KR100425925B1 - 두 가지 혼합효소에 의하여 생산되는 이눌로올리고당 및그 제조방법 - Google Patents

두 가지 혼합효소에 의하여 생산되는 이눌로올리고당 및그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두가지 혼합효소에 의하여 생산되는 이눌로올리고당 및 그 제조방법에 관한 것으로, 토양으로부터 분리한 두 종류의 이눌라제 생산균주인 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7(수탁번호:KCTC 0711BP)과 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5를 각각 발효배양하여 얻은 이눌린 가수분해 효소를 이눌린 용액에 첨가하여 반응시켜서 올리고당의 생산효율이 높으며, 효소의 혼합비율을 조정함으로써 올리고당의 중합도를 조절할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

두 가지 혼합효소에 의하여 생산되는 이눌로올리고당 및 그 제조방법{Inulo-oligosaccharides produced by a dual endoinulinase and process for preparation thereof}
본 발명은 두가지 혼합효소에 의하여 생산되는 이눌로올리고당 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호 KCTC 0711BP)와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5에서 생산하는 서로 다른 두 종류의 이눌린 가수분해 효소를 이눌린에 작용시킴으로서 생산되는 이눌로올리고당 및 그 제조방법에 관한 것이다.
기능성 올리고당으로는 프락토올리고당 (fructo-oligosaccharides), 말토올리고당(malto-oligosaccharides), 이소말토올리고당 (isomalto-oligosaccharides), 자일로올리고당(xylo-oligosaccharides), 대두올리고당(soybean-oligosaccharides), 키토올리고당 (chito-oligosaccharides)등이 개발되어 이용되고 있으나, 이들 제품들은 올리고당의 함량이 50 ~ 60% 전후에 불과하거나, 키토올리고당과 같은 것은 제품의 가격이 고가 이어서 올리고당이 갖고 있는 충치 및 당뇨의 예방, 간보호 효과, 혈중콜레스테롤 저하효과, 혈압 저하효과, 장내 유용 미생물의 증식효과 등의 우수한 기능성을 이용하는데 크게 제한을 받아 왔다.
본 발명자들은 포도당 1분자에 과당이 30-35 분자가 결합된 고분자당류인 이눌린을 이눌린 가수분해 효소와 반응시킬 경우, 고함량의 올리고당류를 생산할 수 있다는 점에 착안하여, 강력한 이눌린 가수분해활성 효소를 생성하는 두 종류의 미생물, 즉 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호 KCTC 0711BP)와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5을 발효 배양하여 생산한 효소와 이눌린을 적정비율로 반응시켜 이눌로올리고당을 제조하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 이눌린을 상기 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호 KCTC 0711BP)이 생산하는 이눌라제와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5가 생산하는 이눌라제를 혼합 반응시켜 제조한 이눌로 올리고당을 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 이눌로 올리고당의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 이눌라제를 고활성으로 생성하는 두 종류의 균주 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호 KCTC 0711BP)와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5을 토양으로부터 분리하고 이 균주들의 최적 효소생산 조건을 확립한 후 이 조건에 따라 이눌린 가수분해 효소를 생산하고, 이들 두 효소를 최적의 반응조건에서 이눌린과 반응시킴으로써 올리고당의 함량을 증가시킬 뿐만 아니라, 제품의 조성을 필요에 따라 변화시킬 수 기능성 이늘로올리고당을 생산하므로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명은 이눌린을 가수분해하여 올리고당만을 생성하는 고활성 이눌라제 생산균주 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호 KCTC 0711BP)와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 를 분리 및 동정하는 단계; 상기 토양으로부터 분리 및 동정한 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호 KCTC 0711BP)와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 를 발효배양하여 이눌라제를 최대농도로 생산하는 단계; 이눌린으로부터 이눌로올리고당 제조조건을 최적화하고 최적의 반응조건으로 효소반응시켜 이눌로올리고당을 제조하는 단계; 상기 제조한 이눌로 올리고당을 농축기로 농축하여 이눌로 올리고당 시럽을 제조하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예와 실험예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 이눌린 가수분해효소 생산균주의 분리 및 동정
슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7의 경우는 경상북도 경산시 진량읍에서 채취한 토양시료, 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 의 경우는 경상남도 김해일원에서 채취한 토양시료 각각을 살균수로 희석한 희석액을 이눌린 한천배지 (이눌린 1.5%, NaNO30.2%, MgSO40.05%, KCl 0.05%, K2HPO40.05%, pH 7.0)에서 도포한 후 30℃에서 3일간 배양하여 이눌린을 이용하는 균주를 일차선별하였다. 일차선별된 각 균주를 1% 효모추출물을 함유한 상기 배지에서 30℃에서 3일동안 진탕배양한 다음 배양상등액의 당조성을 박층크로마토그래피(TLC)로 확인하여 과당(fructose)이 검출되지 않고 올리고당류만 생성하는 고활성균주를 최종 선별하였다. 선별된 균주를 그램염색, 유산생성능, 당발효검정, 전자현미경을 이용한 형태적 검정 등의 결과를 버지의 미생물분류법(Bergy's Manual of Systematic Bacteriology)에 따라 동정한 결과 각각 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)및 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)미생물로 동정되었고, 이들 균주를 최종적으로 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7, 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 로 각각 명명하였다.
본 발명자들은 상기 균주 중 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)YN-7는 생명공학연구소내 미생물기탁센터에 1999년 12월 13일 수탁번호 KCTC 0711BP로 기탁하였다.
또한 상기 균주 중 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5의 균주학적 특성은 표1에 나타낸 바와 같다.
잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5의 균주학적 특성
특 성 결 과
그람 염색 음 성
운동성 양 성
젤라틴(gelatin)가수분해 양 성
에스큐린(esculin) 가수분해 양 성
전분 가수분해 양 성
유단백 가수분해 양 성
최적 성장 온도 20 내지 45℃
뉴트리언트 아가(nutrient agar)에서 성장 잘자라지 않음
질산염 환원효소 음 성
인돌(indole) 생산 음 성
포게스프로스카우어 검정 음 성
탄소원의 이용
D-프럭토즈(fructose) 양 성
락투로즈(lactulose) 양 성
D-사이코즈(psicose) 양 성
메틸 피루베이트(methyl pyruvate) 양 성
트윈 40 가변적임
실시예 2: 이눌린 가수분해 효소의 생산
본 발명에서 이눌린 가수분해효소를 생산하는 균주 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7(KCTC 0711BP)은 이눌린 10(g/L), (NH4)2HPO48(g/L), 옥수수 침지액(corn steep liquor) 15(g/L), KCl 0.5(g/L), MgSO4 ˙7H2O 0.5(g/L), FeSO4˙7H2O 0.03(g/L)로 조성된 배지에서 pH는 4.5, 45℃로 2일간 전배양하였다.
그리고 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5는 이눌린 20 g/L, 효모추출물 20g/L, (NH4)2HPO45g/L, NH4H2PO42g/L, MnCl2˙4H2O 0.5g/L, KCl 0.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, FeSO4˙7H2O 0.01g/L로 조성된 배지에서 pH는 4.5, 37℃에서 1일 동안 전배양하였다.
상기와 같이 전배양된 배양액의 일부를 상기 조건과 동일하게 제조된 배지에 주입하여 2일간 본배양한 후 발효액을 원심분리 (10,000 x g /20분)하여 균체를 제거하고 그 상등액은 투석(막의 분자량절단 10,000)하여 배양 잔존물을 제거함으로써 조효소액을 제조하였다. 제조한 조효소액의 활성을 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 표 2에 나타낸 조건으로 분석하였다. 실험결과, 효소활성은 효소 밀리리터당 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)YN-7의 경우 약 8 단위 (unit) 그리고 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 의 경우 약 25 단위이었다.
효소활성의 측정방법
측정장치 쉬마즈(Shimadzu) 고성능 액체크로마토그래피
검출기 쉬마즈(Shimadzu)-10A 굴절률 검출기
칼럼 바이오-래드(Bio-rad), 아미넥스(Aminex) HPX-42C
칼럼온도 80℃
이동상 및 용출속도 증류수, 0.6 mL/분
활성단위 (unit)의 정의 1분간 1 마이크로몰 (μM)의 이눌로바이오스(inulobiose, 분자량 342)를 생성하는데 필요한 효소의 양
실시예 3: 이눌로올리고당의 제조
제 1 공정: 최대 이눌로올리고당 생성을 위한 효소사용비율의 결정
실시예 2에서 제조한 두 종류의 이눌린 가수분해 조효소액을 표 3에 나타낸 바와 같은 반응온도, 수소이온 농도, 효소사용비율, 이눌린 농도 등을 실험변수로 조합하여 초기효소반응을 2시간, 효소사용량은 460U/g 이눌린으로 반응시킨 후 최적 반응조건을 구하였다. 실험결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 반응온도는 50℃, pH는 5.8, 효소사용비율(단위)은 3:1~4:1 (PseudomonasYN-7:Xanthomonas oryzaeNo.5, 이하 X:P), 이눌린 농도는 50 g/L인 것으로 나타났다.
여러가지 효소반응조건에서 효소 첨가비율 (X:P)에 따른 이눌로올리고당의 생성량
실험번호 온도(℃) pH 효소비율(X:P) 이눌린 농도(g/L) 이눌로올리고당함량(%)
1 47(-1) 5.4(-1) 1:2(-1) 125(+1) 9.06
2 53(+1) 5.4(-1) 1:2(-1) 75(-1) 14.23
3 47(-1) 6.2(+1) 1:2(-1) 75(-1) 17.31
4 53(+1) 6.2(+1) 1:2(-1) 125(+1) 10.89
5 47(-1) 5.4(-1) 2;1(+1) 75(-1) 17.17
6 53(+1) 5.4(-1) 2:1(+1) 125(+1) 10.56
7 47(-1) 6.2(+1) 2;1(+1) 125(+1) 12.08
8 53(+1) 6.2(+1) 2:1(+1) 75(-1) 20.38
9 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 10.30
10 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 10.33
11 47(-1) 5.4(-1) 1:2(-1) 75(-1) 13.57
12 53(+1) 5.4(-1) 1:2(-1) 125(+1) 8.83
13 47(-1) 6.2(+1) 1:2(-1) 125(+1) 12.21
14 53(+1) 6.2(+1) 1;2(-1) 75(-1) 18.64
15 47(-1) 5.4(-1) 2:1(+1) 125(+1) 10.67
16 53(+1) 5.4(-1) 2:1(+1) 75(-1) 18.21
17 47(-1) 6.2(+1) 2:1(+1) 75(-1) 19.99
18 53(+1) 6.2(+1) 2:1(+1) 125(+1) 12.72
19 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 11.07
20 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 11.46
21 44(-2) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 10.43
22 56(+2) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 10.41
23 50(0) 5.0(-2) 1:1(0) 100(0) 10.14
24 50(0) 6.6(+2) 1:1(0) 100(0) 13.25
25 50(0) 5.8(0) 1:4(-2) 100(0) 8.28
26 50(0) 5.8(0) 4:1(+2) 100(0) 13.08
27 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 50(-2) 21.61
28 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 150(+2) 8.98
29 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 11.44
30 50(0) 5.8(0) 1:1(0) 100(0) 10.70
제 2 공정: 최적 반응조건에서 이눌로올리고당의 생산
실시예 2에서 제조된 두 종류의 이눌린 가수분해 조효소액을 사용하여 효소사용량을 기질 g당 460 단위로 고정하고 50 g/L의 이눌린용액을 사용하여 효소사용비율 (X:P)을 1:1에서 4:1까지 변화시키면서 110시간 동안 생성되는 이눌로 올리고당의 함량 및 조성을 조사하였다. 실험결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 이눌로올리고당 제조를 위한 최적 효소사용 비율은 4:1이었으며, 이 때 생성된 올리고당의 함량은 92%이었다. 그러나 중합도가 낮은 올리고당 성분을 얻기 위해서는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)YN-7 기원의 효소비율을 증가시킬 필요가 있으나, 올리고당 함량이 낮아져서 불리하다. 결론적으로 올리고당함량이 높은 제품을 제조하기 위해서는 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 기원 효소사용 비율이 높아야 하고 이 경우에서 생산되는 제품의 조성은 고중합도가 지배적이다.
효소사용비율 (X : P)에 따른 이눌로올리고당의 조성변화a
성 분 조 성 (%, 중량비)
효소사용비율(X:P, 활성비)b
1 : 1 2 : 1 3 : 1 4 : 1
이눌린 4.51 5.01 4.08 4.78
과당 2.24 0.89 미검출 미검출
포도당 0.75 미검출 미검출 미검출
설탕 4.43 4.15 4.51 3.56
이눌로올리고당
DP*2 10.83 6.93 5.63 4.87
DP3 5.06 4.28 3.73 3.67
DP4 3.44 3.68 0.99 0.62
DP5 43.38 47.77 52.77 55.13
DP>5 25.36 27.29 28.29 27.37
총 올리고당 88.07 89.95 91.41 91.66
a : 초기기질 농도 : 50g/Lb : X는 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5, P는 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7(수탁번호:KCTC 0711BP)효소 사용량 : 460U/g 이눌린* DP : 중합도(dgree of polymerization)
실시예 4: 이눌로올리고당 시럽의 제조
상기 실시예 3에서 제조한 본 발명 이눌로 올리고당을 농축기를 사용하여 진공도 76 cmHg, 온도 85℃ 의 조건에서 최종농도가 400~800 g/L이 되게 농축함으로써 이눌로 올리고당 시럽을 제조하였다.
본 발명은 상기 실시예들을 통하여 설명한 바와 같이 토양으로부터 분리한 서로 다른 두 종류의 이눌라제 생산균주 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7 (수탁번호:KCTC 0711BP) 및 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)No.5 를 발효배양하여 얻은 이눌린 가수분해 효소를 이눌린 용액에 첨가하고 반응시켜서 올리고당 함량이 증가되고 올리고당의 조성을 필요에 따라 변화시킬 수가 있어 품질이 우수한 기능성 올리고당을 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

  1. (a) 슈도모나스 속(Pseudomonassp.) YN-7(수탁번호:KCTC 0711BP)와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)를 각각 배양하여 생산되는 각각의 이눌린 가수분해 조효소액을 혼합하는 단계; 그리고
    (b) 상기(a) 단계에서 혼합된 이눌린 가수분해 조효소액을 이눌린에 넣고 40 내지 60℃, pH 5 내지 7로 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이눌로 올리고당의 제조방법.
  2. 상기 제1항에 있어서, 슈도모나스 속(Pseudomonassp.)YN-7(수탁번호:KCTC 0711BP)가 생산하는 이눌라제와 잔토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)가 생산하는 이눌린 가수분해 효소를 1:1 내지 4:1로 혼합하는 것을 특징으로 하는 이눌로 올리고당의 제조방법.
  3. 제1항 내지 제2항 중에서 선택된 어느 하나의 항의 방법에 의하여 생산되는 이눌로 올리고당을 400 ~ 800 g/L가 되게 농축하여 제조된 이눌로 올리고당 시럽.
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Paper 1998, p. 101; 1997 *

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