JPH0691819B2

JPH0691819B2 - デアセチラーゼの製造方法

Info

Publication number: JPH0691819B2
Application number: JP3152595A
Authority: JP
Inventors: 静藤嶋; 富美子夜久; 龍太郎田中; 永之介村木; 尚子山野
Original assignee: 工業技術院長
Priority date: 1991-05-27
Filing date: 1991-05-27
Publication date: 1994-11-16
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: JPH04349884A; US5252468A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビブリオ属に属するデ
アセチラーゼ生産菌により製造される、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、そのオリゴマ−及びキチンに作用する新規
のデアセチラーゼの製造方法に関するものである。

【０００２】ここで、デアセチラーゼとは、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、そのオリゴマ−又はキチンを脱アセチ
ル化する酵素を意味する。

【０００３】

【従来の技術及びその課題】近年、セルロースに次ぐバ
イオマス資源であるキチン及びその脱アセチル化物であ
るキトサンが、機能性多糖として注目されている。特
に、低分子量のキトサン即ち、Ｎ−アセチルグルコサミ
ンのオリゴマーは強い抗細菌性、抗カビ性及びエリシタ
ー活性を持つことが見出され、その重要性が増してい
る。

【０００４】キトサンは、従来エビ、カニ等の甲殻類の
クチクラ（甲殻）から無機塩、タンパク質、脂質等を除
いた精製キチンを原料として、３０〜６０％の濃アルカ
リ溶液中で加熱することにより調製されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の熱濃ア
ルカリ溶液を用いる方法では、脱アセチルと同時にキチ
ン主鎖の分解を伴い、目的とするキトサンの収率の低
下、副生成物の増加を来すという欠点を有する。

【０００６】キチンを脱アセチル化する別法としては、
デアセチラーゼ又は、該酵素を生産する微生物を用いる
方法が考えられる。しかし、この生物学的方法に関して
は、ムコール属及びアエロモナス属について各１例が報
告されているのみであり（Araki Y., E. Ito, Eur. J.
Biochem., 55, 71 (1975) ；島原建三、岩崎浩吉、旭硝
子工業技術奨励会研究報告，４１，２９９（１９８２）
参照）、これらの方法についてはその後ほとんど進展を
見ていない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、そのオリゴマ−及びキチンに作用する
デアセチラーゼの製造方法について鋭意研究を重ねた結
果、ビブリオ属に属する菌株が、デアセチラーゼを生産
することを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、ビブリオ属に属する
デアセチラーゼ生産菌を培養し、生成されたデアセチラ
ーゼを採取することを特徴とするデアセチラーゼの製造
方法に係る。上記デアセチラーゼ生産菌は、例えばビブ
リオ・コレレ非−０１を一例として挙げることができ
る。

【０００９】本発明に用いられるビブリオ属に属する菌
株は公知のものであり、例えばビブリオ・コレレ非−０
１−１１４８Ａは、大阪大学微生物病研究所より入手で
きる。

【００１０】以下に、ビブリオ属に属するデアセチラー
ゼ生産菌の培養条件、デアセチラーゼの取得法及び、デ
アセチラーゼの特徴を、ビブリオ属に属するデアセチラ
ーゼ生産菌としてビブリオ・コレレ非−０１を使用した
場合を例にとり、詳細に説明する。

【００１１】１本酵素の生産菌の培養条件ビブリオ・コレレ非−０１を培養するための培地として
は、炭素源、窒素源及び無機塩を含む通常の培地に誘導
物質を添加したものが使用できる。この誘導物質として
は、キチン、キチン分解物、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン、Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴマ−を単独又はこ
れらのうち２種以上を組み合わせたものを使用できる。
炭素源としては、上記微生物が同化できるものであれば
良く、例えばグルコース、マルトース、キシロース、ス
クロース、ペプトン等が例示でき、前記誘導物質を炭素
源を兼ねて使用することもできる。窒素源としては、例
えばイーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶
液等の有機窒素、又は、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム等の無機窒素が例示できるが、前記誘導物質を窒
素源を兼ねて使用することもできる。無機塩としては硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウ
ム、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、
塩化カルシウム等を適宜組み合わせて使用できる。さら
に、上記の各種成分の他に寒天、ゼラチン等のゲル化剤
を任意的に培地に加えることも可能である。上記培地の
ｐＨは、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨ６．
５〜８．０の範囲内に調整され、高圧殺菌により殺菌さ
れる。

【００１２】ビブリオ・コレレ非−０１によるデアセチ
ラーゼの生成は、上記のようにキチン、キチン分解物、
Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン
オリゴマ−を誘導物質として、培養培地内に存在させた
ときに誘導される。デアセチラーゼの生成のためには、
上記誘導物質を培地に０．１g/リットル以上、好適には１．
０〜５０g/リットルの濃度で加える。

【００１３】培地の具体例としては、培地１リットル当
たり３ｇの硝酸アンモニウム、１ｇのリン酸水素二カリ
ウム、２０ｇの塩化ナトリウム、０．５ｇの硫酸マグネ
シウム、０．０８ｇの塩化カルシウム、４ｇのキチンを
各々含有したｐＨ７．０の液体培地を例示できる。

【００１４】ビブリオ・コレレ非−０１は、２５〜４０
℃、好適には３５〜３８℃の好気的条件下で培養され
る。

【００１５】２本酵素の取得法デアセチラーゼを産生するビブリオ・コレレ非−０１
は、キチン、Ｎ−アセチルグルコサミン等の誘導物質を
０．１ｇ／リットル以上、好適にはキチンを１．０〜５
０ｇ／リットル含有する上記のような培地内で、３５〜
３８℃の好気的条件下で３５〜８０時間培養される。得
られた培養液は、遠心分離、マイクロフィルトレーショ
ン等の当分野で一般的に用いられている方法により、溶
液と菌体とに分離される。アセトンによる沈殿、透析、
限外濾過等の当分野で酵素の濃縮のために一般的に用い
られている分離手段を利用して、分離された溶液から目
的とするデアセチラーゼを濃縮、取得することができ
る。分離された菌体からは、ポリミキシン処理または機
械的な方法により菌体を破壊した後、従来の方法により
酵素を沈殿させて、目的とするデアセチラーゼを得るこ
とができる。

【００１６】本酵素を取得するための一連の好適な方法
の具体例を以下に例示する。

【００１７】ビブリオ・コレレ非−０１は、キチン、Ｎ
−アセチルグルコサミン等の誘導物質を１．０〜５０ｇ
／リットル含有する上記のような培地内において、３５
〜３８℃の好気的条件下で、３５〜８０時間培養され
る。得られた培養液は、８０００×ｇで２０分間遠心分
離にかけて培養液上清と菌体とに分離される。得られた
上清に固形硫酸アンモニウムを６０％飽和溶液になるま
で加え、５℃で３時間以上放置する。析出するデアセチ
ラーゼを含有する沈殿物を８０００×ｇで２０分間遠心
分離にかけて回収し、水に溶解する。この溶液を５℃で
４時間以上透析して目的のデアセチラーゼを得る。一
方、培養液から分離された菌体は、２５万単位のポリミ
キシンＢを含有する生理食塩水１０ｍｌに加え、３７℃
で２０分間振とうした後、８０００×ｇで２０分間の遠
心分離操作を２回繰り返し、得られた上清を合わせて５
℃で４時間以上透析して目的のデアセチラーゼを得る。

【００１８】３本酵素の特徴本発明の方法により製造されるデアセチラーゼは、以下
のような特徴を有する。

【００１９】作用：キチン、Ｎ−アセチルグルコサミン
及びそのオリゴマーに作用し、これらのアセトアミド基
を脱アセチル化し、キトサン、グルコサミン及びグルコ
サミンオリゴマーを生成する。各基質に対する酵素活性
は、ビブリオ・コレレ非−０１から得られた酵素に関
し、以下の実施例に例示される。

【００２０】ｐＨ：ｐＨ６〜１０．６の範囲で活性を有
し、至適ｐＨは、７〜８である。

【００２１】温度：２５〜４０℃の範囲で活性を有し、
至適温度は３０〜３７℃である。

【００２２】

【発明の効果】本発明のデアセチラーゼを使用すること
により、温和な条件で、その基質特異性のため副反応を
起こすことなく、キチン、Ｎ−アセチルグルコサミン及
びそのオリゴマーを脱アセチル化することができ、高品
質のキトサン、グルコサミン及びそのオリゴマーを簡単
に得ることができるようになった。

【００２３】キトサン及びグルコサミンのオリゴマー
は、近年注目されており、本発明の方法は、広範な応用
が期待される。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説
明する。

【００２５】

【実施例１】培地１リットル当たり各々硝酸アンモニウ
ムを３ｇ、リン酸水素二カリウムを１ｇ、塩化ナトリウ
ムを２０ｇ、硫酸マグネシウムを０．５ｇ、塩化カルシ
ウムを０．０８ｇ及びキチンを１５ｇ含有したｐＨ７．
０の液体培地上で、ビブリオ・コレレ非−０１−１１４
８Ａを、３７℃の好気的条件下、５４時間培養した。そ
の後、培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離にか
け、培養液上清と菌体とを分離した。菌体を、２５万単
位のポリミキシンＢを含有する生理食塩水１０ｍｌに加
え、３７℃で２０分間振とうした後、８０００×ｇで２
０分間の遠心分離操作を２回繰り返し、得られた上清を
合わせて５℃で２４時間透析した。さらに、８０００×
ｇで２０分間遠心分離を行い、９．８ｍｌの上清を得
た。

【００２６】この上清０．３ｍに、ｐＨ７．８の０．１
５Ｍリン酸塩緩衝液０．１ｍｌ及び下記の６種類の基質
溶液（濃度１％）０．１ｍｌを各々加え６種類の検体を
作成し、３２℃で１時間振とうした後、生成したアミノ
酸をインド−ル・塩酸法で定量した。結果を、培養液１
リットル当たりの酵素活性に換算して以下の表１に示
す。

【００２７】

【表１】＊１時間に１μ当量のアミノ基を生成する酵素量を１ユ
ニット（Ｕ）とする。

【００２８】

【００２９】

【００３０】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ビブリオ属に属し、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン、そのオリゴマー、またはキチンに作用するデア
セチラーゼ生産菌を培養し、生産されたデアセチラーゼ
を採取することを特徴とするデアセチラーゼの製造方
法。
【請求項２】ビブリオ属に属するデアセチラーゼ生産菌
が、ビブリオ・コレレ非−０１である請求項１に記載の
デアセチラーゼの製造方法。