JPS6017510B2 - 術生物によるエステル結合加水分解酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるェステル結合加水分解酵素の製造
法に関し、より詳しくは／カルディア属に属し、ェステ
ル結合加水分解酵素生産能を有する微生物を培養し、培
地中に該酵素を産生せしめこれを採取するものである。

近年、化学工業の進展に伴なし、天然由来のェステル結
合含有物質とは構造的に異なる例えばフタル酸ェステル
等のような合成化学ェステル結合物質の生産量が増大し
ている。しかしながら従釆の天然油脂に作用するりパー
ゼやェステラーゼではおのづから限界があり、合成ェス
テル系に対してか作用しないか又は作用が認められても
微弱なものが多い。

そこで、本発明者らは天然ェステル系から合成ェステル
系にわたり強力に作用するェステル加水分解酵素生産能
を有する微生物を自然界より検索を行なったところ、ノ
カルディア属に属する菌株が菌体外に生産することを見
出し本発明を完成させたものである。

すなわち、ノカルデイア属に属し、ェステル結合加水分
解酵素生産館を有する微生物を培養し、培地中に該酵素
を産出せしめ、これを採取することを特徴とする微生物
によるェステル結合加水分解酵素の製造法に関するもの
である。

以下、本発明を具体的に説明する。

今回、新たに自然界より分離した菌株の菌学的性質は次
のとおりである。

菌学的性質 グラム染色 ＋運動性
−コロニーブショ
ン培地色 ピンクの入った白色クリーム光
沢 湿光沢形
なめらか、円形Ｒ一培地【３１
なめらか、円形Ｐ−培地｛４ー
〃べん毛
なし細胞壁中のアミノ酸〆ゾージアミノピメリン
酸 十ＬＬ−ジアミノピメリン酸細胞分裂
状態 フラグメンテーション好気性下生育
十カタラーゼ
＋オキシターゼ菌体外ＤＮアーゼ
＋ウレアーゼ
十セルラーゼＣ一Ｆテスト
０ ゼラチン液化 硝化還元 ナイトレイト塔地 コハコ酸−ナイトレィト培地 ＋硝酸呼
吸抗酸性 リトマスミルク アルカリリゾチーム耐
性 ＋カゼイン分解デキスト
リン分解 ｎ−ヘキサデカン資化性 十有機酸
資化性酢酸 十ク
エン酸 ＋ギ酸
＋乳酸
＋オキザロ酢酸
十コハク酸 十糖より酸の
生成 Ｄーアラビノース エリスリトール Ｄーフラクトース 十Ｄーガラスト
ース グルコース ＋イノシト
ー′レラクトース マニトール 十ラフイノー
スＬーラムノース Ｌ−ソルボース シユークロース トレ／・ロース Ｄーキシロース 以上の菌学的性質からバージェ・マニアル（技ｒ期Ｍａ
ｎｎ雌１）第８版によりノカルディァェリスロポレス（
Ｎｏｃａｒｄｉａｅｒ〆ｍｏｐｏｌｉｓ）ＫＲ一Ｓ−１
と命名し徴工研菌寄第３５３ぴ号として寄託されている
。

次に、本菌株により生産される酵素の理化学的性質は次
のとおりである。

■ 作用 該物質のェステル結合部位に作用し、加水分解反応を行
わせしめ、該物質の酸を生成する。

■ 基質特異性各フタル酸ェステルをイオン強度０．０
５の由８．０のトリスー塩酸緩衝液に加えたものを２．
５容量に０．５％塩化カルシウムを含む同緩衝液０．５
容量を更に精製酵素液（トリス−塩酸緩衝液（トリス−
塩化緩衝液ｐＨ８．０１＝０．０５）２容量をＬ字管に
とり、３０℃にて振函させ酵素反応を行わせしめ、一定
時間後に酵素活性測定法に従って、ガスクロマトグラフ
ィ一によって消失基質量を、アルカリ適定（０．０則Ｋ
ＯＨ）により鼓生成量を測定し、酵素活性を測定した。

なお、各フタル酸ェステルの基質最終濃度は２５０■血
である。この結果、本酵素はｎ−アルキル型、枝分れ型
、グラィコール型、オキシ型、フェニル型、二重結合型
及びメタ型のすべてのフタル酸ェステルに効率良く作用
し、そのェステル結合を加水分解することが判明した。
更に詳しく記述するとｎーアルキル型では、ＤＭＰ（ジ
メチルフタレート）、ＤＥＰ（ジエチルフタレート）、
ＤＴＰ（ジーｎ−プロピルフタレート）、Ｄ脂Ｐ（ジー
ｎ−ブチルフタレート）、ＤｎＡＭ円（ジーｎ−アミル
フタレート）、ＯＨＰ（ジーベプチルフタレート）、Ｄ
ｎＯＰ（ジーｎ−オクチルフタレート）、ＤＮＰ（ジー
ノニルフタレート）、ＤＤＰ（ジードデシルフタート）
及びＤＴＤＰ（ジートリデシルフタレート）に、枝分れ
型ではイソアルキルタイプのＤＩＰＰ（ジ−イソプロピ
ルフタレ−ト）、ＤＩＢＰ（ジーイソブチルフタレート
）、ＤＩＤＰ（ジ−イソデシルフタレート）に２−エチ
ルタイプではＤＥＨＰ（ジー２−エチルヘキシルフタレ
ート：通称ＤＯＰ）、ＤＥＨＨＰ（ジー２−エチルヘキ
シルヘキサハイドロフタレート）に作用し、グラィコー
ル型ではＭＰＥＧ（メチルフタリルエチルグリコレート
）、ＥＰＥＧ（エチルフタリルエチルグリコレート）、
ＢＰＢＧ（ブチルフタリルブチルグリコレート）に作用
する。また、オキシ型ではＤＭＥＰ（ジー２−メソキシ
エチルフタレート）ＤＢＥＰ（ジー２ーブリキシエチル
フタレート）に作用し、フェニル型ではＢＢＰ（ジープ
チルベンジルフタレート、）、ＤＰｅＰ（ジーフエニル
フタレート）、ＤＣＨＰ（ジーシクロヘキシルフタレー
ト）に作用し、二重結合型ではＤＡＬＰ（ジーアリルフ
タレート）に、メタ型ではＤＭ花（ジ−メチルィソフタ
レート）に作用し、上述のように現在入手可能なすべて
のフタル酸ェステルに本酵素は作用し、そのェステル結
合を加水分解することが判明した。

これらフタル酸ェステルのうちＤＥＨＰ、ＤＢＰ、Ｄｎ
ＯＰ、Ｄ田Ｐ、ＢＰＢＧには非常に良く働きその活性は
高かった。次に、フタル酸ェステル類の代りに、基質を
未然由来の一般的なオリーブオイル及びトリブチリンに
代えて本酵素反応を行わせたところ、相対酵素活性値は
ＤＥＨＰを１００とするとオリーブオイルで約１７０、
トリブチリンで約２６０という値を示したように本酵素
は、フタル酸ェステル以外にもェステル結合を持つ一般
的な物質にも非常に良く作用することが分かった。

以上の結果を要約すると本酵素は、すべてのフタル酸ヱ
ステルのみではなくオリーブオイル等の一般的な天然油
脂にも良く作用し、ェステル結合を加水分解することが
判明した。

■ 至遜ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 代表的な基質であるＤＥＨＰ（ジ−２−エチルヘキシル
フタレート）を最終濃度２５０■風となるように０．１
％塩化カルシウムを含む各緩衝液（イオン強度０．０５
）に加え、酸素液（脱イオン水中）と容量比で酵素液１
に対して３客を混合し、酵素反応を３０００で行わせ、
酵素活性を測定し、至適ｐＨを求めた。

なお、用いた緩衝液はｐＨ５はコハク酸緩衝液、ｐＨ６
、６．０７．０、７．６はリン酸緩衝液、ｐＨ８、８．
６、９、９．６はトリス−塩酸緩衝液、ｐＨＩＯは炭酸
緩衝液である。この結果、最適（至通）作用ｐＨは８．
６であった。また、本酵素はｐＨ１Ｏにおいても５０％
近くの活性を示した。次にｐＨ安定曲こおいては至適ｐ
Ｈで示した各緩衝液に精製酵素を加えた後、一昼夜４℃
にて静直後、常法に従ってｐＨを８．６に戻して酵素活
性を測定した。この結果、本酵素はｐＨ６．５〜８にお
いて安定であったが、ＰＨ５以下になるとその活性は４
０％程度に低減し、またｐＨ８．６では８５％位の残存
活性を示すが、ｐＨＩ０を超えると４０％に低減した。
■ 作用温度の範囲至通及び安定ｐＨであるｐＨ８．０
、トリスー塩酸緩衝液にて常法に従って酵素活性を測定
した。

なお用いた温度は２０ｑｏ、３０ｏｏ、３７０、４２０
、５０℃、６０℃、７０ｑｏである。この結果、最適作
用温度は４２０であり、作用温度としては３０ｑｏ〜４
が０であり、２０℃および５０ｏｏにおいても本酵素は
８０％近い活性を、６０つ０においても７０％近い活性
を示した。■ ｐＨ、温度などによる失活の条件 ｐＨによる失活の条件については、■の安定ｐＨ範囲に
も記したようにｐＨ５以下になるとその活性は一昼夜放
置後で４０％程度に、またｐＨＩ０を超えると同様に４
０％に低下し失活する。

また、温度による失活は、至通及び安定ｐＨを考え、ｐ
Ｈ８．０トリス−塩酸緩衝液下で酵素を各温度（２０℃
、３０ｑｏ、３６ｏｏ、４２０、５０℃、６０００及び
７０００）にて３０分処理後、作用温度３０℃に直ちに
戻して常法に従い酵素活性を測定した。この結果、本酵
素は３６００以下では完全に安定であるが、４がｏを超
えると失活をはじめ、５０ｑｏを超えると急速な失活が
みられ、７０ｑ０３０分処理で本酵素は完全に失活する
。■ 阻害、活性化及び安定化 精製酵素液に各種阻害剤、活性化剤等を最終濃度が１×
１０‐４Ｍこなるように添加した後、基質ＤＥＨＰ（ジ
ー２−エチルヘキシルフタレ−ト）を最終濃度２５０の
肌‘こなるように加え、常法通り酵素反応を行わせしめ
て阻害及び活性化効果を調べた。

その結果、本酵素はＣａイオンにより活性されることが
判明した。しかしながらカドミウム、水銀、ヒ素により
阻害を受ける。次に、最終濃度１×１０‐４Ｍのカルシ
ウムイオンを含むイオン強度０．０即日８．０のトリス
ー塩酸緩衝液にコール酸の代表的なものとしてタゥロコ
レートを最終濃度０．０２５％になるように添加する。
その後、基質ＤＥＨＰを最終濃度５００の肌こなるよう
に加え、さらに精製酵素を加えて酵素反応を行わせた。
その結果、酵素反応系にコ−ル酸（その代表的なものと
してはタウロコレート）を入れると酵素活性力価が増大
する。■ 精製方法 培養液に０．７５飽和硫安塩折を行い、次いでＤｅ幻ａ
ｎＴ５００一Ｐ．Ｅ．○．（ポリエチレングライコール
６０００系にて水性二層分配法を行い本酵素をＤｅ丸ｒ
ａｎ層に分配させる。

その後、ＤＥＡＥ−セフアデックスＡ−５０（ファーマ
シア社製）に本酵素を吸着（イオン強度０．０５ｐＨ６
．８、リン酸緩衝液）させた後、同緩衝液に０．８ＭＮ
ａＣＩを添加し、グラジェント溶出をかけ本酵素活性画
分を集め、次いでセフアデックスＧ−１００（ファーマ
シア製）を用いてゲル炉過を行い精製酵素を得た。■
分子量 セフフアデックスＧ−１００を用いたゲル炉過法により
分子量を求めたところ約１５０００であった。

■ ディスク電気泳動法による易動度 ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９．４ゲル）を用いて、
ディスク電気泳動法を常法に従って行ったところ、図１
に示す如く本酵素はディスク電気泳動的に均一であり、
その易動度は であった。

■ 本酵素作用の特色 ェステル結合の片側にベンゼン核のようなものがついて
いるような合成ェステルと植物油脂等で代表される天然
ェステルでは構造的に違いがある。

そこで、本発明者らは、本発明のェステル加水分解酵素
と従来のヱステル加水分解酵素との比較検討を行った。
従来のものとしては微生物酵素として有名なりゾップス
・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｄｅｉｍａｒ）由来のリ
パーゼ（生化学工業製）及び動物由来酵素として豚すし
、臓リパーゼ（シグマ社製）を用いた。比較検討試験法
としては、まず、基質にオリーブオイルを用いて常法通
りリパーゼ活性を測定し、３種の酵素の単位の上当りの
ＩＪパーゼ活性をそろえた。

このようにしてリパーゼ活性をそろえた３種の酵素液に
「合成ェステルの代表としてフタル酸ェステルのうち最
汎用のＤＥＨＰ（ジー２−工チルヘキシルフタレート：
通称００Ｐ）を最終濃度５０００脚になるように添加し
、３種の酵素のＤＥＨＰェステル加水分解度を測定した
。この結果、リパーゼ活性当りのＤＥＨＰェステル加水
分解度の割合は本酵素を１とすると、従釆の市販のェス
テル加水分解酵素であるリパーゼは、いずれも０．０部
付近であった。また、酵素反応生成物として、本酵素は
フタル酸を非常に高率で得たのに対して、従来市販酵素
では極端に低かった。以上の結果より、本酵素と従来の
一般的なェステル加水分解酵素（微生物由釆、動物由釆
）とは、ェステル結合の片側が芳香族、例えばフタル酸
ェステルのような基質に対する作用は大きく違っている
ことより、本酵素は従来型の酵素とは違う新規ェステル
加水分解酵素である。

本菌の培養は、通常の炭素源、窒素源を含有する培地で
あれば、液体倍養、固体培養のいずれの方法でも採用さ
れるが、本酵素をより効率的に生産せしめるためには、
各種の栄養源が有効であるが、特にェステル結合を持つ
化合物を添加することにより酵素の生産量を著しく増大
できる。このヱステル化合物は、その化学構造は問わな
く、合成ェステルの代表例として、フタル酸ェステルが
、天然ェステルの代表例としてオリーブオイル、トリブ
チリン等が挙げられる。また本物質の添加は主炭素源と
して用いてもよく、さらに補助炭素源として用いてもよ
い。ェステル化合物が添加されていないような培地では
大豆カスの添加は有効である。

その添加量は０．０１％〜０．５％位いが適当である。
本酵素は菌体内外に産生されるが、培養終了後の本酵素
の回収は、培養液からの方が容易である。

詳細に記すと、まず培養液より培養菌体を遠心または炉
過等により分けた後、該培養液より０．７５飽和硫安塩
析を行い酵素蛋白を回収する。この回収酵素蛋白を前記
■の精製方法に従って精製すると精製酵素標品を得るこ
とができる。本酵素はェステル結合を加水分解するェス
テル加水分解酵素であり、一般的なりパーゼ（ェステラ
ーゼ）の基質であるオリーブオイルやトリブチリンを通
常の反応条件下にて良く加水分解し、なおかつ、フタル
酸ェステルに代表されるような合成ェステルにも良く作
用する。このフタル酸ェステルのェステル加水分解にお
いて、フタル酸ェステルには２つのェステル結合が存在
するが、本酵素によるェステル加水分解が片方で止まる
のではなく、もう片方のェステル結合のよく作用をうけ
る。換言すれば、本酵素の基質をフタ酸ェステルにする
と、その酵素反応生成物としては、フタル酸モノェステ
ルに止まることなくすみやかにフタル酸が検出されてく
る。以上のことよりも、本酵素はジェステル加水分解型
酵素としての特徴を持つている。さらに、ェステル結合
の片側が芳香族、例えばフタル酸ェステルのような物質
に対して、一般的な従来のリパーゼはほとんど作用しな
いのに対して、本酵素の作用力は大きく、かつ、前述の
如く両ェステル結合をすみやかに加水分解することより
、本酵素は従釆型のりパーゼ（ヱステラーゼを含む）と
は異つた新規ェステル加水分解酵素と考えられる。

次に本酵素の一般的な作用形式を記すと、ＲＣＯＯＲ′
→ＲＣＯＯＨ＋Ｒ′ＯＨ となり、基質がフタル酸ヱステルの場合にはとなる。

従って、本酵素の基質特異性は広範囲にわたっており、
ｎーアルキル型、フェニル型、二重結合型、メタ型等の
すべてのフタル酸ェステルに作用するにとどまらず、フ
タル酸ェステル以外にも、オ′リーブオィル、トリプチ
リンで代表されるように、ェステル結合を持つ一般的な
ェステル化合物であればなんでもよい。次に本酵素によ
ってェステル化合物を効率的にェステル加水分解させる
ためには、温度は２ぴ○〜５０ｑｏで、好ましくは２５
〜４５ｑｏで、ｐＨ５〜１政庁ましくは６．５〜９に保
持することが望ましい。

なお、各定量法は次の方法により行った。ｏ本酵素活性
の定量法： ガスクロマトグラフィ‐（ＦＩＤ）による基質消失量ま
たはＫＯＨ（０．０印）を用いたアルカリ適定による酸
生成量を指標とした。

なお、本酵素活性の１ユニットは１分間当りの１山ｍｏ
ｌｅの酸生成量に換算して求めた。また基質は代表的な
基質としてフタル酸ェステルのうちでも最汎用されてい
るＤＥＨＰ（ジー２−エチルヘキシルフタレート）を用
い、濃度は通常最終濃度で２５００皿とした。特に、記
載しない場合はイオン強度０．０５、ｐＨ８．０のトリ
スー塩酸緩衝液（塩化カルシウム０．０００１Ｍを含む
）を用い反応温度は３ぴ０にて行った。用いたガスクロ
マトグラフィ‐は島津製ＧＣ−私型であり検出方法はＦ
ＩＤ方式により、用いたカラムはＳｉｌｉｃｏｎｅＯＶ
−１７（カラム温度２２０ｑｏ）である。以下、実施例
により本発明をより具体的に詳述する。実施例 １ ジ−２ーエチルヘキシルフタレート（ＤＥＨＰ）０．５
％、硫安０．１％、リン酸１ーカリ０．０２％、リン酸
２ーカリ０．１６％、硫酸マグネシウム０．０２％、塩
化カルシウム０．０１％、食塩０．０１％、硫酸鉄０．
０００１％、モリブデン酸ソーダ０．０００５％、硫酸
マンガン０．０００５％、タングステン酸ソーダ０．０
００５％、パントテン酸カルシウム０．０００４％、ィ
ノシトール０．０００２％、ニコチン０．０００４％、
Ｐ−アミノ安息香酸０．０００２％、ピリドキシ塩酸塩
０．０００４％、チアミン塩酸塩０．０００４％、リボ
フラビン０．０００４％、ピオチン０．０００００２％
、ビタミンＢ２０．００００００５％の組成からなるＤ
ＥＨＰ液体培地３夕を５そジャーファーメーターに入れ
、これに同じＤＥＨＰ寒天斜面培地（前記のＤＥＨＰ塔
地に寒天１．５％を加えたもの）で３日間前培養（３０
℃）したところのＮｏｃａｒｄｉａｅひ比ｒｏｐｏｌｉ
ｓＫＲ‐Ｓ−１（ＦＥＲＭ Ｐ‐３５３０）を１０白金
耳移植してｐＨを７〜８に調整しながら３０℃にて３日
間培養する。

３日間培養後、冷却遠心（１８０００多×３０分）を行
い培養液と培養菌体を得る。

培養菌体を培養液と同量のイオン強度０．０５ｐＨ７の
リン酸緩衝液（０．００１％塩化カルシウムを含む）に
再懸濁させ、酵素活性測定法に従って、酵素活性を測定
し、菌体内・外の酵素の存在比を求めた。結果を表１に
示す。表１ この結果より、本酵素は菌体内は勿論のこと、菌体外に
も分泌されることが認められた。

以下、精製及び利用のしやすさより菌体外に分泌される
酵素にて本研究を進めた。

実施例 ２ 実施例１にしたものと同じＤＥＨＰ完全合成液体培地に
大豆カス０．０１％を添加した後、実施例１と同じ培養
条件で同じくＮｏｃａｒｄｉａ ｅｒｙ比ｒｏｐｏｌｉ
ｓＫＲ−Ｓ−１（ＦＥＲＭＰ−３５３０）を移植して実
施例１と同様に菌を増殖させ、３日間の培養液の酵素活
性を測定した。

結果を表２に示す。表２ この結果より大豆カスを添加することにより培養液中の
酵素の生産量が増大することが明らかにななった。

実施例 ３ 実施例１に従って得られた培養液より本酵素の回収例を
示す。

培養液１００の‘よりまず冷却遠心機を用いて１８００
０夕、３船ふ間遠○をおこない培養上燈液と培養菌体を
分け、培養菌体を除去する。

しかる後、得られた該培養上燈液８５机上に硫安を少量
づつ添加溶解させ、硫安飽和度０．７５飽和にする。こ
の後２時間静層させ、再び冷却遠心機にて１００００夕
１５分遠心を行い、酵素蛋白沈澱画分を集める。この沈
澱画分を少量のリン酸緩衝液（イオン強度０．０５ｐＨ
７）に溶かし、同リン酸緩衝液にて一昼夜４℃にて透析
を行い硫安を除去する。こうして得られた透析内液（８
泌）に本酵素が存在し、回収できる。表３はこのように
して回収された本酵素と回収前の培養上燈液との酵素活
性、回収率、精製度を示す。表３実施例 ４ 積製酵素をイオン強度０．０５ｐＨ８．０のトリス塩酸
緩衝液に溶解し、蟹白吸光度（０．Ｄ．２８０）０．１
の精製酵素液を調整した。

本精製酵素液２．０の‘に０．０５％塩化カルシウムを
含んだ同トリス塩酸緩衝液０．５の【を加え、さらに同
トリス塩酸緩衝液にミセル状に分散させたＤＥＨＰ（ジ
ー２−エチルヘキシルフタレート）５００皿血液２．５
の【を加え、Ｌ字試験管内にて３０００（１観時間）に
て本酵素反応を行わせしめた結果を表４に示す。表４ 実施例 ５ イオン強度０．０５ｐＨ８．０のトリス−塩酸緩衝液２
．５泌に各基質を最終濃度２５０■血もこなるようにこ
れに、さりこ０．５の‘の同緩衝液（０．５％塩化カル
シウム）を加え、ついで同緩衝液に溶かした精製酵素液
２．０私を加えた後、３０ｑｏで酵素反応を行わせしめ
本酵素の基質特異性を測定した。

ＤＥＨＰ（ジー２ーエチルヘキシルフタレート）に対す
る活性を１００として表示したのが表５である。

この結果、本酵素はすべてのフタル酸ェステルに作用し
、又、天然由来にオリーブオイル等で代表される一般的
なステル結合をもつ油脂に作用することが明らかになっ
た。表 ５基質特異性

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ノカルデイア属に属し、エステル結合加水分解酵素
   生産能を有する微生物を培養し、培地中に該酵素を産生
   せしめ、これを採取することを特徴とする微生物による
   エステル結合加水分解酵素の製造法。