JPH0614792A - イヌロオリゴ糖の製造法 - Google Patents
イヌロオリゴ糖の製造法Info
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- JPH0614792A JPH0614792A JP5021074A JP2107493A JPH0614792A JP H0614792 A JPH0614792 A JP H0614792A JP 5021074 A JP5021074 A JP 5021074A JP 2107493 A JP2107493 A JP 2107493A JP H0614792 A JPH0614792 A JP H0614792A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なエンド型イヌリナーゼを用いてイヌリ
ンから効率よくイヌロオリゴ糖を製造する方法を提供す
る。 【構成】 ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属
カビを培養し、該培養液の硫安画分より得られた酵素液
をイヌリンに作用させることにより、反応液中にイヌロ
オリゴ糖を生成せしめる。
ンから効率よくイヌロオリゴ糖を製造する方法を提供す
る。 【構成】 ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属
カビを培養し、該培養液の硫安画分より得られた酵素液
をイヌリンに作用させることにより、反応液中にイヌロ
オリゴ糖を生成せしめる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規エンド型イヌリナ
ーゼを用いたイヌリンからイヌロオリゴ糖を効率良く製
造する方法に関する。
ーゼを用いたイヌリンからイヌロオリゴ糖を効率良く製
造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】イヌリンは約３５個のフラクトースが直
鎖状にβ−１，２結合で結合し、グルコース分子を末端
に有する多糖ポリマーであり、種々の植物、特にキク科
のダリヤ、キクイモの塊茎、チコリーの根などに存在す
る。また、イヌリンは熱水で容易に抽出可能であり、ビ
ート糖と同様に石灰処理などで精製できる。イヌリンを
酸あるいは酵素で分解してフラクトースを得ることは以
前より研究され、工業的に実施されたこともある。酸で
イヌリンを分解する場合はｐＨ１〜２、温度７０〜９０
℃で数時間加水分解することによりほぼ目的を達成する
が、着色物の生成やジフラクトースアンハイドライドの
ような副生成物ができるなど問題がある。一方、酵素を
用いる場合はこのような問題もなく、工業的に有利であ
ると考えられる。ところで、イヌリンを分解する酵素
（イヌリナーゼ）は、イヌリン含有植物、微生物などに
数多く発見され、研究されている（文献１．後記．各文
献以下同じ）。微生物イヌリナーゼの代表的なものは、
酵母ではクルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyce
s fragilis) やカンディダ・シュウドトロピカリス（Ca
ndidapseudotropicalis）のものであり、糸状菌ではア
スペルギルス（Aspergillus)属、フザリウム（Fusariu
m）属やペニシリウム（Penicillium)属のものである。
これらの内でPenicillium 属のエキソ型のもの（文献
２）、アスペルギルス・ニガー（Asp. nigar）のエキソ
型のもの（文献３）およびエンド型のもの（文献４）は
精製されてその性質が調べられているが、Penicillium
属ではエンド型のものはいままでは全く知られていな
い。また、Aspergillus 属カビのエンド型イヌリナーゼ
としてアスペルギルス・フィキュウム（Asp. ficuum)の
ものが知られており、このカビはエキソ型のものも含ん
でおり、イヌリンの完全加水分解のための両酵素の最適
混合比についても調べられている（文献５）。エキソ型
イヌリナーゼはイヌリンのグルコース残基の逆の側から
順にフラクトースを１分子ずつ遊離していき、一方、エ
ンド型イヌリナーゼはイヌリンの任意の位置まで糖鎖を
切断し、最終的にフラクトース３〜６分子からなるオリ
ゴ糖を生成する。また、両酵素が共存するとエンド型イ
ヌリナーゼが生成したイヌロオリゴ糖がエキソ型イヌリ
ナーゼの基質となるためフラクトースを生成する速度が
速くなることは容易に予想されるところであり、イヌロ
オリゴ糖が生成してもフラクトースになってしまう。イ
ヌリナーゼの研究や利用は主としてフラクトースの生成
を目的となされており、酵素を用いてイヌリンの部分分
解物、すなわちイヌロオリゴ糖を積極的に得ようとする
試みはなされていない。また、酸を用いたイヌロオリゴ
糖調製の研究も殆ど行われていない。
鎖状にβ−１，２結合で結合し、グルコース分子を末端
に有する多糖ポリマーであり、種々の植物、特にキク科
のダリヤ、キクイモの塊茎、チコリーの根などに存在す
る。また、イヌリンは熱水で容易に抽出可能であり、ビ
ート糖と同様に石灰処理などで精製できる。イヌリンを
酸あるいは酵素で分解してフラクトースを得ることは以
前より研究され、工業的に実施されたこともある。酸で
イヌリンを分解する場合はｐＨ１〜２、温度７０〜９０
℃で数時間加水分解することによりほぼ目的を達成する
が、着色物の生成やジフラクトースアンハイドライドの
ような副生成物ができるなど問題がある。一方、酵素を
用いる場合はこのような問題もなく、工業的に有利であ
ると考えられる。ところで、イヌリンを分解する酵素
（イヌリナーゼ）は、イヌリン含有植物、微生物などに
数多く発見され、研究されている（文献１．後記．各文
献以下同じ）。微生物イヌリナーゼの代表的なものは、
酵母ではクルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyce
s fragilis) やカンディダ・シュウドトロピカリス（Ca
ndidapseudotropicalis）のものであり、糸状菌ではア
スペルギルス（Aspergillus)属、フザリウム（Fusariu
m）属やペニシリウム（Penicillium)属のものである。
これらの内でPenicillium 属のエキソ型のもの（文献
２）、アスペルギルス・ニガー（Asp. nigar）のエキソ
型のもの（文献３）およびエンド型のもの（文献４）は
精製されてその性質が調べられているが、Penicillium
属ではエンド型のものはいままでは全く知られていな
い。また、Aspergillus 属カビのエンド型イヌリナーゼ
としてアスペルギルス・フィキュウム（Asp. ficuum)の
ものが知られており、このカビはエキソ型のものも含ん
でおり、イヌリンの完全加水分解のための両酵素の最適
混合比についても調べられている（文献５）。エキソ型
イヌリナーゼはイヌリンのグルコース残基の逆の側から
順にフラクトースを１分子ずつ遊離していき、一方、エ
ンド型イヌリナーゼはイヌリンの任意の位置まで糖鎖を
切断し、最終的にフラクトース３〜６分子からなるオリ
ゴ糖を生成する。また、両酵素が共存するとエンド型イ
ヌリナーゼが生成したイヌロオリゴ糖がエキソ型イヌリ
ナーゼの基質となるためフラクトースを生成する速度が
速くなることは容易に予想されるところであり、イヌロ
オリゴ糖が生成してもフラクトースになってしまう。イ
ヌリナーゼの研究や利用は主としてフラクトースの生成
を目的となされており、酵素を用いてイヌリンの部分分
解物、すなわちイヌロオリゴ糖を積極的に得ようとする
試みはなされていない。また、酸を用いたイヌロオリゴ
糖調製の研究も殆ど行われていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
なエンド型イヌリナーゼを用いたイヌリンからイヌロオ
リゴ糖を効率よく製造する方法を提供することである。
なエンド型イヌリナーゼを用いたイヌリンからイヌロオ
リゴ糖を効率よく製造する方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、イヌロオリゴ糖生産能の高い微生物
を土中微生物より検索し、意外にもPenicillium 属カビ
にもイヌロオリゴ糖を生産するものがあるのを見出し、
本発明を完成した。
を解決するために、イヌロオリゴ糖生産能の高い微生物
を土中微生物より検索し、意外にもPenicillium 属カビ
にもイヌロオリゴ糖を生産するものがあるのを見出し、
本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明はPenicillium 属カビが
生産するエンド型イヌリナーゼをイヌリンに作用させる
ことを特徴とするイヌロオリゴ糖の製造法である。
生産するエンド型イヌリナーゼをイヌリンに作用させる
ことを特徴とするイヌロオリゴ糖の製造法である。
【０００６】本発明で用いるカビは、Penicillium 属カ
ビであり、従来はエキソ型イヌリナーゼしか知られてい
なかった。特に、本発明者等が今回検索して同定したペ
ニシリウム・パープロゲナム・ヴァル・ルブリスクレロ
チウム（P. purpurogenum var rubrisclerotium)（寄託
名“HOK-1 ”、FERM P8705、再寄託番号：FERM BP3162
）およびペニシリウム・トルゼビンスキイ（P. trzebi
nskii）（寄託名“HOK-2 ”FERM P8706) は、以下に述
べる培養方法によるエンド型イヌリナーゼの産生が良好
であり、エキソ化型イヌリナーゼの産生が殆どないの
で、得られた培養液から菌体を除去したのみで粗酵素液
として使用可能である。イヌリナーゼ産生のPenicilliu
m 属カビは、天然または人口培地として一般に使用され
ている各種組成の栄養源を含む固体あるいは液体の培養
基に表面培養あるいは深層培養する。なお、イヌリナー
ゼ産生菌の培養条件によってはエキソ型活性が活発とな
り、得られた酵素液をイヌリンに作用させるとフラクト
ースばかりが得られることとなるので、エンド型活性が
主体となるように工夫する必要がある。その工夫として
は有機質窒素をできるだけ用いずに培養することであ
る。エキソ型とエンド型の混じった酵素混合物から硫安
分画、種々のゲルクロマトグラフィーなどの酵素蛋白分
離技術を用いてエンド型酵素のみ分離することは可能で
あるが、微生物が主としてエンド型酵素のみ産生するこ
とは大変好ましいことである。培養における栄養源とし
ては、フスマ、大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカーなどと、主たる炭素源とし
てフラクトース、イヌリンなどであり、さらにこれらを
補足する無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩および
少量の金属塩を含む培地が使用される。なお、Penicill
ium 属カビが強力なイヌリナーゼ活性を発現するために
は有機質窒素が必要とされ、補足する無機質窒素源とし
てはリン酸第１アンモニウムやリン酸第２アンモニウム
が効果的であるとの報告がある（文献６）。なお、本発
明ではPenicillium 属カビの成長培養のためには他の養
分と共に有機質窒素の存在が好ましいが、培地中に産出
される酵素はエンド型活性よりもエキソ型活性が高くな
り、場合によってはエキソ型活性ばかりになる。そこ
で、上記したように有機質窒素をできるだけ用いずに培
養することが望ましく、実質的に有機質窒素を含まない
状態でPenicillium 属カビを培養すれば、初期にはエキ
ソ型活性を有するイヌリナーゼが産生されるが、培養に
伴いエンド型イヌリナーゼが主として産生される。な
お、有機質窒素がない状態でカビを培養する際には窒素
源として各種の塩が使用できるが、好適には上記した無
機質窒素が使用できる。培養温度は２５〜３５℃が適当
である。ｐＨは初発は５．０〜７．０とするが、培養中
は２．５〜７．０の範囲とする。なお、炭素源としてイ
ヌリンおよびそり部分加水分解物を用いた場合は培養３
日目で培地のｐＨは急激な低下をみるが、ｐＨの調整を
行わずに培養する方がエンド型イヌリナーゼの活性は高
くなる。また、炭素源としてマルトースを用いた場合の
ｐＨ低下はより緩慢である。培養の期間は培養の条件で
異なるが、エンド型イヌリナーゼの活性が最高になる時
点で培養を中止するのが好ましく、通常４〜８日間で活
性が最高になる。Penicillium 属カビのエンド型イヌリ
ナーゼは菌体外に産生される酵素であるので、培養終了
後に培地から菌体を濾過あるいは遠心分離により除去
し、得られた上澄液を必要により限外濾過などで濃縮
し、硫安などによる塩析やアセトン、エタノールなどの
有機溶媒を加えて酵素を沈澱として分離する。なお、本
発明の製造法に用いられるPenicillium 属カビのエンド
型イヌリナーゼは、イヌリンに対する最適分解温度は５
５〜５８℃にあり、従来知られているPenicillium 属カ
ビのエキソ型イヌリナーゼのそれ（約４５℃、文献６参
照）と異なっている。また、本発明の製造法に用いられ
るPenicillium 属カビのエンド型イヌリナーゼは、熱安
定性がよく、６０℃／１０分間の熱安定性試験でもほと
んど失活しない。
ビであり、従来はエキソ型イヌリナーゼしか知られてい
なかった。特に、本発明者等が今回検索して同定したペ
ニシリウム・パープロゲナム・ヴァル・ルブリスクレロ
チウム（P. purpurogenum var rubrisclerotium)（寄託
名“HOK-1 ”、FERM P8705、再寄託番号：FERM BP3162
）およびペニシリウム・トルゼビンスキイ（P. trzebi
nskii）（寄託名“HOK-2 ”FERM P8706) は、以下に述
べる培養方法によるエンド型イヌリナーゼの産生が良好
であり、エキソ化型イヌリナーゼの産生が殆どないの
で、得られた培養液から菌体を除去したのみで粗酵素液
として使用可能である。イヌリナーゼ産生のPenicilliu
m 属カビは、天然または人口培地として一般に使用され
ている各種組成の栄養源を含む固体あるいは液体の培養
基に表面培養あるいは深層培養する。なお、イヌリナー
ゼ産生菌の培養条件によってはエキソ型活性が活発とな
り、得られた酵素液をイヌリンに作用させるとフラクト
ースばかりが得られることとなるので、エンド型活性が
主体となるように工夫する必要がある。その工夫として
は有機質窒素をできるだけ用いずに培養することであ
る。エキソ型とエンド型の混じった酵素混合物から硫安
分画、種々のゲルクロマトグラフィーなどの酵素蛋白分
離技術を用いてエンド型酵素のみ分離することは可能で
あるが、微生物が主としてエンド型酵素のみ産生するこ
とは大変好ましいことである。培養における栄養源とし
ては、フスマ、大豆粉、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスティープリカーなどと、主たる炭素源とし
てフラクトース、イヌリンなどであり、さらにこれらを
補足する無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩および
少量の金属塩を含む培地が使用される。なお、Penicill
ium 属カビが強力なイヌリナーゼ活性を発現するために
は有機質窒素が必要とされ、補足する無機質窒素源とし
てはリン酸第１アンモニウムやリン酸第２アンモニウム
が効果的であるとの報告がある（文献６）。なお、本発
明ではPenicillium 属カビの成長培養のためには他の養
分と共に有機質窒素の存在が好ましいが、培地中に産出
される酵素はエンド型活性よりもエキソ型活性が高くな
り、場合によってはエキソ型活性ばかりになる。そこ
で、上記したように有機質窒素をできるだけ用いずに培
養することが望ましく、実質的に有機質窒素を含まない
状態でPenicillium 属カビを培養すれば、初期にはエキ
ソ型活性を有するイヌリナーゼが産生されるが、培養に
伴いエンド型イヌリナーゼが主として産生される。な
お、有機質窒素がない状態でカビを培養する際には窒素
源として各種の塩が使用できるが、好適には上記した無
機質窒素が使用できる。培養温度は２５〜３５℃が適当
である。ｐＨは初発は５．０〜７．０とするが、培養中
は２．５〜７．０の範囲とする。なお、炭素源としてイ
ヌリンおよびそり部分加水分解物を用いた場合は培養３
日目で培地のｐＨは急激な低下をみるが、ｐＨの調整を
行わずに培養する方がエンド型イヌリナーゼの活性は高
くなる。また、炭素源としてマルトースを用いた場合の
ｐＨ低下はより緩慢である。培養の期間は培養の条件で
異なるが、エンド型イヌリナーゼの活性が最高になる時
点で培養を中止するのが好ましく、通常４〜８日間で活
性が最高になる。Penicillium 属カビのエンド型イヌリ
ナーゼは菌体外に産生される酵素であるので、培養終了
後に培地から菌体を濾過あるいは遠心分離により除去
し、得られた上澄液を必要により限外濾過などで濃縮
し、硫安などによる塩析やアセトン、エタノールなどの
有機溶媒を加えて酵素を沈澱として分離する。なお、本
発明の製造法に用いられるPenicillium 属カビのエンド
型イヌリナーゼは、イヌリンに対する最適分解温度は５
５〜５８℃にあり、従来知られているPenicillium 属カ
ビのエキソ型イヌリナーゼのそれ（約４５℃、文献６参
照）と異なっている。また、本発明の製造法に用いられ
るPenicillium 属カビのエンド型イヌリナーゼは、熱安
定性がよく、６０℃／１０分間の熱安定性試験でもほと
んど失活しない。
【０００７】次に、本発明のPenicillium 属カビのエン
ド型イヌリナーゼを用いるイヌリンからイヌロオリゴ糖
を製造する方法について述べる。
ド型イヌリナーゼを用いるイヌリンからイヌロオリゴ糖
を製造する方法について述べる。
【０００８】イヌリンの分解操作については通常イヌリ
ンの濃度をできるだけあげ、また、分解中の微生物汚染
を避けるために操作温度はできるだけ高い方がよく、低
くても５５℃であることが望ましい。本発明ではイヌリ
ンの濃度を２０％程度とし、反応温度を５５〜６０℃、
好ましくは６０℃程度とし、反応液のｐＨを３．５〜
７．０、好ましくは４．０〜５．５として、分解反応を
行う。イヌリンの濃度は、溶液調製時の温度、原料のイ
ヌリンの分子量分布により変わり、広い範囲に及びう
る。特に、イヌリンを９０℃以上で溶解し、６０℃に保
った場合には、２５％程度の濃度でも過飽和状態である
が調製することができる。
ンの濃度をできるだけあげ、また、分解中の微生物汚染
を避けるために操作温度はできるだけ高い方がよく、低
くても５５℃であることが望ましい。本発明ではイヌリ
ンの濃度を２０％程度とし、反応温度を５５〜６０℃、
好ましくは６０℃程度とし、反応液のｐＨを３．５〜
７．０、好ましくは４．０〜５．５として、分解反応を
行う。イヌリンの濃度は、溶液調製時の温度、原料のイ
ヌリンの分子量分布により変わり、広い範囲に及びう
る。特に、イヌリンを９０℃以上で溶解し、６０℃に保
った場合には、２５％程度の濃度でも過飽和状態である
が調製することができる。
【０００９】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。 イヌリン分解酵素の力価測定法 １．５％イヌリン溶液０．５ｍｌに１／１０Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）で希釈した酵素液０．５ｍｌを加え、
５０℃で３０分間静置後、生成した還元糖を３，５−ジ
ニトロサリチル酸法により５００ｎｍの吸光度で比色定
量した。酵素単位は５０℃において酵素液１ｍｌあたり
１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１ｕｎ
ｉｔとした。
液（ｐＨ５．０）で希釈した酵素液０．５ｍｌを加え、
５０℃で３０分間静置後、生成した還元糖を３，５−ジ
ニトロサリチル酸法により５００ｎｍの吸光度で比色定
量した。酵素単位は５０℃において酵素液１ｍｌあたり
１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１ｕｎ
ｉｔとした。
【００１０】実施例１ （ａ）P. purpurogenum var rubrisclerotium （寄託名
“HOK-1 ”、FERM P8705、再寄託番号：FERM BP3162 ）
によるエンド型イヌリナーゼの調製 イヌリン（チコリー根より分離精製したもの）０．５
％、マルトース０．５％、ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ０．２７
％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ2 ０．０５％、Ｔ
ｗｅｅｎ８０ ０．０２％の培地を水道水で調製し、ｐ
Ｈを７に調製したのち、５００ｍｌ容の坂口フラスコに
１００ｍｌとり、滅菌処理した後菌体を１白金耳接種
し、２８℃で９６時間振盪培養した。培養液から漏過に
より菌体を除去して、イヌリンの分解活性を測定したと
ころ２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ培養液であった。上記により
得られた菌体を除去した培養液１０００ｍｌ（イヌリン
の分割活性２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ）に硫安を添加し、４
０〜８０％飽和沈澱画分を遠心分離し、１／１０Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、蒸留水に対して透析し
て、イヌリンの分解活性１７．７ｕｎｉｔ／ｍｌの酵素
液を１００ｍｌ得た。得られた酵素は、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量５５，００
０±３，０００、酵素活性の至適ｐＨおよび温度４．５
〜５．５、約５５℃であり、６０℃／１０分の熱安定試
験でも活性の低下は認められない。
“HOK-1 ”、FERM P8705、再寄託番号：FERM BP3162 ）
によるエンド型イヌリナーゼの調製 イヌリン（チコリー根より分離精製したもの）０．５
％、マルトース０．５％、ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ０．２７
％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．１％、ＭｇＳＯ2 ０．０５％、Ｔ
ｗｅｅｎ８０ ０．０２％の培地を水道水で調製し、ｐ
Ｈを７に調製したのち、５００ｍｌ容の坂口フラスコに
１００ｍｌとり、滅菌処理した後菌体を１白金耳接種
し、２８℃で９６時間振盪培養した。培養液から漏過に
より菌体を除去して、イヌリンの分解活性を測定したと
ころ２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ培養液であった。上記により
得られた菌体を除去した培養液１０００ｍｌ（イヌリン
の分割活性２．５ｕｎｉｔ／ｍｌ）に硫安を添加し、４
０〜８０％飽和沈澱画分を遠心分離し、１／１０Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、蒸留水に対して透析し
て、イヌリンの分解活性１７．７ｕｎｉｔ／ｍｌの酵素
液を１００ｍｌ得た。得られた酵素は、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量５５，００
０±３，０００、酵素活性の至適ｐＨおよび温度４．５
〜５．５、約５５℃であり、６０℃／１０分の熱安定試
験でも活性の低下は認められない。
【００１１】（ｂ）イヌロオリゴ糖の製造 上記で得られた酵素液を２０％イヌリン溶液に、イヌリ
ン１ｇあたり３ｕｎｉｔ添加し、ｐＨ４．５、６０℃で
４８時間反応した。反応の途中で反応液を取り、ゲルク
ロマトグラフィーで分析したところ、反応開始３時間後
で重合度（ＤＰ）３〜９のイヌロオリゴ糖と少量のＤＰ
２およびＤＰ１の糖が生成していることがわかり（図
１）、２４時間ではＤＰ３〜９のイヌロオリゴ糖の生成
量が増していた（図２）。反応停止時（４８時間反応
後）では、ＤＰ１が１．５％、ＤＰ２が３．３％、ＤＰ
３が３１．４％、ＤＰ４が２６．６％、ＤＰ５が２０．
４％、ＤＰ６が１３．３％、それ以上のもの３．５％で
あった（図３）。このような経時的分解パターンは典型
的なエンド型酵素の分解パターンであり、この酵素液に
よる最終的な分解限度はフラクトースとして計算して約
５０％であった。 反応終了後、イオン交換樹脂や活性
炭を用いて常法により精製したのち、濃縮乾燥して白色
のイヌロオリゴ糖を得ることができた。
ン１ｇあたり３ｕｎｉｔ添加し、ｐＨ４．５、６０℃で
４８時間反応した。反応の途中で反応液を取り、ゲルク
ロマトグラフィーで分析したところ、反応開始３時間後
で重合度（ＤＰ）３〜９のイヌロオリゴ糖と少量のＤＰ
２およびＤＰ１の糖が生成していることがわかり（図
１）、２４時間ではＤＰ３〜９のイヌロオリゴ糖の生成
量が増していた（図２）。反応停止時（４８時間反応
後）では、ＤＰ１が１．５％、ＤＰ２が３．３％、ＤＰ
３が３１．４％、ＤＰ４が２６．６％、ＤＰ５が２０．
４％、ＤＰ６が１３．３％、それ以上のもの３．５％で
あった（図３）。このような経時的分解パターンは典型
的なエンド型酵素の分解パターンであり、この酵素液に
よる最終的な分解限度はフラクトースとして計算して約
５０％であった。 反応終了後、イオン交換樹脂や活性
炭を用いて常法により精製したのち、濃縮乾燥して白色
のイヌロオリゴ糖を得ることができた。
【００１２】実施例２ （ａ）P. trzebinskii（寄託名“HOK-2 ”、FERM P870
6）によるエンド型イヌリナーゼの調製 イヌリン（チコリー根より分離精製したもの）１．０
％、（ＮＨ4)2 ＨＰＯ4０．１５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．
１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2 Ｏ０．０５％を含む水道水で調製したｐＨ７の培地を
１ｌ容の三角フラスコに３００ｍｌとり、滅菌処理した
後、菌体を１白金耳接種し、２８℃で振幅７ｃｍ、スト
ローク数１００で回転培養した。培養４日目以降にｐＨ
が低下をはじめ、６日目ではｐＨが３．５となった。始
めはフラクトース生成型（エキソ型）であったイヌリナ
ーゼ活性はイヌロオリゴ糖生成型（エンド型）となっ
た。７日目に培養液１ｍｌあたり０．８ｕｎｉｔと最大
になった時点で培養を止め、培養液と菌体を漏別した。
実施例１（ａ）と同様に培養液を塩析し、硫安による４
０〜８０％飽和沈澱画分を得、１／１００Ｎ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶解した後、バイオラッド社製のバイ
オゲル Ｐ−６ＤＧを用いて脱塩し、粗酵素液を得た。
6）によるエンド型イヌリナーゼの調製 イヌリン（チコリー根より分離精製したもの）１．０
％、（ＮＨ4)2 ＨＰＯ4０．１５％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．
１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．０２％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ
2 Ｏ０．０５％を含む水道水で調製したｐＨ７の培地を
１ｌ容の三角フラスコに３００ｍｌとり、滅菌処理した
後、菌体を１白金耳接種し、２８℃で振幅７ｃｍ、スト
ローク数１００で回転培養した。培養４日目以降にｐＨ
が低下をはじめ、６日目ではｐＨが３．５となった。始
めはフラクトース生成型（エキソ型）であったイヌリナ
ーゼ活性はイヌロオリゴ糖生成型（エンド型）となっ
た。７日目に培養液１ｍｌあたり０．８ｕｎｉｔと最大
になった時点で培養を止め、培養液と菌体を漏別した。
実施例１（ａ）と同様に培養液を塩析し、硫安による４
０〜８０％飽和沈澱画分を得、１／１００Ｎ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．０）に溶解した後、バイオラッド社製のバイ
オゲル Ｐ−６ＤＧを用いて脱塩し、粗酵素液を得た。
【００１３】（ｂ）イヌロオリゴ糖の製造 上記で得られた酵素液を２０％イヌリン溶液に、イヌリ
ン１ｇあたり３ｕｎｉｔ添加し、ｐＨ４．５、６０℃で
４８時間反応した。反応終了後、ゲルクロマトグラフィ
ーで分析したところ、ＤＰ１が１．３％、ＤＰ２が０．
９％、ＤＰ３が２６．５％、ＤＰ４が２７．６％、ＤＰ
５が１８．５％、ＤＰ６が１４．２％、それ以上のもの
１１．０％であった（図４）。本菌株の粗酵素液により
イヌリンを分解した場合の経時的な分解パターンは、実
施例１と同様にエンド型の分解パターンを示した。 文献１：Vandemme,E.J.,Derycke,D.G.;Adv.Appl.Microb
iol.,1983,29, P139〜176. 文献２：中村豊彦，中津誠一郎；農化,1977,51, P681〜
689. 文献３：中村豊彦ら；農化,1978,52, P159〜166. 文献４：中村豊彦ら；農化,1978,52, P581〜587. 文献５：J.Zitten；Starch, 1981, 33, P373〜377. 文献６：中村豊彦ら；農化,1969,43, P599〜605.
ン１ｇあたり３ｕｎｉｔ添加し、ｐＨ４．５、６０℃で
４８時間反応した。反応終了後、ゲルクロマトグラフィ
ーで分析したところ、ＤＰ１が１．３％、ＤＰ２が０．
９％、ＤＰ３が２６．５％、ＤＰ４が２７．６％、ＤＰ
５が１８．５％、ＤＰ６が１４．２％、それ以上のもの
１１．０％であった（図４）。本菌株の粗酵素液により
イヌリンを分解した場合の経時的な分解パターンは、実
施例１と同様にエンド型の分解パターンを示した。 文献１：Vandemme,E.J.,Derycke,D.G.;Adv.Appl.Microb
iol.,1983,29, P139〜176. 文献２：中村豊彦，中津誠一郎；農化,1977,51, P681〜
689. 文献３：中村豊彦ら；農化,1978,52, P159〜166. 文献４：中村豊彦ら；農化,1978,52, P581〜587. 文献５：J.Zitten；Starch, 1981, 33, P373〜377. 文献６：中村豊彦ら；農化,1969,43, P599〜605.
【００１４】
【発明の効果】本発明により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
属カビのエンド型イヌリナーゼが提供され、イヌリン
から効果的にイヌロオリゴ糖をフラクトースの生成なし
に製造することができるようになり、工業的に極めて優
れたイヌロオリゴ糖の製造方法が提供される。
属カビのエンド型イヌリナーゼが提供され、イヌリン
から効果的にイヌロオリゴ糖をフラクトースの生成なし
に製造することができるようになり、工業的に極めて優
れたイヌロオリゴ糖の製造方法が提供される。
【図１】 実施例１における反応開始３時間後のゲルク
ロマトグラフ
ロマトグラフ
【図２】 実施例１における反応開始２４時間後のゲル
クロマトグラフ
クロマトグラフ
【図３】 実施例１における反応開始４８時間後のゲル
クロマトグラフ
クロマトグラフ
【図４】 実施例２における反応終了後のゲルクロマト
グラフ
グラフ
ＤＰ フラクトースの重合度
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐藤 一雄 砂川市日の出町１番地
Claims (3)
- 【請求項１】 ペニシリウム（Penicillium ) 属カビが
生産するエンド型イヌリナーゼをイヌリンに作用させる
ことを特徴とするイヌロオリゴ糖の製造法。 - 【請求項２】 Penicillium 属カビが、P.purpurogenum
var rubrisclerotiumである請求項１記載のイヌロオリ
ゴ糖の製造法。 - 【請求項３】 Penicillium 属カビが、P. trzebinskii
である請求項１記載のイヌロオリゴ糖の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61068773A JPS62228293A (ja) | 1986-03-28 | 1986-03-28 | エンド型イヌリナーゼおよびその産生方法 |
| JP5021074A JPH06102033B2 (ja) | 1986-03-28 | 1993-02-09 | イヌロオリゴ糖の製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61068773A JPS62228293A (ja) | 1986-03-28 | 1986-03-28 | エンド型イヌリナーゼおよびその産生方法 |
| JP5021074A JPH06102033B2 (ja) | 1986-03-28 | 1993-02-09 | イヌロオリゴ糖の製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61068773A Division JPS62228293A (ja) | 1986-03-28 | 1986-03-28 | エンド型イヌリナーゼおよびその産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614792A true JPH0614792A (ja) | 1994-01-25 |
| JPH06102033B2 JPH06102033B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=26358090
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61068773A Granted JPS62228293A (ja) | 1986-03-28 | 1986-03-28 | エンド型イヌリナーゼおよびその産生方法 |
| JP5021074A Expired - Lifetime JPH06102033B2 (ja) | 1986-03-28 | 1993-02-09 | イヌロオリゴ糖の製造法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61068773A Granted JPS62228293A (ja) | 1986-03-28 | 1986-03-28 | エンド型イヌリナーゼおよびその産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS62228293A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005793A1 (fr) * | 1996-08-01 | 1998-02-12 | Raffinerie Tirlemontoise | Procede de preparation d'une composition polydispersee de saccharides et composition polydispersee de saccharides obtenue |
| CN112725306A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-04-30 | 云南师范大学 | 热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用 |
| CN112813050A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-18 | 云南师范大学 | 热稳定性降低的外切菊粉酶突变体MutP126Q |
| CN112813052A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-18 | 云南师范大学 | 一种低温活性提高的外切菊粉酶突变体MutDP121ET6 |
| CN112813053A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-18 | 云南师范大学 | 菊粉酶突变体MutY119H及其制备方法 |
| CN112980813A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-06-18 | 云南师范大学 | 低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19717823A1 (de) * | 1997-04-26 | 1998-10-29 | Tshisuaka Barbara I Dr | Verfahren zur Erzeugung eines Endoinulinase produzierenden Mikroorganismus, Verfahren zur Herstellung von Endoinulinase sowie Verfahren zur Herstellung von Oligofructosiden aus Insulin und Verfahren zur Detektion von Endoinulinase-Aktivität |
| CN112725307B (zh) * | 2021-01-13 | 2022-09-16 | 云南师范大学 | 一种耐热性降低的低温外切菊粉酶突变体MutG169Δ4及应用 |
-
1986
- 1986-03-28 JP JP61068773A patent/JPS62228293A/ja active Granted
-
1993
- 1993-02-09 JP JP5021074A patent/JPH06102033B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998005793A1 (fr) * | 1996-08-01 | 1998-02-12 | Raffinerie Tirlemontoise | Procede de preparation d'une composition polydispersee de saccharides et composition polydispersee de saccharides obtenue |
| BE1010449A3 (fr) * | 1996-08-01 | 1998-08-04 | Raffinerie Tirlemontoise Sa | Procede de preparation d'une composition polydipersee de saccharides, composition polydispersee de saccharides, produit alimentaire, pharmaceutique et/ou cosmetique comprenant ladite composition polydispersee. |
| AU726112B2 (en) * | 1996-08-01 | 2000-11-02 | Raffinerie Tirlemontoise | Method for preparing a polydispersed saccharide composition and resulting polydispersed saccharide composition |
| US7084131B2 (en) | 1996-08-01 | 2006-08-01 | Raffinerie Tirlemontoise S.A. | Method for preparing a polydispersed saccharide composition and resulting polydispersed saccharide composition |
| CN112725306A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-04-30 | 云南师范大学 | 热盐性改变的菊粉酶突变体MutY119T及其应用 |
| CN112813050A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-18 | 云南师范大学 | 热稳定性降低的外切菊粉酶突变体MutP126Q |
| CN112813052A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-18 | 云南师范大学 | 一种低温活性提高的外切菊粉酶突变体MutDP121ET6 |
| CN112813053A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-05-18 | 云南师范大学 | 菊粉酶突变体MutY119H及其制备方法 |
| CN112980813A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-06-18 | 云南师范大学 | 低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G |
| CN112813053B (zh) * | 2021-01-13 | 2022-06-24 | 云南师范大学 | 菊粉酶突变体MutY119H及其制备方法 |
| CN112813052B (zh) * | 2021-01-13 | 2022-08-26 | 云南师范大学 | 一种低温活性提高的外切菊粉酶突变体MutDP121ET6 |
| CN112813050B (zh) * | 2021-01-13 | 2022-08-30 | 云南师范大学 | 热稳定性降低的外切菊粉酶突变体MutP126Q |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06102033B2 (ja) | 1994-12-14 |
| JPS62228293A (ja) | 1987-10-07 |
| JPH0561910B2 (ja) | 1993-09-07 |
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