−
１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素としては、例え
ば、生化学工業（株）のザイモリアーゼ(Zymolyaze-100
T(Zase))や同20Ｔ、ケイアイ化成（株）のKitalase、天
野製薬（株）の溶菌酵素YL−15などをあげることができ
る。
【０００７】以下に、シゾフィランを基質としザイモリ
アーゼの酵素反応を利用する製造法について説明する。
まず、基質である該多糖の高次構造を３重らせん構造か
ら少なくとも部分的にランダムコイルに導く。これは、
例えば、0.１Ｎ以上の水酸化ナトリウムや水酸化カリウ
ム等のアルカリ溶液，ＤＭＳＯ等の有機溶剤或は尿素等
の水素結合破壊剤を用いることにより行うことができ
る。そして、アルカリ溶液を用いた場合には、その後、
酸により中和して少なくとも部分的にランダムコイルの
多糖溶液を得ることができる。又、ＤＭＳＯ等の有機溶
剤を添加した場合にはアルコール、アセトン等水混和性
の有機溶剤を用いて多糖をランダムコイルのまま沈殿さ
せると同時に、溶媒として用いたＤＭＳＯ等の脱有機溶
剤後、沈殿物を水に再溶解することにより少なくとも部
分的にランダムコイルの多糖溶液を調製することが出来
る。また、多糖の溶液を加熱処理、例えば１３０℃以上
１５０℃以下の温度で処理を行うことによっても３重ら
せん構造をランダムコイルに変化させることができる。
アーゼの酵素反応を利用する製造法について説明する。
まず、基質である該多糖の高次構造を３重らせん構造か
ら少なくとも部分的にランダムコイルに導く。これは、
例えば、0.１Ｎ以上の水酸化ナトリウムや水酸化カリウ
ム等のアルカリ溶液，ＤＭＳＯ等の有機溶剤或は尿素等
の水素結合破壊剤を用いることにより行うことができ
る。そして、アルカリ溶液を用いた場合には、その後、
酸により中和して少なくとも部分的にランダムコイルの
多糖溶液を得ることができる。又、ＤＭＳＯ等の有機溶
剤を添加した場合にはアルコール、アセトン等水混和性
の有機溶剤を用いて多糖をランダムコイルのまま沈殿さ
せると同時に、溶媒として用いたＤＭＳＯ等の脱有機溶
剤後、沈殿物を水に再溶解することにより少なくとも部
分的にランダムコイルの多糖溶液を調製することが出来
る。また、多糖の溶液を加熱処理、例えば１３０℃以上
１５０℃以下の温度で処理を行うことによっても３重ら
せん構造をランダムコイルに変化させることができる。
【０００８】この様にして得られたランダムコイル多糖
溶液は、２％以上の高濃度の場合ゲル状でそれ以下の低
濃度では粘度の高い溶液となる。この溶液にザイモリア
ーゼを作用させて酵素反応を行わせ、例えば１時間でこ
れらの粘稠な溶液は低粘度の溶液に変化し目的の低分子
量シゾフィラン及び分岐ラミナリオリゴ糖を得ることが
出来る。酵素反応は３５〜４５℃で行うのが好ましい。
図１に調製した分岐オリゴ糖画分のＨＰＬＣチャートを
示したが３糖，４糖を中心に８糖まで確認することが出
来る。また、未分解の多糖は、元の分子量と比較して１
／２〜１／１００以下の分子量にシフトすることもわか
った。こうして得られた酵素反応液より、目的とする低
分子量の多糖或は分岐ラミナリオリゴ糖は、ＵＦ膜処理
やエタノールなどの有機溶剤による沈澱分離法により簡
単に分離することが出来る。低分子量体はその分子量が
６０万から１万までの混合物であるが、アセトンやアル
コールによる分子量分別沈殿により簡単に、分子量分画
を行うことができる。また、低分子量体は、再度酵素処
理することにより全てをオリゴ糖に導くことが出来る。
集めたオリゴ糖は、活性炭カラムクロマト分離、ゲルろ
過カラムクロマト分離、ＯＤＳカラムクロマト分離によ
り純度９０％以上に精製できる。また、糖液を水または
アルコール−水の２溶媒系で結晶化する事により更に高
純度標品に導くことが出来る。
溶液は、２％以上の高濃度の場合ゲル状でそれ以下の低
濃度では粘度の高い溶液となる。この溶液にザイモリア
ーゼを作用させて酵素反応を行わせ、例えば１時間でこ
れらの粘稠な溶液は低粘度の溶液に変化し目的の低分子
量シゾフィラン及び分岐ラミナリオリゴ糖を得ることが
出来る。酵素反応は３５〜４５℃で行うのが好ましい。
図１に調製した分岐オリゴ糖画分のＨＰＬＣチャートを
示したが３糖，４糖を中心に８糖まで確認することが出
来る。また、未分解の多糖は、元の分子量と比較して１
／２〜１／１００以下の分子量にシフトすることもわか
った。こうして得られた酵素反応液より、目的とする低
分子量の多糖或は分岐ラミナリオリゴ糖は、ＵＦ膜処理
やエタノールなどの有機溶剤による沈澱分離法により簡
単に分離することが出来る。低分子量体はその分子量が
６０万から１万までの混合物であるが、アセトンやアル
コールによる分子量分別沈殿により簡単に、分子量分画
を行うことができる。また、低分子量体は、再度酵素処
理することにより全てをオリゴ糖に導くことが出来る。
集めたオリゴ糖は、活性炭カラムクロマト分離、ゲルろ
過カラムクロマト分離、ＯＤＳカラムクロマト分離によ
り純度９０％以上に精製できる。また、糖液を水または
アルコール−水の２溶媒系で結晶化する事により更に高
純度標品に導くことが出来る。
【０００９】クロマト分離により精製したオリゴ糖の構
造は、箱守法によるメチル化及び還元末端を還元後箱守
法によるメチル化を行い、ＴＦＡによる加水分解後還元
しアセチル誘導体に導きＳｉ１８８キャピラリーカラム
でガスクロマト分析を行った結果、構成糖はグルコース
でその構造式は図２に示すものであることが分かった。
また、還元末端をピリジルアミノ化後ＯＤＳカラムによ
るＨＰＬＣ分析の結果、図２の構造に間違いないことを
確認し、その純度は１００％であった。また、このよう
にして得られた分子量約２0,０００の多糖は、コンゴレ
ッドとの錯体形成および熱容量測定により３重らせん構
造を保持していることが確認された。以上のようにし
て、本発明によれば分子量６００万以上の分岐β−１，
３−グルカンから、分岐β−１，３−グルカンの３重ら
せん構造を保持したまま分子量１０万以下の低分子量分
岐β−１，３−グルカン及び３〜８糖の分岐ラミナリオ
リゴ糖を得ることができる。さらに、エタノール分別沈
殿やゲル濾過分画を行い、分子量８0,０００〜２0,００
０の任意の分子量のものを得ることもできる。次に実施
例により本発明を説明する。
造は、箱守法によるメチル化及び還元末端を還元後箱守
法によるメチル化を行い、ＴＦＡによる加水分解後還元
しアセチル誘導体に導きＳｉ１８８キャピラリーカラム
でガスクロマト分析を行った結果、構成糖はグルコース
でその構造式は図２に示すものであることが分かった。
また、還元末端をピリジルアミノ化後ＯＤＳカラムによ
るＨＰＬＣ分析の結果、図２の構造に間違いないことを
確認し、その純度は１００％であった。また、このよう
にして得られた分子量約２0,０００の多糖は、コンゴレ
ッドとの錯体形成および熱容量測定により３重らせん構
造を保持していることが確認された。以上のようにし
て、本発明によれば分子量６００万以上の分岐β−１，
３−グルカンから、分岐β−１，３−グルカンの３重ら
せん構造を保持したまま分子量１０万以下の低分子量分
岐β−１，３−グルカン及び３〜８糖の分岐ラミナリオ
リゴ糖を得ることができる。さらに、エタノール分別沈
殿やゲル濾過分画を行い、分子量８0,０００〜２0,００
０の任意の分子量のものを得ることもできる。次に実施
例により本発明を説明する。
【００１０】
実施例１ シゾフィラン（分子量６０万）１ｇを0.２Ｎ水酸化ナト
リウム溶液２０mlに完全に溶解してシゾフィラン溶液を
得た。このシゾフィラン溶液を0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中
に撹拌しながら添加し、添加後pH６に調整し全量を１０
０mlとした。この溶液にザイモリエイス−２０Ｔ（生化
学工業製）を2.５mg加えて溶解し４０℃〜４５℃で撹拌
しながら１０時間反応させた。得られたもののＨＰＬＣ
チャートを図１に、又その構造式を図２に示す。 比較例 シゾフィラン１ｇをpH６のリン酸緩衝液１００mlに溶解
し、ザイモリエイス−２０Ｔを2.５mg加え溶解後、４０
℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。実施例
１及び比較例で得られた反応液１mlを反応の所定時間ご
とに採取後煮沸しザイモリエイスを完全に失活させた。
その後、１００μｌをソモジーネルソン法に供し還元糖
測定を行い、残りの溶液は高速液体クロマトグラフィー
（HPLCカラム：TSK-Gel G5000PWXL ＋G3000PWXL ，Poly
spherCHNA)に供してオリゴ糖について分析した。各反応
系に於ける全糖量を１００として各時間のオリゴ糖量を
算出し、分解率とした。結果を図３に示す。図３より、
比較例の反応系に於いては、殆どオリゴ糖が生成しない
のに対し、実施例１の反応系では５時間でほぼ８０％が
分解しオリゴ糖が効率よく生成することがわかる。ま
た、ＨＰＬＣチャートより比較例の反応系に於ては、殆
ど分子量が変化しないのに対し、実施例１の反応系では
１時間でその平均分子量は１０万となっていることがわ
かる。
リウム溶液２０mlに完全に溶解してシゾフィラン溶液を
得た。このシゾフィラン溶液を0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中
に撹拌しながら添加し、添加後pH６に調整し全量を１０
０mlとした。この溶液にザイモリエイス−２０Ｔ（生化
学工業製）を2.５mg加えて溶解し４０℃〜４５℃で撹拌
しながら１０時間反応させた。得られたもののＨＰＬＣ
チャートを図１に、又その構造式を図２に示す。 比較例 シゾフィラン１ｇをpH６のリン酸緩衝液１００mlに溶解
し、ザイモリエイス−２０Ｔを2.５mg加え溶解後、４０
℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。実施例
１及び比較例で得られた反応液１mlを反応の所定時間ご
とに採取後煮沸しザイモリエイスを完全に失活させた。
その後、１００μｌをソモジーネルソン法に供し還元糖
測定を行い、残りの溶液は高速液体クロマトグラフィー
（HPLCカラム：TSK-Gel G5000PWXL ＋G3000PWXL ，Poly
spherCHNA)に供してオリゴ糖について分析した。各反応
系に於ける全糖量を１００として各時間のオリゴ糖量を
算出し、分解率とした。結果を図３に示す。図３より、
比較例の反応系に於いては、殆どオリゴ糖が生成しない
のに対し、実施例１の反応系では５時間でほぼ８０％が
分解しオリゴ糖が効率よく生成することがわかる。ま
た、ＨＰＬＣチャートより比較例の反応系に於ては、殆
ど分子量が変化しないのに対し、実施例１の反応系では
１時間でその平均分子量は１０万となっていることがわ
かる。
【００１１】実施例２ ザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）をキトパール
ＢＣＷ−３５０１（富士紡績製）にグルタールアルデヒ
ドを介して固定化した固定化酵素をジャケット付きカラ
ムに詰め、別に調製した実施例１と同様のアルカリ処理
ＳＰＧ溶液を空間速度；ＳＶ＝0.５にて流し連続的に反
応を行った。反応液からオリゴ糖生成と分解率を実施例
１と同様にして算出した。また、カラム内の固定化酵素
の残存活性を測定するため繰り返し反応を行い分解率を
算出した。その結果、オリゴ糖については生成率が多少
低下するものの残存活性の半減期（５０％）になるには
実施例１のバッチ方式と比較して１０倍以上の基質を処
理できることを確認した。
ＢＣＷ−３５０１（富士紡績製）にグルタールアルデヒ
ドを介して固定化した固定化酵素をジャケット付きカラ
ムに詰め、別に調製した実施例１と同様のアルカリ処理
ＳＰＧ溶液を空間速度；ＳＶ＝0.５にて流し連続的に反
応を行った。反応液からオリゴ糖生成と分解率を実施例
１と同様にして算出した。また、カラム内の固定化酵素
の残存活性を測定するため繰り返し反応を行い分解率を
算出した。その結果、オリゴ糖については生成率が多少
低下するものの残存活性の半減期（５０％）になるには
実施例１のバッチ方式と比較して１０倍以上の基質を処
理できることを確認した。
【００１２】実施例３ シゾフィリューム・コミューン培養ブロスから遠心分離
除去した菌体２５０ｇに0.５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
２５０mlを加え撹拌後１Ｎ塩酸にてpH７に調製した。こ
れにザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）５mgを加
え溶解し４５℃にて１０時間反応を行った。反応液を実
施例１と同様にＨＰＬＣ分析した結果、同様のオリゴ糖
を生成していることを確認した。 実施例４ スクレログルカン１ｇを0.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液２
０mlに完全に溶解させた。このスクレログルカン溶液を
0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中に撹拌しながら添加し、添加後
pH６に調整し全量を１００mlとした。この溶液にザイモ
リエイス−２０Ｔ（生化学工業製）を2.５mg加え溶解し
４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。生
成したオリゴ糖をＨＰＬＣ分析により確認したところシ
ゾフィランと比較してやや重合度の多いオリゴ糖が生成
していることを確認した。
除去した菌体２５０ｇに0.５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
２５０mlを加え撹拌後１Ｎ塩酸にてpH７に調製した。こ
れにザイモリエイス−２０Ｔ（生化学工業製）５mgを加
え溶解し４５℃にて１０時間反応を行った。反応液を実
施例１と同様にＨＰＬＣ分析した結果、同様のオリゴ糖
を生成していることを確認した。 実施例４ スクレログルカン１ｇを0.２Ｎ水酸化ナトリウム溶液２
０mlに完全に溶解させた。このスクレログルカン溶液を
0.１Ｎ塩酸溶液４０ml中に撹拌しながら添加し、添加後
pH６に調整し全量を１００mlとした。この溶液にザイモ
リエイス−２０Ｔ（生化学工業製）を2.５mg加え溶解し
４０℃〜４５℃で撹拌しながら１０時間反応させた。生
成したオリゴ糖をＨＰＬＣ分析により確認したところシ
ゾフィランと比較してやや重合度の多いオリゴ糖が生成
していることを確認した。
【００１３】実施例５ 上記の方法により調製した低分子量分岐β−１，３−グ
ルカンの抗腫瘍効果を次のようにして測定した。すなわ
ち、対照群および試料投与群それぞれ１０匹ずつのマウ
スに、Sarcoma １８０腫瘍細胞２×１０6 個を皮下に移
植し、２４時間後に対照群には生食水を、試料投与群に
は１０mg／kg−マウス体重の投与量になるように調製し
た試料生食水溶液をそれぞれ0.０５mlずつ筋注した。腫
瘍移植後３１日後の腫瘍重量を測定し、以下の式によっ
て抑制率を求めた。 抑制率（％）＝〔１−（試料投与群の平均腫瘍重量
（ｇ）／（対照群の平均腫瘍重量（ｇ）〕×１００ 結果を表−１に示す。
ルカンの抗腫瘍効果を次のようにして測定した。すなわ
ち、対照群および試料投与群それぞれ１０匹ずつのマウ
スに、Sarcoma １８０腫瘍細胞２×１０6 個を皮下に移
植し、２４時間後に対照群には生食水を、試料投与群に
は１０mg／kg−マウス体重の投与量になるように調製し
た試料生食水溶液をそれぞれ0.０５mlずつ筋注した。腫
瘍移植後３１日後の腫瘍重量を測定し、以下の式によっ
て抑制率を求めた。 抑制率（％）＝〔１−（試料投与群の平均腫瘍重量
（ｇ）／（対照群の平均腫瘍重量（ｇ）〕×１００ 結果を表−１に示す。
【００１４】
【表１】 表−１ 試 料 腫瘍重量 抑制率 完全後退 M.W.×１０4 5.０ 酵 素 0.４５（±0.２９） ８7.３ ７／１０ 2.０ 1.８１（±0.５６） ４9.４ ４／１０ 5.５ ソニック 0.７５（±0.８５） ７9.０ ４／１０ 2.５ 3.５７（±1.７３） 0.１７ ２／１０ ＰＢＳ コントロール 3.５８（±0.５３） ─── ０／１０ ４5.０ 0.０１（±0.０２） ９9.６ ９／１０
【００１５】実施例６ シゾフィラン１ｇに水２０mlを加え耐圧耐熱のステンレ
ス製容器に入れ１４０℃の恒温機に１時間放置した後、
これにpH６のリン酸緩衝液１mlとザイモリエイス−２０
Ｔを2.５mg加えて溶解し４０〜４５℃で１０時間、振盪
反応させた。１０時間後、ＨＰＬＣ分析により、実施例
１と同様のオリゴ糖を生成していることを確認した。ま
た未分解の多糖も、低分子量であることを確認した。
ス製容器に入れ１４０℃の恒温機に１時間放置した後、
これにpH６のリン酸緩衝液１mlとザイモリエイス−２０
Ｔを2.５mg加えて溶解し４０〜４５℃で１０時間、振盪
反応させた。１０時間後、ＨＰＬＣ分析により、実施例
１と同様のオリゴ糖を生成していることを確認した。ま
た未分解の多糖も、低分子量であることを確認した。
【００１６】
【発明の効果】エンドタイプの加水分解酵素では、従来
殆ど反応しなかった分岐β−１，３−グルカンを、本発
明の方法によればその高次構造を変化させることにより
８０％以上の分解率で分解することができた。この方法
によって、従来の低分子化方法によっては得ることがで
きなかった３重らせん構造を保持した低分子量のβ−
１，３−グルカンを短時間で効率よく得ることが出来
た。また、この反応で生成する分岐ラナミリオリゴ糖は
有機合成等の手法では得ることの困難な特殊な構造を有
しているものも高収率で得られた。これら低分子量の分
岐β−１，３−グルカンおよび分岐ラミナリオリゴ糖や
それらの誘導体の生理的性質として、例えば抗腫瘍作
用、抗エイズ作用、ファイトアレキシンのエリシター活
性、整腸作用、酵素阻害活性等が考えられ、今後医薬品
や機能性食品としての用途が期待される。また、これま
で行なわれていない分岐β−１，３−グルカンのオリゴ
糖レベルからの物性、構造、生化学等の基礎的研究の発
展に寄与することが期待できる。
殆ど反応しなかった分岐β−１，３−グルカンを、本発
明の方法によればその高次構造を変化させることにより
８０％以上の分解率で分解することができた。この方法
によって、従来の低分子化方法によっては得ることがで
きなかった３重らせん構造を保持した低分子量のβ−
１，３−グルカンを短時間で効率よく得ることが出来
た。また、この反応で生成する分岐ラナミリオリゴ糖は
有機合成等の手法では得ることの困難な特殊な構造を有
しているものも高収率で得られた。これら低分子量の分
岐β−１，３−グルカンおよび分岐ラミナリオリゴ糖や
それらの誘導体の生理的性質として、例えば抗腫瘍作
用、抗エイズ作用、ファイトアレキシンのエリシター活
性、整腸作用、酵素阻害活性等が考えられ、今後医薬品
や機能性食品としての用途が期待される。また、これま
で行なわれていない分岐β−１，３−グルカンのオリゴ
糖レベルからの物性、構造、生化学等の基礎的研究の発
展に寄与することが期待できる。
【００１７】
【図１】 本発明の方法により製造した低分子量分岐β
−１，３−グルカン及びオリゴ糖のＨＰＬＣチャートを
示す。
−１，３−グルカン及びオリゴ糖のＨＰＬＣチャートを
示す。
【図２】 本発明の方法により製造した分岐ラミナリオ
リゴ糖を構成する糖の構造式を示す。
リゴ糖を構成する糖の構造式を示す。
【図３】 本発明の方法における酵素の作用時間による
分岐β−１，３−グルカンの分解率を示す。
分岐β−１，３−グルカンの分解率を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 ３重らせん構造を有する分岐β−１，３
−グルカンの高次構造を少くとも部分的にランダム状態
に導いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ
を作用させて低分子化させることを特徴とする低分子量
分岐β−１，３−グルカンの製造方法。 - 【請求項２】 ３重らせん構造を有する分岐β−１，３
−グルカンの高次構造を少くとも部分的にランダム状態
に導いた後、エンドタイプのβ−１，３−グルカナーゼ
を作用させて低分子化させることを特徴とする３から８
糖の分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07046593A JP3650409B2 (ja) | 1993-03-29 | 1993-03-29 | 低分子量分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07046593A JP3650409B2 (ja) | 1993-03-29 | 1993-03-29 | 低分子量分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277085A true JPH06277085A (ja) | 1994-10-04 |
| JP3650409B2 JP3650409B2 (ja) | 2005-05-18 |
Family
ID=13432304
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP07046593A Expired - Fee Related JP3650409B2 (ja) | 1993-03-29 | 1993-03-29 | 低分子量分岐β−１，３−グルカン及び分岐ラミナリオリゴ糖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3650409B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2766059A1 (fr) * | 1997-07-18 | 1999-01-22 | Goemar Lab Sa | Procede pour la stimulation des defenses naturelles de plantes agronomiquement utiles et composition pour la mise en oeuvre de ce procede |
| JP2001323001A (ja) * | 2000-05-16 | 2001-11-20 | Asahi Denka Kogyo Kk | 免疫増強作用を有する低分子化βグルカン |
| JP2001354570A (ja) * | 2000-06-15 | 2001-12-25 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | 免疫賦活剤及びそれを利用した香粧品 |
| JPWO2002098440A1 (ja) * | 2001-06-01 | 2004-09-16 | 味の素株式会社 | 糖尿病用薬剤 |
| WO2005027952A1 (ja) * | 2003-09-17 | 2005-03-31 | Ssi Co., Ltd | 生体の免疫機構を通じて生理活性を発現する組成物 |
-
1993
- 1993-03-29 JP JP07046593A patent/JP3650409B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2766059A1 (fr) * | 1997-07-18 | 1999-01-22 | Goemar Lab Sa | Procede pour la stimulation des defenses naturelles de plantes agronomiquement utiles et composition pour la mise en oeuvre de ce procede |
| WO1999003346A1 (fr) * | 1997-07-18 | 1999-01-28 | Laboratoires Goemar S.A. | Procede pour la stimulation des defenses naturelles des plantes |
| US6387847B1 (en) | 1997-07-18 | 2002-05-14 | Laboratoires Goemar S.A. | Method for stimulating natural control system of plants |
| JP2001323001A (ja) * | 2000-05-16 | 2001-11-20 | Asahi Denka Kogyo Kk | 免疫増強作用を有する低分子化βグルカン |
| JP2001354570A (ja) * | 2000-06-15 | 2001-12-25 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | 免疫賦活剤及びそれを利用した香粧品 |
| JPWO2002098440A1 (ja) * | 2001-06-01 | 2004-09-16 | 味の素株式会社 | 糖尿病用薬剤 |
| JP4561098B2 (ja) * | 2001-06-01 | 2010-10-13 | 味の素株式会社 | 糖尿病用薬剤 |
| WO2005027952A1 (ja) * | 2003-09-17 | 2005-03-31 | Ssi Co., Ltd | 生体の免疫機構を通じて生理活性を発現する組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3650409B2 (ja) | 2005-05-18 |
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