JPH04349884A - デアセチラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビブリオ属に属するデ
アセチラーゼ生産菌により製造される、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、そのオリゴマ−及びキチンに作用する新規
のデアセチラーゼの製造方法に関するものである。

【０００２】ここで、デアセチラーゼとは、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、そのオリゴマ−又はキチンを脱アセチ
ル化する酵素を意味する。

【０００３】

【従来の技術及びその課題】近年、セルロースに次ぐバ
イオマス資源であるキチン及びその脱アセチル化物であ
るキトサンが、機能性多糖として注目されている。特に
、低分子量のキトサン即ち、Ｎ−アセチルグルコサミン
のオリゴマーは強い抗細菌性、抗カビ性及びエリシター
活性を持つことが見出され、その重要性が増している。

【０００４】キトサンは、従来エビ、カニ等の甲殻類の
クチクラ（甲殻）から無機塩、タンパク質、脂質等を除
いた精製キチンを原料として、３０〜６０％の濃アルカ
リ溶液中で加熱することにより調製されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の熱濃ア
ルカリ溶液を用いる方法では、脱アセチルと同時にキチ
ン主鎖の分解を伴い、目的とするキトサンの収率の低下
、副生成物の増加を来すという欠点を有する。

【０００６】キチンを脱アセチル化する別法としては、
デアセチラーゼ又は、該酵素を生産する微生物を用いる
方法が考えられる。しかし、この生物学的方法に関して
は、ムコール属及びアエロモナス属について各１例が報
告されているのみであり（Ａｒａｋｉ　Ｙ．，　Ｅ．　
Ｉｔｏ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５５
，　７１　（１９７５）　；島原建三、岩崎浩吉、旭硝
子工業技術奨励会研究報告，４１，２９９（１９８２）
参照）、これらの方法についてはその後ほとんど進展を
見ていない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、そのオリゴマ−及びキチンに作用する
デアセチラーゼの製造方法について鋭意研究を重ねた結
果、ビブリオ属に属する菌株が、デアセチラーゼを生産
することを見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、ビブリオ属に属する
デアセチラーゼ生産菌を培養し、生成されたデアセチラ
ーゼを採取することを特徴とするデアセチラーゼの製造
方法に係る。上記デアセチラーゼ生産菌は、例えばビブ
リオ・コレレ非−０１を一例として挙げることができる
。

【０００９】本発明に用いられるビブリオ属に属する菌
株は公知のものであり、例えばビブリオ・コレレ非−０
１は、例えば微生物工業技術研究所（微工研）より入手
できる。

【００１０】以下に、ビブリオ属に属するデアセチラー
ゼ生産菌の培養条件、デアセチラーゼの取得法及び、デ
アセチラーゼの特徴を、ビブリオ属に属するデアセチラ
ーゼ生産菌としてビブリオ・コレレ非−０１を使用した
場合を例にとり、詳細に説明する。

【００１１】１　　本酵素の生産菌の培養条件ビブリオ
・コレレ非−０１を培養するための培地としては、炭素
源、窒素源及び無機塩を含む通常の培地に誘導物質を添
加したものが使用できる。この誘導物質としては、キチ
ン、キチン分解物、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−ア
セチルグルコサミンオリゴマ−を単独又はこれらのうち
２種以上を組み合わせたものを使用できる。 炭素源としては、上記微生物が同化できるものであれば
良く、例えばグルコース、マルトース、キシロース、ス
クロース、ペプトン等が例示でき、前記誘導物質を炭素
源を兼ねて使用することもできる。窒素源としては、例
えばイーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶
液等の有機窒素、又は、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム等の無機窒素が例示できるが、前記誘導物質を窒
素源を兼ねて使用することもできる。無機塩としては硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム
、リン酸カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩
化カルシウム等を適宜組み合わせて使用できる。さらに
、上記の各種成分の他に寒天、ゼラチン等のゲル化剤を
任意的に培地に加えることも可能である。上記培地のｐ
Ｈは、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨ６．５
〜８．０の範囲内に調整され、高圧殺菌により殺菌され
る。

【００１２】ビブリオ・コレレ非−０１によるデアセチ
ラーゼの生成は、上記のようにキチン、キチン分解物、
Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン
オリゴマ−を誘導物質として、培養培地内に存在させた
ときに誘導される。デアセチラーゼの生成のためには、
上記誘導物質を培地に０．１ｇ／リットル以上、好適に
は１．０〜５０ｇ／リットルの濃度で加える。

【００１３】培地の具体例としては、培地１リットル当
たり３ｇの硝酸アンモニウム、１ｇのリン酸水素二カリ
ウム、２０ｇの塩化ナトリウム、０．５ｇの硫酸マグネ
シウム、０．０８ｇの塩化カルシウム、４ｇのキチンを
各々含有したｐＨ７．０の液体培地を例示できる。

【００１４】ビブリオ・コレレ非−０１は、２５〜４０
℃、好適には３５〜３８℃の好気的条件下で培養される
。

【００１５】２　　本酵素の取得法 デアセチラーゼを産生するビブリオ・コレレ非−０１は
、キチン、Ｎ−アセチルグルコサミン等の誘導物質を０
．１ｇ／リットル以上、好適にはキチンを１．０〜５０
ｇ／リットル含有する上記のような培地内で、３５〜３
８℃の好気的条件下で３５〜８０時間培養される。得ら
れた培養液は、遠心分離、マイクロフィルトレーション
等の当分野で一般的に用いられている方法により、溶液
と菌体とに分離される。アセトンによる沈殿、透析、限
外濾過等の当分野で酵素の濃縮のために一般的に用いら
れている分離手段を利用して、分離された溶液から目的
とするデアセチラーゼを濃縮、取得することができる。 分離された菌体からは、ポリミキシン処理または機械的
な方法により菌体を破壊した後、従来の方法により酵素
を沈殿させて、目的とするデアセチラーゼを得ることが
できる。

【００１６】本酵素を取得するための一連の好適な方法
の具体例を以下に例示する。

【００１７】ビブリオ・コレレ非−０１は、キチン、Ｎ
−アセチルグルコサミン等の誘導物質を１．０〜５０ｇ
／リットル含有する上記のような培地内において、３５
〜３８℃の好気的条件下で、３５〜８０時間培養される
。得られた培養液は、８０００×ｇで２０分間遠心分離
にかけて培養液上清と菌体とに分離される。得られた上
清に固形硫酸アンモニウムを６０％飽和溶液になるまで
加え、５℃で３時間以上放置する。析出するデアセチラ
ーゼを含有する沈殿物を８０００×ｇで２０分間遠心分
離にかけて回収し、水に溶解する。この溶液を５℃で４
時間以上透析して目的のデアセチラーゼを得る。一方、
培養液から分離された菌体は、２５万単位のポリミキシ
ンＢを含有する生理食塩水１０ｍｌに加え、３７℃で２
０分間振とうした後、８０００×ｇで２０分間の遠心分
離操作を２回繰り返し、得られた上清を合わせて５℃で
４時間以上透析して目的のデアセチラーゼを得る。

【００１８】３　　本酵素の特徴 本発明の方法により製造されるデアセチラーゼは、以下
のような特徴を有する。

【００１９】作用：キチン、Ｎ−アセチルグルコサミン
及びそのオリゴマーに作用し、これらのアセトアミド基
を脱アセチル化し、キトサン、グルコサミン及びグルコ
サミンオリゴマーを生成する。各基質に対する酵素活性
は、ビブリオ・コレレ非−０１から得られた酵素に関し
、以下の実施例に例示される。

【００２０】ｐＨ：ｐＨ６〜１０．６の範囲で活性を有
し、至適ｐＨは、７〜８である。

【００２１】温度：２５〜４０℃の範囲で活性を有し、
至適温度は３０〜３７℃である。

【００２２】

【発明の効果】本発明のデアセチラーゼを使用すること
により、温和な条件で、その基質特異性のため副反応を
起こすことなく、キチン、Ｎ−アセチルグルコサミン及
びそのオリゴマーを脱アセチル化することができ、高品
質のキトサン、グルコサミン及びそのオリゴマーを簡単
に得ることができるようになった。

【００２３】キトサン及びグルコサミンのオリゴマーは
、近年注目されており、本発明の方法は、広範な応用が
期待される。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例を挙げてより詳細に説
明する。

【００２５】

【実施例１】培地１リットル当たり各々硝酸アンモニウ
ムを３ｇ、リン酸水素二カリウムを１ｇ、塩化ナトリウ
ムを２０ｇ、硫酸マグネシウムを０．５ｇ、塩化カルシ
ウムを０．０８ｇ及びキチンを１５ｇ含有したｐＨ７．
０の液体培地上で、ビブリオ・コレレ非−０１−１１４
８Ａを、３７℃の好気的条件下、５４時間培養した。そ
の後、培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離にかけ
、培養液上清と菌体とを分離した。菌体を、２５万単位
のポリミキシンＢを含有する生理食塩水１０ｍｌに加え
、３７℃で２０分間振とうした後、８０００×ｇで２０
分間の遠心分離操作を２回繰り返し、得られた上清を合
わせて５℃で２４時間透析した。さらに、８０００×ｇ
で２０分間遠心分離を行い、９．８ｍｌの上清を得た。

【００２６】この上清０．３ｍに、ｐＨ７．８の０．１
５Ｍリン酸塩緩衝液０．１ｍｌ及び下記の６種類の基質
溶液（濃度１％）０．１ｍｌを各々加え６種類の検体を
作成し、３２℃で１時間振とうした後、生成したアミノ
酸をインド−ル・塩酸法で定量した。結果を、培養液１
リットル当たりの酵素活性に換算して以下の表１に示す
。

【００２７】

【表１】 ＊１時間に１μ当量のアミノ基を生成する酵素量を１ユ
ニット（Ｕ）とする。

【００２８】

【実施例２】デアセチラーゼ生産菌としてビブリオ・コ
レレ非−０１−１１３６Ｂ（海水分離菌）を使用し、誘
導物質としてキチン１５ｇの代わりに１０ｇのＮ−アセ
チルグルコサミンを含有する培地を使用する他は、実施
例１と同じ条件で培養及び単離操作を行い、目的のデア
セチラーゼを含む１０．３ｍｌの上清を得た。

【００２９】この上清０．３ｍｌに、ｐＨ９．２の炭酸
ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液０．１ｍｌ及び
０．１モルのＮ−アセチルグルコサミン溶液０．１ｍｌ
を加えて３２℃で１時間振とうした後、生成したアミノ
酸をインド−ル・塩酸法で定量した。この方法で得られ
た酵素は、４．７（Ｕ／ｌ）の活性を示した。

【００３０】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ビブリオ属に属するデアセチラーゼ生産菌
   を培養し、生産されたデアセチラーゼを採取することを
   特徴とするデアセチラーゼの製造方法。
2. 【請求項２】ビブリオ属に属するデアセチラーゼ生産菌
   が、ビブリオ・コレレ非−０１である請求項１に記載の
   デアセチラーゼの製造方法。