JP2801608B2 - 新規ヘパラン硫酸分解酵素並びにそれを生産する微生物及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、新規なヘパラン硫酸系グリコサミノグリカ
ン（ヘパラン硫酸及びヘパリン）分解酵素並びにそれを
生産する微生物及び方法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） 従来ヘパリン（以下Hepと略す）及びヘパラン硫酸
（以下HSと略す）を分解する酵素（以下HSaseと略す）
はフラボバクテリウム・ヘパリナム菌に所在することが
知られており、すでに３種類の酵素について精製の報告
がある。

しかし、この菌種に由来する酵素以外に微生物の産生
するHSaseについての精製の報告はまだない。

これらHSaseは、近年抗血栓剤として開発が進められ
ている低分子ヘパリンの調製時の低分子化剤として、あ
るいは細胞表面や基底膜に広く分布し細胞の挙動や機能
の発現に関与しているヘパラン硫酸の構造解析のための
試薬としてその有用性が注目されている。

これらの用途に役立つ酵素の性質として特に特異性が
異なりより安定な酵素が必要であり、これらの性質を有
する酵素を産生する微生物が求められている。

本発明者等はかかる性質を有するHSase産生菌を広く
自然界に検索した結果、山梨県下の土壌より分離したフ
ラボバクテリウム属に属するHp206株がかかる性質を有
する新規な酵素を産生する能力をもつことを見出した。

この酵素を分画・精製した結果、理化学的性質及び特
異性の異なる３種の新しいHSaseが単離された。これら
の酵素は従来のフラボバクテリウム・ヘパリナム由来の
３酵素（HSase I,II,III）に較べ、HSase Iと理化学的
性質では異なるが特異性の類似している酵素（HSase
I）、両性質のいずれに於ても異なる二つの酵素（HSase
IV及びHSase V）の３種の新酵素であった。また、この
酵素は比較的安定性も良好であり初期目標に適する性格
を有することを確認し本発明を完成するに至った。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用） 本発明は、新規ヘパラン硫酸分解酵素ヘパリチナーゼ
Ｉ、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶ並びにそれ
を産生する微生物及び方法に関するものである。

本発明の微生物は、フラボバクテリウム属に属するヘ
パリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼ
Ｖ生産能を有する細菌であり、次のような菌学的性質を
有する。

A.形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は短い桿状であ
り、0.5〜0.7×0.8〜1.0μの大きさで、通常２連である
が、まれに単独ないし数連をなす。

（２）細胞の多形成はない （３）運動性なし （４）胞子形成なし （５）グラム染色性は陰性 B.生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 半透明、クリーム色（JIS Z8102“色名”準拠、工業
用色名帳による判定）で光沢を有する円形の丘状ないし
半球状の均質なコロニーを生ずる。表面は平滑かつ湿潤
で、周縁は全縁。拡散性色素を生成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育は良好で拡布状に生育する。生育部分はクリーム
色を呈し、半透明である。

（３）肉汁液体培養 生育はやや良好で表面に膜を形成することなく培地は
半透明の状態である。

（４）肉汁ゼラチン平板培養 生育は良好でクリーム色を呈する。ゼラチンをわずか
であるが液化する。

（５）リトマス・ミルク リトマスの色が桃色に変化する（酸の生成）。

C.生理学的性質及びその他の性質 （１）亜硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応：陰性 （３）MRテスト：陰性 （４）VPテスト：陽性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陰性 （７）デンプンの加水分解：わずかに陽性 （８）クエン酸の利用：陰性 （９）無機窒素源の利用：アンモニウム塩；陽性、硫酸
塩；陰性 （10）色素の生成 キングＡ培地、キングＢ培地で非水溶性のクリーム色
の色素を生成する （11）ウレターゼ：陰性 （12）オキシダーゼ：陽性 （13）カタラーゼ：陽性 （14）酸素に対する態度：好気性 （15）生育pH:5〜9.5、特に７〜８が最適 （16）生育温度:4〜37℃、特に25〜30℃が最適 （17）Ｏ−Ｆテスト：グルコースを酸化的に利用する （18）炭素源の利用： 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用をしらべ
た。いずれの炭素源からもガスを発生せず、酸の生成は
次の通りである。

（＋；陽性、−；陰性） Ｌ−アラビノース ＋ セロビオース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−ソルビトール ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンニトール − Ｄ−マンノール ＋ イノシトール − Ｄ−フラクトース ＋ ズルシトール − Ｄ−ガラクトース ＋ アドニトール − 麦芽糖 ＋ グリセリン ＋ ショ糖 ＋ サリシン − 乳糖 ＋ エタノール − トレハロース ＋ （19）カゼインの分解：陰性 （20）エスクリンの分解：陽性 （21）β−ガラクトシダーゼ産生：陽性 （22）マロン酸の利用：陰性 （23）アルギニンの分解：陰性 （24）リジンの脱炭酸反応：陰性 （25）オルニチンの脱炭酸反応：陰性 （26）デオキシリボヌクレアーゼ産生：陰性 （27）ペニシリン感受性：陰性 （28）黄色色素産生：陽性 （29）蛍光色素産生：陰性 （30）GC含量:39.7％ 上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上の位置をバ
ージェィのマニュアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー、第１版、第１巻（1984年）を参照して検
討すると、本菌はグラム陰性のグルコース非発酵性の好
気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシダ
ーゼを産生し、ペニシリン感受性が陰性でGC含量が31％
から42％の範囲にあることから、フラボバクテリウム属
に属すると判定される。更に炭素源利用性の大部分及
び、カゼイン分解能、エスクリン分解能、インドール産
性能、亜硫酸塩還元能、β−ガラクトシダーゼ産生能の
性質がフラボバクテリウム・マルティボラム（Flavobac
terium multivorum）に類似しているが、サリシン利用
性、ウレアーゼ産生能の性質がフラボバクテリウム・マ
ルティボラムと異なるので、本菌はフラボバクテリウム
属に属する新菌種と同定される。

なお、本菌株Hp206は工業技術院微生物工業技術研究
所に微生物受託番号第10207号（以下微工研菌寄第10207
号と略記する）として寄託されている。

本発明の新規ヘパラン硫酸分解酵素ヘパリチナーゼ
Ｉ、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶは、フラボ
バクテリウム属に属する上記Hp206菌あるいはフラボバ
クテリウム属に属する該酵素産生菌を通常、微生物の培
養に用いられる栄養培地、好ましくは酵素産生能を高め
るためにヘパリンやヘパラン硫酸或はこれらを含む物質
を添加した培地で培養することにより培地中あるいは菌
体中に生産蓄積されるので、公知の方法で抽出、精製す
ることによって精製酵素を得ることができる。

更に具体的に説明するとフラボバクテリウム属に属す
る該酵素産生菌を適当な栄養培地、例えば適当な炭素
源、窒素源、無機塩類と酵素生産能を高めるためにヘパ
リンやヘパラン硫酸或はこれらを含む物質などの誘導物
質を含む培地で菌を培養し、該酵素を培地中あるいは菌
体中に生産蓄積せしめるのであるが、炭素源としてはグ
ルコース、ガラクトース、マンノース、フラクトース、
キシロース、ラムノース、シユクロース、ラクトース、
マルトース、セロビオース、ラフィノース、澱粉及びそ
の加水分解物、糖蜜、グリセリンなどが利用できる。窒
素源としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉
エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーンスティープリカ
ー、尿素、アンモニウム塩など有機、無機の窒素化合物
又はこれを含有するものが用いられる。無機塩として
は、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウ
ム、カルシウムなどの塩類が使用される。そして更に必
要に応じて菌の生育あるいは酵素生産に必要な各種の無
機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油、各種界面
活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添加すること
ができる。

本発明においては、好ましくは、酵素の誘導物質とし
てヘパリンやヘパラン硫酸又はそれらを含有する物質を
添加すれば大量の該酵素を生成せしめることができる。
これらの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に
行なってもよい。添加量としてはヘパリンやヘパラン硫
酸として通常0.2％〜２％添加すれば良い結果が得られ
る。

培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、通常
は液体培養が好適であり、工業的には深部通気拡散培養
を行なうのが有利である。

本発明における培養条件は使用する菌株、培地組成等
により多少異なるが、該酵素の生産に最も有利な条件を
適当に選択、調節して行なう。培養温度は４〜37℃の範
囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいのは
25〜30℃である。培養時間は条件によって異なるが、１
〜２日程度であって該酵素が最高蓄積量に適する時期に
培養を終了すればよい。培地のpHは培地調製時に中性付
近にあればよく、通常の場合、特に調節の必要はない。

このようにして培養した培養液及び菌体内抽出液双方
から三種の酵素を得ることができる。菌体外液について
は硫酸アンモニウムを加え、0.85飽和として析出した沈
殿物を透析した後、ハイドロキシアパタイト、イオン交
換樹脂、ゲルろ過、吸着クロマト剤を用いて酵素を分画
精製する。また菌体内酵素については、菌体を適当な緩
衝液に懸濁し超音波又は機械的磨砕法によって菌体を破
壊して酵素を抽出した後、その遠心上清を菌体外液に用
いたのと同様の手法により酵素を精製することができ
る。しかしこれら精製の手法により本発明は何ら制約を
受けるものではない。

これら酵素の力価は酵素がいずれもヘキソサミニド結
合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウロン酸
の４位と５位の炭素の間に二重結合が作られ紫外吸収を
持つことを利用し、その増大を測定することにより求め
られる。

酵素の基質にはヘパリチナーゼＩとヘパリチナーゼＶ
についてはウシ腎臓由来のヘパラン硫酸を、ヘパリチナ
ーゼIVについてはブタ腸粘膜由来のヘパリンを用いる。

即ち、上記基質10mg/ml水溶液25μｌに対し、酵素液1
0μｌ、200mM酢酸緩衝液pH7.0、25μｌ、20mM塩化カリ
ウム25μｌ及び水15μｌを加え、37℃で10分間反応させ
る。この液に対し、0.06N塩酸溶液500μｌを加え、反応
を停止させ、232nmにおける紫外吸収Ａを測る。対照液
として同混液のゼロ時間における紫外吸収Aoを測定す
る。

酵素力価の表示は上記反応条件で１分間に１μmolの
分解量を生じせしめる力価を１単位として次の式から算
出する： 本発明の新規なHSaseの理化学的性質を示す。

（１）作用 いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸
のグルコサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断
部のグルクロン酸又はイデュロン酸の４位と５位の炭素
の間に二重結合を形成する。

（２）基質特異性（図１） HSase Iは主としてヘパラ
ン硫酸に作用し、分解産物として不飽和２糖である、非
硫酸化物（以下「△DiHS−OS」という）、Ｎ−アセチル
グルコサミン−６−硫酸（以下「△DiHS−6S」とい
う）、グルコサミン−Ｎ−硫酸（以下「△DiHS−NS」と
いう）と少量のグルコサミン−N,6−ジ硫酸（以下「△D
iHS−diN,6S」という）を生じる。

HSase IVはヘパリン及びヘパラン硫酸に作用し、分解
産物として不飽和２糖である、ウロン酸−２−硫酸−グ
ルコサミン−Ｎ−硫酸（以下「△DiHS−di,U,NS」とい
う）及びウロン酸−２−硫酸−グルコサミン−N,6−ジ
硫酸（以下「△DiHS−triS」という）を生じる。

HSase VはHSase Iの分解産物のうち、△DiHS−diN,6S
以外の産物を生じる。

（３）至適pH及び安定pH範囲： 本酵素類の至適pHは、HSase I及びHSase IVはいずれ
もpH7.5（50mMトリス酢酸緩衝液）、HSase V、pH6.5〜
7.0（同緩衝液）にある（図２）。

本酵素類の安定pH域は、HSase I及びHSase IVはいず
れも100mMトリス酢酸緩衝液中でpH6.0〜7.5、SHase Vで
は同緩衝液でpH6.0〜7.0にある（図３）。

（４）作用適温の範囲 本酵素類の作用至適温度は50mM
酢酸緩衝液pH7.0、5mM塩化カルシウム存在下でHSase
I、45℃付近、HSase IV及びHSase V40℃付近である（図
４）。

（５）pH、温度などによる失活の条件 本酵素類はいずれもpH5.5以下、pH8.0以上で37℃30分
放置することにより50％以下に失活する（図３）。また
本酵素類を50mM酢酸緩衝液ph7.0中で各温度に60分間放
置した時の安定性はHSase IとHSase IVは35℃を越える
温度で、HSase Vは40℃を越える温度で急激に失活する
（図５）。

（６）種々薬剤の影響 本酵素類の活性はいずれもBa²⁺,Ca²⁺,Mg²⁺等で賦活さ
れ、Co²⁺,Zn²⁺で阻害された。またHSase Iは更にPO₄ ^3-,
EDTAでも阻害される（表参照）。

（７）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により本酵
素の分子量を求めると、HSase Iは64,000±5,000、HSas
e IVは100.000±5,000、HSase Vは72,000±5,000と算出
される（図６）。図中Ａはミオシン（分子量200,00
0）、ＢはフォスフォリラーゼＢ（分子量97,400）、Ｃ
は牛血清アルブミン（分子量68,000）、Ｄは卵白アルブ
ミン（分子量43,000）を示す。

また、本酵素類は還元下でもいずれも同じ分子量を示
し一本鎖であると推定される。

（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例 ペプトン（極東製）0.5％、酵母エキス（極東製）0.2
％、ヘパリンナトリウム（シンテックス製）0.2％、K₂H
PO₄ 0.1％、MgSO₄・7H₂O 0.02％、NaCl 0.1％、消泡剤
アデカノールLG109（旭電化製）0.005％（pH7.0）の組
成からなる培地20を30容のジャーファーメンターに
仕込み、120℃で20分間蒸気滅菌後、予め同組成（但
し、酵母エキス濃度0.5％、消泡剤は無添加）の培地で3
0℃、８時間振盪培養しておいたHp206株（微工研菌寄第
10207号）600ml（３％）を無菌的に植菌し、30℃で16時
間通気（1V.V.m）撹拌（200rpm）培養した。

培養液20を連続遠心分離機にて処理して菌体を集
め、この菌体を0.1M燐酸緩衝液（pH6.8）にて250mlに懸
濁した。この懸濁液をダイノミルにかけ菌体を破砕し
た。破砕後、遠心分離により不溶物の除去を行ない、得
られた上清液にプロタミンを100mg添加した。不溶物を
遠心分離により除去し、上清液に硫酸アンモニウムを加
え0.8飽和とした。沈殿物を集め、50mM燐酸緩衝液pH6.8
で一夜透析し透析内液をハイドロキシアパタイトカラム
（3.4×40cm）に負荷し同緩衝液中に食塩濃度を０→0.7
5Mまで直線的に上昇させることにより溶出させた。Hep
及びHSを基質として活性を測定した。0.5M前後でHSase
IV及びHSase Vが溶出された。HSase Iはグラジエント終
了後、2M食塩で溶出せた。HSase IV及びHSase Vの画分
を集め、50mMトリス緩衝液pH7.2に透析し、透析内液を
硫酸化セルロファインのカラム（2.5×20cm）に負荷し
同緩衝液で洗った後、食塩濃度を０→0.6Mまで直線的に
上昇せしめることにより、0.2M付近でHSase Vを、0.35M
付近でHSase IVを分離溶出せしめることができた。

HSase IVについては更にデルマタン硫酸をAH−セファ
ロースに固定化したカラム（B.B−AH−セファロース4
B、２×10cm）を用い、予め5mMリン酸緩衝液pH6.8によ
り試料及びカラムを緩衝化した後、負荷し、食塩濃度を
０→0.3Mまで上昇せしめることにより混入するスルファ
ターゼを除去精製した。

各得られた画素画分は限外ろ過膜（ウルトラフィルタ
ーUK−10）を用いて濃縮脱塩し、酵素濃液を得た。

各酵素の収量 HSase I 40U HSase IV 38U HSase V 5U ［発明の効果］ 本発明によれば、新規ヘパラン硫酸分解酵素ヘパリチ
ナーゼＩ、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶを提
供することができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の酵素類の基質特異性を示す図であり、
図２は、本発明の酵素類の至適pHを示す図であり、図３
は、本発明の酵素類の安定pH範囲を示す図であり、図４
は、本発明の酵素類の作用至適温度を示す図であり、図
５は、本発明の酵素類の温度による失活の条件を示す図
であり、図６は、本発明の酵素類の分子量を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−54398（ＪＰ，Ａ) ＣＡＲＢＯＨＹＤＲ ＲＥＳ．137 （０）（1985）Ｐ．227−238 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/88 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴と
   する新規ヘパラン硫酸分解酵素ヘパリチナーゼＩ、ヘパ
   リチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶ。 作用 いずれの酵素もヘパリン又はヘパラン硫酸のグ
   ルコサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の
   グルクロン酸又はイデュロン酸の４位と５位の炭素の間
   に二重結合を形成する。 基質特異性 ヘパリチナーゼI :主としてヘパラン硫酸に作用し、分
   解産物として不飽和２糖である、非硫酸化物、Ｎ−アセ
   チルグルコサミン−６−硫酸、グルコサミン−Ｎ−硫酸
   と少量のグルコサミン−N,6−ジ硫酸を生じる。 ヘパリチナーゼIV:ヘパリン及びヘパラン硫酸に作用
   し、分解産物として不飽和２糖である、ウロン酸−２−
   硫酸−グルコサミン−Ｎ−硫酸及びウロン酸−２−硫酸
   −グルコサミン−N,6−ジ硫酸を生じる。 ヘパリチナーゼV :主としてヘパラン硫酸に作用し、分
   解産物として不飽和２糖である、非硫酸化物、Ｎ−アセ
   チルグルコサミン−６−硫酸及びグルコサミン−Ｎ−硫
   酸を生じる。 至適pH（50mMトリス−酢酸緩衝液、37℃反応） ヘパリチナーゼI :約7.5 ヘパリチナーゼIV:約7.5 ヘパリチナーゼV :約7.0 安定pH範囲（100mMトリス−酢酸緩衝液、37℃、30分
   処理） ヘパリチナーゼI :6.0〜7.5 ヘパリチナーゼIV6.0〜7.5 ヘパリチナーゼV :6.0〜7.0 至適温度（50mM酢酸緩衝液、pH7.0、5mM塩化カルシウ
   ム） ヘパリチナーゼI :約45℃ ヘパリチナーゼIV:約40℃ ヘパリチナーゼV :約40℃ 安定温度範囲（50mM酢酸緩衝液、pH7.0、60分処理） ヘパリチナーゼI :35℃以下 ヘパリチナーゼIV:35℃以下 ヘパリチナーゼV :40℃以下 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法） ヘパリチナーゼI : 64,000±5,000 ヘパリチナーゼIV:100,000±5,000 ヘパリチナーゼV : 72,000±5,000
2. 【請求項２】フラボバクテリウム属に属するヘパリチナ
   ーゼＩ、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶ生産能
   を有する細菌。
3. 【請求項３】フラボバクテリウム属に属するヘパリチナ
   ーゼＩ、ヘパリチナーゼIV及びヘパリチナーゼＶ生産能
   を有する細菌を培養し、その培養液又は菌体内抽出液か
   らヘパリチナーゼＩ、ヘパリチナーゼIV又はヘパリチナ
   ーゼＶを分離、採取することを特徴とするヘパリチナー
   ゼＩ、ヘパリチナーゼIV又はヘパリチナーゼＶの製造
   法。