JPH089972A - 新規デアミノノイラミニダーゼとその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｎ−アシルノイラミン酸残基には作用せず、
デアミノノイラミン酸残基に極めて特異的なデアミノノ
イラミニダーゼ及びこれを産生する微生物を提供する。 【構成】 スフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−４ｓ
などのスフィンゴバクテリウム属に属する細菌を培養
し、その培養物から、デアミノノイラミン酸を含有する
複合糖質もしくは糖質に作用し、デアミノノイラミン酸
ケトシド結合を加水分解して、デアミノノイラミン酸を
含有しない糖質もくしは複合糖質またはデアミノノイラ
ミン酸が部分的に除去された複合糖質もしくは糖質と遊
離のデアミノノイラミン酸とを生成し、かつ、Ｎ−アセ
チルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸を含
有する複合糖質もしくは糖質に対し、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結
合には作用しないデアミノノイラミニダーゼを採取す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なデアミノノイラ
ミニダーゼに関し、詳しくは、シアリダーゼ活性を有し
ないデアミノノイラミニダーゼに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】デアミノノイラミン酸（3-deoxy-D-glyc
ero-D-galacto-nonulosonic acid、あるいは2-keto-3-d
eoxy-D-glycero-D-galacto-nononic acid；以下、「Ｋ
ＤＮ」という）は、シアル酸の５位の炭素に結合するＮ
−アシル基が水酸基に置き換わっている以外は、シアル
酸と同一の構造をしている。これまでに、ＫＤＮはシア
ル酸と同様、複合糖質の構成成分として生物界に広く分
布し、多様な存在様式をもつことが判明している。ま
た、ＫＤＮはシアル酸と異なるユニークな性質をもち、
ＫＤＮ含有複合糖質が受精時の卵−精子相互作用におい
て重要な役割を果たすことなどが明らかにされてきてお
り、ＫＤＮ含有糖タンパク質や糖脂質の構造や機能の解
明には大きな興味がよせられている。

【０００３】ところで、ＫＤＮを含有する複合糖質にお
けるＫＤＮケトシド結合を切断する酵素（デアミノノイ
ラミニダーゼ；以下、「ＫＤＮａｓｅ」ともいう）とし
て、ドジョウの肝臓に存在するＫＤＮ−シアリダーゼ
（Li, Y. -T.ら，Archives ofBiochemistry and Biophy
sics, 第310巻, 第1号, 第243−246頁 (1994年)）が
知られている。また本発明者らは、魚類のニジマスの卵
巣等の組織に、シアリダーゼ活性とデアミノノイラミニ
ダーゼ活性とを有する酵素が存在することを見い出して
いる（未発表）。

【０００４】しかし、いずれの酵素も、ＫＤＮケトシド
結合を特異的に切断する酵素ではなく、ＫＤＮケトシド
結合切断活性と同程度（上記ドジョウ由来の酵素）もし
くはそれ以上（上記ニジマス由来の酵素）のシアリダー
ゼ活性を含んでおり、ＫＤＮのみに特異的に作用する酵
素は知られていない。また、上記の酵素の至適ｐＨは、
ドジョウ由来のものがｐＨ４．５付近であることが知ら
れており、本発明者らはニジマス由来のものがｐＨ４．
４付近であることを見い出している。

【０００５】上記ドジョウ由来の酵素のｐＨ６付近にお
けるデアミノノイラミニダーゼ活性は、至適ｐＨにおけ
るデアミノノイラミニダーゼ活性の６５％であることが
知られており、また、本発明者らは上記ニジマス由来の
酵素はｐＨ６．５付近ではデアミノノイラミニダーゼ活
性が検出されないことを見い出しており、中性ｐＨ条件
下でデアミノノイラミニダーゼ反応を行なうことは困難
であった。さらに、上記のデアミノノイラミニダーゼは
いずれも動物由来の酵素であり、微生物由来のデアミノ
ノイラミニダーゼは全く知られておらず、得られる酵素
量にも限界があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】デアミノノイラミン酸
の構造や機能の解析などの研究にとって、活性が高く、
しかも中性付近で活性を有するデアミノノイラミニダー
ゼは極めて有用であることが期待される。また、活性の
高いデアミノノイラミニダーゼが得られれば、ＫＤＮケ
トシド結合加水分解の逆反応を行なわせることにより、
新しいデアミノノイラミン酸含有複合糖質または糖質等
を創出できることが期待される。

【０００７】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、中性域においても高いＫＤＮａｓｅ活性を有し、し
かも従来知られているＫＤＮａｓｅ活性を有するシアリ
ダーゼと異なり、Ｎ−アシルノイラミン酸残基には作用
せず、ＫＤＮケトシド結合に極めて特異的なＫＤＮａｓ
ｅを提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、ＫＤＮａｓｅを産生する微生物を鋭
意検索した結果、スフィンゴバクテリウム（Sphingobac
terium）属に属する細菌の一種がＫＤＮａｓｅを産生す
ることを見出し、さらにこのＫＤＮａｓｅは中性域で高
い活性を有し、しかもシアリダーゼ活性を示さないこと
を見出し、本発明に至った。

【０００９】すなわち本願発明は、下記の理化学的性質
を有するデアミノノイラミニダーゼである。

【００１０】作用：デアミノノイラミン酸を含有する
複合糖質もしくは糖質に作用し、デアミノノイラミン酸
ケトシド結合を加水分解して、デアミノノイラミン酸を
含有しない複合糖質もしくは糖質、またはデアミノノイ
ラミン酸が部分的に除去された複合糖質もしくは糖質と
遊離のデアミノノイラミン酸とを生成する。

【００１１】基質特異性：デアミノノイラミン酸を含
有する複合糖質もしくは糖質には作用するが、Ｎ−アセ
チルノイラミン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸を含
有する複合糖質もしくは糖質における、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸またはＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシ
ド結合には作用しない。

【００１２】至適反応ｐＨ：ｐＨ５．７〜６．０ 安定ｐＨ範囲：２５℃においてｐＨ４〜９で安定 至適反応温度：２５℃付近 熱安定性：２５℃で少なくとも４８時間失活しない。 阻害及び安定化：遊離のデアミノノイラミン酸によっ
て阻害される。ウシ血清アルブミンなどのタンパク質存
在下で安定化される。

【００１３】また本願発明は、スフィンゴバクテリウム
属に属し、デアミノノイラミニダーゼ生産能を有する細
菌を培養し、その培養物から前記性質を有するデアミノ
ノイラミニダーゼを採取することを特徴とするデアミノ
ノイラミニダーゼの製造方法、及びデアミノノイラミニ
ダーゼ生産能を有するスフィンゴバクテリウム ｍＯＬ
１２−４ｓを提供する。

【００１４】さらに本願発明は、デアミノノイラミン酸
と、糖質及び／又は複合糖質と、上記性質を有するデア
ミノノイラミニダーゼとを共存させることを特徴とする
デアミノノイラミン酸含有糖質及び／又は複合糖質の製
造方法を提供する。

【００１５】尚、本発明のＫＤＮａｓｅを、「本発明酵
素」ということがある。また、ＫＤＮ含有複合糖質また
は糖質とは、糖タンパク質もしくは糖脂質等の複合糖質
または単糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類などの糖質に
ＫＤＮがケトシド結合により結合しているものをいい、
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリ
ルノイラミン酸を含む）含有複合糖質または糖質とは、
複合糖質または糖質にシアル酸がケトシド結合により結
合しているものをいう。さらに、本明細書において、
「シアリダーゼ活性」とは、シアル酸含有複合糖質また
は糖質におけるシアル酸ケトシド結合を分解する活性を
いい、従来知られているシアリダーゼが有するＫＤＮａ
ｓｅ活性を含まない。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１７】＜１＞本発明のＫＤＮａｓｅ （１）本発明酵素の取得法 本発明のデアミノノイラミニダーゼは、上記性質を有す
る新規酵素である。本発明酵素は、例えば、スフィンゴ
バクテリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌を培
養し、その培養物から採取することができる。スフィン
ゴバクテリウム属に属する細菌としては、スフィンゴバ
クテリウム マルチボラム（Sphingobacterium multivo
rum）が挙げられ、具体的には本発明により分離された
スフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−４ｓが挙げられ
る。

【００１８】具体的には、本発明酵素を生産する微生物
を適当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体
培養のときは培養液）から菌体を遠心分離などによって
収集し、菌体を超音波処理などにより破砕して得られる
菌体破砕液、または浸透圧ショックによって菌体外に放
出される酵素活性を持つ画分等を出発物質として、次い
でＫＤＮａｓｅ活性を指標として一般的な酵素の分離法
を適用することにより、所望の精製度の酵素標品を採取
することができる。

【００１９】本発明酵素を産生する微生物の培養は、こ
の微生物が資化可能な炭素源、（ＫＤＮを含むオリゴ
糖、グルコースなど）、窒素源（酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粕などの
有機窒素源；塩酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿
素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、無機塩（カ
ルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなどの
硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩など）などを含む培地中で、
好気的な培養法（振盪培養、通気撹拌培養など）によっ
て生育に適した温度で数時間〜数日間培養することによ
って行うことができる。

【００２０】培養物から収集した菌体から、超音波処理
などによる破砕、あるいは浸透圧ショック等の適当な方
法によって放出された酵素を含む画分から、例えば、硫
酸アンモニウム（硫安）、硫酸ナトリウム等による塩
析；透析；限外ろ過法；吸着クロマトグラフィー、陰イ
オン及び陽イオン交換クロマトグラフィー；疎水性クロ
マトグラフィー；ゲル濾過法；電気泳動法など公知の酵
素精製法、さらにはＫＤＮ含有糖タンパク質 (KDN-gp)
を結合させたアガロースゲル等を用いたアフィニティー
クロマトグラフィーによって目的とする精製度の酵素標
品を得ることができる。

【００２１】本発明酵素のＫＤＮａｓｅ活性は、ＫＤＮ
を含有する複合糖質または糖質等に本発明酵素を作用さ
せて、ＫＤＮのケトシド結合を加水分解させ、遊離する
ＫＤＮを定量することによって測定することができる。
具体的には、本発明酵素を４−メチルウンベリフェリル
ＫＤＮ(4-MU-KDN)に作用させ、ケトシド結合が酵素的に
加水分解されて遊離される４−メチルウンベリフェロン
の蛍光を測定する方法が挙げられる。また、ニジマス卵
巣液由来のＫＤＮ含有糖タンパク質等を基質として用
い、これに本発明酵素を加えて反応させ、この反応液に
塩化セチルピリジニウム（CPC）を加え、遠心分離して
得られる上清中のＫＤＮ量をチオバルビツール酸法（An
alytical Biochemistry 第205巻、244-250,(1992)）で
定量することによっても、ＫＤＮａｓｅ活性を測定する
ことができる。ＫＤＮ含有糖タンパク質は、CPC存在下
で複合体を形成して沈殿するが、酵素反応によって遊離
するＫＤＮは沈殿しないので、未反応のＫＤＮ含有糖タ
ンパク質は遠心分離によって反応系から除くことができ
る。これらの方法は、後記実施例に、より具体的に説明
した。

【００２２】（２）本発明酵素の理化学的性質 本発明酵素の理化学的性質を示す。 作 用 ＫＤＮを含有する複合糖質もしくは糖質に作用し、ＫＤ
Ｎと、それが結合している複合糖質あるいは糖質との結
合を加水分解して、ＫＤＮを持たない複合糖質もしくは
糖質、またはＫＤＮが部分的に除去された複合糖質もし
くは糖質と遊離のＫＤＮとを生成する。また、例えば４
−メチルウンベリフェリルＫＤＮのような、複合糖質及
び糖質以外の化合物とＫＤＮとのケトシド結合にも作用
し得ることが確認されている。

【００２３】さらに、ＫＤＮとラクトースとの混合液に
本発明酵素を作用させたところ、反応液中にＫＤＮ含有
オリゴ糖鎖の存在が認められ、上記反応の逆反応も触媒
することが確認されている。この反応を利用して、ＫＤ
Ｎと、糖質及び／又は複合糖質等と本発明酵素とを共存
させることによって、ＫＤＮ含有糖質及び／又は複合糖
質等を製造することができる。

【００２４】基質特異性 デアミノノイラミン酸（ＫＤＮ）ケトシド結合に作用し
て分解するが、Ｎ−アセチルノイラミン酸又はＮ−グリ
コリルノイラミン酸のケトシド結合には作用しない。

【００２５】本発明酵素は、以下に示すＫＤＮ含有複合
糖質または糖質等に存在するＫＤＮ残基のすべてを切断
し、ＫＤＮ残基の天然において既知な結合様式α2→3，
α2→6，α2→8のケトシド結合のいずれにも作用する。

【００２６】(a)ＫＤＮ含有糖タンパク質，3つの異なる
ＫＤＮ結合(ＫＤＮα2→3Gal，ＫＤＮα2→8ＫＤＮ，Ｋ
ＤＮα2→6GalNAc)を有する糖鎖を多数本結合している
ムチン様糖タンパク質。 (b)ＫＤＮ含有糖タンパク質からアルカリ−ボロヒドリ
ド処理して得られたＫＤＮオリゴ糖アルコール：一般式
(→8ＫＤＮα2→)n→8ＫＤＮα2→6[ＫＤＮα2→3Galβ
1→3GalNAcα1→３］GalNAc-ol，nは2〜9であり、平均
は5。

【００２７】(c)ＫＤＮダイマー，ＫＤＮα2→8ＫＤ
Ｎ。 (d)α2→3Galで結合したＫＤＮ残基を2つ有するＮ−型
糖鎖，ＫＤＮα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→6[K
DNα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→2Manα1→3]Manβ1→4Gl
cNAcβ1→4GlcNAc。

【００２８】(e)ＫＤＮをもつスフィンゴ糖脂質，ＫＤ
Ｎ含有ガングリオシドＧＭ３，ＫＤＮα2→3Galβ1→4G
lcβ1→Cer。 (f)４−メチルウンベリフェリルＫＤＮ。

【００２９】一方、本発明酵素は、既知のシアル酸（Ｎ
−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン
酸）を含有する複合糖質もしくは糖質における、シアル
酸ケトシド結合の加水分解は触媒せず（後記実施例２参
照）、本発明酵素はデアミノノイラミン酸ケトシド結合
に対して極めて特異性が高い。

【００３０】至適反応ｐＨ 本発明酵素は、pH 5.7〜6.0の間で最も高い活性が得ら
れる。pH 4.8と7.5において活性が半減する。

【００３１】至適反応温度 本発明酵素は、25〜30℃付近で、高い酵素活性が得られ
る。 安定性 本発明酵素は、２５℃、pH 4〜9において、数時間放置
した後、比較的安定である。また、本発明酵素は、25℃
で少なくとも48時間失活しない。ただし、本発明酵素は
数10μg/ml以下の濃度では、ｐＨ及びイオン強度に拘わ
らず不安定であるが、ウシ血清アルブミンなどのタンパ
ク質存在下で安定化される。

【００３２】阻害及び活性化 本発明酵素の活性は、各々１mMのカルシウムイオン(Ca
²⁺)， マグネシウムイオン(Mg²⁺)， マンガンイオン(Mn
²⁺) 及びEDTA（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム）に
よって影響されない。

【００３３】本発明酵素の活性は、イオン強度の増加に
ともなって急激に上昇する。NaClの場合、300 mM NaCl
存在下で最高値を示し、50 mM 以下の低イオン強度下で
は、活性は極めて低い。

【００３４】本発明酵素は、遊離のＫＤＮによって阻害
される (3 mM の濃度で）。一方、デアミノノイラミン
酸（ＫＤＮ）の構造アナログである遊離のシアル酸、本
発明酵素の基質とならないＮ−アセチルノイラミン酸又
はＮ−グリコリルノイラミン酸をもつ複合糖質もしくは
糖質によっては阻害されない。また、公知のシアリダー
ゼ (Ｎ−アシルノイラミン酸のケトシド結合を切断) の
特異的な阻害剤である2，3−デヒドロ−2−デオキシ−N
−アセチルノイラミン酸によって阻害されない。

【００３５】分子量 本発明酵素の分子量は、ゲル濾過（セファクリル(Sepha
cryl)S-200 カラム，1.8 cm×135 cm；20 mM トリス塩
酸緩衝液 (pH 8.0)／0.5 M NaClで溶出）により、およ
そ 50,000、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、約 57,000と推定される。

【００３６】ミカエリス定数 ４−メチルウンベリフェリルＫＤＮ(4-MU-KDN)を基質と
したときの本発明酵素のミカエリス定数（Km)及び 酵素
反応最大速度(Vmax）は以下の通りである。

【００３７】Km ： 19μM Vmax： 0.19μM/min または 7.4 mM/min/mg タンパク質

【００３８】＜２＞本発明のスフィンゴバクテリウム
ｍＯＬ１２−４ｓ 本発明の微生物スフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−
４ｓは、養魚場の汚泥から、デアミノノイラミン酸（Ｋ
ＤＮ）を含有するオリゴ糖アルコールを唯一の炭素源と
する集積培地で培養し、菌体破砕液中に４−ＭＵ−ＫＤ
Ｎを加水分解する活性を有するものとして選択された微
生物であり、シアリダーゼ活性を有しない上記ＫＤＮａ
ｓｅを産生することを特徴とする。

【００３９】本微生物は、同様に、養魚場などの汚泥あ
るいは土壌から、ＫＤＮを含む複合糖質または糖質等を
唯一の炭素源とする集積培地で培養し、ＫＤＮａｓｅ活
性を有するか否かを指標としてスクリーニングすること
によって、取得することができる。尚、本発明により分
離されたスフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−４ｓ
は、平成６年５月２４日に、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４３２５の受託
番号で寄託されている。

【００４０】本発明の微生物の菌学的性状は後記実施例
１に示す通りであり、これらの性質からスフィンゴバク
テリウム（Sphingobacterium）属に属する細菌であると
同定された。尚、本菌は、スフィンゴバクテリウム マ
ルチボラム（Sphingobacterium multivorum）である可
能性が高い。

【００４１】

【実施例】つぎに実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、この実施例は本発明の一例を示すものであり、
これに限定されるものではない。尚、本実施例におい
て、ＫＤＮａｓｅ活性の測定は、下記の方法によって行
った。

【００４２】＜酵素活性測定法＞ （１）４−メチルウンベリフェリルＫＤＮを用いる方法
（４−ＭＵ−ＫＤＮ法） ４−メチルウンベリフェリルＫＤＮ(4-MU-KDN)のケトシ
ド結合が酵素的に加水分解される（次の反応）と、蛍光
性の ４−メチルウンベリフェロンが遊離される。その
蛍光を測定する。

【００４３】 4-メチルウンヘ゛リフェリルKDN → KDN + 4-メチルウンヘ゛リフェロン

【００４４】具体的には、1.4 nmolの4-MU-KDNを、20μ
ｌの0.1 M トリス酢酸緩衝液 (pH 6.0)/0.1M NaClに溶
解した酵素溶液に加えて、25℃、30分間反応させ、反応
後、反応液20μｌをとって、2.5 mlの85 mMグリシン炭
酸塩緩衝液 (pH 9.3) と混合して、蛍光強度を測定した
（励起波長365 nm、測定波長 450 nm）。蛍光強度測定
については、Biochemistry 第18巻、第13号、2783-2787
ページ を参照した。酵素を加えずに上記と同様の反応
を行ったときの蛍光強度をコントロールとした。25℃に
おいて、１分間に１nmolの4-MU-KDNを加水分解する酵素
量を１ユニットと定義した。

【００４５】本方法に用いた４−ＭＵ−ＫＤＮは、以下
に示すDr. Thomas G. Warnerによって開発された方法に
よって得られたものであり、Dr. Thomas G. Warnerから
恵与されたものを用いた。

【００４６】ＫＤＮは、酵素的に既知の方法［Auge,
C.,ら，Tetrahedron 46, 201-214 (1990)］にしたがっ
て、Ｄ−マンノースとピルビン酸からＮｅｕ５Ａｃアル
ドラーゼを用いて合成した。ＫＤＮを乾燥後、１０ｍｌ
の無水酢酸、１０ｍｌのピリジンに懸濁し、室温で一晩
反応させた。反応液を氷冷し、メタノールを加えて反応
を停止させ、溶媒を除去した。残渣をメタノールに溶か
し、Ｄｏｗｅｘ ５０（Ｈ⁺）カラム（４×５ｃｍ）にか
けて、メタノールで溶出した。溶出物は溶媒除去後、エ
チルエーテル中で過剰量のジアゾメタンを加えて、メチ
ルエステルとした。生成した完全アセチル化メチルエス
テル物は、シリシック酸カラム（２．５×１７ｃｍ）に
かけて、ヘキサン中で酢酸エチルの濃度勾配をかけて溶
出し、メチル２，４，５，７，８，９−ヘキサ−Ｏ−ア
セチルＫＤＮ（Ｋ１）を得た。次いで、既知の方法［Wa
rnerら，Biochemistry 18, 2783-2787 (1979)］にした
がってＫ１をグリコシルクロリドに変え、４−メチルウ
ンベリフェロン（４−ＭＵ）のナトリウム塩と反応させ
て、Ｋ１と４−ＭＵを重合させ、４−メチル−２−オキ
ソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル ４，５，７，
８，９−ペンタ−Ｏ−アセチルＫＤＮ（Ｋ２）を得た。

【００４７】Ｋ２ ０．５ｇに４ｍｌのメタノール、続
いて４ｍｌの０．５Ｎの水酸化ナトリウムを加えて懸濁
し、３７℃で１時間置いた。さらに、４ｍｌの水酸化ナ
トリウムを加え、３７℃で９０分間置いた後、ｐＨをＤ
ｏｗｅｘ ５０（Ｈ⁺）樹脂を加えて中和して、ｐＨ
６．０とした。濾過して樹脂を除き、溶媒を除去した。
残渣に対して、少量の１０ｍＭアンモニア水を加えて、
ｐＨ９とした後、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）
Ｇ−２５ゲル濾過によって高純度の４−ＭＵ−ＫＤＮ
が精製された。

【００４８】尚、４−ＭＵ−ＫＤＮは、Schreiner, E.
and Zbiral, E. (1990) Liebigs Ann. Chem., 581-586
に記載の方法によっても得られる。

【００４９】（２）塩化セチルピリジニウム (CPC) 法 基質として、ニジマス卵巣液由来のＫＤＮ含有糖タンパ
ク質を用いた。酵素反応を上記（１）項に述べた条件と
同様に行なった後、反応液に２mlの0.1%塩化セチルピリ
ジニウム（CPC）を加えた。ＫＤＮ含有糖タンパク質
は、CPC存在下で複合体を形成して沈殿するが、酵素反
応によって遊離するＫＤＮは沈殿しない。反応液を30分
放置した後、遠心分離（3000rpm、10分間）し、得られ
る上清のＫＤＮ量をチオバルビツール酸法（Analytical
Biochemistry 第205巻、244-250,(1992)）で定量する
ことによって酵素活性を測定した。 25℃において、１
分間に１nmolのＫＤＮ含有糖タンパク質を加水分解する
酵素量を１ユニットと定義した。

【００５０】

【実施例１】 スフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−
４ｓの取得 養魚場の汚泥を、ＫＤＮオリゴ糖アルコール（J. Biol.
Chem. 265, 21811-21819 (1990)記載の方法で調製）
０．０５％を添加したＭ９液体培地（１Ｌ中に、Na₂HPO
₄ 6.0g、KH₂PO₄ 3.0g、NH₄Cl 1.0g、NaCl 0.5g、MgSO₄
1mM、CaCl₂ 0.1mMを含む）に接種して２５℃で４８時間
培養した。培養液を、ＫＤＮオリゴ糖アルコールを含む
Ｍ９寒天培地プレートにストリークして２５℃で４８時
間培養し、ＫＤＮオリゴ糖アルコールを唯一の炭素源と
して生育する微生物として、６６コロニーが得られた。

【００５１】各々のコロニーを形成する微生物を、ＫＤ
Ｎオリゴ糖アルコール ０．０５％を含むＭ９液体培地
に接種して培養し、遠心分離により集菌した。得られた
菌体を超音波処理により破砕し、破砕液中のＫＤＮａｓ
ｅ活性及びシアリダーゼ活性を、４−ＭＵ−ＫＤＮ法に
より測定した。これらのうち、ＫＤＮａｓｅ活性が認め
られ、シアリダーゼ活性が認められなかった破砕液が由
来する微生物をｍＯＬ１２とし、以下の選択に用いた。

【００５２】ｍＯＬ１２株のコロニーをＫＤＮオリゴ糖
アルコール ０．０５％を含むＭ９寒天培地にストリー
クし、４株のコロニーを分離し、各々ｍＯＬ１２−１、
ｍＯＬ１２−２、ｍＯＬ１２−３及びｍＯＬ１２−４と
した。各々のコロニーをＬＢ平板培地にストリークし、
単一コロニーをＫＤＮオリゴ糖アルコール ０．０５％
を含むＭ９液体培地に接種して培養し、菌体破砕液のＫ
ＤＮａｓｅ活性及びシアリダーゼ活性を、各々４−ＭＵ
−ＫＤＮ法及び塩化セチルピリジニウム法により測定し
た。ｍＯＬ１２−４をＬＢ平板培地にストリークした際
に形成されたコロニーは、「大」、「中」及び「小」の
３種類の大きさに分かれ、それらのうち、「大」コロニ
ー及び「中」コロニーを形成する株には、ＫＤＮａｓｅ
活性が認められなかったが、「小」コロニーを形成した
株は、ＫＤＮａｓｅ活性を示し、シアリダーゼ活性を示
さなかった。これらのＫＤＮａｓｅ活性のみを示した株
のうちの１株をｍＯＬ１２−４ｓとした。

【００５３】上記のようにして分離されたｍＯＬ１２−
４ｓの同定を、市販の腸内細菌以外のグラム陰性桿菌同
定キット（ビオメリュー社、ＡＰＩ ２０ＮＥ）を用い
て行った。試験された主な菌学的性状を以下に示す。

【００５４】 形態 ： 桿菌 グラム染色性 ： 陰性 胞子形成性 ： − 運動性 ： − 酸素に対する態度 ： 好気性 インドール生成 ： − グルコース発酵性 ： − 尿素分解 ： ＋ エスクリン分解 ： ＋

【００５５】資化性 グルコース ： ＋ Ｌ−アラビノース ： ＋ Ｄ−マンノース ： ＋ Ｄ−マンニトール ： − マルトース ： ＋ カタラーゼ ： ＋ オキシダーゼ ： ＋ β−ガラクトシダーゼ： ＋

【００５６】以上の結果から、ｍＯＬ１２−４ｓは、ス
フィンゴバクテリウム（Sphingobacterium）属に属する
細菌であると同定され、スフィンゴバクテリウム ｍＯ
Ｌ１２−４ｓと命名された。本菌は、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１４３
２５の受託番号で寄託されている。尚、本菌は、菌学的
性状から、スフィンゴバクテリウム マルチボラム（Sp
hingobacterium multivorum）である可能性が高い。

【００５７】

【実施例２】 ＫＤＮａｓｅの生産 ミラーのルリア・ブロス (LB) 培養液 (ギブコ・BRL)
を ２リットルの三角フラスコに800 ml分注し、オート
クレーブした。この培地にスフィンゴバクテリウム ｍ
ＯＬ１２−４ｓを接種した後、振盪培養機を用いて、25
℃で、48時間培養した。

【００５８】＜１＞ＫＤＮａｓｅの抽出及び硫安分画 （１）菌体破砕によるＫＤＮａｓｅの抽出及び硫安分画 培養終了後、遠心分離 (15,000×g, 40分間) により、
培養液から菌体を集めた。得られた菌体を、氷冷した
0.1 M NaClを含む 0.1 M トリス−塩酸緩衝液 (pH 8.0)
に懸濁し、再び遠心分離を行うことによって菌体を洗
浄した。この洗浄操作を３回行なった後、菌体に対して
1/2容量の0.１M NaCl−20 mM トリス−塩酸緩衝液 (pH
8.0)に菌体を懸濁し、超音波処理 (50ワット, ５分間)
して菌体を破砕した。

【００５９】この菌体破砕液を遠心分離（17,000×g, 4
0分間）して得られる上清を冷却し、この上清に硫酸ア
ンモニウムを50%飽和になるまで加え、4 ℃で１時間放
置した。これを、150,000×gで１時間遠心分離して沈殿
物を除去し、得られる上清に対して70%飽和になるよう
に硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置した。これ
を再び150,000×gで１時間遠心分離して沈殿を得、10 m
lの0.5 M NaCl−20 mMトリス−塩酸緩衝液 (pH 8.0)に
溶解した。この溶液に、43%飽和となるように飽和硫酸
アンモニウム水溶液を加え、4℃で１時間放置した。こ
れを、150,000×gで１時間遠心分離して得られる上清
に、85%飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、4℃
で一晩放置した。生じた沈殿を、150,000×gで１時間遠
心分離により回収し、これを10.9 mlの0.5 M NaCl−20
mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 8.0)に溶解した。こうして
得られた画分を、50〜70%硫安沈殿画分とした。

【００６０】（２）浸透圧ショックによるＫＤＮａｓｅ
の抽出及び硫安分画 菌体からＫＤＮａｓｅを抽出する他の方法として、菌体
に浸透圧ショックを与えて菌体外に酵素を遊離させ、そ
の菌体外液を硫安分画することによりＫＤＮａｓｅの精
製を行った。

【００６１】上記と同様にしてスフィンゴバクテリウム
ｍＯＬ１２−４ｓを培養し、遠心分離 (15,000×g, 4
0分間) により集菌、洗滌を行った。この菌体を、既知
の方法［Nossal, N. G. and Heppel, L. A.(1966) J. B
iol. Chem. 241, 3055-3062］に従って、浸透圧ショッ
ク処理し、菌体外に酵素を遊離させた。すなわち、菌体
１gに対して40 mlの蔗糖20％を含む20mM トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．１）に菌体を懸濁し、１０分間放置し
た後、菌体を遠心操作（13,000×g, 30分間）して沈澱
させた。この菌体を、１mM塩化マグネシウムを含む20mM
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．１）に懸濁して１０分間
放置することにより浸透圧ショックを与えた。

【００６２】上記菌体懸濁液を再び遠心分離（13,000×
g, 30分間）し、菌体を除去した。得られた上清に、速
やかに硫酸アンモニウムを90%飽和となるように加え、
４℃で一晩放置した。生じた沈澱を遠心分離（15,000×
g, 30分間）によって集め、50%飽和硫安に懸濁・溶解
し、不溶性の懸濁物を遠心分離（15,000×g, 30分間）
によって除去した。得られた上清に対して70％飽和とな
るように硫酸アンモニウムを加え、４℃で一晩放置し
た。これを、再び遠心分離（15,000×g, 30分間）し、
得られた沈澱画分を50〜70%硫安沈澱画分として集め
た。

【００６３】＜２＞ＫＤＮａｓｅの精製 上記（１）のようにして得られた５０〜７０％硫安沈殿
画分の全量を、セファクリル S-200 (ファルマシア社
製) カラム (1.8×135cm)にかけて、0.5 M NaClを含む2
0 mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 8.0)で溶出し、ゲル濾過
分画を行った（図１）。各溶出画分について、ＫＤＮａ
ｓｅ活性を４−ＭＵ−ＫＤＮ法により測定し、活性画分
を集め、これに90%飽和となるように硫酸アンモニウム
を加え、一晩放置した。これを150,000×gで１時間遠心
分離して得られる沈殿を、4.7 mlの20 mM トリス−塩酸
緩衝液 (pH 8.0)／0.5 M NaClに溶解し、再び、上記と
同様にしてセファクリル S-200 カラムを用いたゲル濾
過を行い、ＫＤＮａｓｅ活性画分を集めた（図２）。

【００６４】上記ＫＤＮａｓｅ活性画分を集め、これに
90%飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一晩放
置し、150,000×gで１時間遠心分離して得られる沈殿
を、4.8 mlの20 mM トリス−酢酸緩衝液 (pH 6.0)／0.0
5 M NaClに溶解した。この溶液を、ＫＤＮ含有糖タンパ
ク質 (KDN-gp) を結合させたアガロースゲル (Affi-gel
15、バイオラッド社製)を充填したカラム (2.0×15 cm)
にかけ、90 mlの20 mMトリス−酢酸緩衝液 (pH 6.0)／
0.05 M NaCl、135 mlの20 mM トリス−酢酸緩衝液 (pH
6.0)／0.5 M NaClを順次用いて溶出させた（図３）。カ
ラムの結合能力容量をこえて未吸着となった活性画分
は、そのまま再び上記カラムにかけて吸着させた後、20
mM トリス−酢酸緩衝液 (pH 6.0)／0.5 M NaClで溶出
させた（図４）。このようにしてKDN-gpを結合させたア
ガロースゲルに吸着後、高イオン強度で溶出される酵素
画分をすべて集め（15 ml）、限外濾過（セントリフロ
ーCF25、アミコン社製）によって２ mlまで濃縮し、ア
フィニティー精製酵素画分とした。

【００６５】得られた酵素画分についての各精製段階ご
とに酵素活性、タンパク質量、収率及び精製度を測定し
た。ＫＤＮａｓｅ活性は、４−ＭＵ−ＫＤＮ法により測
定し、２５℃で１分間に１ｎｍｏｌの４−ＭＵを生成す
る酵素量を１ユニットとした。また、タンパク質量の定
量は、ローリー法の改変法（BCA reagent; Pierce, U.
S.A.) でウシ血清アルブミン（BSA）を標準として230 n
mにおける吸収を測定することにより行った。結果を表
１に示す。

【００６６】

【表１】 ─────────────────────────────────── 画 分 活性 蛋白 比活性 収率 精製度 (ユニット) (mg) (ユニット/mg) (%) (倍) ─────────────────────────────────── 菌体破砕液 153 207 0.737 100 1.0 50〜70%硫安画分 113 103 1.11 74.2 1.5 セファクリル S-200 １回目 76.1 57.3 1.33 49.8 1.8 セファクリル S-200 ２回目 57.4 26.6 2.16 37.6 2.9 KDN-gpアカ゛ロース吸着画分 52.2 0.410 127 34.2 173 ───────────────────────────────────

【００６７】アフィニティー精製酵素の１０％ ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行った。泳動後、ゲルを銀染色キット（和光純薬
工業株式会社製）を用いて染色し、染色された５〜６本
のバンドの位置及び濃度を、デンシトメーター（600nm
の吸収を測定）を用いて測定した。結果を図５に示す。

【００６８】この酵素画分を、更にセファクリル Ｓ−
２００ゲル濾過カラムを用いて分画し、Ｋａｖ０．３〜
０．４に溶出されたＫＤＮａｓｅ活性を有する７本の画
分について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で検出されるバンドの挙動とＫＤＮａｓｅ活性との関係
を詳しく調べた結果、バンドの出現パターンと活性の大
小が一致するバンドが一成分見いだされ、ＫＤＮａｓｅ
のバンドであると推定された。このバンドの見かけの分
子量は、分子量マーカー (生化学工業株式会社製)との
比較から５７，０００と計算された。一方、ゲル濾過ク
ロマトグラフィーから推定される活性成分の分子量は、
分子量マーカー (生化学工業株式会社製)との比較から
５０，０００と計算され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果
とほぼ一致した。図５には、アフィニティー精製酵素の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターンと、ＫＤＮａｓｅと思われ
るバンドの位置を示した。

【００６９】上記の精製工程によっては、ＫＤＮａｓｅ
は完全には精製されていないが、菌体破砕液などの粗酵
素液、及びアフィニティー精製酵素画分ともにシアリダ
ーゼ活性を有しないＫＤＮａｓｅとして使用することが
できる。また、必要に応じて、通常の酵素の精製方法に
よってさらに精製すればよい。その際、ＫＤＮａｓｅ活
性及び推定される分子量を指標とすることができる。

【００７０】＜３＞本発明酵素の性質 上記で得られたアフィニティー精製酵素を用いて、本発
明酵素の性質を調べた。 （１）基質特異性 種々のＫＤＮ含有複合糖質及び糖質、シアル酸含有複合
糖質及び糖質について、本発明酵素の反応性を調べた。

【００７１】用いたＫＤＮ含有複合糖質及び糖質、シア
ル酸含有複合糖質及び糖質の入手法あるいは入手先を以
下に示す。

【００７２】ＫＤＮダイマー、Ｎ−アセチルノイラミン
酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）ダイマー、Ｎ−グリコリルノイラミ
ン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）ダイマー ： Anal. Biochem. 20
2, 25-34 (1992)。

【００７３】ＫＤＮ含有二本鎖Ｎ型糖鎖： Biochemistr
y 33, 6495-6502 (1994) ＫＤＮオリゴ糖アルコール、ＫＤＮ含有糖タンパク質：
J. Biol. Chem. 265,21811-21819 (1990)。

【００７４】ＫＤＮ含有ガングリオシドＧＭ３： J. Bi
ol. Chem. 266, 21929-21935 (1991) ４−メチルウンベリフェリルＮｅｕ５Ａｃ、コロミン
酸： 半井化学より購入。

【００７５】Ｎ−アセチルノイラミン酸ラクトース、ヒ
トトランスフェリン、ウシ胎仔血清フェツイン： シグ
マ社より購入。

【００７６】Ｎｅｕ５Ａｃ含有二本鎖Ｎ型糖鎖： J. Bi
ol. Chem. 264, 18520-18526 (1989)。 ブタ顎下腺ムチン： Arch. Biochem. Biophys. 129, 49
-56 (1969)。

【００７７】レイクトラウトポリシアロ糖タンパク質、
ニジマスポリシアロ糖タンパク質、イワナポリシアロ糖
タンパク質： J. Biol. Chem. 268, 23675-23684 (199
3)。 Ｎｅｕ５Ａｃ含有ガングリオシドＧＭ３、Ｎｅｕ５Ａｃ
含有ガングリオシドＧＭ１： Biochem. J. 441, 488-49
7 (1976)。

【００７８】ＫＤＮまたはＮ−アセチルノイラミン酸
（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸
（Ｎｅｕ５Ｇｃ）として５μｇの上記ＫＤＮまたはシア
ル酸含有複合糖質または糖質を、１０μｌの０．１Ｍ
ＮａＣｌを含む０．１Ｍ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ
６．０）中で、本発明酵素８０ミリユニットとともに２
５℃で２０時間おいた。

【００７９】上記反応液を、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフィー用プレート（メルク社製）にスポットし、１−
プロパノール：２５％アンモニア水：水＝６：１：２．
５（体積比）中で７時間展開した。展開後、風乾し、１
０％硫酸エタノール溶液を噴霧し、１２０℃で加熱し
て、複合糖質または糖質、及び遊離したＫＤＮ、Ｎｅｕ
５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃを発色させた。酵素を加えず
に反応させたものをコントロールとした。結果を表２に
示す。尚、ＫＤＮ、Ｎｅｕ５ＡｃまたはＮｅｕ５Ｇｃを
遊離するものを「＋」とし、まったく遊離しないものを
「−」で表した。

【００８０】

【表２】

【００８１】この結果から、本発明酵素は、合成基質で
ある ４−ＭＵ−ＫＤＮだけでなく、ＫＤＮ残基の天然
において既知な結合様式α2→3,α2→6,α2→8 のケト
シド結合のいずれにも作用することが明らかとなった。

【００８２】一方、本発明酵素は、表２に示したいろい
ろなＮ−アセチルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイ
ラミン酸を含む複合糖質及び糖質に対しては、Ｎ−アセ
チルノイラミン酸及びＮ−グリコリルノイラミン酸のケ
トシド結合の加水分解を触媒しなかった。このように、
本発明酵素はデアミノノイラミン酸に対してきわめて特
異性が高い。

【００８３】（２）至適ｐＨ 本発明酵素の至適ｐＨの測定を行った。緩衝液として0.
1 M トリス−酢酸緩衝液を用い、pH 4.0〜9.0の各ｐＨ
で反応を行った他は、前記４−ＭＵ−ＫＤＮ法にしたが
って酵素反応を行い、各ｐＨ条件下での酵素活性を測定
した。その結果、図６に示したように、pH 5.7〜6.0の
間で最も高い活性が得られた。pH 4.8及び7.5付近にお
いては、活性が半減した。

【００８４】（３）至適温度 温度条件を変えた以外は、前記４−ＭＵ−ＫＤＮ法にし
たがってＫＤＮａｓｅ活性を測定した。その結果、本発
明酵素は、25〜30 ℃付近で高い酵素活性を示した。

【００８５】（４）安定性 本発明酵素を２５℃、pH 4〜9の条件下で数時間放置し
た後、４−ＭＵ−ＫＤＮ法によってＫＤＮａｓｅ活性を
測定した。本発明酵素は、このｐＨ範囲で比較的安定で
あった。

【００８６】本発明酵素を0.1 M トリス−酢酸緩衝液(p
H 6.0) ／0.1 M NaClに70 μg/mlとなるように溶解し、
種々の温度下で所定時間放置した後、４−ＭＵ−ＫＤＮ
法によってＫＤＮａｓｅ活性を測定した。その結果、本
発明酵素は２５℃で少なくとも４８時間失活しなかっ
た。

【００８７】また、本発明酵素は数１０μg/ml以下の濃
度では、pH 及びイオン強度にかかわらず、不安定であ
った。精製酵素は、ウシ血清アルブミンなどのタンパク
質存在下で安定化された。

【００８８】（５）本発明酵素の阻害及び活性化 本発明酵素の活性に与える無機イオン、EDTA （エチレ
ンジアミン四酢酸）などの影響を調べるために、これら
の化合物を反応液に添加し、４−ＭＵ−ＫＤＮ法にした
がって酵素反応をおこなった。その結果、カルシウムイ
オン (Ca²⁺),マグネシウムイオン (Mg²⁺), マンガンイ
オン (Mn²⁺) の各二価陽イオン及び EDTA は、１ mM の
濃度で調べたところ活性に影響を与えなかった。

【００８９】本発明酵素に対するイオン強度の影響を調
べた結果を図７に示す。酵素活性は、イオン強度の増加
にともなって急激に上昇し、300 mM NaCl存在下で最高
値を示した。50 mM 以下の低イオン強度下では、活性は
極めて低かった。

【００９０】本発明酵素は、遊離のＫＤＮ(３mM）によ
って阻害された。一方、ＫＤＮの構造アナログである遊
離のシアル酸によっては阻害されなかった。本発明酵素
の基質とならないことがわかったＮ−アセチルノイラミ
ン酸またはＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合
糖質及び糖質によっても阻害されなかった。また、公知
のシアリダーゼ (Ｎ−アシルノイラミン酸のケトシド結
合を切断) の特異的な阻害剤である 2,3−デヒドロ−2
−デオキシ−N−アセチルノイラミン酸によって阻害さ
れなかった。

【００９１】（６）ミカエリス定数の測定 本発明酵素に対して、基質として４−メチルウンベリフ
ェリルＫＤＮ(4-MU-KDN)を用いたときのミカエリス定数
（Km)及び酵素反応最大速度(Vmax）を求めた。32ミリユ
ニットの酵素と6.7 μMの基質4-MU-KDNとを216μlの反
応液 (0.1 mg/mlウシ血清アルブミンを含む0.1 M トリ
ス−酢酸緩衝液 (pH 6.0)／0.1 M NaCl)中、25℃で反応
させたところ、4−メチルウンベリフェロン(4-MU) の遊
離は、１時間以内で直線的であった。

【００９２】この酵素濃度下で4-MU-KDNを21〜167μMの
範囲の様々な濃度に変えて、同一反応液中で25℃で30分
間反応させて、反応初速度を測定した。Lineweaver-Bur
kプロットをおこない、ミカエリス定数を算出した結
果、本発明酵素に対する4-MU-KDN加水分解のVmaxは、0.
19μM/min または 7.4 mM/min/mgタンパク質であり、Km
は19μMであった。

【００９３】

【実施例３】 ＫＤＮ含有糖鎖の合成 40 mM KDNと40 mMラクトースの混合液 50μlに、本発明
酵素１ユニットを加え、0.1 M トリス−酢酸緩衝液 (pH
6.0) 中、25 ℃で放置したところ、30分後の反応液中
に、KDN含有ラクトースの存在が確認された。

【００９４】

【発明の効果】本発明の微生物は、新規ＫＤＮａｓｅを
産生する。このＫＤＮａｓｅは、公知のシアリダーゼが
作用するＮ−アシルノイラミン酸残基に対しては、反応
性を持たないことに加えて、公知のシアリダーゼが極め
て切断しにくいデアミノノイラミン酸残基に作用してそ
のケトシド結合を加水分解することができる。

【００９５】本発明酵素は、デアミノノイラミン酸の構
造や機能の解析などの研究に有用な試薬などへの活用が
期待される。また、本発明酵素を、加水分解反応の逆反
応に利用することによって、新しいデアミノノイラミン
酸含有複合糖質または糖質を創出することができる。こ
のような新しいデアミノノイラミン酸含有複合糖質及び
糖質は、そのアナログであるＮ−アシルノイラミン酸含
有複合糖質及び糖質の機能改変の可能性、あるいは新し
い生理活性物質としての利用などが期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明酵素の精製において、一回目のセファ
クリル S-200ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パター
ンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線はタ
ンパク質量を示す紫外吸収(A280)を表す。

【図２】 本発明酵素の精製において、二回目のセファ
クリル S-200ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出パター
ンを示す図である。実線は、酵素活性を表し、点線は、
タンパク質量を示す紫外吸収(A280)を表す。

【図３】 本発明酵素の精製において、一回目のKDN-gp
結合アガロース・ゲルによるアフィニティークロマトグ
ラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素
活性を表し、点線はタンパク質量を示す紫外吸収(A230)
を表す。

【図４】 本発明酵素の精製において、二回目のKDN-gp
結合アガロース・ゲルによるアフィニティークロマトグ
ラフィーの溶出パターンを示す図である。実線は、酵素
活性を表し、点線はタンパク質量を示す紫外吸収(A220)
を表す。

【図５】 アフィニティー精製酵素画分の１０％アクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。銀染色後
の各バンドの位置及び染色強度をデンシトメーター（６
００ｎｍの吸収を測定）を用いて解析した。

【図６】 本発明酵素の至適ｐＨを示すｐＨ−酵素活性
曲線である。

【図７】 本発明酵素の至適イオン強度を示すイオン強
度−酵素活性曲線である。イオン強度は、添加したNaCl
の濃度で表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するデアミノノ
   イラミニダーゼ。 作用：デアミノノイラミン酸を含有する複合糖質もし
   くは糖質に作用し、デアミノノイラミン酸ケトシド結合
   を加水分解して、デアミノノイラミン酸を含有しない複
   合糖質もしくは糖質、またはデアミノノイラミン酸が部
   分的に除去された複合糖質もしくは糖質と遊離のデアミ
   ノノイラミン酸とを生成する。 基質特異性：デアミノノイラミン酸を含有する複合糖
   質もしくは糖質には作用するが、Ｎ−アセチルノイラミ
   ン酸又はＮ−グリコリルノイラミン酸を含有する複合糖
   質もしくは糖質における、Ｎ−アセチルノイラミン酸ま
   たはＮ−グリコリルノイラミン酸のケトシド結合には作
   用しない。 至適反応ｐＨ：ｐＨ５．７〜６．０ 安定ｐＨ範囲：２５℃においてｐＨ４〜９で安定 至適反応温度：２５℃付近 熱安定性：２５℃で少なくとも４８時間失活しない。 阻害及び安定化：遊離のデアミノノイラミン酸によっ
   て阻害される。ウシ血清アルブミンなどのタンパク質存
   在下で安定化される。
2. 【請求項２】 スフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−
   ４ｓによって産生されることを特徴とする請求項１記載
   のデアミノノイラミニダーゼ。
3. 【請求項３】 スフィンゴバクテリウム属に属し、デア
   ミノノイラミニダーゼ生産能を有する細菌を培養し、そ
   の培養物から請求項１記載のデアミノノイラミニダーゼ
   を採取することを特徴とするデアミノノイラミニダーゼ
   の製造方法。
4. 【請求項４】 デアミノノイラミニダーゼ生産能を有す
   るスフィンゴバクテリウム ｍＯＬ１２−４ｓ。
5. 【請求項５】 デアミノノイラミン酸と、糖質及び／又
   は複合糖質と、請求項１記載のデアミノノイラミニダー
   ゼとを共存させることを特徴とするデアミノノイラミン
   酸含有糖質及び／又は複合糖質の製造方法。