JPH08508639A

JPH08508639A - ボウベリア・バシアナおよびそれから誘導されるケトプロフェンエステルのエナンチオ選択的加水分解

Info

Publication number: JPH08508639A
Application number: JP6520268A
Authority: JP
Inventors: エル．ヒーフナー，ドナルド; エム．ゼップ，チャールズ
Original assignee: セプラコア，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-03-09
Filing date: 1994-03-08
Publication date: 1996-09-17
Also published as: US5457051A; WO1994020635A1; AU674945B2; AU6444494A; EP0689607A1; CA2157799A1

Abstract

(57)【要約】ラセミ体ケトプロフェンコリンエステルのエナンチオ選択的加水分解により実質的に純粋なＲ−ケトプロフェンを製造する方法が開示される。その方法は完全なボウベリア・バシアナ（Beauveria bassiana）菌糸またはそれから単離されたＲ−特異性エステル加水分解酵素を利用する。前記のエステル加水分解酵素は約１７，８００ダルトンの分子量およびＡla−Ｐro−Ａsp−Ｗ−Ｉle−Ｉle−Ｇln−Ｇly−Ｌeu−Ｓer−Ａrg−Ａla−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ｇln−ＡspのＮ−末端配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】ボウベリア・バシアナおよびそれから誘導されるケトプロフェンエステルのエナンチオ選択的加水分解発明の背景ケトプロフェンは現在ラセミ体混合物として入手できるα−メチルアリール酢酸鎮痛薬／抗炎症薬である。そのＳ−鏡像体は鎮痛薬としてＲ−鏡像体以上の利点を有すると従来信じられていたので、およびＳ−α−メチルアリール酢酸鎮痛薬／抗炎症薬は一般にそれらのＲ−対応物に優ると信じられているので、Ｓ−ケトプロフェンのエナンチオ選択的製造について広範な文献が存在する。発明者らは最近にＲ−ケトプロフェンが、鎮痛薬および解熱薬として従来価値を認められなかった若干の利点を持っていることを発見した。それ故に商業的規模でのＲ− ケトプロフェンのエナンチオ選択的製造方法はかなりの有用性と重要性を有する。Ｓ−ケトプロフェンを製造するためのラセミ体ケトプロフェンエステルのエナンチオ選択的加水分解は当業界に知られている。IriuchijimaとKeiyuはかなり古い報告において〔Agric. Biol．Chem. ４５，１３８９−１３９２（１９８１）〕、ミコバクテリウム・スメグマチス（Mycobacterium smegmatis）を用いて特定されない、低収率で３８％鏡像体過剰率（e.e.）のＳ−ケトプロフェンを得るラセミ体ケトプロフェンメチルエステルのやや低度に選択的な加水分解を発表した。Sihは（欧州特許出願第２２７０７８号）カンジダ・シリンドラセア（Candi da cylindracea）のエステル加水分解酵素を用いて特定されない収率で６０％ｅｅのＳ−ケトプロフェンへのラセミ体ケトプロフェンメチルエステルのさらに低度に選択的な加水分解を開示した。Cobbsら（米国特許第５，１０８，９１６号およびＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５１４６号）はその後カンジダ・ルゴサ（Ca ndida rugosa）（以前はカンジダ・シリンドラセアと呼ばれていた）からのエステル加水分解酵素によるラセミ体ケトプロフェンのアルキル、ハロアルキルおよびグリセリルエステルをより多く選択的な加水分解させて、２０から３０％までの変換率で非常に高い鏡像体過剰率のＳ−ケトプロフェンを得る方法を開示した。これはカンジダ・ルゴサからのエステル分解イソ酵素を精製して分離することにより達成された。Ｒ−ケトプロフェンを製造するためのラセミ体ケトプロフェンエステルのエナンチオ選択的加水分解は、低収率または低ｅｅではあるが、また報告されたことがある。IriuchijimaとKeiyuは（前掲書中に）、ケトプロフェンのメチルエステルはアスペルギリス・ソージェー（Aspergillis sojae）により「少し加水分解」されて発表されてないｅｅのＲ−ケトプロフェンを与えると報告した。Goswam i（ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１３１６３号）は、イヌ肝臓アセトン粉末により８％の変換率において７４％ｅｅのＲ−ケトプロフェンへのラセミ体ケトプロフェンメチルエステルの加水分解を開示した。これは、たといイヌの肝臓が安価な試薬であったとしても、Ｒ−ケトプロフェンのため商業的に有用な製造方法を提供するには余りにも非能率である。CobbsのＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５１４６号は、ブタ肝臓エスラーゼによりおよびムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）エステル加水分解酵素により４２より６４％までのｅｅでラセミ体のケトプロフェンエチレングリコールエステルのＲ−ケトプロフェンへの加水分解を開示しているようである。 Wuら〔J. Am. Chem. Soc．１１２，１９９０−１９９５（１９９０）〕はｅｅと変換度の両者を組合わせるエナンチオ選択反応の有用な尺度を定義した。それは鏡像異性体比Ｅと名づけられて、次のように定義される。上式中、ｅｅ_sは基質（この場合にラセミ体エステル）の鏡像異性体過剰率である。ｅｅ_pは生成物（この場合にＲ−酸）の鏡像異性体過剰率である。鏡像異性体過剰率は当業界において周知であり、次式のようにａｂ→ａ＋ｂの分割のために定義される。鏡像異性体過剰率はより古い用語「光学純度」に関係づけられるが、前記両者は共に同じ現象の尺度である。ｅｅの値は０より１００までの数になり、そして０はラセミ体であり、１００は純粋な、単一の鏡像異性体である。過去において９８％光学純度と呼ばれたような化合物は、今はより正確に９６％ｅｅと記述される。約８０％より小さいｅｅの生成物を得る方法は一般に商業上魅力的と見なされない。同様に商業的製法としては、目標はＥの値を最大にすることである。１０より小さいＥ値は望ましくない。Ｒ−ケトプロフェンを製造するためのGosw amiの方法は低いエナンチオ特異性、非常に低い変換率、この方法により計算された７より小さいＥの値を有する。Ｒ−ケトプロフェンのため商業的に有用な製造方法に対する要求が存在する。ある取り上げ方では、これは１０より大きいＥ値を有する方法によりＲ−ケトプロフェンを製造するためにラセミ体ケトプロフェンエステルをエナンチオ選択的加水分解する方法に対する要求に帰する。選択的加水分解によりＲ−ケトプロフェンを製造することは第２の考え、すなわち、それからＲ−ケトプロフェンを製造するエステル、の考えを生じさせる。ケトプロフェンのアルキルエステルは水に不溶であり、そして一般に商業的酵素加水分解のためにはむかない基質である。なぜならば、多相の／不均一の反応系は工業的規模では多くの欠点から不利を招く。例えば、規模拡大および信頼性の問題はしばしば分散液および乳濁液の加工に結びつけられ、また連続運転とpH制御（特に加水分解反応において）は達成することが困難であるからである。その上、それらの相は製品を回収することができる前に分離されなければならないし、過剰の相間物質移動としばしば遭遇する。これらは水相中に難溶性の基質の拡散と結びつけられる。不均一反応系におけるキラルカルボン酸エステルの水に難溶性のエステルを酵素分割することに結びつけられるこれらの不利益の多くは、もしエステル誘導体の水溶性を実質的に増加させることができたならば、最小化されるかまたは除去されることができた。一つの近づく道は、例えばCobbのＰＣＴ出願に見られるように、溶液ブロスに界面活性剤を添加することである。これは殆ど利益を与えないように見える。第２の近づく道は水溶性エステルの使用である。この方法の一例をDoddsらの欧州特許出願第４６１０４３号明細書に見出すことができる。そこではケトプロフェンのコリンエステルの製造およびプロテアーゼにより非常に低いｅｅでＲ−ケトプロフェンエチルエステルへのそのエステル転移反応が記載されている（Dodds の出願明細書における例１８と２０は、エステル転移反応生成物はそれぞれ−０．１６６°と−０．２０３°の旋光度を有していた。純粋なＲ−ケトプロフェンエチルエステルは報告された条件下では−４５．５°の旋光度を有する。）本発明の第一の目的はＲ−ケトプロフェンのための商業的に有用な製造方法を提供することであるから、エナンチオ選択的に加水分解されることのできる水溶性エステルの高い効率の合成法が必要である。次にそのエステルのエナンチオ選択的加水分解が必要である。発明の要約本発明の目的はＲ−ケトプロフェンのための商業的に有用な製造方法を提供することである。さらに一つの目的はラセミ体ケトプロフェンエステルのエナンチオ選択的加水分解のための方法を提供することであり、そしてその方法は、前記のように、１０よりも大きいＥ値を有することである。さらにもう一つの目的は、コリンエステルを経由してラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンのエナンチオ選択的合成法を提供することである。これらのおよびその他の目的、特徴および利点は本発明において実現されるが、本発明は一態様において、ケトプロフェンコリンエステル鏡像異性体混合物の水溶液とボウベリア・バシアナ（Beauveria bassiana）種の微生物とpH４．０からpH８．０までにおいて、および１０°から４０℃までの温度において、接触させることから成る、Ｓ−ケトプロフェンコリンエステルの存在において優先的にＲ −ケトプロフェンコリンエステルを加水分解する方法に関する。好ましくはボウベリア・バシアナは菌株ＡＴＣＣ４４８６０、３８６５７および７１５９から選択され、最も好ましくは菌株ＡＴＣＣ４４８６０である。温度は好ましくは約２５℃であり、そしてpHは５．５から６．５までに維持されることが好ましい。前記の水溶液はさらにボウベリア・バシアナのための栄養源を含むことがある。他の一態様において、本発明は、Ｒ−ケトプロフェンのコリンエステルをボウベリア・バシアナ種の微生物に、好ましくはpH５．５よりpH６．５までにおいておよび約２５℃において露出させることから成るＲ−ケトプロフェンを製造する方法に関する。そのボウベリア・バシアナは菌種４４８６０、３８６５７および７１５９から選択されることができる。さらにもう一つの態様において、本発明は（a）ラセミ体ケトプロフェンを適当な前駆体と反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを製造すること、（b）前記ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中でボウベリア・バシアナ種の真菌と共に処理してＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルの存在で優先的にＲ−ケトプロフエンを製造すること、および（c）ラセミ体ケトプロフェンコリンエステルとＳ−ケトプロフェンコリンエステルからＲ−ケトプロフェンを単離すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンを得る方法に関する。特に好ましい実施態様において、ラセミ体ケトプロフェンは活性化剤、例えば塩化チオニル、と反応させられて活性化されたケトプロフェンを与え、それから後者はコリンと反応させられてラセミ体コリンエステルを生成する。他の一つの実施態様においてラセミ体ケトプロフェンはＮ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンと反応させられ、それは次にメチル化剤によりコリンエステルに第四級化される。他の一つの好ましい実施態様においては、ボウベリア・バシアナ種の真菌からのエステル加水分解酵素が真菌それ自身の代りに使用される。さらにもう一つの態様において、（a）ラセミ体ケトプロフェンを活性化剤と反応させて活性化されたケトプロフェンを与えること、（b）活性化されたケトプロフェンをコリンと反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを与えること、（c）ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中でボウベリア・バシアナ種の真菌と共に処理して本質的にＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルとＲ−ケトプロフェンから成る混合物を製造すること、（d）Ｒ−ケトプロフェンをＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから分離すること、および（e）Ｓ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルを加水分解すること、によりラセミ体ケトプロフェンからＳ−濃縮されたケトプロフェンを得るために同じ方法を使用することができる。Ｓ−濃縮されたとは、そのエステルまたは酸がラセミ体（すなわち、鏡像異性体の５０：５０混合物）ではなくて、むしろＳ−鏡像異性体の過剰がある（すなわち、ｅｅ_{S-ケトフ゜ロフェン}＞１０）ことを意味する。さらにもう一つの態様において本発明は、Ｓ−ケトプロフェンコリンエステルの存在でＲ−ケトプロフェンコリンエステルを優先的に加水分解する方法に関し、その方法は前記のＲ−ケトプロフェンコリンエステルの水溶液をボウベリア・バシアナのエステル加水分解酵素とpH４．０からpH８．０で１０°から４０℃の温度で接触させることから成る。ボウベリアエステル分解酵素は約１７，８００ダルトン、またはその倍数、の分子量を有し、トリプトファンとシステインを除いて、Ａla−Ｐro−Ａsp−Ｗ−Ｉle−Ｉle−Ｇln−Ｇly−Ｌeu−Ｓer−Ａrg−Ａ la−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ｇln−Ａsp−のＮ−末端配列および−Ｐhe−Ａla−Ｉle− Ａsn−Ａsn−Ｇln−Ｌeu−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｔhr−Ａla−Ｙ−Ｔhr−Ｔyr−Ｖ al−Ｖal−Ｌys−および−Ｌeu−Ｉle−Ａla−Ｔyr−Ｐro−Ａla−Ｔyr−Ａsn− Ａsp−Ｇlu−Ｚ−Ａla−Ａla−Ｇly−Ａsn−Ｖal−Ｐro−Ａsp−Ｌys−（前式中Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺは確認できないアミノ酸を表わす）の内部配列を有する。「〜と接触させる」および「〜に露出させる」という用語は、基質とボウベリアエステル加水分解酵素が溶液中で伝統的な反応物がいっしょにされるようにばかりでなく、カラムを通る浸出または下記に述べるように膜上の循環によっても、または、確かに、基質と水との間の反応をボウベリアエステル分解酵素の参加を通して強化させるすべての手段によってもいっしょにされることができるということを示す。さらにもう一つの態様において本発明は、（a）ボウベリア・バシアナの多数の砕かれた細胞を水性緩衝液によりpH６．５で抽出すること、（b）その緩衝液を濾過または遠心分離して水性濾液または上澄液中に不純なエステル加水分解酵素を回収すること、および（c）上澄液を弱塩基性の陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂、と接触させてエステル加水分解酵素の水溶液を製造すること、その際エステル加水分解酵素は溶液中のタンパク質のミリグラム当り１００単位より大きい活性を有しかつラセミ体ケトプロフェンコリンエステルを９０％より大きいｅｅでＲ−ケトプロフェンに加水分解することができること、から成る方法により製造されたタンパク質のミリグラム当り１００単位より大きい活性を有するエステル加水分解酵素に関する。酵素活性の１単位は、毎時１ナノモルのケトプロフェンニトロフェニルエステルの加水分解を触媒する酵素の量として定義されている。エステル加水分解酵素は上記の構造的要素を有し、かつ１７，８００ダルトンのモノマーがサブユニットであるオリゴマーとして存在することができよう。発明の詳細な説明本発明はラセミ体ケトプロフェンエステルを選択的に加水分解してＲ−ケトプロフェンを得る方法に関する。３００より多い微生物種から７８が、それらのラセミ体ケトプロフェンメチルエステルを不確定のキラリティーのケトプロフェンに加水分解する能力について大規模なスクリーニングプログラムにより選択された。前記メチルエステルは初めのスクリーニングのために選ばれたが、それはその入手の容易さと初めのスクリーニングのためのその適性のためであって、初めのスクリーニングにおいては不溶の物質（エステル）の可溶性の物質（酸）への変換が有利であるからである。それは商業的製法のためには、下記に論ぜられるように、最適のエステルではない。水溶性の乏しいエステル（例えばケトプロフェンメチルエステル）を水溶性のかなり高い酸の塩（例えばケトプロフェン塩）に変換することのできる微生物を選択する特に速やかなかつ有効な方法は変換によりもたらされる溶解度の変化の利益を享受する。従って、ある水性媒体、例えばアガロース、の中の前記エステルの懸濁液は微生物の単数または複数のコロニーに接触させられ、そして初めに不透明な媒体はコロニーの周辺に半透明または透明な形跡を認められる。貧溶性の前駆物質を含む水性媒体中に透明を生じさせるコロニーがその際選択されて標準的な微生物学的技術を用いて大量培養される。微生物を選択する手順は次の順序に従う。（a）ある基質上で水性媒体中に多数の微生物コロニーを培養すること。特に好ましい媒体はブレーン・ハート・インフュージョン（ＢＨＩ）であり、そして特に好ましい基質はプレート上に塗被された寒天である。（b）コロニーを不透明な水性媒体、好ましくはリン酸塩緩衝液でpH７．０に緩衝され、エステルを懸濁して含むアガロース、で被覆すること。微生物はエステル層の下で増殖を続けさせられる。および（c）その上で不透明媒体が透明になったコロニーの初めの選択をすること。これは一次選択を構成する。７８の選択された菌株は次に液状媒体中で定常期まで増殖させられ、次いでラセミ体ケトプロフェンメチルエステルと共にＢＨＩ媒体中で４８時間、２５℃ において培養された。この期間の終りに試料を採取して、キラルＨＰＬＣ（Chir acel OJ column，Daicel Chemical Industries，日本）により分析した。７８の菌株から、２株が、Ｒ−ケトプロフェンのために有望と思われたので、選択された。シュードモナスsp．１４６９６およびボウベリア・バシアナＡＴＣＣ４４８６０は優先的にＲ−メチルエステルを加水分解した。ボウベリアにより得られたＲ−酸のｅｅ％は７８．８％であったが、シュードモナスsp．ＡＴＣＣ１４６９６はより高い選択性を示した（エステルの酸への４０％変換において、生成したＲ−酸は８５％のｅｅ値を有していた）。光学的に濃縮されたＳ−酸もまたこの反応から最初に濃縮されたＳ−エステルを単離し、その次にそのＳ−エステルをＳ−酸に加水分解することにより回収することができる。アルキルエステルの溶解度が前記に論じられたような欠点を生じさせるので、塩素エステルが検討された。初めに塩素エステルの合成にはDodds（前記引用）の出願方法が適用された。この合成は従来通りに酸塩化物を生成する酸の反応、第三級アミンエステルを形成するためのＮ，Ｎ−ジメチルエタノールアミンとの反応、および次にジメチル硫酸エステル、ヨウ化メチルまたは塩化メチルとのコリンメチルスルファート、ヨウ化物または塩化物を製造するための第四級化、により進行した。一つの改良された合成法が次に述べられる。２５０mLの三つ口丸底フラスコを適当な加熱用マントルの中に置き、濃縮器とかくはん機の付いた２５mLのディーン・スターク（Dean-Stark）トラップを取り付けた。そのフラスコに２５．４ｇ（０．１モル）のラセミ体ケトプロフェン、７．５mLの９７％塩化チオニル（０．１モル）、２滴のジメチルホルムアミドおよび５０mLのトルエンを仕込んだ。ディーン・スタークトラップにはまたトルエンを容量一杯に充填した。反応物を加熱して還流させ、ゆるやかな速度で攪拌した。１時間の還流の後、１４．５ｇの塩化コリン（０．１１モル）を固体のまま１回に加え、そして反応物を続けて還流させた。塩化コリンは反応において消耗してしまうまで固体のまま留まっているように見えた。塩化コリンの添加後約２０分に、反応物は激しく発泡し始めた。この時点で攪拌速度を最低に減じ、加熱を還流温度の丁度下にまで弱めた。第二相は油（エステル生成物）のように見え、そしてトルエンに不溶であった。反応物を低い温度で攪拌し続けた。１４時間後に、エステル層の試料を水に溶解してから、Ｃ−１８ＨＰＬＣにより分析した。エステルの分析は９２％のエステルおよび８％の酸を示した。その後の実験は、コリンを使用前に周到に乾燥させることによりエステルの収率を９８％以上に増加させた。前記の例において活性化剤は塩化チオニルであり、そして活性化されたケトプロフェンは酸塩化物であった。化学業界において周知の、その他の活性化剤が塩化チオニルの代りに使用されてもよい。従って、例えば、Ｏ−アシルイソウレアはカルボジイミドから製造されることができるし、アジドはヒドラジドから製造されることができるなどである。コリンエステルの物理的性質はメチルエステルのそれと異なるから、結果を一つから他へと外挿することは賢明でない。それ故、メチルエステルに対する以前の選別からの最も選択性のある微生物はコリンエステルに対する加水分解選択性について再検査された。ボウベリア・バシアナはＲ−コリンエステルに対する高度に特定的な加水分解選択性を示した。その他の微生物はどれもそれほど選択的でなかった。ケトプロフェンコリンエステルのメチルスルファートおよびヨウ化物塩のボウベリア・バシアナによる加水分解が検査された。３０mLのボウベリア・バシアナＡＴＣＣ４４８６０の定常期培養株（ＢＨＩ媒体、pH７．０）に２５℃で、メチルスルファートまたはヨウ化物塩のいずれかのラセミ体コリンエステル１ｇを加えて、培養を振とうしながら続けた。指示された時に試料を採取して、Ｒ−酸とＳ−エステルについて分析した。それらの結果を表１に示す。ヨウ化物塩の若干高いｅｅとより良いＥ値はその塩自体の効果よりむしろ、ヨウ化物塩中のコリンエステルの比較的高い初期純度に関係づけられるようである。大規模反応においては、３Ｌの定常期ボウベリア・バシアナＡＴＣＣ４４８６０はラセミ体ケトプロフエンコリンエステルメチルスルファート塩を初期速度１４．３ｇ／Ｌ／日で加水分解した。４日後残りのＳ−エステルは９０％ｅｅ以上であった。Ｒ−酸とＳ−酸の両者共に容易に結晶化されて（分割剤、すなわち、キラルアミンの使用なしで）、もし出発原料が９０％ｅｅ以上であるならば、９８％以上になることができるので、この加水分解により得られる濃縮水準は光学的に純粋のＲ−およびＳ−ケトプロフェンへの直接径路を表わす。３００mLの定常期ボウベリア・バシアナＡＴＣＣ４４８６０を、２５ｇのダイズ粉と１００mLのオリーブ油を補充された３Ｌのブレイン・ハート・インフュージョン媒体の中で培養した。培養種は２５℃に保温されかつpH６．１に緩衝され、７日間攪拌されて、その時に１６０ｇのラセミ体ケトプロフェンコリンエステルメチルスルファート塩が加えられた。指示された時に試料が採取されて、キラルＨＰＬＣによりＲ−酸およびＳ−エステルについて分析された。時間の関数としての反応の進行が表２に示されている。ボウベリア・バシアナＡＴＣＣ４４８６０の菌糸がケトプロフェンコリンエステルのＲ−エステルを立体特異性的に加水分解することを例示する他の一つの例を表３に示す。この実験において６０mLの定常期培養菌からの細胞が収集されて、５ｇのコリンエステルのヨウ化物塩を含む２５mLの２Ｘブレイン・ハート・インフュージョン媒体の中に懸濁させられた。３３．９％変換の後、９３．６％ｅｅのＲ−酸が存在した。特に６日目に５４．７のＥ値が示されたことは注目に値する。Ｒ−特異性のケトプロフェンエステル加水分解酵素はボウベリアに見出される多くの酵素の一つに過ぎない。真菌は非常に立体特異性のエステル加水分解酵素を含むばかりでなく比較的選択性の小さい酵素をも含むこと、および完全な微生物と共に観察される選択性は数種の異なる酵素活性の平均値であり得ることは確からしいようである。表４のデータは、このことが事実であることを暗示する。完全なボウベリア細胞、細胞ホモジネートの遠心分離により得られた細胞ペレット、および粗抽出液（細胞ホモジネートの遠心分離の後に得られた上澄み部分）がケトプロフェンコリンエステル加水分解活性について比較された。それらの結果を表４に示す。最高のＥ値は完全な細胞と細胞ペレットに結びつけられた。その他の実験は、その酵素は細胞外でない、すなわち、媒体中で分泌されないことを示した。粗抽出液と共に得られた低いＥ値は、ボウベリアがＲ−エステルについて低い特異性の１種以上の細胞質酵素を含むことを暗示する。１mL（最終体積）の反応混合物はケトプロフェンコリンエステル（６mg）、Na Pi緩衝液（２００mM、pH６．５）、および１５０mgの完全細胞またはペレット、または３００μＬの細胞粗抽出液を含んでいた。反応は３０℃において１６９rp mの往復速度の振とう機内で行われた。酵素の日常検定はｐ−ニトロフェニルケトプロフェンを基質として用いて３０℃において行われた。Ｒ−特異性エステル加水分解酵素の部分的精製は下記のようにして達成されることができる。この製剤はＲ−エステルについて高い選択性を示す。酵素の精製は、他に指定されなければ、室温で行われた。段階１．酵素の抽出約１２０ｇのボウベリア・バシアナの凍結細胞を解凍してから、ビード・ビーター（Bead Beater,BioSpec Products,Bartlesville,ＯＫ）を使用して２５０mL のリン酸塩緩衝液（５０mM、pH６．５および１５０mM KClを含む）で２回抽出した。細胞抽出液を半融ガラス濾過器を通して吸引濾過した。その濾液を次に１６０００rpmで４０分間遠心分離して上澄み部分を回収した。段階２．透析酵素試料を６Ｌのリン酸塩緩衝液（５０mM、pH６．５）に対して、およびその緩衝液を１回代えて、４℃で１６時間透析した。酵素試料の透析は結果として重い沈殿を生じ、それを除去して捨てた。段階３．ＤＥＡＥ−スフェロデクスカラムクロマトグラフィー透明な、透析された酵素試料を、リン酸塩緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−スフェロデクス（Spherodex）カラム（５×８cm）に適用した。酵素活性の大部分はフロースルー画分中に回収され、その画分は次にＹＭ１０膜（Beverly,ＭＡ）を取りつけたAmicon Diaflo限外濾過装置により約２０mLに濃縮された。段階４．ウルトロゲルＡＣＡカラムクロマトグラフィー前段階からの濃縮された酵素試料をウルトロゲル（Ultrogel）ＡＣＡ４４カラム（２．５×９０cm）の上に充填した。酵素を酢酸ナトリウム緩衝液（５０mM、 pH６および０．０２％ナトリウムアジド）により１４mL／時の流速で溶出した。酵素活性に富む画分をためて、−２０℃に貯蔵した。酵素精製の要約を表５に示す。それ以後の実験において、段階１におけるKClを削除することにより、透析（段階２）を省略できることが判った。さらに段階４を省略すると、段階４の後の精製された酵素のそれよりもｅｅとＥの値が大して劣らない、おおよそそれに匹敵する有用性のある酵素製剤を与えることがさらに判った。エステラーゼ活性に対するpHの効果が、初めに５mgのケトプロフェンコリンエステルを８００μＬの２００mM NaPi緩衝液中で２００μＬの７．１５２mg／mL 酵素溶液と共に使用して検査された。pH８．０から６．０までの結果が表６に示されている。前記の媒体は次に少し改変され（１０mgエステル、９２０μＬ緩衝液、３０℃の８０μＬの２４mg／mLまたは１９．０３８単位／mL酵素溶液）、そしてpH４．５から６．０までの範囲が検査された。それらの結果は表７に示されている。最適はpH５．５であるように見え、その場合１００以上のＥ値が得られた。 pH６．０における精製酵素によるその他の実験は前に全体のボウベリア細胞により観察されたものに一致した。再びヨウ化物塩は高いＥ値をあげたが、少し低い変換率を示した。これは多分ヨウ化物塩の初期純度が比較的高かったためであろう。１mLの反応混合物は基質（１０または５０mg）、リン酸ナトリウム緩衝液（２００mM、pH６）、０．８７mL、濃縮されたボウベリア・バシアナ酵素（１２０００Ｕ／mLおよび１９．６４１mg／mLのタンパク質濃度）、０．１３mL、を含んでいた。反応は室温（約２１℃）で攪拌しながら行われた。それらの結果を表８に示す。部分精製された酵素製剤が、反応の酸生成物は阻害性（４０mM酸で約４５％阻害）であるが、コリン生成物は阻害性に見えないことを証明するために使用された。基質のいろいろな濃度におけるその製剤の活性から、推定された４．９６mM のkmが得られた。前記の酵素は水溶性のコリンエステルを加水分解するが、この酵素はリパーゼであるかも知れないと思われた。この結論は、その酵素がｐ−ニトロフェニルアセタートと共によりもｐ−ニトロフェニルパルミタートと共に高い活性を示すという事実（表９を参照されたい）、およびこの酵素製剤はオリーブ油を容易に加水分解するという観察に基づく。この酵素は、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）に鋭敏であるが、プロテアーゼではないように思われる。なぜならば、この製剤はアゾカセインまたはＮ−サクシニル−ala−ala−pro−phe− ｐ−ニトロアニリン、他の一つのプロテアーゼ基質を加水分解しないからである。ＰＭＳＦの感度は、セリンがこのエステル加水分解酵素の活性部位の要素であることを暗示する。ＤＥＡＥ−スフェロデクスクロマトグラフィー（表５参照）に続いてクロマトフォーカシング段階およびその後のサイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相ＨＰＬＣの挿入は酵素の均一性への精製を可能にした。クロマトフォーカシングはＰＢＥ^TM９４樹脂（Pharmacia Fine Chemicals，スェーデン）により行われ、そしてＲ−特異性エステル加水分解酵素はpH７．１５と６．５４の間で溶出された。還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルからの酵素の推定分子量は約１７，５００ダルトンであった。この酵素が数個のサブユニットから構成されているかどうかは未知である。従って、１７，５００ダルトンはモノマーのサブユニットを表わすかも知れないし、またこの酵素は１７，５００のある倍数である分子量を有することもある。精製された酵素モノマーは過ヨウ素酸塩−シッフ試薬の塩基と反応しないので、この酵素はグリコプロテインではないことを示す。精製された酵素モノマーのアミノ酸分析が表１０に示されている。分子量はトリプトファンとシステインを除き約１７，８００と推定された。この酵素のＮ−末端と二つの内部フラグメントは配列をきめられた。Ｎ−末端の配列は次のように定められた。Ａla−Ｐro−Ａsp−Ｗ−Ｉle−Ｉle−Ｇln−Ｇly−Ｌeu−Ｓer−Ａrg−Ａla−Ｘ −Ａsp−Ｇly−Ｇln−Ａsp 上式中ＷとＸは確認できないアミノ酸である。エンドペプジダーゼ、IysＣ、による消化およびそれに続く配列決定の前の逆相ＨＰＬＣによるフラグメントの精製により得られた内部フラグメントの配列は次の通りである。Ｐhe−Ａla−Ｉle−Ａsn−Ａsn−Ｇln−Ｌeu−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｔhr−ＡlaＹ −Ｔhr−Ｔyr−Ｖal−Ｖal−Ｌys 及びＬeu−Ｉle−Ａla−Ｔyr−Ｐro−Ａla−Ｔyr−Ａsn−Ａsp−Ｇlu−Ｉle（？）− Ａla−Ａla−Ｇly−Ａsn−Ｖal−Ｐro−Ａsp−Ｌys−Ｉle（？）−Ｐhe（？）− Ｈis（？） “Ｙ”はこの位置のアミノ酸は確認できなかったことを示し、（？）は帰属が確かでないことを示す。ＢＨＩ媒体への油、例えばオリーブ油、の低水準の添加（５０から１００部の媒体に約１部の油）は変換を剌激しかつ選択性を高める。バウベリアを増殖させるために好ましい媒体はＢＨＩである。バウベリアは当業者に知られている多くのその他の媒体中で増殖するであろう、そしてエナンチオ選択的にケトプロフェンコリンエステルを加水分解するであろうが、しかしその結果はＢＨＩによるほど良くない。０°と４５℃の間の温度および３．５と９の間のpHが前記の微生物の増殖の間に維持される。好ましくは前記微生物は２０ °と３７℃の間の温度および５と９の間のpHにおいて増殖される。許容できる結果を生ずるより安価な媒体は、硝酸アンモニウム（６ｇ／Ｌ）、塩化カリウム（１ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（１ｇ／Ｌ）、二塩基性リン酸カリウム（２ｇ／Ｌ）、硫酸第一鉄七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ダイズ粉（１ｇ／Ｌ）、ダイズ油（６．７mL／Ｌ）およびグルコース（４０ｇ／Ｌ）である。この媒体中の発酵は２５℃でpH６．０〜６．５に維持されるのが最適である。微生物の増殖の間に必要である好気性条件は、もし酸素の供給が微生物の代謝要求に見合うため十分であるならば、いずれの既に定着した方法によっても与えられることができる。これは酸素を、空気の形が適しているが、供給することにより、および任意に反応液を同時に振とうまたは攪拌することにより最も便利に達成される。エステルの加水分解の間に微生物は増殖段階にあるであろう、または酵素の分解を防ぐ何らかの系（媒体または緩衝液）の中に保護されていることもあろう。エステルの加水分解の間、通常の培養媒体が、必要ならば同化できる炭素源（例えば、グルコース、スクロースなど）、必要ならば窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）、を必要ならば有機栄養源（例えば、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキスなど）および必要ならば無機栄養源（例えば、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄およびその他の金属の痕跡量）、のための薬剤と共に含んで使用されることがある。微生物は、例えば、同化できる炭素源の排除により、または窒素源の排除により、非成長段階に保たれることができる。この段階の間０°と４５℃の間の温度および３．５と９の間のpHが維持される。微生物またはそれからの物質により製造されたケトプロフェンは、上記のように、そのような製品のためにそれ自身既知のおよび、例えば、米国特許第５，１０８，９１６号に記載の、いずれかの方法に従って回収されおよび精製されることができる。代表的な操作は次のようであろう。約４０％酸が生産されたとき、反応をボウベリア細胞を濾別するか遠心分離してから上澄液をデカントすることにより停止させる。水性濾液または上澄液をHClでpH１．５まで酸性にしてから、メチルｔ−ブチルエーテル中に抽出する。そのエーテルを蒸発させてから、もし望ましければ、ケトプロフェンを再結晶させることができる。その回収は、シリカプレート上で９５：５CHCl₃：CH₃OHおよびヨウ素蒸気展開を用いるＴＬＣにより、並びにＨＰＬＣにより、監視されることができる。ボウベリア・バシアナまたは関連したボウベリア種から遺伝物質の導入を通してケトプロフェンの水溶性エステルの選択的加水分解をする能力を得た微生物もまた本発明の内に包含される。その遺伝物質の導入は、ボウベリアエステル加水分解酵素を記号化してクローン化された遺伝子を、当業界に周知の方法により他の一つの微生物に転移することにより達成されることができる。適当な宿主微生物は、例えば、Saccharomyces，Kluyveromyces，Aspergillus，Escherichia，Ps eudomonasおよびStreptomyces属の各員である。エステル加水分解酵素、微生物自身でさえも、は当業界に周知の方法に従って固定化されて使用されることができる。固定化のための適当な方法は米国特許第４，４３６，８１３号および第４，６５０，７５５号、および米国同時係属出願番号第０８７／９０８４９３号に記載されている。これらの開示は引用によりここに組み込まれる。阻害生成物を除去してそれにより反応を効率良く推進するため有利な装置と方法は米国特許第５，０７７，２１７号（Matsonら）に記載されている。この開示は引用によりここに組み込まれる。Matsonの方法を例６．２．１（第４３欄、第３６行）に記載のように使用して、部分精製されたボウベリアエステル加水分解酵素（１８０，０００）単位と１０ｇのラセミ体ケトプロフェンコリンエステルメチルスルファート塩の２８０mLの５０mMリン酸ナトリウム緩衝液pH５．３中の初めの反応混合物が抽出膜反応器を室温で通過させられ、その間に生成物は４５０mLのトルエン中に抽出された。そのトルエンは１．８Ｌの０．１Ｍ Na₂CO₃水溶液でpH１０．４５において再抽出された。緩衝液中の追加の基質が表１１の体積と基質欄に示されているように添加された。９１時間において、回収されたＲ −酸の収率は理論値の（すなわち、加水分解反応の間に形成された量の）９４％であった。本発明はその好ましい実施態様に関して特に示されかつ説明されたが、形および詳細におけるその他の変更は本発明の精神と範囲を逸脱することなくその中でなされ得ることは当業者により理解されるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年４月４日【補正内容】８．該ボウベリア・バシアナはＡＴＣＣ菌株４４８６０、３８６５７および７１５９から選択される請求項６に記載の方法。９．（a）ラセミ体ケトプロフェンを適当な前駆体と反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを製造すること、（b）前記ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌と共に処理してＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルの存在で優先的にＲ−ケトプロフェンを製造すること、および（c）前記Ｓ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから前記Ｒ−ケトプロフェンを単離すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンを得る方法。 10．（a）ラセミ体ケトプロフェンを活性化剤と反応させて活性化されたケトプロフェンを与えること、（b）前記の活性化されたケトプロフェンをコリンと反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを製造すること、（c）前記ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌と共に処理してＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルの存在で優先的にＲ−ケトプロフェンを製造すること、および（d）前記Ｓ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから前記Ｒ−ケトプロフェンを単離すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンを得る方法。 14．（a）ラセミ体ケトプロフェンを活性化剤と反応させて活性化されたケトプロフェンを与えること、（b）前記の活性化されたケトプロフェンをコリンと反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを与えること、（c）前記のラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌と共に処理して本質的にＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルとＲ−ケトプロフェンから成る混合物を製造すること、（d）前記のＲ−ケトプロフェンを前記のＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから分離すること、および（e）前記のＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルを加水分解すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＳ−ケトプロフェンを得る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．ケトプロフェンコリンエステル鏡像異性体の混合物の水溶液を菌種ボウベリア・バシアナ（Beauveria bassiana）の微生物とpH４．０よりpH８．０までにおいておよび１０°より４０℃までの温度で接触させることから成る、Ｓ−ケトプロフェンコリンエステルの存在においてＲ−ケトプロフェンコリンエステルを優先的に加水分解する方法。２．該ボウベリア・バシアナは菌株ＡＴＣＣ４４８６０、３８６５７および７１５９から選択される請求項１に記載の方法。３．該ボウベリア・バシアナは菌株ＡＴＣＣ４４８６０である請求項２に記載の方法。４．該温度は約２５℃であり、かつ該pHは５．５より６．５までに維持される請求項１に記載の方法。５．該水溶液は該ボウベリア・バシアナのための栄養源を追加して含む請求項１に記載の方法。６．Ｒ−ケトプロフェンのコリンエステルを菌種ボウベリア・バシアナの微生物に露出させることから成るＲ−ケトプロフェンを製造する方法。７．該R−ケトプロフェンのコリンエステルは該ボウベリア・バシアナにpH５．５より６．５までにおいておよび約２５℃において露出させられる請求項６に記載の方法。８．該ボウベリア・バシアナは菌株４４８６０、３８６５７および７１５９から選択される請求項６に記載の方法。９．（a）ラセミ体ケトプロフェンを適当な前駆体と反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを製造すること、（b）前記ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌と共に処理してＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルの存在で優先的にＲ−ケトプロフェンを製造すること、および（c）前記Ｓ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから前記Ｒ−ケトプロフェンを単離すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンを得る方法。 10．（a）ラセミ体ケトプロフェンを活性化剤と反応させて活性化されたケトプロフェンを与えること、（b）前記の活性化されたケトプロフェンをコリンと反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを製造すること、（c）前記ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌と共に処理してＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルの存在で優先的にＲ−ケトプロフェンを製造すること、および（d）前記Ｓ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから前記Ｒ−ケトプロフェンを単離すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンを得る方法。 11．（a）ラセミ体ケトプロフェンを活性化剤と反応させて活性化されたケトプロフェンを与えること、（b）前記の活性化されたケトプロフェンをコリンと反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを製造すること、（c）前記ラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌からのエステル加水分解酵素と共に処理してＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルの存在で優先的にＲ−ケトプロフェンを製造すること、および（d）前記Ｓ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから前記Ｒ−ケトプロフェンを単離すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＲ−ケトプロフェンを得る方法。 12．ケトプロフエンコリンエステル鏡像異性体の混合物の水溶液をボウベリア・バシアナエステル分解酵素とpH４．０よりpH８．０までにおいておよび１０° より４０℃までの温度で接触させることから成る、Ｓ−ケトプロフェンコリンエステルの存在においてＲ−ケトプロフェンコリンエステルを優先的に加水分解する方法。 13．該エステル加水分解酵素は約１７，８００ダルトン、またはその倍数、の分子量を有し、トリプトファンとシステインを除いて、Ａla−Ｐro−Ａsp−Ｗ− Ｉle−Ｉle−Ｇln−Ｇly−Ｌeu−Ｓer−Ａrg−Ａla−Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ｇln−Ａ sp−のＮ−末端配列および−Ｐhe−Ａla−Ｉle−Ａsn−Ａsn−Ｇln−Ｌeu−Ｔhr −Ａla−Ｐro−Ｔhr−Ａla−Ｙ−Ｔhr−Ｔyr−Ｖal−Ｖal−Ｌys−およびＬeu− Ｉle−Ａla−Ｔyr−Ｐro−Ａla−Ｔyr−Ａsn−Ａsp−Ｇlu−Ｚ−Ａla−Ａla−Ｇ ly−Ａsn−Ｖal−Ｐro−Ａsp−Ｌys−（前式中Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺはアミノ酸を表わす）の内部配列を有する請求項１２に記載の方法。 14．（a）ボウベリア・バシアナの多数の砕かれた細胞を水性緩衝液によりpH ６．５で抽出すること、（b）前記緩衝液を濾過または遠心分離して水性上澄液中に不純なエステル加水分解酵素を回収すること、および（c）前記上澄液を弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させてエステル加水分解酵素の水溶液を製造し、そして前記エステル加水分解酵素は前記溶液中のタンパク質のミリグラム当り１００単位より大きい活性を有することおよび前記エステル加水分解酵素はラセミ体ケトプロフェンコリンエステルを９０％より大きいｅｅでＲ−ケトプロフェンに加水分解できること、から成る方法により製造されたタンパク質のミリグラム当り１００単位より大きい活性を有するエステル加水分解酵素。 15．約１７，８００ダルトンの分子量、トリプトファンとシステインを除いて、Ａla−Ｐro−Ａsp−Ｗ−Ｉle−Ｉle−Ｇln−Ｇly−Ｌeu−Ｓer−Ａrg−Ａla− Ｘ−Ａsp−Ｇly−Ｇln−Ａsp−のＮ−末端配列および−Ｐhe−Ａla−Ｉle−Ａsn −Ａsn−Ｇln−Ｌeu−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｔhr−Ａla−Ｙ−Ｔhr−Ｔyr−Ｖal− Ｖal−Ｌys−および−Ｌeu−Ｉle−Ａla−Ｔyr−Ｐro−Ａla−Ｔyr−Ａsn−Ａsp −Ｇlu−Ｚ−Ａla−Ａla−Ｇly−Ａsn−Ｖal−Ｐro−Ａsp−Ｌys−（前式中Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺはアミノ酸を表わす）の内部配列を有する少なくとも一つのモノマーから成るエステル加水分解酵素。 16．（a）ラセミ体ケトプロフェンを活性化剤と反応させて活性化されたケトプロフェンを与えること、（b）前記の活性化されたケトプロフェンをコリンと反応させてラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを与えること、（c）前記のラセミ体ケトプロフェンのコリンエステルを水中で菌種ボウベリア・バシアナの真菌と共に処理して本質的にＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルとＲ−ケトプロフェンから成る混合物を製造すること、（d）前記のＲ−ケトプロフェンを前記のＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルから分離すること、および（e）前記のＳ−濃縮されたケトプロフェンコリンエステルを加水分解すること、から成るラセミ体ケトプロフェンからＳ−ケトプロフェンを得る方法。