JPH067793B2 - アルカリ性アミラ−ゼの製造法 - Google Patents
アルカリ性アミラ−ゼの製造法Info
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- JPH067793B2 JPH067793B2 JP5149285A JP5149285A JPH067793B2 JP H067793 B2 JPH067793 B2 JP H067793B2 JP 5149285 A JP5149285 A JP 5149285A JP 5149285 A JP5149285 A JP 5149285A JP H067793 B2 JPH067793 B2 JP H067793B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アルカリ性アミラーゼの製造法に関し、更に
詳しくは、ストレプトマイセス属に属する新規なアルカ
リアミラーゼ生産菌を培養し、その培地からアルカリ性
アミラーゼを採取することを特徴とするアルカリ性アミ
ラーゼの製造法に関する。
詳しくは、ストレプトマイセス属に属する新規なアルカ
リアミラーゼ生産菌を培養し、その培地からアルカリ性
アミラーゼを採取することを特徴とするアルカリ性アミ
ラーゼの製造法に関する。
アルカリ性アミラーゼは、自動食器用洗浄剤や衣料用洗
浄剤の成分として注目を集めている。然し、自然界にお
いて微生物の産生するアミラーゼは、大部分が中性乃至
酸性において至適な酵素活性を有する、所謂中性若しく
は酸性アミラーゼであって、アルカリ性アミラーゼは極
めて少ない。
浄剤の成分として注目を集めている。然し、自然界にお
いて微生物の産生するアミラーゼは、大部分が中性乃至
酸性において至適な酵素活性を有する、所謂中性若しく
は酸性アミラーゼであって、アルカリ性アミラーゼは極
めて少ない。
而して、従来アルカリ性アミラーゼ生産菌によりアルカ
リ性アミラーゼを生産する方法としては、僅かに２例、
パチルス属に属しアルカリ側に至適pHを有するアミラー
ゼ生産菌バチルスNo.P-203（Bacillus sp.No.Ｐ−２０
３）を培養して培地より採取する方法（特公昭５５−３
３３０９号公報）及びバチルス・オーベンシス・エスピ
ー・ノブＣ−1400（Bacillus Obensis sp. nov.Ｃ−１
４００）を培養して培地より酸性及びアルカリ性に作用
pHを有するα−アミラーゼを採取する方法（特公昭５２
−３１９４９号公報）が知られているのみであった。
リ性アミラーゼを生産する方法としては、僅かに２例、
パチルス属に属しアルカリ側に至適pHを有するアミラー
ゼ生産菌バチルスNo.P-203（Bacillus sp.No.Ｐ−２０
３）を培養して培地より採取する方法（特公昭５５−３
３３０９号公報）及びバチルス・オーベンシス・エスピ
ー・ノブＣ−1400（Bacillus Obensis sp. nov.Ｃ−１
４００）を培養して培地より酸性及びアルカリ性に作用
pHを有するα−アミラーゼを採取する方法（特公昭５２
−３１９４９号公報）が知られているのみであった。
従って、本発明の目的は、アルカリ性アミラーゼの新規
な製造法を提供することにある。
な製造法を提供することにある。
本発明者は、アルカリ性アミラーゼを生産する微生物を
自然界に求め、鋭意探索を続けてきたが、今般、栃木県
芳賀郡の土壌より採取した放線菌がアルカリ性アミラー
ゼを生産することを見出し、本発明を完成した。
自然界に求め、鋭意探索を続けてきたが、今般、栃木県
芳賀郡の土壌より採取した放線菌がアルカリ性アミラー
ゼを生産することを見出し、本発明を完成した。
従来、放線菌が産生するアミラーゼとして中性若しくは
酸性アミラーゼは公知であったが（例えば特開昭５０−
５２２７７号公報）、本発明の様に放線菌がアルカリ性
アミラーゼを生産することについては今迄知られていな
かった。
酸性アミラーゼは公知であったが（例えば特開昭５０−
５２２７７号公報）、本発明の様に放線菌がアルカリ性
アミラーゼを生産することについては今迄知られていな
かった。
本発明で使用される微生物は、ストレプトマイセス属に
属し、かつ、アルカリ性アミラーゼを生産しうるもので
あれば良く、例えばストレプトマイセス・エスピー Ｋ
ＳＭ−９（Streptomyces sp.ＫＳＭ−９，微工研菌寄第
２６２０号）が挙げられる。この菌株は、本発明者が栃
木県芳賀郡の土壌より分離したもので、次の第１表及び
第２表に示す菌学的性質を有する。
属し、かつ、アルカリ性アミラーゼを生産しうるもので
あれば良く、例えばストレプトマイセス・エスピー Ｋ
ＳＭ−９（Streptomyces sp.ＫＳＭ−９，微工研菌寄第
２６２０号）が挙げられる。この菌株は、本発明者が栃
木県芳賀郡の土壌より分離したもので、次の第１表及び
第２表に示す菌学的性質を有する。
ＫＳＭ−９株は形態学的に放線菌の特徴を有する。また
細胞壁にＬＬ−ジアミノピメリン酸を含むなどのことか
らストレプトマイセス属に分類される。
細胞壁にＬＬ−ジアミノピメリン酸を含むなどのことか
らストレプトマイセス属に分類される。
ＫＳＭ−９株は、各種寒天培地上での気中菌糸の色から
黄色シリーズの菌株に属すること、胞子の表面は平滑で
あること、胞子鎖はやや屈曲するかおおむね直線である
こと、メラニン様色素は生成しないこと及び炭素源の同
化性試験の結果をもとに既知菌株の中から、本菌株の類
似株をバージエーズマニュアル第８版に従って検索する
と、ストレプトマイセス・プニセウス（St. puniceus）
が類似の菌株として挙げられる。しかし、ストレプトマ
イセス・プニセウスは紫〜赤系統の色素をつくるのが特
徴であるのに対し、ＫＳＭ−９株にはその性質が認めら
れないことから、ＫＳＭ−９株は新菌種である。
黄色シリーズの菌株に属すること、胞子の表面は平滑で
あること、胞子鎖はやや屈曲するかおおむね直線である
こと、メラニン様色素は生成しないこと及び炭素源の同
化性試験の結果をもとに既知菌株の中から、本菌株の類
似株をバージエーズマニュアル第８版に従って検索する
と、ストレプトマイセス・プニセウス（St. puniceus）
が類似の菌株として挙げられる。しかし、ストレプトマ
イセス・プニセウスは紫〜赤系統の色素をつくるのが特
徴であるのに対し、ＫＳＭ−９株にはその性質が認めら
れないことから、ＫＳＭ−９株は新菌種である。
分離源の土壌からの本菌株の分離は、例えば後記参考例
１に示す如く、寒天培地を用いて従来法により行なっ
た。
１に示す如く、寒天培地を用いて従来法により行なっ
た。
本発明方法は、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ア
ルカリ性アミラーゼを生産する微生物を適当な培地に接
種し、培養することにより実施される。微生物として
は、上記ＫＳＭ−９株はもとより、その変異株も同様に
使用できる。
ルカリ性アミラーゼを生産する微生物を適当な培地に接
種し、培養することにより実施される。微生物として
は、上記ＫＳＭ−９株はもとより、その変異株も同様に
使用できる。
本発明で使用する培地の組成は、使用する菌株が良好に
生育し、アルカリ性アミラーゼの生産を順調に行なわし
めるために適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養源、
無機塩等からなっている。
生育し、アルカリ性アミラーゼの生産を順調に行なわし
めるために適当な炭素源、窒素源あるいは有機栄養源、
無機塩等からなっている。
炭素源としては、例えば馬鈴薯、甘藷、トウモロコシ、
コメ、モチゴメ、コムギ等のデンプン、デキストリン、
デキストラン、可溶性デンプン等の加工デンプン、アミ
ロース等のデンプン類、ブドウ糖、蔗糖、麦芽糖若しく
はソルビトール等の炭水化物、クエン酸、コハク酸、酢
酸等の有機酸等の資化されるものであればいずれも使用
できる。これらの炭素源のうちデンプン類、就中可溶性
デンプンを使用した培地はアルカリ性アミラーゼの生産
量が多く好適に使用される。
コメ、モチゴメ、コムギ等のデンプン、デキストリン、
デキストラン、可溶性デンプン等の加工デンプン、アミ
ロース等のデンプン類、ブドウ糖、蔗糖、麦芽糖若しく
はソルビトール等の炭水化物、クエン酸、コハク酸、酢
酸等の有機酸等の資化されるものであればいずれも使用
できる。これらの炭素源のうちデンプン類、就中可溶性
デンプンを使用した培地はアルカリ性アミラーゼの生産
量が多く好適に使用される。
窒素源あるいは有機栄養源としては、例えば硝酸ナトリ
ウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩類；
酵母エキス、肉エキス、ペプトンが挙げられる。
ウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩類；
酵母エキス、肉エキス、ペプトンが挙げられる。
無機塩としては、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウ
ム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸
塩、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン
酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、ピロリン酸カリ
ウム、ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウ
ム、ヘキサメタリン酸ナトリウム等々のリン酸塩、硫酸
マグネシウム等の無機塩が使用できる。就中炭酸塩を0.
１〜1.５重量％含有する培地はアルカリ性アミラーゼの
産生量が多く好適である。さらに微量の重金属塩類が使
用されるが天然物を含む培地では必ずしも添加を必要と
しない。
ム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等の炭酸
塩、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン
酸二水素ナトリウム、リン酸カリウム、ピロリン酸カリ
ウム、ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウ
ム、ヘキサメタリン酸ナトリウム等々のリン酸塩、硫酸
マグネシウム等の無機塩が使用できる。就中炭酸塩を0.
１〜1.５重量％含有する培地はアルカリ性アミラーゼの
産生量が多く好適である。さらに微量の重金属塩類が使
用されるが天然物を含む培地では必ずしも添加を必要と
しない。
また、上記以外の栄養源を必要とする変異株を用いる場
合には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなけ
ればならない。
合には、その栄養要求を満たす物質を培地に添加しなけ
ればならない。
培養は、培地を加熱等により殺菌後、菌を接種し、２５
〜３５℃で、２〜４日振盪又は通気攪拌すれば良い。pH
は８〜１１程度に調製すると良い結果が得られる。水に
難溶性の炭素源等を使用する場合にはポリオキシエチレ
ンソルビタン等の各種界面活性剤を培地に添加すること
も可能である。
〜３５℃で、２〜４日振盪又は通気攪拌すれば良い。pH
は８〜１１程度に調製すると良い結果が得られる。水に
難溶性の炭素源等を使用する場合にはポリオキシエチレ
ンソルビタン等の各種界面活性剤を培地に添加すること
も可能である。
斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リ性アミラーゼの採取及び精製は、例えば後記実施例に
示す如く、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行
うことができる。
リ性アミラーゼの採取及び精製は、例えば後記実施例に
示す如く、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行
うことができる。
すなわち、培養物を遠心分離、又は過等に付して菌体
を分離し、その菌体及び培養液から通常の分離手段、
例えば塩析法、沈澱法、限外過法等を単独で、あるい
は適宜組合せてアルカリ性アミラーゼを分離する。沈澱
法は例えば培養液に低級アルコール類やアセトン等の有
機溶媒を添加して酵素を沈澱させることにより、また限
外過法は例えばダイアフローメンブレンＹＣ（アミコ
ン社製）を用いて上清液中の酵素を濃縮乾固することに
よりこれを分離する。塩析法では例えば硫安により塩析
した沈殿を、過あるいは遠心分離後、脱塩し、凍結乾
燥して粉末とする。脱塩の方法としては、透析法、又は
例えばセフアデックスＧ−２５を用いるゲルロ過法等た
挙げられる。
を分離し、その菌体及び培養液から通常の分離手段、
例えば塩析法、沈澱法、限外過法等を単独で、あるい
は適宜組合せてアルカリ性アミラーゼを分離する。沈澱
法は例えば培養液に低級アルコール類やアセトン等の有
機溶媒を添加して酵素を沈澱させることにより、また限
外過法は例えばダイアフローメンブレンＹＣ（アミコ
ン社製）を用いて上清液中の酵素を濃縮乾固することに
よりこれを分離する。塩析法では例えば硫安により塩析
した沈殿を、過あるいは遠心分離後、脱塩し、凍結乾
燥して粉末とする。脱塩の方法としては、透析法、又は
例えばセフアデックスＧ−２５を用いるゲルロ過法等た
挙げられる。
更に、酵素を精製するには、例えばDEAE−セルロース又
はDEAE−セフアデックスを用いるイオン交換クロマトグ
ラフィー及びセフアデックスＧ−１００のようなゲルク
ロマトグラフィーを夫夫単独で、あるいは併用して分別
精製すればよい。
はDEAE−セフアデックスを用いるイオン交換クロマトグ
ラフィー及びセフアデックスＧ−１００のようなゲルク
ロマトグラフィーを夫夫単独で、あるいは併用して分別
精製すればよい。
なお、培養液はそのまま酵素源とすることもできる。
以上の如くして得られたアルカリ性アミラーゼは次の様
な理化学的性質を有する。
な理化学的性質を有する。
1)作用及び基質特異性 でんぷんに作用し、ヨード反応を消失せしめると同時に
還元糖の生成も認められる。
還元糖の生成も認められる。
2)至適pH pH 9.0付近ででんぷんに対する作用が至適である（第
１図）。
１図）。
3)安定pH範囲 ５mM CaClを安定化剤として加え、４０℃で１０分間処
理した場合、pH７〜９において８０％以上、pH１０にお
いて６０％以上の残存活性を示す（第２図）。
理した場合、pH７〜９において８０％以上、pH１０にお
いて６０％以上の残存活性を示す（第２図）。
4)至適温度 pH９においてはでんぷんを基質とした場合、４０℃付近
が至適であり、２０℃〜５０℃において４０％以上の活
性を示す（第３図）。
が至適であり、２０℃〜５０℃において４０％以上の活
性を示す（第３図）。
5)熱安定性 pH９において４０℃で１０分間処理した場合、９０％以
上安定である（第４図）。
上安定である（第４図）。
6)分子量 トヨパールＨＷ−５５Ｓカラム（φ１cm×１００cm）に
よるゲル過法で測定した結果、約３万であった。
よるゲル過法で測定した結果、約３万であった。
本発明において、アミラーゼ活性は次の方法により測定
した。
した。
〈アミラーゼ活性測定方法〉 酵素液（適当に希釈して５８０nmの吸光度が１０〜３０
％減少するようにする）0.１ｍに基質として0.１％可
溶性でんぷん水溶液0.２ｍ及びpH9.０の0.２Ｍグリシ
ン−NaOH緩衝液0.２ｍ又は種々のpHの緩衝液0.２ｍ
を加え、４０℃で１０分間反応させる。次いでこれに0.
２ＮHClを0.５ｍ加えて反応を停止させ、ヨウ素液2.
０ｍを加えて良く攪拌した後、５８０ｎｍの吸光度を
測定する。また対照は、上記と同じ基質及び緩衝液各0.
2ｍに0.２ＮHClをあらかじめ0.５ｍ加え、そこに酵
素液0.１ｍを加えた後、ヨウ素液2.０ｍを加えて良
く攪拌した後、５８０ｎｍの吸光度を測定する。なお、
ヨウ素液としては、ＫＩ４５ｇとヨウ素酸カリウム3.５
７ｇを水１に溶解してヨウ素原液とし、使用時にこれ
を水で３００倍に希釈したものを使用した。
％減少するようにする）0.１ｍに基質として0.１％可
溶性でんぷん水溶液0.２ｍ及びpH9.０の0.２Ｍグリシ
ン−NaOH緩衝液0.２ｍ又は種々のpHの緩衝液0.２ｍ
を加え、４０℃で１０分間反応させる。次いでこれに0.
２ＮHClを0.５ｍ加えて反応を停止させ、ヨウ素液2.
０ｍを加えて良く攪拌した後、５８０ｎｍの吸光度を
測定する。また対照は、上記と同じ基質及び緩衝液各0.
2ｍに0.２ＮHClをあらかじめ0.５ｍ加え、そこに酵
素液0.１ｍを加えた後、ヨウ素液2.０ｍを加えて良
く攪拌した後、５８０ｎｍの吸光度を測定する。なお、
ヨウ素液としては、ＫＩ４５ｇとヨウ素酸カリウム3.５
７ｇを水１に溶解してヨウ素原液とし、使用時にこれ
を水で３００倍に希釈したものを使用した。
本発明において、アミラーゼ活性は次式により評価し、
アミラーゼ活性１単位(U)とは、上記の条件下で１０％
の吸光度を減少させる酵素量をいう。
アミラーゼ活性１単位(U)とは、上記の条件下で１０％
の吸光度を減少させる酵素量をいう。
Ｄ０：対照の吸光度 Ｄ：反応液の吸光度 〔発明の効果〕 本発明により、従来アルカリ性アミラーゼを生産するこ
とが知られていなかった放線菌によってアルカリ性アミ
ラーゼを生産することが可能となった。
とが知られていなかった放線菌によってアルカリ性アミ
ラーゼを生産することが可能となった。
次に参考例及び実施例を挙げて本発明を説明する。
参考例１ 栃木県芳賀郡の土壌をスパーテル１杯分（約0.5ｇ）を
１０ｍ無菌水に懸濁し、充分に攪拌した後放置した。
かくして得られる土壌懸濁液上清0.１ｍを下記組成の
分離様寒天培地に塗布した。
１０ｍ無菌水に懸濁し、充分に攪拌した後放置した。
かくして得られる土壌懸濁液上清0.１ｍを下記組成の
分離様寒天培地に塗布した。
組成： 可溶性でんぷん １０ｇ 肉エキス １５ｇ 酵母エキス ５ｇ KH2PO4 １ｇ Na2CO3 １０ｇ 寒 天 １５ｇ 水 １０００ml pH10.5 次いで、これを３０℃で３日間培養し、４Ｎ ＨＣｌで
培地を中和後その表面にヨウ素液を流し、集落の周囲に
ヨウ素デンプン反応の消失にもとづく黄色の変色帯を有
する菌が出現するのを確認し、明瞭な変色帯を有する集
落を釣菌し、上記分離用寒天培地と同組成の斜面寒天培
地に接種し、３０℃で３日間培養し、保存用菌株とし
た。
培地を中和後その表面にヨウ素液を流し、集落の周囲に
ヨウ素デンプン反応の消失にもとづく黄色の変色帯を有
する菌が出現するのを確認し、明瞭な変色帯を有する集
落を釣菌し、上記分離用寒天培地と同組成の斜面寒天培
地に接種し、３０℃で３日間培養し、保存用菌株とし
た。
上記菌株の各培地上の性状及び生理学的性質は前記第１
表及び第２表に示した通りであり、本発明者はこれをス
トレプトマイセス・エスピー ＫＳＭ−９（Streptomyc
es sp. KSM-9）と命名した。
表及び第２表に示した通りであり、本発明者はこれをス
トレプトマイセス・エスピー ＫＳＭ−９（Streptomyc
es sp. KSM-9）と命名した。
実施例１ ５００ｍ容量の坂口フラスコに、可溶性でんぷん1.０
％、肉エキス1.５％、酵母エキス0.５％、リン酸二水素
カリウム0.１％、炭酸ナトリウム0.5％（w/v％pH9.５）
の組成からなる液体培地１００ｍを入れ、この液体培
地にストレプトマイセス・エスピー ＫＳＭ−９株（微
工研菌寄託番号第７６２０号）をスラントより接種し、
30℃で振盪培養した。
％、肉エキス1.５％、酵母エキス0.５％、リン酸二水素
カリウム0.１％、炭酸ナトリウム0.5％（w/v％pH9.５）
の組成からなる液体培地１００ｍを入れ、この液体培
地にストレプトマイセス・エスピー ＫＳＭ−９株（微
工研菌寄託番号第７６２０号）をスラントより接種し、
30℃で振盪培養した。
３日間培養後、菌体を遠心分離して除去して得た培養液
を硫安分画し、生成する固型分を凍結乾燥して酵素粉末
を得た。培養液１当り0.４ｇの酵素粉末が得られた。
得られた酵素のアミラーゼ活性はpH9.０において８５０
単位であった。
を硫安分画し、生成する固型分を凍結乾燥して酵素粉末
を得た。培養液１当り0.４ｇの酵素粉末が得られた。
得られた酵素のアミラーゼ活性はpH9.０において８５０
単位であった。
実施例２ 実施例１に於て、培地成分を可溶性でんぷん0.5％、肉
エキス0.３％、ポリペプトン0.５％、リン酸二水素カリ
ウム0.１％、炭酸ナトリウム0.５％（pH9.５）とした以
外は、実施例１と同様にストレプトマイセス・エスピー
ＫＳＭ−９株を培養して得た培養液から酵素粉末を得
た。得られた酵素のアミラーゼ活性はpH9.０％において
７２０単位であった。
エキス0.３％、ポリペプトン0.５％、リン酸二水素カリ
ウム0.１％、炭酸ナトリウム0.５％（pH9.５）とした以
外は、実施例１と同様にストレプトマイセス・エスピー
ＫＳＭ−９株を培養して得た培養液から酵素粉末を得
た。得られた酵素のアミラーゼ活性はpH9.０％において
７２０単位であった。
第１図はＫＳＭ−９株アミラーゼの至適pHを示す図面、
第２図は同安定pH範囲を示す図面、第３図は同至適温度
を示す図面、第４図は同熱安定性を示す図面である。
第２図は同安定pH範囲を示す図面、第３図は同至適温度
を示す図面、第４図は同熱安定性を示す図面である。
Claims (2)
- 【請求項１】ストレプトマイセス属に属するアルカリ性
アミラーゼ生産菌を培養して培地中にアルカリ性アミラ
ーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
るアルカリ性アミラーゼの製造法。 - 【請求項２】ストレプトマイセス属に属するアルカリ性
アミラーゼ生産菌がストレプトマイセス・エスピー（St
reptomyces sp.）ＫＳＭ−９（微工研菌寄第７６２０
号）である特許請求の範囲第１項記載のアルカリ性アミ
ラーゼ製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5149285A JPH067793B2 (ja) | 1985-03-14 | 1985-03-14 | アルカリ性アミラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5149285A JPH067793B2 (ja) | 1985-03-14 | 1985-03-14 | アルカリ性アミラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61209588A JPS61209588A (ja) | 1986-09-17 |
| JPH067793B2 true JPH067793B2 (ja) | 1994-02-02 |
Family
ID=12888464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5149285A Expired - Fee Related JPH067793B2 (ja) | 1985-03-14 | 1985-03-14 | アルカリ性アミラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH067793B2 (ja) |
-
1985
- 1985-03-14 JP JP5149285A patent/JPH067793B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61209588A (ja) | 1986-09-17 |
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