JPH06153936A - アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法 - Google Patents
アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法Info
- Publication number
- JPH06153936A JPH06153936A JP23994192A JP23994192A JPH06153936A JP H06153936 A JPH06153936 A JP H06153936A JP 23994192 A JP23994192 A JP 23994192A JP 23994192 A JP23994192 A JP 23994192A JP H06153936 A JPH06153936 A JP H06153936A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- allylsulfotransferase
- producing
- sulfate
- enzyme
- sulfuric acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 芳香族硫酸エステルを硫酸供与体とし、その
硫酸基をフェノール化合物に移転する反応を触媒するア
リルスルホトランスフェラーゼ及びその産生菌によるア
リルスルホトランスフェラーゼの製造法。 【構成】 ３７℃以上の温度でも安定で耐アルカリ性に
優れた新規なアリルスルホトランスフェラーゼ及びその
産生菌であるクラブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）Ｋ
−３６（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７６）。この菌は、ラッ
ト糞便より分離された腸内細菌である。
硫酸基をフェノール化合物に移転する反応を触媒するア
リルスルホトランスフェラーゼ及びその産生菌によるア
リルスルホトランスフェラーゼの製造法。 【構成】 ３７℃以上の温度でも安定で耐アルカリ性に
優れた新規なアリルスルホトランスフェラーゼ及びその
産生菌であるクラブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）Ｋ
−３６（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７６）。この菌は、ラッ
ト糞便より分離された腸内細菌である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なアリルスルホトラ
ンスフェラーゼ及びクラブシェラ属に属する菌株による
アリルスルホトランスフェラーゼの製造法に関する。ア
リルスルホトランスフェラーゼ（Ａｒｙｌｓｕｌｆｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＥＣ２．８．２．１）は硫酸供
与体から硫酸基をフェノール化合物に転移しフェノール
化合物の硫酸抱合体を形成する反応を触媒する酵素であ
り、フェノール化合物の解毒経路に関する酵素として重
要である。また、生体内で重要な役割をもつコレシスト
キニンパンクレオザイミンの合成において、チロシンを
特異的に硫酸エステル化するためにアリルスルホトラン
スフェラーゼが有用であることが見出されている（特開
昭６４−８０３００号）。
ンスフェラーゼ及びクラブシェラ属に属する菌株による
アリルスルホトランスフェラーゼの製造法に関する。ア
リルスルホトランスフェラーゼ（Ａｒｙｌｓｕｌｆｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＥＣ２．８．２．１）は硫酸供
与体から硫酸基をフェノール化合物に転移しフェノール
化合物の硫酸抱合体を形成する反応を触媒する酵素であ
り、フェノール化合物の解毒経路に関する酵素として重
要である。また、生体内で重要な役割をもつコレシスト
キニンパンクレオザイミンの合成において、チロシンを
特異的に硫酸エステル化するためにアリルスルホトラン
スフェラーゼが有用であることが見出されている（特開
昭６４−８０３００号）。
【０００２】
【従来の技術】従来アリルスルホトランスフェラーゼは
肝、小腸、腎、脳などの動物組織中および糸状菌類に存
在することが知られている。例えば、ラット肝には四つ
のタイプのアリルスルホトランスフェラーゼが存在し
［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２５４巻、５６５８ペ
ージ、１９７９年、アーカイブス オブ バイオケミス
トリー アンド バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）第２１１巻、３５２ペー
ジ、１９８１年およびユーロピアン ジャーナル オブ
バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）
第１０４巻、３ページ、１９８０年］、これらはいずれ
も硫酸供与体として３′−ホスホアデニル５′−硫酸
（以下「ＰＡＰＳ」という）を必要とし、ＰＡＰＳがな
いと反応は進行しない。糸状菌類では、アスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生するアリルスル
ホランスフェラーゼはＰＡＰＳを介さずに硫酸基を転移
することが知られている［ザ バイオケミカル ジャー
ナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ）第１４９巻、６９７ペー
ジ、１９７５年］。
肝、小腸、腎、脳などの動物組織中および糸状菌類に存
在することが知られている。例えば、ラット肝には四つ
のタイプのアリルスルホトランスフェラーゼが存在し
［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２５４巻、５６５８ペ
ージ、１９７９年、アーカイブス オブ バイオケミス
トリー アンド バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）第２１１巻、３５２ペー
ジ、１９８１年およびユーロピアン ジャーナル オブ
バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）
第１０４巻、３ページ、１９８０年］、これらはいずれ
も硫酸供与体として３′−ホスホアデニル５′−硫酸
（以下「ＰＡＰＳ」という）を必要とし、ＰＡＰＳがな
いと反応は進行しない。糸状菌類では、アスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生するアリルスル
ホランスフェラーゼはＰＡＰＳを介さずに硫酸基を転移
することが知られている［ザ バイオケミカル ジャー
ナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ）第１４９巻、６９７ペー
ジ、１９７５年］。
【０００３】また、細菌類ではＰＡＰＳを介さずに芳香
族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に転移する反応を触媒するアリルスルホ
トランスフェラーゼがヒト糞便より分離した嫌気性細菌
であるユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株から見い
だされている（特公平３−６３３５１号）。しかしなが
ら、ユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株は嫌気的培
養が必要なため大量培養に適さず、またその産生するア
リルスルホトランスフェラーゼは安定性の面でも３７℃
以上の温度や塩基性溶液中において活性が低下するため
それらの改善が望まれていた。
族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に転移する反応を触媒するアリルスルホ
トランスフェラーゼがヒト糞便より分離した嫌気性細菌
であるユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株から見い
だされている（特公平３−６３３５１号）。しかしなが
ら、ユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株は嫌気的培
養が必要なため大量培養に適さず、またその産生するア
リルスルホトランスフェラーゼは安定性の面でも３７℃
以上の温度や塩基性溶液中において活性が低下するため
それらの改善が望まれていた。
【０００４】
【発明の開示】本発明者らは、３７℃以上の温度でも安
定で耐アルカリ性に優れた新規なアリルスルホトランス
フェラーゼを得ることを目的に酵素及び酵素産生用微生
物の探索を行った。その結果、新たにラット糞便より腸
内細菌の一種であるクラブシェラ属菌が新規なアリルス
ルホトランスフェラーゼを産生することを見い出した。
これらの菌は通性嫌気性菌であるため好気的大量培養も
可能であり、またこれら菌から産生される新規なアリル
スルホトランスフェラーゼは、ＰＡＰＳを硫酸供与体と
しない性質を有する酵素であり、安定性の面でも温度に
対しては５０℃でも安定であり、塩基性溶液において活
性が高いなどの特徴をもつ。以下に本発明で用いる菌株
のスクリーニング法ならびに性質およびそれらから得ら
れるアリルスルホトランスフェラーゼの製法、性質につ
いて説明する。
定で耐アルカリ性に優れた新規なアリルスルホトランス
フェラーゼを得ることを目的に酵素及び酵素産生用微生
物の探索を行った。その結果、新たにラット糞便より腸
内細菌の一種であるクラブシェラ属菌が新規なアリルス
ルホトランスフェラーゼを産生することを見い出した。
これらの菌は通性嫌気性菌であるため好気的大量培養も
可能であり、またこれら菌から産生される新規なアリル
スルホトランスフェラーゼは、ＰＡＰＳを硫酸供与体と
しない性質を有する酵素であり、安定性の面でも温度に
対しては５０℃でも安定であり、塩基性溶液において活
性が高いなどの特徴をもつ。以下に本発明で用いる菌株
のスクリーニング法ならびに性質およびそれらから得ら
れるアリルスルホトランスフェラーゼの製法、性質につ
いて説明する。
【０００５】本発明法に用いるクラブシェラ属菌の例と
して、具体的には本発明者らが腸内菌より見いだしたク
ラブシェラＫ−３６があげられる。本菌株は次のように
光岡らの方法（臨床検査、第２３巻、３２２ページ、１
９７９年）に準じて分離した。即ち、ラット糞便を希釈
し４−メチルウンベリフェリル硫酸（以下「ＭＵＳ」と
いう。）を含んだＧＡＭ（ｇｅｎｅｒａｌ ａｎａｅｒ
ｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）寒天平板培地（日水製薬社
製）、およびＭＵＳを含んだＴＳ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓ
ｏｙ ａｇａｒ）寒天平板培地（ディフコ社製）にそれ
ぞれ塗抹後、ＧＡＭ寒天平板培地は嫌気ジャー（ヒラヤ
マ製作所製）で３７℃ ３〜５日間培養し、ＴＳ寒天平
板培地は好気ジャー（ヒラヤマ製作所製）で３７℃ １
〜２日間培養した。培養した平板に紫外線（３２０ｎ
ｍ） を照射し蛍光を発したコロニーを釣菌し、それぞ
れ０．１ｍＭ ＭＵＳを含むＧＡＭ培地およびＢＨＩ
（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏ
ｔｈ）培地（ディフコ社製）５ｍｌに接種したのち培養
し、アリルスルホトランスフェラーゼ陽性株Ｋ−３６を
得た。
して、具体的には本発明者らが腸内菌より見いだしたク
ラブシェラＫ−３６があげられる。本菌株は次のように
光岡らの方法（臨床検査、第２３巻、３２２ページ、１
９７９年）に準じて分離した。即ち、ラット糞便を希釈
し４−メチルウンベリフェリル硫酸（以下「ＭＵＳ」と
いう。）を含んだＧＡＭ（ｇｅｎｅｒａｌ ａｎａｅｒ
ｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ）寒天平板培地（日水製薬社
製）、およびＭＵＳを含んだＴＳ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓ
ｏｙ ａｇａｒ）寒天平板培地（ディフコ社製）にそれ
ぞれ塗抹後、ＧＡＭ寒天平板培地は嫌気ジャー（ヒラヤ
マ製作所製）で３７℃ ３〜５日間培養し、ＴＳ寒天平
板培地は好気ジャー（ヒラヤマ製作所製）で３７℃ １
〜２日間培養した。培養した平板に紫外線（３２０ｎ
ｍ） を照射し蛍光を発したコロニーを釣菌し、それぞ
れ０．１ｍＭ ＭＵＳを含むＧＡＭ培地およびＢＨＩ
（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏ
ｔｈ）培地（ディフコ社製）５ｍｌに接種したのち培養
し、アリルスルホトランスフェラーゼ陽性株Ｋ−３６を
得た。
【０００６】クラブシェラＫ−３６株は次のような性質
を有する。 （１） 形態的性質 形：桿菌 胞子：形成しない グラム染色性：陰性 （２） 培地における生育状態 ＧＡＭ、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉ
ｕｍ）、ＥＧ（Ｅｇｇｅｒｔｈ ａｎｄ Ｇａｇｎｏｎ
ｂｒｏｔｈ ）、ＢＨＩ、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｂｒｏｔｈ）およびＭＨ（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏ
ｎ ｂｒｏｔｈ）培地のうち、ＬＢ培地において最も生
育がよい。 （３） 生理学的性質 オキシダーゼ生成：陰性 硫化水素生成：陰性 運動性：陰性 インドール生成：陽性 メチルレッド：陽性 ＶＰテスト：陽性 クエン酸塩（Ｃ源として）：陽性 ウレアーゼ生成：陽性 酸素に対する態度：通性嫌気性 以上の性質を「腸内細菌の世界−嫌気性菌の分離と同
定」（光岡知足著、叢文社発行、１９８０年）および
「バージェイズ マニュアル オブ デイターミネイテ
ィブ バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ）」（第８版、１９７４年）に従い検討
したところ、上記Ｋ−３６株は非運動性、通性嫌気性グ
ラム陰性無芽胞桿菌であり、ＶＰテストが陽性であるこ
とからクラブシェラ属に分類される。本菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所にクラブシェラＫ−３６（微工
研菌寄第１２９７６号、ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７６）と
して寄託されている。
を有する。 （１） 形態的性質 形：桿菌 胞子：形成しない グラム染色性：陰性 （２） 培地における生育状態 ＧＡＭ、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉ
ｕｍ）、ＥＧ（Ｅｇｇｅｒｔｈ ａｎｄ Ｇａｇｎｏｎ
ｂｒｏｔｈ ）、ＢＨＩ、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｂｒｏｔｈ）およびＭＨ（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏ
ｎ ｂｒｏｔｈ）培地のうち、ＬＢ培地において最も生
育がよい。 （３） 生理学的性質 オキシダーゼ生成：陰性 硫化水素生成：陰性 運動性：陰性 インドール生成：陽性 メチルレッド：陽性 ＶＰテスト：陽性 クエン酸塩（Ｃ源として）：陽性 ウレアーゼ生成：陽性 酸素に対する態度：通性嫌気性 以上の性質を「腸内細菌の世界−嫌気性菌の分離と同
定」（光岡知足著、叢文社発行、１９８０年）および
「バージェイズ マニュアル オブ デイターミネイテ
ィブ バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ）」（第８版、１９７４年）に従い検討
したところ、上記Ｋ−３６株は非運動性、通性嫌気性グ
ラム陰性無芽胞桿菌であり、ＶＰテストが陽性であるこ
とからクラブシェラ属に分類される。本菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所にクラブシェラＫ−３６（微工
研菌寄第１２９７６号、ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７６）と
して寄託されている。
【０００７】本発明によりアリルスルホトランスフェラ
ーゼを採取するには、まず通常の好気性菌用培地または
嫌気性菌用培地にアリルスルホトランスフェラーゼを産
生するクラブシェラ属に属する菌株を植菌し、それぞれ
好気条件下または嫌気条件下約２５〜４５℃で培養し酵
素を蓄積せしめる。培養時間は酵素の生産が最大になっ
た時をとればよく、通常約１３〜１８時間である。本酵
素は公知の酵素精製方法を適宜組合せて精製される。即
ち、培養物をそのままか、または菌体のみを集めて超音
波、フレンチプレス、アルミナ磨砕などの方法により菌
体を破砕し酵素を抽出したのち、塩析、有機溶媒沈殿、
透析、限外ろ過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、濃縮、凍結乾
燥などの方法を適宜組合せ精製される。
ーゼを採取するには、まず通常の好気性菌用培地または
嫌気性菌用培地にアリルスルホトランスフェラーゼを産
生するクラブシェラ属に属する菌株を植菌し、それぞれ
好気条件下または嫌気条件下約２５〜４５℃で培養し酵
素を蓄積せしめる。培養時間は酵素の生産が最大になっ
た時をとればよく、通常約１３〜１８時間である。本酵
素は公知の酵素精製方法を適宜組合せて精製される。即
ち、培養物をそのままか、または菌体のみを集めて超音
波、フレンチプレス、アルミナ磨砕などの方法により菌
体を破砕し酵素を抽出したのち、塩析、有機溶媒沈殿、
透析、限外ろ過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、濃縮、凍結乾
燥などの方法を適宜組合せ精製される。
【０００８】本発明によりクラブシェラＫ−３６より得
られたアリルスルホトランスフェラーゼの性質は次のと
おりである。 （１） 作用 芳香族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、その硫酸基
をフェノール化合物に移転する反応を触媒する。 （２） 基質特異性 各種芳香族硫酸エステルならびに生体内硫酸エステルを
硫酸供与体として、またフェノールを受容体として反応
させ生成されるフェノール硫酸の量を高速液体クロマト
グラフィーで定量した。すなわち、反応液をケムコソル
ブ７−ＯＤＳ−Ｈを担体とする高速液体クロマトグラフ
装置（島津製作所製）にかけ４５％メタノールで１．０
ｍｌ／分で溶出し、波長２５４ｎｍで検出した。ｐ−ニ
トロフェニル硫酸（以下「ＰＮＳ」という）を硫酸供与
体として、フェノールを受容体として反応させた時の比
活性（蛋白当りの活性）８．８２μｍｏｌ／ｍｉｎ ｍ
ｇ蛋白質を１００％としたときの活性を表１に示す。ま
たＰＮＳを硫酸供与体としたときの各種硫酸受容体の基
質特異性は表２のとおりである。
られたアリルスルホトランスフェラーゼの性質は次のと
おりである。 （１） 作用 芳香族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、その硫酸基
をフェノール化合物に移転する反応を触媒する。 （２） 基質特異性 各種芳香族硫酸エステルならびに生体内硫酸エステルを
硫酸供与体として、またフェノールを受容体として反応
させ生成されるフェノール硫酸の量を高速液体クロマト
グラフィーで定量した。すなわち、反応液をケムコソル
ブ７−ＯＤＳ−Ｈを担体とする高速液体クロマトグラフ
装置（島津製作所製）にかけ４５％メタノールで１．０
ｍｌ／分で溶出し、波長２５４ｎｍで検出した。ｐ−ニ
トロフェニル硫酸（以下「ＰＮＳ」という）を硫酸供与
体として、フェノールを受容体として反応させた時の比
活性（蛋白当りの活性）８．８２μｍｏｌ／ｍｉｎ ｍ
ｇ蛋白質を１００％としたときの活性を表１に示す。ま
たＰＮＳを硫酸供与体としたときの各種硫酸受容体の基
質特異性は表２のとおりである。
【０００９】
【表１】
【００１０】
【表２】
【００１１】（３） 至適ｐＨ 硫酸供与体としてＰＮＳを用い、受容体を各種変えて至
適ｐＨをみた。その結果本酵素は受容体にフェノール、
１−ナフトールを用いた場合はｐＨ約１０〜１０．５に
至適ｐＨが存在した。（図１） 使用した緩衝液は、ｐＨ５〜６は０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐ
Ｈ６〜７は０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７〜９は０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１２．５は０．１Ｍグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液である。 （４） 温度安定性 ５〜６０℃の各温度で１０分間処理したのち酵素活性を
測定したところ、５０℃以下で安定であった。（図２） （５） 活性測定法 硫酸供与体としてＰＮＳ、受容体としてフェノールを用
い、５０ｍＭＰＮＳ０．０３ｍｌ、１ｍＭフェノール
０．２９ｍｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
０．２１ｍｌおよび酵素溶液０．１ｍｌを混合し３７
℃、３０分間反応させる。１Ｎ水酸化ナトリウム０．４
ｍｌを加えて反応を止め、白濁したものについては遠心
したのち透明な上清の４０５ｎｍにおける吸光度を測定
し、別にｐ−ニトロフェノールの標準液を用いて作成し
た検量線にもとづいて定量する。１分間に１μｍｏｌの
ｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位とし
た。またＰＮＳ以外の硫酸供与体を用いる場合は高速液
体クロマトグラフィーにて行った。
適ｐＨをみた。その結果本酵素は受容体にフェノール、
１−ナフトールを用いた場合はｐＨ約１０〜１０．５に
至適ｐＨが存在した。（図１） 使用した緩衝液は、ｐＨ５〜６は０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐ
Ｈ６〜７は０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７〜９は０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１２．５は０．１Ｍグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液である。 （４） 温度安定性 ５〜６０℃の各温度で１０分間処理したのち酵素活性を
測定したところ、５０℃以下で安定であった。（図２） （５） 活性測定法 硫酸供与体としてＰＮＳ、受容体としてフェノールを用
い、５０ｍＭＰＮＳ０．０３ｍｌ、１ｍＭフェノール
０．２９ｍｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
０．２１ｍｌおよび酵素溶液０．１ｍｌを混合し３７
℃、３０分間反応させる。１Ｎ水酸化ナトリウム０．４
ｍｌを加えて反応を止め、白濁したものについては遠心
したのち透明な上清の４０５ｎｍにおける吸光度を測定
し、別にｐ−ニトロフェノールの標準液を用いて作成し
た検量線にもとづいて定量する。１分間に１μｍｏｌの
ｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位とし
た。またＰＮＳ以外の硫酸供与体を用いる場合は高速液
体クロマトグラフィーにて行った。
【００１２】（６） 基質親和性 受容体としてフェノールを用いたときＰＮＳに対するミ
カエリス定数（Ｋｍ値）は０．１１ｍＭ、硫酸供与体と
してＰＮＳを用いたときフェノールに対するミカエリス
定数（Ｋｍ値）は０．６６ｍＭであった。 （７） 安定剤と阻害剤 本酵素に対する金属イオンの影響を表３に示した。マグ
ネシウムイオン、コバルトイオンは２ｍＭ添加すること
により活性はそれぞれ６５％、３０％上昇するが、カド
ミウムイオンは活性を強く阻害し、エチレンジアミン四
酢酸（２ｍＭ）は元の活性の５３％にまで減少させる。
なおユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株由来硫酸基
転移酵素の阻害剤であったｐ−ニトロフェノールリン
酸、アデノシン三リン酸、ピロリン酸による阻害は認め
られなかった。
カエリス定数（Ｋｍ値）は０．１１ｍＭ、硫酸供与体と
してＰＮＳを用いたときフェノールに対するミカエリス
定数（Ｋｍ値）は０．６６ｍＭであった。 （７） 安定剤と阻害剤 本酵素に対する金属イオンの影響を表３に示した。マグ
ネシウムイオン、コバルトイオンは２ｍＭ添加すること
により活性はそれぞれ６５％、３０％上昇するが、カド
ミウムイオンは活性を強く阻害し、エチレンジアミン四
酢酸（２ｍＭ）は元の活性の５３％にまで減少させる。
なおユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株由来硫酸基
転移酵素の阻害剤であったｐ−ニトロフェノールリン
酸、アデノシン三リン酸、ピロリン酸による阻害は認め
られなかった。
【００１３】
【表３】
【００１４】（８） 等電点 等電点カラムクロマトグラフィーにより、本酵素の等電
点は５．３であった。 （９） 分子量 セファクリルＳ−３００スーパーファイン（ファルマシ
ア社製）を用いたゲルろ過法により測定したところ、約
１６００００であった（図３）。またＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により約７３０００の２つの
サブユニットから成なることが示された。
点は５．３であった。 （９） 分子量 セファクリルＳ−３００スーパーファイン（ファルマシ
ア社製）を用いたゲルろ過法により測定したところ、約
１６００００であった（図３）。またＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により約７３０００の２つの
サブユニットから成なることが示された。
【００１５】次に本発明法を実施例をもって具体的に説
明する。 実施例 １ ０．１５％寒天を含んだＬＢ培地３１を滅菌したのち、
あらかじめ上記と同様の培地にクラブシェラＫ−３６を
培養して得た種培養液６０ｍｌを植菌し、好気的に３７
℃、１５時間培養した。培養液を遠心分離して菌体を集
めたのち超音波破砕機（ヒートシステムズ社製）にて菌
体を破砕し、さらに遠心分離により上清を集め粗酵素抽
出液を得た。これに最終濃度６０％になるよう硫安を加
え、沈殿物を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解し、同緩衝液に１５時間透析した。次いであらか
じめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ファル
マシア社製）カラム（２．５×３０ｃｍ）に通し酵素を
吸着させたのち、０〜０．５Ｍ塩化カリウムでグラジエ
ントに溶出し活性画分を集めた。これをＵＭ−１０メン
ブラン（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮、
２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し同
緩衝液に透析した。次にあらかじめ同緩衝液で平衡化し
たクロマトフォーカシングカラム（１．５×１５ｃｍ）
に通し酵素を吸着させたのち、酢酸でｐＨ４までグラジ
エントに溶出し活性画分を集め、ＵＭ−１０メンブラン
で濃縮した。最後にこれを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００ス
ーパーファインカラム（２×８６ｃｍ）に通し精製酵素
標品を得た。図４にＤＥＡＥセルロースカラムクロマト
グラフィーの溶出パターン、図５にクロマトフォーカシ
ングカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを、また
表４には精製過程の結果を示す。なお蛋白量はフォーリ
ン−ロウリィ（Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ）法により牛血
清アルブミン（フラクションＶ）を標準として測定し
た。
明する。 実施例 １ ０．１５％寒天を含んだＬＢ培地３１を滅菌したのち、
あらかじめ上記と同様の培地にクラブシェラＫ−３６を
培養して得た種培養液６０ｍｌを植菌し、好気的に３７
℃、１５時間培養した。培養液を遠心分離して菌体を集
めたのち超音波破砕機（ヒートシステムズ社製）にて菌
体を破砕し、さらに遠心分離により上清を集め粗酵素抽
出液を得た。これに最終濃度６０％になるよう硫安を加
え、沈殿物を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解し、同緩衝液に１５時間透析した。次いであらか
じめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ファル
マシア社製）カラム（２．５×３０ｃｍ）に通し酵素を
吸着させたのち、０〜０．５Ｍ塩化カリウムでグラジエ
ントに溶出し活性画分を集めた。これをＵＭ−１０メン
ブラン（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮、
２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し同
緩衝液に透析した。次にあらかじめ同緩衝液で平衡化し
たクロマトフォーカシングカラム（１．５×１５ｃｍ）
に通し酵素を吸着させたのち、酢酸でｐＨ４までグラジ
エントに溶出し活性画分を集め、ＵＭ−１０メンブラン
で濃縮した。最後にこれを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００ス
ーパーファインカラム（２×８６ｃｍ）に通し精製酵素
標品を得た。図４にＤＥＡＥセルロースカラムクロマト
グラフィーの溶出パターン、図５にクロマトフォーカシ
ングカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを、また
表４には精製過程の結果を示す。なお蛋白量はフォーリ
ン−ロウリィ（Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ）法により牛血
清アルブミン（フラクションＶ）を標準として測定し
た。
【００１６】
【表４】
【図１】アリルスルホトランスフェラーゼの至適ｐＨを
表す図である。
表す図である。
【図２】アリルスルホトランスフェラーゼの温度安定性
を表す図である。
を表す図である。
【図３】同酵素のゲルろ過法による分子量の測定を表す
図である。
図である。
【図４】同酵素のＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの溶出パターンを表す図である。
ラフィーの溶出パターンを表す図である。
【図５】同酵素のクロマトフォーカシングカラムクロマ
トグラフィーの溶出パターンを表す図である。
トグラフィーの溶出パターンを表す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 下記性質を有するアリルスルホトランス
フェラーゼ （ａ）作用 芳香族硫酸エステルを硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に移転する反応を触媒する。 （ｂ） 至適ｐＨ １０〜１０．５ （ｃ） 温度安定性 ５０℃以下で安定 （ｄ） 各種金属イオン、阻害剤の影響 Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋により活性は上昇し、Ｃｄ２＋、Ｅ
ＤＴＡにより阻害される。 - 【請求項２】 クラブシェラ属に属する下記性質を有す
るアリルスルホトランスフェラーゼ産生菌を培養し、該
アリルスルホトランスフェラーゼを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とするアリルスルホトランスフ
ェラーゼの製造法。 （ａ） 作用 芳香族硫酸エステルを硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に移転する反応を触媒する。 （ｂ） 至適ｐＨ １０〜１０．５ （ｃ） 温度安定性 ５０℃以下で安定 （ｄ） 各種金属イオン、阻害剤の影響 Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋により活性は上昇し、Ｃｄ２＋、Ｅ
ＤＴＡにより阻害される。 - 【請求項３】 クラブシェラ属に属するアリルスルホト
ランスフェラーゼ産生菌がクラブシェラＫ−３６である
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のアリルス
ルホトランスフェラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23994192A JPH06153936A (ja) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23994192A JPH06153936A (ja) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153936A true JPH06153936A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=17052101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23994192A Pending JPH06153936A (ja) | 1992-07-23 | 1992-07-23 | アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06153936A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6225100B1 (en) | 1996-07-09 | 2001-05-01 | Dcv, Inc. | Arylsulfotransferase |
-
1992
- 1992-07-23 JP JP23994192A patent/JPH06153936A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6225100B1 (en) | 1996-07-09 | 2001-05-01 | Dcv, Inc. | Arylsulfotransferase |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS604716B2 (ja) | 新規なコリンオキシダーゼおよびその製法 | |
| JPH0236230B2 (ja) | ||
| Kim et al. | Purification and characterization of novel sulfotransferase obtained from Klebsiella K-36, an intestinal bacterium of rat | |
| JPS60149399A (ja) | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 | |
| JP5022044B2 (ja) | 新規ウリカーゼの製造方法 | |
| JPH06153936A (ja) | アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法 | |
| JPH03127985A (ja) | Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
| JP2684238B2 (ja) | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 | |
| JP3076856B2 (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
| JPH02234678A (ja) | アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 | |
| JP2623507B2 (ja) | マルトオリゴ糖の製造法 | |
| JP2801608B2 (ja) | 新規ヘパラン硫酸分解酵素並びにそれを生産する微生物及び方法 | |
| JPH09247A (ja) | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 | |
| JP2588707B2 (ja) | サルコシン・オキシダーゼの製造法 | |
| JP3649765B2 (ja) | 新規なグリセロールキナーゼおよびその製造法 | |
| JPS6098982A (ja) | ポリアミン測定用酵素の製造法 | |
| JPH05236955A (ja) | 耐熱性アルカリホスファターゼの製造法 | |
| JPH01137973A (ja) | アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 | |
| JPS60244286A (ja) | 蓚酸オキシダ−ゼの製造法 | |
| JP3602169B2 (ja) | ソルビトール−６−リン酸脱水素酵素の製造法 | |
| JPS59183690A (ja) | アリルスルホトランスフェラ−ゼの製造法 | |
| JPH0838169A (ja) | ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 | |
| JPH0260313B2 (ja) | ||
| JPH0561911B2 (ja) | ||
| JPH1156355A (ja) | コレステロール・エステラーゼの製造方法 |