JPH01174383A - 酵素によるｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素によるＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造
方法に関するものである。

Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の応用用途については、６量
体であるＮ−アセチルキトヘキサオースの免疫機能増強
作用、抗腫瘍効果など、医薬面での効果が期待されてい
る。臨床検査薬分野においては、β−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼやリゾチームの測定基質として使用する
ことができる。

従来の技術 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法としては、酸による
部分分解により各種オリゴ糖を得る方法〔ジェイ・エイ
・ルプリー；ハイオケミカ・バイオフィジカ・アクタ　
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　８３
゜２４５−２５５（１９６４）　〕があるが、本方法に
よっては、特定のオリゴ糖を選択的に得ることはできず
、また分解条件を必ずしも一定に保つことは難しく、そ
のため収率も低い。

一方、キチンを原料としてキチナーゼにより酵素分解し
て調製する方法〔アール・エフ・パウニングら；ネイチ
＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２００．１１２８（１９６３
）　〕もあるが、本方法によっても、特定のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を効率的に調製することは同様に困難で
ある。

さらに、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法について
は、ノカルジア属に属する微生物の生産するキチナーゼ
の逆反応を利用する方法が報告されている（特開昭６２
−１４６５９８）。本方法は、硫安沈殿、カラムクロマ
ト分離などにより精製された精製キチナーゼを用いて、
Ｎ−アセチルキトテトラオースからＮ−アセチルキトヘ
キサオース、Ｎ−アセチルキトペンフォースからＮ−ア
セチルキトテトラオースなど２糖単位の付加転移を行う
ものである。本方法の場合、高度に精製した酵素を用い
ることが必須であり、必ずしも安価なＮ−アセチルキト
オリゴ糖の製造法とはいえない。

発明が解決しようとする問題点 本発明は、酵素を用いてより安価に重合度の高いＮ−ア
セチルキトオリゴ糖を製造する方法を提供する。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、より安価なＮ−セチルキトオリゴ糖の製
造方法について鋭意検討した結果、トリコデルマ属に属
する微生物の培養物に、糖転移付加反応の強いキチナー
ゼ活性を見出し、さらにノカルジア属に属する微生物の
培養物より精製されたキチナーゼに見出されている２糖
の転移付加活性に加え、１糖単位が転移付加される活性
を新たに見出し本発明を完成させるに至った。本発明に
示す微生物の培養物中のキチナーゼの糖転移付加活性は
、ノカルジア属に属する微生物の場合に比べはるかに強
力であって、従って、ノカルｓ、；゛ｒ属に属する微生
物の場合と同様に微生物の培養物から精製した酵素を反
応に用いることができるにとどまらず、精製した酵素を
用いずに、その培養液、。

菌体あるいは、培養物よりキトビアーゼ活性を除去した
粗精製酵素を用いてもＮ−アセチルキトオリゴ糖を製造
することができる。例えば、ノカルジア属に属する微生
物の場合には、菌体を除去した培養液から塩析により取
得した沈殿物を、さらに、溶解、透析、イオン交換体ク
ロマトグラフィー、塩析、溶解、透析、ゲルクロマトグ
ラフィーの順に従って精製した酵素を用いることが必須
であったが、本発明による微生物の場合には、菌体を除
去した培養液から塩析により取得した沈殿物を、単に、
緩衝液に溶解し、イオン交換体クロマトグラフィーによ
って精製するだけで、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖を製造
することのできる酵素を取得することができる。

本発明の方法において用いられる酵素は、トリコデルマ
属に属する微生物の生産するキチナーゼであって少なく
とも３種類の酵素である。そのうちの１種は精製単離さ
れており次に示す如き理化学的性質を有する。

（ａ）作用 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、強い２糖単位の糖
転移反応を起こす。本酵素の酵素量に対し過剰のＮ−ア
セチルキトオリゴ糖を作用させた場合、糖転移反応によ
り重合度の高いＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成する。

またキチンまたはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、
これを加水分解する。

（ｂ）　　至適ｐＨ コロイドキチンを基質として４０℃で反応を行った場合
、本酵素はｐ　Ｈ５，５に至適ｐＨを有する。

（ｃ）ｐＨ安定性 本酵素は４℃で２４時間の処理においてｐＨ４〜８で安
定である。

（ｄ”ｌ　　至適温度 コロイドキチンを基質としてｐ　Ｈ５，５で反応を行っ
た場合、本酵素は４０℃付近に至適温度を有する。

（ｅ）　　熱安定性 本酵素はｐ　Ｈ５，５で３０分間の処理において５５℃
以下で安定である。

（ｆ）　　分子量 ５ＤＳ−ディスク電気泳動により測定される本酵素の分
子量は約６８０００である。

〔励　等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定される本酵
素の等電点は４．５〜４．６である。

本発明のキチナーゼは、次のようにして製造することが
できる。

本発明に用いられるキチナーゼは、トリコデルマ属に属
するキチナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物中にキチ
ナーゼを生成させ、これを採取することにより得ること
ができる。

酵素生産に用いるトリコデルマ属に属するキチナーゼ生
産菌としては、トリコデルマ属に属しキチナーゼを生産
する菌であればいずれでも用いることができる。その例
としては、例えば、トリコブル’？・リーセイ　（Ｔｒ
ｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）が挙げられ、具体
的にはトリコデルマ・リーセイＫＤＤ−１０（ＮＲＲＬ
−１５４９７）（特開昭６Ｏ−２７３８５）、同ＫＤＲ
−１１（ＦＥＲＭ−Ｐ６６３５）（特開昭５９−１７９
８４）、同ｐ　ｃ　−３−７（ＮＲＲＬ−１５５００）
　（特開昭６Ｏ−２７３１１１４）、同Ｐ　ＣＤ　−１
０（ＦＢＲＭ−Ｐ８１７２）　（特開昭６ｌ−２６５０
８９）、同ＣＤＵ−１１（ＦＥＲＭ−Ｐ８１７３）（特
開昭６ｌ−２６５０８９）などが挙げられる。培養に用
いられる培地は、上記微生物が利用し得る炭素源、窒素
源、無機物など程よく含むものであれば天然培地または
合成培地のいづれでも用いることができる。

炭素源としては、アビセル、ホエー、沖紙、一般紙類（
°例えば、新聞紙、トイレットペーパー）、バガス、も
みがら、稲わらなどの植物繊維質およびその含有物、シ
ュークロース、グルコース、ケーンモラセス、グリセロ
ール、セロビオース、キシロース、アラビノースなどが
単独もしくは組み合わせて用いられる。

窒素源としては、硫安などの無機アンモニウム塩、尿素
、アミノ酸、肉エキス、ポリペプトン、ペプトンなどの
有機物が単独もしくは組み合わせて用いられる。

無機塩類としては、リン酸第−カリウム、リン酸第二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化銅、
硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛などが単独もしく
は組み合わせて用いられる。

さらに必要に応じて、培地に界面活性剤などを添加して
もよい。

また、キチナーゼの生産能をより高めるには誘導基質で
あるキチンを添加することが好ましい。

培地は、液体培地でも固体培地でも良いが、大量に行う
場合には液体培地が好ましい。培養方法としては通常、
通気攪拌培養などの方法が用いられる。培養条件は、培
地の組成、菌株の種類によって異なるが、培養温度は２
５〜３５℃、ｐ）１は３〜６、培養時間は２〜１５日間
である。培養は、培養途中でさらに新たな培地を該培養
培地に一括添加または間欠もしくは連続添加しながら行
うこともできる。目的とするキチナーゼは通常菌体外に
蓄積されるので、公知の分離精製手段により、培養物か
ら分離精製される。例えば、培養物から遠心分離あるい
は濾過により菌体を除去した後、培養ν液に飽和量の芒
硝（硫酸ナトリウム１０水塩）または硫酸アンモニウム
などの塩を加えて沈殿物を得る。

この沈殿物を濾過あるいは遠心分離などの方法により分
離取得した後、風乾、凍結乾燥、アセトンなど親水溶媒
による脱水乾燥などの方法で乾燥粉末とする。このよう
な方法で得られた材料を、粗酵素粉末とする。粗酵素粉
末からのキチナーゼの分離精製は、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−
３ｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア・ファイン・ケミカ
ル社製）などの１段階のイオン交換クロマトク゛ラフイ
ー、または硫安分画操作など、キトビアーゼ活性を除く
ことのできる操作ならいずれの操作でもよく、簡単な単
位操作で精製を行うことができる。

この精製方法により、３種のキチナーゼを得ることがで
きる。１種は１糖単位の転移付加反応を有し、他の２種
は２糖単位の転移付加反応を有する。２糖単位の転移付
加反応の活性が強い方の酵素の理化学的性質は前記のと
おりである。

このようにして得られるキチナーゼの活性や糖転移反応
は次のようにして測定する。

（１）キチナーゼの活性 ０．２％コロイドキチンを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，６）２．０ｍｌに酵素液を加えて４０℃で１０分
間反応させる。反応後シャール試薬（０５ｇのフェリシ
アン化カリウムを０．５Ｍ炭酸す）　ＩＪウム溶液１１
に溶解したもの＞３．０ｍｌを加え沸騰渦中で１５分間
加熱する。水で冷却後、遠心分離して不溶物を除き上清
液の４２０ｎｍにおける吸光度の減少を測定する。還元
糖の生成はＮ−アセデルグルコサミンを用いた標準曲線
から求める。酵素活性ＩＵは１分間に１μｍｏｌｅのＮ
−アセデルグルコサミンを生成する酵素量とした。

（２）糖転移反応 ５％のＮ−アセチルキトオリゴ糖を含む０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ５，６）２ｍｌに酵素溶液を加えて４０℃
で６０時間反応させる。

一定時間ごとに反応液を採取し沸騰渦中で１０分加熱し
反応を停止させる。これら溶液を高速液体クロマトグラ
フィーに供し、反応生成物を確認する。

本発明の原料としては、キチン部分加水分解物、Ｎ−ア
セチルキトオリゴ糖などが用いられる。

これらキチン部分加水分解物は、キチンを濃塩酸で４０
℃で２〜３時間加水分解しアルカリで中和した後、活性
炭に吸着させアルコ一ルで溶出することによって調製で
きる。また、キチン部分加水分解物は、キチンを酸また
はアルカリで可溶化機中和し、キチナーゼを作用させて
部分分解させ、その後、ＯＦ膜で処理した透過液を活性
炭に吸着させアルコールで溶出することによって調製で
きる。キチン部分加水分解物は、２〜８量体のＮ−アセ
チルキトオリゴ糖を含むそれぞれのＮ−アセチルキトオ
リゴ糖は、上記アルコール溶出時に、アルコール濃度勾
配をかけて溶出したり、あるいは、ゲル沖過や高速液体
クロマトグラフィーなどの手段により分離し調製するこ
とができる。

本発明で上記原料と上記キチナーゼを作用させるには、
原料を０．５〜３０重量％含むものを基質とし、ｐＨ３
〜７、温度３０〜６０℃で酵素量は基質１ｇ当り１〜２
０００Ｕを用いて反応させると良い。反応時間は、基質
量、反応ｐＨ，温度、酵素量などによって大きく異なる
が、通常３０分〜６０時間である。

かくして酵素反応を終了した反応混合物は沸騰湯中で１
０分間加熱し反応を停止させる。

上記酵素反応により１以上の糖が転移付加したＮ−アセ
チルキトオリゴ糖を含む反応混合物が得られる。

このようにして得られる反応混合物からのＮ−アセチル
キトオリゴ糖の分離精製は、周知の分離、精製手段によ
り行うことができる。

たとえば、活性炭に反応混合物を吸着させ、アルコール
濃度勾配法により分離溶出させる方法や、ゲルｐ過、高
速液体クロマトグラフィーなどの手段により分離、精製
することができる。

次に、本発明の参考例および実施例についてさらに具体
的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するもの
ではない。

参考例Ｉ ＫＤＲ−１１をポテトデキストロース寒天培地で２８℃
で７日間培養し活性化した。該活性化胞子を生理食塩水
に均一に懸濁したく約１０８個／ｍ１）。

その懸濁液Ｑ、５ｍｌを５Ｑｍｌの第１表に示す標準培
地に植菌し、２８℃、ｐＨ４で２日間培養した。

第　　１　　表　（標準培地） アビセルｐＨ３０１（旭化成社製）　　　　　１　　％
ポリペプトン　　　　　　　　　　　０．１　　％酵母
エキス　　　　　　　　　　　０．０５％（ＮＨ＝）ｓ
ｓｏ＜　　　　　　　　　　　０．１４％Ｋ　Ｈ２Ｐ　
０４　　　　　　　　　　　　０．２　％ＭｇＳＯ４・
７Ｈ，ＯＯ，０３％ Ｃａ　ＣＡｘ　・２　Ｈ２Ｏ０，０３％トゥイーンー８
０（花王アトラス社製＞　　１　１１１１／β微量金属
塩液”　　　　　　　　　　　　１ｍｌ／ｊ！＊〔ホウ
酸　　　　　　　　　　　　６　　ｍｇモリブデン酸ア
ンモニウム　　２６’　　ｍｇ塩化第二鉄　　　　　　
　　１００　　ｍｇ硫酸銅　　　　４０　ｍｇ 塩化マンガン　　　　　　　　　８　　ｍｇ塩化亜鉛　
　　　　　２００　ｍｇ を１００　ｍｌのイオン交換水に溶かしたもの〕ついで
、該培養液２５　Ｑｍｌ　（フラスコ５本分）を２５０
　Ｑｍｌの標準培地を含有する５βジャーファーメンタ
−に添加して２８℃、ｐＨ４で２日間種培養した。さら
に核種培養液２５　Ｑｍｌを２５００ｍ１の培地（第１
表の標準培地において、アビセルｐＨ３０１を６％に代
え、さらにコロイドキチン０．５％を加えたもの）を含
有する５Ｉｌジャーファーメンタ−に添加し、２８℃、
ｐＨ４で１０日間培養した。

培養終了後、培養液を濾過し、その上澄液中のキチナー
ゼ活性を求めたところ、６．２　ロ／ｌｌ１ｌであった
。

さらに、培養液を８００　Ｑｒ、ｐ、ｍ、１５分間で遠
心分離した。得られた炉液に硫安を０．８飽和度で添加
し、５℃で２４時間塩析した。沈殿したタンパク質と塩
の混合物を炉別しｐ液を水に溶解抽出後、セファデック
スＧ−２５（ファルマシア・ファイン・ケミカル社製）
カラムに通液し蒸留水で溶出を行い脱塩した。

ついで溶出液を凍結乾燥し、粗酵素標品的５０ｇを得た
。本粗酵素標品のキチナーゼ活性は０、２８０／ｍｇで
あった。

この粗酵素標品２ｇを、予め５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５，０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　　（７ｙルマシア・ファイ
１ン・ケミカル社製）イオン交換体カラム（３，２φＸ
５０ｃｍ＞に通塔し、１８ｍ１ずつ分取したところ、素
通り画分に２つのキチナーゼ活性を有する画分Ｆ−Ｉ（
フラクション番号１０−３０）とＦ−ＩＩ　（フラクシ
ョン番号４０−４５）を得た。

さらに、吸着部を０〜０．５Ｍ　　ＮａＣｌ２直線濃度
勾配により溶出させると、フラクション１３０〜１４０
にキチナーゼ活性を有するＦ−ＩＩＩ画分を得た。第１
図に本カラムの溶出パターンを示した。

Ｆ−Ｉ［［画分をさらに５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２０
０（７ｙルマシア・ファイン・ケミカル社製１．６φＸ
９５ｃｍ）に通塔し、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５，
５）で溶出を行った。２ｍｌずつ分取し、キチナーゼ活
性を有するフラクション４０−５２を集め、濃縮し、凍
結乾燥したところ、精製酵素粉末的２５０ｍｇを得た。

このようにして得られたキチナーゼはＳＤＳ一ゾイスク
電気泳動で均一であった。

実施例１ Ｎ−アセチルキトトリオース１ｇを４０ｍ１の０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に溶解し、３０℃に保った
後、参考例１０Ｆ−Ｉ画分を４〜５Ｕ相当分添加して、
３０℃で２４時間反応させた。

反応終了後、１００℃で１０分間加熱し、反応を停止さ
せた。得られた反応混合物を３．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ
。

１０分間遠心分離し、その上清を高速液体クロマトグラ
フィーにかけ、その組成を調べたところ、Ｎ−アセチル
キトテトラオース１３％、Ｎ−アセチルキトペンフォー
ス２％、Ｎ−アセチルキトトリオース４７％、Ｎ−アセ
チルキトビオース２６％、Ｎ−アセチルグルコサミン１
２％であった。

実施例２ Ｎ−アセチルキトテトラオース１ｇを４　Ｑｍｌの０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に溶解し、３０℃に保
った後、Ｆ−ｎ画分を４〜５Ｕ相当分添加して、３０℃
で２４時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分
間加熱し、反応を停止させた。

得られた反応混合物を３．０ＯＯｒ、　ｐ、　ｍ、１０
分間遠心分離にかけ、その上清を高速液体クロマトグラ
フィーにかけて、その組成を調べたところ、Ｎ−アセチ
ルキトヘキサオース２％、Ｎ−アセチルキトテトラオー
ス８８％、Ｎ−アセチルキトトリオース７％、Ｎ−アセ
チルキトビオース２％、Ｎ−アセチルグルコサミン１％
であった。

実施例３ Ｎ−アセチルキトテトラオース１０　Ｑｍｇを２ｍｌの
０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に溶解し、
４０℃に保った後、Ｆ−ＩＩＩ画分を４〜５Ｕ相当分添
加して、４０℃で５６時間反応させた。反応が進むにつ
れて、反応液の濁りが増大し、最後には沈殿物を生成し
た。反応終了後、１００℃で１０分間加熱し、反応を停
止させた。沈殿物を遠心分離（３，００Ｏｒ、　ｐ、　
ｍ、　　１０分間）して除き、上清液をＢｉｏ　Ｇｅｌ
　　Ｐ−４（２，６φＸ９５ｃｍ；　バイオラッド社製
）に通塔し、蒸留水で溶出を行い、４ｍｌずつ分取した
。フラクション番号３４〜４０を集めて減圧濃縮し、次
いで凍結乾燥することによりＮ−アセチルキトヘキツオ
ース１６ｍｇを得た。なお、反応液中の不溶物（５ｍｇ
）は、７糖以上の重合度の高い高級オリコマ−であるこ
とを確認した。

実施例４ Ｎ−アセチルキトテトラオース１００ｍｇを２ｍｌの０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に溶解し、４０℃に
保った後、精製したキチナーゼ４〜５１Ｊ添加して、４
０℃で５６時間反応させた。反応終了後１００℃で１０
分間加熱し、反応を停止させた。沈殿物を遠心分離（３
，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、　　１０分間）して除き、上清液
をＢｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−４（２，６φ×９５０ｍ：　バ
イオラッド社製）に通塔し、蒸留水で溶出を行い、４ｍ
ｌずつ分取した。フラクション番号５８〜６５を集めて
減圧濃縮し、次いで凍結乾燥することにより、Ｎ−アセ
チルキトヘキサオース１５ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、参考例１に示したＤＢＡＥ−８ｅｐｈａｒｏ
ｓｅＦａｓｔ　ｆｌｏｗの溶出パターンを示したもので
ある。 □は２８０ｎｍでの吸光度、○□０はキチナーゼ活性、
・−・はキトビオーゼ活性、　　　はＮａＣＲ濃度を示
す。 発明の効果 本発明により、工業的に安価に重合度の高いＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を得ることができる。 特許出願人　（１０２＞協和醗酵工業株式会社代表者　
　加　藤　幹　夫 第　１　図 分伽滞号 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６２年特許願第２１４２３０号 ２、発明の名称 酵素によるＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造法３、補正
をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　　１００ 住所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名称　（１
０２）協和醗酵工業株式会社（ＴＢＬ　：　０３−２８
２−００３６）昭和６４年１月６日（全送日：平成元年
１月３１日）５、補正の対象 発明の詳細な説明の欄及び図面の簡単な説明の欄６、補
正の内容 （１）明細書第２０頁下から第４行の「４、図面の簡単
な説明」の前に、以下の記載を加入する。 「発明の効果 本発明により、工業的に安価に重合度の高いＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を得ること力（できる。」 （２）明細書第２１頁第３行〜第５行の発明の効果の欄
を削除する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トリコデルマ属に属し、キチナーゼ生産能を有する
   微生物を栄養培地に培養し、培養物中にキチナーゼを生
   成蓄積させ、これを採取することを特徴とするキチナー
   ゼの製造法。 ２、トリコデルマ属に属し、キチナーゼ生産能を有する
   微生物の培養液、菌体、またはそれらの処理物と、キチ
   ン部分加水分解物またはＮ−アセチルキトオリゴ糖とを
   水性溶液中で接触させることにより該水性溶液中に原料
   中のＮ−アセチルキトオリゴ糖に１以上の糖が転移付加
   したＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成蓄積させ、これを
   採取することを特徴とする酵素によるＮ−アセチルキト
   オリゴ糖の製造法。 ３、下記理化学的性質を有する新規キチナーゼ１）作用
   および基質特異性：Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に作用し
   、強い２糖単位の糖転移反応を起こす。また、キチンま
   たはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水分
   解する。 ２）至適ｐＨ：４０℃でｐＨ５．５に至適ｐＨを有する
   （基質：コロイドキチン） ３）至適温度：ｐＨ５．５で４０℃付近に至適温度を有
   する（基質：コロイドキチン） ４）熱安定性：ｐＨ５．５、５５℃、３０分間の処理に
   安定 ５）ｐＨ安定性：４℃、ｐＨ４〜８、２４時間の処理に
   安定 ６）分子量：６８０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）７）等
   電点：４．５〜４．６