JPH0398583A - 新規α―Ｌ―フコシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、糖鎮の構造解析に有用な新規エキソ型α−Ｌ
−フコシダーゼに関する。

〔従来の技術〕

α−Ｌ−フコシダーゼはα一Ｌ−フコシド結合に作用し
て、Ｌ−フコースを遊離する酵素で、細菌、カビ、放線
菌、植物、軟体動物、ほ乳類に見出されている。一方、
高等動物由来の糖蛋白質、糖脂質等の複合糖質中の糖鎖
部分には、α−Ｌ−フコシル基が頻繁に見出され、これ
らの糖鎮の構造と機能が検討されているが、このために
は、特異性の高いα−Ｌ−フコシダーゼが重要な役割を
果す。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来より、サザエ〔アーカイブズ・オブ・バイオケミス
トリー・アンド・バイオフィジクス（＾ｒｃｈｉｖｅｓ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ，　＆　Ｂｉｏｐｈｙｓ，　）　、第
１４５巻、第５０頁（１　９　７　１年）〕、ホラガイ
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ−（　Ｊ，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．）第７０巻、第７５頁（１　９　７　１年
）〕等の軟体動物及びほ乳動物臓器にアグリコン特異性
の広いα−Ｌ−フコシダーゼが見出されている。しかし
、これらの酵素はその広いアグリコン特異性のために、
フコシル基の置換位置を推定することはできない。一方
、クロストリディウム属〔ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・　ケ　ミ　ス　ト　リ　ー　（　　Ｊ．　　　
Ｂｉｏｌ　．　　Ｃｈｅｍ，　　）　　第　２　４　５
巻、第１６５９頁（１　９　７　０年）〕、アスペルギ
ルス属（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー第２４５巻、第２９９頁（１９７０年）〕、フサリ
ウム属〔アグリカルチコラル・バイオロジカル・ケミス
トリ−（　Ａｇｒ．　Ｂｉｏ１、Ｃｈｅｍ，　）第４９
巻、第３１７９頁（１　９　８　５年）及びコリネバク
テリウム属（特開昭６２−１５５０８６号）等の酵素の
基質特異性は比較的限定的で、α１→２フコシル基には
作用するが、他のフコシド結合には作用しないか、又は
弱く作用する。またアーモンドエムルシンのフコシダー
ゼ■〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー第２５７巻、第８２０５頁（１　９　８　２年〉〕は
α１→３及びα１→４フコシド結合に作用し、α１→２
とα１→６フコシド結合及び合戒基質には全く作用しな
い。

また、ストレプトマイセス属よりのムシン分解酵素は、
α１−２フコシド結合を持つムシン及びα−グリコシド
結合を持つｐ−ニトロフェニルーα一Ｌ−フコシドに作
用すると報告されている（特開平１−１６８２８３号公
報）以上のように現在のところ、α１→２フコシド結合
に特異的なフコシダーゼを用いて、糖釦中のα１→２フ
コシル基の有無を直接推定することはできるが、α１→
３フコシド結合に特異〕、的なフコシダーゼはもとより
、αｌ→３及びα１→２フコシド結合に特異的なフコシ
ダーゼも知られていないため、フコシダーゼを用いて糖
鎖中のα１→３フコシル基の有無を直接推定することは
できない。

したがって本発明の目的は、α１→３フコシド結合構造
解析に有用なα一Ｌ−フコシダーゼを提供することにあ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は下記の理化学的性質を有
することを特徴とするエキソ型α−Ｌ−フコシダーゼに
関する。

（Ｉ）作用： α−Ｌ−フコシドに作用して、Ｌ−フコースを遊離する （ｎ）基質特異性： α１→３及びα１→２フコシド結合に作用する。α１→
４及びα１→６フコシド結合に作用しない。また、ｐ−
ニトロフェニル−αＬ−フコシドにも作用しない （ＩＩＩ）至適ｐＨ：ｐＨ６付近 （ＩＶ）至適温度＝３７℃付近 （Ｖ）分子量：約９３０００　（ゲルろ過法による） 本発明者らは、上記現状にかんがみ、αｌ→３フコシド
結合分解フコシダーゼを探索中のところ、ある種の放線
菌がα１→３及びαｌ→２フコシド結合に特異的なα−
Ｌ−フコシダーゼを産生ずることを見出し、本発明に到
達した。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明に使用される菌株は、α−Ｌ−フコシダーゼ生産
能を有する菌株であればいかなる菌株でもよく、またこ
れらの菌株の変異株でもよい。α一Ｌ−フコシダーゼ生
産能を有する菌株の具体例としては、例えば、ストレブ
トマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　Ｓ　Ｐ　１
　４　２が挙げられる。

本菌は、滋賀県内の土壌中より本発明者らが新たに検索
して得た菌株で、その菌学的性質は次のとおりである。

（１）形態的性質 基生菌糸は長く伸張し、よく分岐するが、通常は分断し
ない。胞子はオートミール寒天培地、イースト・麦芽寒
天培地で良く形或される。顕微鏡で観察すると気菌糸の
分岐方法は単純分岐で、輪生分岐は見られない。気菌糸
先端の形状は直状ないしかぎ型で、まれにはループ状も
認められる。胞子は通常ｌＯ〜２０個の連鎖が認められ
、表面はスムーズである。胞子の形状は円筒形ないし楕
円形で、その大きさは、０．７〜０．８Ｘ０．９〜１．
０μｍある。胞子のう、運動性胞子、菌核などは観察さ
れない。

（２）各種培地上での生育状態 各種培地上に２７℃で１４日間培養したときの肉眼での
観察結果を第ｌ表に示す。

飄 第 表 （３）生理的性質 （イ）生育温度範囲（酵母・麦芽寒天培地）：１０〜３
７℃の温度範囲で生育し、２５〜３０℃で良好に生育す
る。

（０ゼラチンの液化：陽性 （ハ）スターチの加水分解：陽性 （二）脱脂乳のペプトン化：陽性 脱脂乳の凝固：陰性 （ネ）メラニン様色素の生或：陰性 （４）炭素源の利用（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地
上で２７℃、１４日間培養） （イ）利用する：Ｄ−グルコース，Ｄ−フラクトース，
Ｌ−アラビノース．Ｄ〜キシロース，Ｌ−ラムノース．
Ｄ−マンニトール，ラフィノース，Ｌ−フコース （ロ）利用しない：イノシトール．シュクロース以上の
性状より、本菌株は、放線菌の中でストレブトマイセス
属に属し、気菌糸の色調は“白色”〜“灰色”シリーズ
、気菌糸先端は直状ないしかぎ型で、胞子表面はスムー
ズ、コロ二一裏面の色調は白色〜淡褐色で、メラニン様
色素を生産しない菌株と要約される。本発明者らは本菌
株をストレプトマイセス・エスピー１４２と称し、本菌
株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ　１４２と表示し
、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１
０８０６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０　８　０　６）とし
て寄託されている。

本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは、例えば上述した菌を
栄養培地中で培養し、該培養物から酵素を分離すること
によって得られる。培養に当っては、通常の微生物の培
養方法が用いられる。

培地に加える栄養源は、本菌株が利用し、α−Ｌ−フコ
シダーゼを生産するものであればよく、炭素源としては
、例えばグリセロール、グルコース、マルトース、ラク
トース、Ｌ−フコースなどが利用でき、窒素源としては
、酵母エキス、ペプトン、コーンスティーブリカー、肉
エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニウムなどが適当
である。その゜他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩、亜鉛塩などの無機質及び金属塩類を加えてもよい
。なお、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは誘導酵素であ
るため、Ｌ−フコースを培地に添加すれば著しく酵素生
産量が増大する。

α一Ｌ−フコシダーゼ生産菌を培養するに当り、生産量
は培養条件により大きく変動するが、一般に培養温度は
２０〜３５℃、培地のｐＨ５〜８が良く、１日〜７日の
通気かくはん培養で、本発明によるα−Ｌ−フコシダー
ゼが生産される。培養条件は使用する菌株、培地組或な
どに応じ、α一Ｌ−フコシダーゼの生産量が最大になる
ように設定するのは当然である。

上述の放線菌によって生産されたα一Ｌ−フコシダーゼ
は主に菌体内に存在するので、培養物を固液分離し、得
られた湿菌体から通常用いられる超音波処理、フレンチ
プレス、ダイナミルなどの種々の破壊手段を用いて菌体
を破壊すると、あるいはりゾチームのごとき細胞壁溶解
酵素を用いて菌体細胞壁を溶解すると無細胞抽出液が得
られる。次いで、この抽出液から通常用いられる精製手
段により精製酵素標品を得ることができる。例えば、塩
析、有機溶媒沈殿、イオン交換カラムクロマト、疎水結
合カラムクロマト、ゲルろ過、凍結乾燥などにより、精
製を行い、ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動的
に単一な精製α−Ｌ−フコシダーゼを得ることができる
。

本発明により得られるα−Ｌ−フコシダーゼの酵素化学
的及び理化学的性質は次のとおりである。

（１）　　　作　　用　： α一Ｌ−フコシドに作用して、Ｌ−フコースを遊離する
。

（２）基質特異性： 本酵素は、ヒトα１一酸性糖蛋白質由来のα１→３フコ
シル基を有する複合型糖鎖に作用して、Ｌ−フコースを
遊離させる。また人乳白来の２′−フコシルラクトース
にも作用するが、ブタサイログロプリン由来のα１→６
フコシル基を還元末端に有する複合型糖鎮及びα１→４
フコシル基を有するシアリルールイスａ型糖鎖には作用
しない。すなわち、本酵素はα１→３及びα１→２フコ
シド結合に特異的で、αｌ→４とα１→６フコシド結合
には作用しない。

また、本酵素は、α−グリコシド結合を持つｐ−ニトロ
フェニルーα−Ｌ−フコシドにも作用しない。

（３）至適ｐｔ＋及びｐＨ安定性 本酵素の至適ｐＨは第１図の曲線で表されるごと＜ｐ８
６．０付近に高い活性を有している。

本酵素を３７℃において、それぞれのＪ）Ｈで６０分間
処理したときのｐＨ安定性を第２図に示した。第２図よ
り明らかなように本酵素はｐＨ６．０〜７．５の間で安
定である。なお、第１図ば本発明により得られるα−Ｌ
−フコシダーゼのｐＨ　（横軸）と相対活性（％、縦軸
）の関係を表すグラフ、第２図はｐＨ　（横軸）と残存
活性（％、縦軸）との関係を示すグラフである。

（４）至適温度及び熱安定性 本酵素の作用最適温は３７℃であり、２５℃〜４０℃の
範囲で適用可能である。本酵素は３７℃で一夜間安定で
あり、凍結品は−３０℃で少なくとも数か月間安定であ
る。

（５）分子量 分子量は約９３０００である（トヨパールＨＷ−５５３
を用いたゲルろ過法による）（６）酵素活性の測定 α一Ｌ−フコシダーゼ活性の測定は次のようにして求め
た。基質として下記式： ，／　＼一 Ｔ　　　↑ 句　　　　句 １　　　５ 一一／＼一 ↑　↑　　　↑ 一一一 曵亀　亀 二；＼　二 ↑　↑　↑　↑ 一一一一 ＱＩＱＩ　　　む　Ｑｌ を意味する。〕 で表される構造のピリジルアミノ化糖鎖を用いた。本基
質及びこれからフコースが遊離した酵素反応生戒物は還
元末端をピリジルアミノ基で標識してあるために、蛍光
検出器を備えた逆相系あるいはアミド系高速液体クロマ
トグラフイーで直接定性定量分析が可能である。上記の
基質２　０　ｐｍｏｌを含む２５０ｍ［Ｉン酸ナトリウ
ム緩衝液４μｌに酵素液６μｌを加えて混合し、３７℃
で２０分間反応させた後、１％のトリフルオロ酢酸溶液
４０μｌを加えて反応を停止させ、高速液体クロマトグ
ラフィーに供した。この条件下で、１分間に１μｍｏｌ
のアフコ糖鎮を生じる酵素量を１単位とする。

本発明のα−Ｌ−フコシダーゼを利用して以下の事項を
解明することができる。

（１）複合糖質中のフコース残基の役割を知ることがで
きる。

（２）　　本酵素と、例えばコリネバクテリウム属の生
産するα１−２フコシド結合特異的α−Ｌ−フコシダー
ゼを用いれば、複合糖質中のフコシル基の有無及び置換
位置を直接推定することが可能である。すなわち、複合
糖質にまずα１→２フコシダーゼを作用させて、遊離α
一Ｌ−フコース量を測定すれば糖質中のα１→２フコシ
ル基の有無を推定することができ、更に続けて本発明の
α−Ｌ−フコシダーゼを作用させてα〜Ｌ−フコース生
成量を測定すれば、糖鎮中のα１→３フコシル基の有無
を直接推定することができる。

（３）＠鎖還元末端をあらかじめ還元ピリジルアミノ化
法〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、第９５巻
、第１９７〜２０３頁（１９８４））にて蛍光標識した
糖釦を用いて、上記の逐次酵素消化法と２次元糖鎮マッ
プ法〔アナリティカル・バイオケミストリー（＾ｎａｌ
，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第１７１巻、第７３頁（１９８
８））を組合せることによって、α１→２及びα１→３
フコシル基も含めた糖鎮構造全体を、従来の数百倍の感
度で推定することができる。

（４）還元末端を〔３Ｈ〕　　・標識した糖鎖、あるい
は、末標識糖鎖を用いて、（２）の逐次酵素消化を行い
、酵素消化物をゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交
換クロマトグラフィ一等で分析することによって、糖釦
構造を推定することができる。

〔実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例１ （１）　　菌の培養と無細胞抽出液の調製ストレブトマ
イセス・エスビー・１４２〔微工研菌寄第１０８０６号
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０８０６）］・をペプトン０．３
％、イーストエキス０．０５％、リン酸−カリウム０．
１％、硫酸マグネシウム７永和物０．０５％及びＬ−フ
コース１％を含む５００ｍｌｌ！の液体培地（ｐＨ７．
０）を用いて２５〜２７℃で２日間培養した後、培養液
を遠心分離して菌体を得た。菌体を１ｍＭのエチレンジ
アミン四酢酸を含む１０ｍＭＩＪン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ７．０で洗浄後、同緩衝液に懸濁して超音波処理し
、遠心分離によって菌体残渣を除いて、無細胞抽出液を
得た。

（２）酵素の調製 上記に得た無細胞抽出液１００ｍｌを、１　ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７．３を用いて平衡化したＤＥＡＥ−セファロー
スＣＬ−６Ｂのカラム（７，Ｏ　ｘ　３　８ｃｍ）にか
けた。カラムをその３倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、
次いで２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で溶出
し、活性画分を集めた。活性画分は限外ろ過（分画分子
量１万）にて濃縮後１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含
む１０ｍＭＩＪン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７Ｊに対して
透析し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂのカラム（２．Ｏ　Ｘ　２　５ｃｍ）にかけ
た。

カラムをその２倍容量の同一の緩衝液で洗浄し、次いで
塩化ナトリウムの０−０．３Ｍ直線濃度勾配液で溶出し
た。４３−４７の両分から本発明のα−Ｌ−フコシダー
ゼを得た。こうして得られたα−Ｌ−フコシダーゼの比
活性は０．９ｍ単位／ｍｇであり、構造解析用試薬とし
て充分使用可能であった。

なお、上記酵素を比活性は前記の測定法によって測定し
た。

〔発明の効果〕

本発明により、複合糖鎖の構造と機能の解明に有用な新
規α一Ｌ−フコシダーゼが提供された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られるα−Ｌ−フコシダーゼの
ｐｏと活性の関係を表すグラフ、第２図はα一Ｌ−フコ
シダーゼを３７℃において、それぞれのｐＨで６０分間
処理した後のｐＨと活性の関係を表すグラフである。 ａ文寸ラ舌＋生　（％）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有することを特徴とするエキ
   ソ型α−Ｌ−フコシダーゼ。 （ I ）作用： α−Ｌ−フコシドに作用して、Ｌ−フコ ースを遊離する （II）基質特異性： α１→３及びα１→２フコシド結合に作 用する。α１→４及びα１→６フコシド結 合に作用しない。また、ｐ−ニトロフェニ ル−α−Ｌ−フコシドにも作用しない （III）至適ｐＨ：ｐＨ６付近 （IV）至適温度：３７℃付近 （Ｖ）分子量：約９３０００（ゲルろ過法による）