JPS62272984A - Ｌ−（−）−カルニチンクロライドのバイオテクノロジ−による製造方法 - Google Patents

Ｌ−（−）−カルニチンクロライドのバイオテクノロジ−による製造方法

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JPS62272984A
JPS62272984A JP62055461A JP5546187A JPS62272984A JP S62272984 A JPS62272984 A JP S62272984A JP 62055461 A JP62055461 A JP 62055461A JP 5546187 A JP5546187 A JP 5546187A JP S62272984 A JPS62272984 A JP S62272984A
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ester
range
enzyme
hydrolysis
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JP62055461A
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フランコ・フランカランチ
マルコ・リツチ
ピエトロ・チエステイ
カルロ・ベントウレルロ
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Istituto Guido Donegani SpA
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Istituto Guido Donegani SpA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
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  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バイオテクノロジーでの製造方法による式（
■）： を有するＬ−（−）−カルニチンクロライドの製造方法
に関するものである。
ざらに詳細には本発明は、トリメチルアミンとＲ（＋）
−３，４−エポキシ酪酸のアルカリ性塩との反応に基づ
くＬ−（−）−力ルニチンクロライドの製造方法に関し
、前記Ｒ（＋）−３，４−エポキシ酪酸は前記ラセミ型
３，４−エポキシ醋酸の特定エステルを２回の連続する
酵素加水分解反応にかけることにより得られる。
公知のように、カルニチン（β−ヒドロキシ−Ｔ−トリ
メデルアミノ醋酸としも定義される）はβ位置に不斉中
心を有し、したがって一般にＤ型及σ［−型光学対掌体
又は光学エナンヂオマとじて一般に定義される２種の立
体異性体が存在する。
本発明によるクロライドとして得られる１−（−）−力
ルニチンは、ヒ１〜代謝の分野及び脂肪酸の変換の分野
にて顕毬な（Ｑ割を演づ′る。これに対し、Ｄ（＋）−
力ルニブンはＬ−（−）−カルニチン−アシルトランス
フェラーゼに対し競合する抑制剤であって、心臓組織中
に存在するＬ−（−）−力ルニチンのレベルを低下させ
る（ｉＢ、フランス、Ｓ、に、シュルツ、ジャーナル・
バイオロジカル・ケミストリー（１９６５）　、第２４
０巻、第２１８８頁：Ｃ，Ｒ，ロエ、Ｔ、Ｐ、ポハン、
ランセラ１〜（１９８２）　、第１４１１頁］。
したがって、Ｌ−（−）−カルニチンの最も一般的な治
療用途は心筋貧血症、狭心症及び心筋硬化症を治療する
ための栄養補給剤及び心臓保護剤としてである。
合成によるカルニチン製造には幾つかの方法が知られて
いるが、その殆んどはカルニチンをラセミ型で得ており
、したがってラセミ混合物を２（壬の個々の光学対掌体
に分離することを目的とじた操作工程が必要とされる。
したがって、これらの方法は光学活性である高価な反応
体、たとえばジベンゾイル酒石酸、樟脳酸、マンゾリン
酸などを必要とする。さらに、これらは反応条件の慎重
な制御を必要としかつ数段階の結晶化工程を必要とする
。したがって、これらは複雑である結果、経済上及び操
作上の観点、特に工業上の観点から負担となることか判
る［ヨーロッパ１４許出願第ＥＰ１４１．４０８＠　：
フランス特許第１，４６６．６９６号及び英国特許第Ｇ
Ｂ−Ａ−２，１３１，４０９号］。
たとえばＤ−マニト−ルのような光学活性化合物から出
発してＬ−（−）−カルニチン合成を目指ず方法も記載
されている［ヨーロッパ特許出願第ＥＰ６０，５９５号
１゜この方法は、いかなる分割工程をも必要としないが
、多くの工程と高価かつ極めて危険な反応体、たとえば
四酢酸鉛の使用を必要とする。
たとえばアルキルクロルアセト酢酸、クロ１〜ンベタイ
ン又はブチロベタインなどのプロギラル基質から出発し
てＬ−（−）−カルニチンを得る幾つかの微生物学的方
法も知られている［ペルキー特８′１第ＢＦ　８９８，
３９６号、ヨーロッパ特許出願第１三Ｐ　１２２，７９
４号、フランス１１許出願第Ｆ　Ｒ２，４８５，５６４
＠］　：。
この種の方法は高張る反応容積を必要とづると言う欠点
を示し、かつ低収率及び生成物の精製国難性を特徴とす
る。
したがって、工業子実！−５することができ、１−一−
（−）−力ルニチンの製造を簡単、効率的かつ経済的に
行ないうる簡便な方法を得ることが必要であると考えら
れる。
したかつて本発明の目的は、操作上の観点から簡単かつ
工業上の観点から有利である方法にしたがってし−（−
）−力ルニヂンクロライトの製造を可１止にすることて
′ある。
今回、この目的及びイの他の目的は、トリメデルアミン ルカリ性塩との反応に基づくバイオテクノロジー法によ
って達成されうろことが判明し、Ｒ（＋）−３，４−エ
ポキシ酪酸は前記ラセミ型３，４−１ボキシ醋酸の特定
エステルを酵素加水分解（よる２つの連続する反応にか
けて得られる。次いで、得られた生成物を１−１０で処
理する。
実際上、酵素加水分解の上記２つの反応においては２種
の異なる酵素を使用し、これら酵素はそれぞれ次のよう
に加水分解することができる：（ａ）ｉ択的な上記ラセ
ミ型エステルのエナンチオマＳ　（−）　、及び （ｂ）エナンヂオマＲ（＋）のエステル白身。
したがって、本発明のの目的は、式（Ｉ）を有するＬ−
（−）−カルニチンクロライドのバイオテクノロジーに
よる製造方法を提供することであり、この方法は： （ａ）式（■）： ［式中、ＲはＣ１−Ｃｏｏアルキル基、又はベンジル基
を示す１ を有する（Ｒ，５）−３，４−エポキシ酪酸のラセミ型
エステルを、エナンチオマ５（−）を不斉的にかつ通常
の方法で加水分解しつる酵素又はこの酵素を産生ずる微
生物に対しアルカリにより調節されたｐＨ条件下゛で反
応させ、かつ前記］−ナンチオマ５（−）を通常の技術
にしたがいＲ（＋）型で実質的に存在する未反応のニス
デル（Ｉ（）から分離し： （ｂ）このようにして得られた前記Ｒ（＋）型のエステ
ル（Ｉｔ＞を前記Ｒ（＋）型を定串的に加水分解しうる
酵素に対し、アルカリにより調節されたＯ　ｌ−１条件
下で式（■）： ［式中、Ｘ＝Ｎａ、Ｋ、ｌ−ｉである］を有する実質的
にＲ（十）型の３，４−エポキシ醋酸の塩が得られるま
で反応させ、かつ（Ｃ）式（ＩＩＩ）を有する前記Ｒ（
＋）型の塩をモル過剰のトリメチルアミンと反応させ、
かつ前記過剰量をＨＣｌにより除去した後、式（１）：
ことを特徴とする。
［式中、Ｒは上記の意味を有し、かつＲ′はＣ１〜Ｃ５
アルキル基を示す１゜ 式（ＩＩ）を有するラセミ型エステルはそれ自体公知の
化合物であり、たとえば下記するような常法で製造する
ことができる： ［ファーマスーチカル・サイエンス、第６４巻、第１２
６２頁（１９７５）　］ ［ジャーナル・オーガニック・ケミストリー第３２巻、
第３８８８頁］ 上記したように式（ＩＩ）を有するラセミ型エステルを
酵素と反応させ、これらの酵素は微生物により産生させ
うるか或いは動物源とすること５でき、かつエナンチオ
マ５（−）を選択的に加水分解してＲ（＋）型のエナン
チオマを実質的に未変化で残留させることができる（不
斉加水分解）。
この目的で、市販されている種々異なる原料の加水分解
酵素を使用することができ、殊に次のものが後記するよ
うに特に活性であると判明した：へ　　　　−ξ　　　
　々く　　さ 上記したように、加水分解酵素を産生する微生物も使用
することができる。
この目的で、式（ＩＩ）を石するラセミ型エステルを不
斉加水分解しうる酵素を産生する限り、全ゆる微生物を
使用りることかできる。
これらの微生物のうち、次のものが殊に効果的であると
判明した： シュードモナス・フラギ　　　ＩＦＯ３４５８（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｆｒａｇｊ　）バチルス・ズブチリ
ス　　　　ＡＴＣＣ６６３６（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ　）ロドトルラ・ミヌタ　　　　　Ｉ　Ｆ
　Ｏ０８７９（Ｒｏｄｏｔｏｒｕｄａ　ｍ１ｎｕｔａ　
）カンジダ・シリンドラセア　　ＡＴＣＣ１４８３０（
Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｒａｃｅａ）アースロバフ
タ・シンプレックス （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｉｍｐｉｅｘ）　　　
Ｉ　Ｆ　Ｏ３５３０式（ＩＩ）を有するラセミ型エステ
ルの不斉加水分解における最初の反応は、ラセミ型エス
テルと粗製若しくは精製酵素の水溶液とよりなる混合物
を強力撹拌して行なわれる。或いは、酵素の水溶液の代
りに、微生物を含有する培養ブロス或いはその瀘液若し
くはそのＳ厚物又は微生物菌体の懸濁物も使用すること
ができる。
代案として、この分野に関する従来技術にしたがって選
択された種々異なる性質の支持体に固定して酵素を使用
することもできる。ラセミ型エステル（ＩＩ）に対し約
０．０３〜１０重量％の範囲の量の酵素が使用される。
本発明による加水分解は約５〜６０℃、好ましくは１０
〜３０℃の範囲の温度にてｌ）Ｈ値を５〜９、好ましく
は６〜８に保ちながら行なうことができ、酵素はこれら
の数値範囲でその最高活性を示す。
反応媒体のｐＨは、ナトリウム及び（又は）カリウム緩
衝溶液を用いてたとえばＮａＯＨ１ＫＯＨ，Ｌ−ｉ　０
Ｈ，ＣａＣＯ３などの無機塩基により生成酸度を中和し
て一定に保たれる。
反応混合物中の出発ラセミ型エステル（ＩＩ）の濃度は
１〜２０重儂％の範囲とすることができる。
不斉加水分解の反応時間は、用いる酵素の比活性又は所
望の変換率に応じて約５〜７２時間の範囲とすることが
できる。
不斉加水分解の反応が終了した後、異性体Ｒ（＋）が濃
縮された未反応エステル（ＩＩ）はたとえば塩化メヂレ
ン、トル：Ｌン、リグロイン、エチルエーテルなどの水
に対し不混和性の溶剤を用いて反応混合物から抽出する
ことができる。このように１ｑられたエステルはたとえ
ば照温、カラムクロマトグラフィーなどの通常技術にし
たがって精製することかできる。
式（Ｉｆ）を有し、実質的にＲ（＋）型である未反応エ
ステルは、通常の化学法によっては容易に加水分解する
ことができない。何故なら、反応条件下にてオキシラン
環の反応性が高いからである。
これに対し、本発明によれば、この種の加水分解を選択
的加水分解酵素を用いて簡単なｈ法で行ないうろことが
判明し、この酵素は−［ステルＲ（＋）（ＩＩ）を定量
的に加水分解して実質的にＲ（÷−）型の３，４−エポ
キシ酪酸の塩を生成することができる。
市販の加水分解酵素を使用７ることができ、特に次のも
のが効果的であると判明したニア／ ／′ ／′ 囮！　　　　　　　　　　　　　　　　原料ズブチリシ
ナＢＰＮ’　　　　バチルス・アミロ１（ＢａＣｉ　Ｉ
　Ｉｕｓ　ａｍｙｉｏｌズブチリシナ・　　　　　　バ
チルス・ズブチ１カールスベルグ　　　　　　（８ａｃ
　ｉ　ｌ　Ｉｕｓ　５ｕｂｔ　ｉ　１アルカラービ（登
録商標）　バチルス・リツヒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｌ
ｉｃｈｅｒ 製造業者 ノキフ １ｑｕｅｆａｃ　１ｅｎｓ　＞　　　　−社、セントル
イス、ＵＳＡノス　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　〃ｉｓ　） ［ニフォルミス　　　ノボ・インダストリーＡ／Ｓ社、
１１［０ｒＩＩＩＩＳ）　　　　　　デンマーク未反応
エステル（Ｕ）の前記第２の加水分解反応は、未反応エ
ステルと粗製酵素若しくは精製酵素の水溶液とよりなる
混合物を強力撹拌し°Ｃ行なわれる。
或いは、酵素をこの分野に関する従来技術にしたがって
選択される種々異なる性質の支持体に固定して使用する
ことができる。
エステルＲ（＋＞　　（ＩＩ）に対し約０．５〜３０重
量％の範囲の量で酵素を使用する。
本発明による加水分解は約５〜６０℃、好ましくは１０
〜４０°Ｃの範囲の温度で行なうことができ、ＤＨを５
〜１０．好ましくは６〜９の範囲に保つ。
反応媒体におけるρ（−１は、Ｎａ若しくはに緩衝溶液
を用いて或いはたとえばＮａＯＨ，ＫＯＨｌＬｉＯＨの
ような塩基により生成酸度を中和して一定に保たれる。
反応混合物中の未反応エステルＲ（＋＞（ＩＩ＞の濃度
は約１〜２０重量％の範囲とすることができる。加水分
解の反応時間は、使用可る酵素の比活性に応じて約５〜
７２時間の範囲とダることかできる。
反応の完結後、生じた混合物を水に対し不混和性の溶剤
、たとえば塩化メブーレン、１〜ルｌン、リグロイン、
エチルエーテルなどで洗浄覆る。
過剰のトリメチルアミンの水溶液を、実質的にＲ（十）
型としての式（［１）を有する３、４−エポキシ酪酸の
アルカリ性塩を含有する水イ目に添加し、かつ得られた
混合物を約１０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃の範
囲の温度にて約１〜１２時間の範囲の時間にわたり撹拌
する。
トリメチルアミン溶液の濃度は約０．１〜５，５モル／
乏の範囲とすることができ、トリメチルアミンは３，４
−エポキシ醋酸の塩（■）１モル当り約１．５〜３モル
の範囲の量で使用される。
反応の完結後、水及び未反応トリメチルアミンを蒸溜に
よって除去する。
Ｄ２０における残留物のＮＭＲ分析は専ら式（ＩＶ）を
有する化合物、ずなわら式：０Ｍ３ の内部塩としてのＬ−（−）−カルニチンの存在を示す
。
水及びトリメデルアミンを除去した後に得られる残留物
を、式（Ｉ）を有づるＬ−（−）−カルニチンクロライ
ドの水溶液が得られるまで塩酸水溶液で処理する。
前記水溶液から、水の蒸発及び次いで公知技術にしたが
う残留物の結晶化により式（Ｉ）を有するＬ−（−）−
カルニチンクロライドがＲ柊的に得られる。
このように得られたＬ−（−）−力ルニチンクロライド
から、同様に公知である方法により、たとえば無機酸（
ＨＢｒなど）若しくは有機酸（１酸なと）の塩類として
Ｌ−（−）−力ルニチンの他の誘導体も得ることができ
る。
以下、限定はしないが幾つかの例により本発明をさらに
説明する。
以下の記号を使用する： Ｂｕ　（ｈｆｃ）３　　：ヨーａビウムトリス［３−（
ヘプタフルオロプルビルヒドロキシメチレン）−ｄ−カ
ンフオレート］。
ｅ、ｅ、＝１ナンヂΔマ過剰。
例　　１ 工程（ａ） 燐酸ノー１〜リウムよりなる緩衝溶液（ｐ　ｆ−１＝　
７　＞４５ｍ１と（Ｒ，５）−３，４−エポキシ酪酸イ
ソ１チル１０（］　　（６３，３ミリモル）とステアプ
シン酵素（シグマ・ケミカル・カンパニー？ｆ、ＵＳＡ
により販売され、３５％の蛋白質含有量と蛋白質１ｍ（
］当り３５ｍ７０単位に等しい活性とを４＝［る豚膵臓
から得られたリバーｄ　）　６４０ｍｇとをＫＣ２の０
．１Ｍ溶液４５ｍＩ２へ添加した。この混合物を２０’
Ｃにて強力１！拌し、かつｌ）Ｈを５Ｎ　　ＮａＯＨ水
溶液の添加により７の値に一定に保った。２２時間後（
６５％に等しい３，４−エポキシブチレートの変換率〉
、残留ニスデルを塩化メチレンでの抽出により反応混合
物から回収し、次いで蒸溜により精製した。かくして、
３．３ｇのＲ（＋）−３，４−１ニボキシ醋酸イソブチ
レー１〜を回収した。Ｅｕ（ｔｌｆ’ｃ）３（エステル
１モル当り０．０５モル）の存在下にお【プる３００Ｍ
　ｌ　ｌ　２でのＮＭＲ分析はｅ、ｅ、＞９０％を示し
た。
工程　（ｂＬ＋−（ｃ） 燐酸ナトリウムよりなるＨＤ？溶液（ｐｌ−１＝７＞１
ｍｌとＲ（＋＞　　３．４−エポキシ酪酸イソ１デル３
．３ｇ（２０，９ミリモル）と酵素ズブチリシナＢＰＮ
’　　（シグマ・ケミカル・カンパニー社、Ａにより販
売され、固体ｌｌｌ１ｇ当り６〜９単位の活性を有する
）　３０ｍｇとを水３０７！に添加した。この混合物を
２０℃にて強力撹拌し、かつｐＩ−１を１ＮのＮａＯＨ
水溶液の添加により７の値に一定に保った。
７０１１間後、反応混合物を塩化メチレンで抽出しかつ
５Ｎトリメチルアミンの水溶液５ｄを水相へ添加した。
得られた溶液を２時間かけて強力撹拌下に４５℃にした
。
完了後、この溶液を減圧下、（約２０ｍ１ｌｌｌｌ（］
　）で蒸発させた。Ｄ２０中でＮ　Ｍ　Ｒにて分析した
残留物の試料は化合物（ＩＶ）で構成されることが判明
した。
この残留物を再σ３ｄの溌ＷｉＭ水溶液で溶解させた。
次いで、この溶液を再び減ｌｌ下で蒸発さけかつ残留物
をエタノールで処理した。得られた混合物を２０分間か
けて沸騰温度となし、かつ濾過した。
［ｃｒｌ’ｆ＝−２１，３°　（Ｃ＝Ｌ　Ｈ２０）　、
ｅ、ｅ。
９０％を有するし−（−）−力ルニチンクＯライド３、
２８ｇを冷却により濾液から結晶化させた。
例２ 工程（ａ） 例１におけると同様に操作したが、（Ｒ，Ｓ）１ボキシ
酪酸イソブチルの代りに１０ｇの（Ｒ，５）−３，４−
エポキシ酪酸ｎ−ブチル（６３，３ミリモル）を使用し
た。２６時間後（６０％に等しいエステル変換率）、塩
化メチレンでの抽出及び次いで照温にＪ＝すＲ（＋）−
３，４−Ｉボキシｌ！ｉ８酸ｎ−ブチル３．８ｇが回収
された。
ＥＬＪ　（ｈｆｃ）３の存在下における３００１ｖｌ　
＠　ｚでのＮＭＲ分析はｅ、　ｅ、　＞９０％を示した
。
工程（ｂ）＋（ｃ） 実施例１におりると同様に操作したが、Ｒ（＋）−３，
４−エポキシ醋酸イソブチルの代りに３．８９のＲ（＋
）　−３，４−エポキシ酪Ｍｎ−７チル（２４，１ミリ
モル〉を使用した。反応の完結後、［α　コ　’ｆ＝−
２２，０℃　（Ｃ＝１　　、　ト１２　０）　　、　ｅ
、　　ｅ。
９３％を有するＬ−（−）−カルニヂンクロライド３．
８９が得られた。
例３−８ 例１にあけると同様に操作したが、第１表に示１ように
改変した。得られた結果をも第１表に示ず。
、、′／ ／′ 例９ 工程（ａ） アースロバフタ・シンプレックス（Ｉ　Ｆ　０３５３０
＞のスラントの内容物を５０ｄの［栄養ブロス、１　（
オギソイド・リミテッド、Ｕ、に、により製造された栄
養ブロス）に接種しかつ３７℃にて２００ｒｐｒｎの撹
拌下で２５０ｄのフラスコ中において１８時間保った。
次いで、この培地４　ｎｉｌを１００７の「栄養ブロス
」に接種し、かつ５００ｄのフラスコ中で３７°Ｃにて
２００ｐｐｍの撹拌下に保った。
１２時間後、燐酸カリウムよりなる緩衝溶液（ｐ　）−
１＝　７　＞　５０ｄ及び（Ｒ，５）−３，４−エポキ
シ酪酸イソブチル５ｇを得られた混合物に添加し、かつ
全体を２０℃にて撹拌下に４８時間保った。
完了後、この混合物を塩化メヂレンで抽出し、溶剤を蒸
発させ、かつ残留した３、４−エポキシ醋酸イソブチル
をシリカカラム上でのクロマトグラフィーにより精製し
た。かくしてｅ、ｅ、＝７５％を有するＲ（十）−３，
４−エポキシ酪酸イソブチル２．２５（］が得られた。
工程（ｂ）　＋（ｃ） 例１にお番プると同様に操作してｅ、ｅ、＝７５％を有
するｌ　−（−）−力ルニチンクロライド２．０３ｇを
ｊＯ７こ。
例　　１０ 例９におけると同様に操作したが、ただし使用した微生
物をシュードモナス・フラギ（ＩＦＯ３４５８）とする
ことによりｅ、ｅ、＝５６％を有するＲ（十）−３，４
−エポキシ酪酸イソブチル２．３５１Ｊを得た。次いで
、このエステルからｅ、ｅ。
＝５３％を有するＬ−（−）−力ルニチンクロライド２
．１２ＣＩを得た。
例　　１１ 例９におけると同様に操作したが、ただし使用した微生
物をバチルス・ズブチリスＣＡＴＣＣ６６３３’）とす
ることによりｅ、ｅ、＝５２％を有するＲ　（＋）−３
，４−エポキシ酪酸イソブチル２．８５ｇを得た。次い
で、このエステルからｅ、ｅ。
＝５１％を有するし−（−）−力ルニヂンクロライド２
．４９０を得た。
例　　１２ 工程（ａ） ロドトルラ・ミヌタ（Ｉ　Ｆｏ　　０８７９）のスラン
トの内容物を、次の組成を有する培地５０ｄに接種した
： オキソイド・リミテッド召、Ｕ、に、による酵母抽出物
０．３％、 オキソイド・リミテッド社によるペプトン１％、グルコ
ース２％。
この培地を５００ｄのフラスコに入れ、かつ２８℃にて
ｔａｏｒｐｍの撹拌下に１８時間保った。次いで、この
培地４蔵を後取りかつ上記と同じ組成を有する培地１０
０ｍに接種した。次いで、０．５ｇの炭酸カルシウムを
添加しかつ全体を２８℃にて１６ｐｐｍの撹拌下に保っ
た。２４時間後、得られた混合物へ５ｇの（Ｒ，５）−
３，４−エポキシ酪酸イソブチルを添加し、かつ全体を
２０℃にて撹拌下に７２時間保った。完了後、この混合
物を塩化メチレンで抽出し、溶剤を蒸発させかつ残留し
たＲ　（＋）　−３，４−エポキシ醋酸イソブチルをシ
リカカラム上でのクロマトグラフィーにより枯興した。
かくＬＴｅ、ｅ、＝２７％を有するＲ　（＋−）−３，
４−エポキシ酪酸イソブチル３．１ｇが得られた。
工程（ｂ）＋（Ｃ） 例１におけると同様に操作してｅ、ｅ、＝２８％を有す
る１−（−）−カルニチンクロライド２．８ｇを得た。
例　　１３ 例１２におけると同様に操作したが、ただし使用した微
生物をカンジダ・シリンドラセア（ＡＴＣＣ１４８３０
）とすることによりｅ、ｅ、＝４７％を有するＲ　（十
）−３，４−エポキシ酪酸イソブチル２．７５９を得た
。次いで、このエステルからｅ、ｅ、　＝４５％を有す
る１〜−（−）−力ルニチンクロライド２．５９を得た
。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） を有するＬ−（−）−カルニチンクロライドをバイオテ
    クノロジーにより製造するに際し、（ａ）式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） ［式中、ＲはＣ＿１−Ｃ＿１＿０アルキル基、又はベン
    ジル基を示す］ を有する（Ｒ，Ｓ）−３，４−エポキシ酪酸のラセミ型
    エステルを、エナンチオマＳ（−）を不斉的にかつ通常
    の方法で加水分解しうる酵素又はこの酵素を産生する微
    生物に対しアルカリにより調節されたｐＨ条件下で反応
    させ、かつ前記エナンチオマＳ（−）を通常の技術にし
    たがいＲ（＋）型で実質的に存在する未反応のエステル
    （II）から分離し； （ｂ）このようにして得られた前記Ｒ（＋）型のエステ
    ル（II）を前記Ｒ（＋）型を定量的に加水分解しうる酵
    素に対し、アルカリにより調節されたｐＨ条件下で式（
    III）： ▲数式、化学式、表等があります▼（III） ［式中、Ｘ＝Ｎａ、Ｋ、Ｌｉである］ を有する実質的にＲ（＋）型の３，４−エポキシ酪酸の
    塩が得られるまで反応させ、かつ （ｃ）式（III）を有する前記Ｒ（＋）型の塩をモル過
    剰のトリメチルアミンと反応させ、かつ前記過剰量をＨ
    Ｃｌにより除去した後、式（ I ）を有するＬ−（−）
    −カルニチンクロライドを得る ことを特徴とするＬ−（−）−カルニチンクロライドの
    バイオテクノロジーによる製造方法。 （２）式（II）を有するラセミ型エステルの不斉加水分
    解に際し、好ましくはステアプシン、パンクレアチン、
    カンジダ・シリンドラセアからのリパーゼよりなる群か
    ら選択される酵素を使用することを特徴とする特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 （３）式（II）を有するラセミ型エステルの不斉加水分
    解に際し、好ましくはシュードモナス・フラギ（ＩＦＯ
    ３４５８）、バチルス・ズブチリス（ＡＴＣＣ６６３３
    ）、ロドトルラ・ミヌタ（ＩＦＯ０８７９）、カンジダ
    ・シリンドラセア（ＡＴＣＣ１４８３０）、アースロバ
    クタ・シンプレックス（ＩＦＯ３５３０）よりなる群か
    ら選択される微生物によって産生された酵素を使用する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （４）微生物をその培養ブロス、濾液、濃厚物又は菌体
    の懸濁物として使用することを特徴とする特許請求の範
    囲第３項記載の方法。 （５）酵素を支持体上に固定させて使用することを特徴
    とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 （６）ラセミ型エステル（II）の不斉加水分解に際し、
    ラセミ型エステル（II）に対し約 ０．０３〜１０重量％の範囲の量の酵素を使用すること
    を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （７）ラセミ型エステル（II）の不斉加水分解を約１０
    〜３０℃の範囲の温度で行なうことを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。 （８）ラセミ型エステル（II）の不斉加水分解を塩基性
    緩衝溶液又は無機塩基を用いて５〜９の範囲のｐＨ値に
    て行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 （９）不斉加水分解の混合物におけるラセミ型エステル
    （II）の濃度が約１〜２０重量％の範囲であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１０）式（II）を有するＲ（＋）型のエステルの加水
    分解に際し、好ましくはズブチリシナＢＰＮ′、ズブチ
    リシナ・カールスベルグ、アルカラーゼ（登録商標）よ
    りなる群から選択される加水分解酵素を使用することを
    特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１１）酵素を支持体上に固定して使用することを特徴
    とする特許請求の範囲第１０項記載の方法。 （１２）式（II）を有するエステルＲ（＋）の加水分解
    に際し、式（II）を有するエステルＲ（＋）に対し約０
    ．５〜３０重量％の範囲の量の酵素を使用することを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１３）式（II）を有するエステルＲ（＋）の加水分解
    を約１０〜４０℃の範囲の温度で行なうことを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１４）式（II）を有するエステルＲ（＋）の加水分解
    を、塩基性緩衝溶液又は無機塩基を用いて５〜１０範囲
    のｐＨ値にて行なうことを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 （１５）加水分解混合物におけるＲ（＋）型の式（II）
    を有するエステルの濃度が約１〜２０重量％の範囲であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 （１６）式（III）を有するＲ（＋）−３，４−エポキ
    シ酪酸の塩に対し、トリメチルアミンを約０．１〜５．
    ５モル／ｌの範囲の濃度を有する水溶液としてＲ（＋）
    −３，４−エポキシ酪酸の塩（III）の１モル当り約１
    ．５〜３モルの範囲のモル比により約１０〜６０℃、好
    ましくは４０〜５０℃の範囲の温度で添加することを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
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