JP3741758B2 - 光学活性グリセロール誘導体の製法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラセミ体または光学純度の低い後記式(Ｉ)で示されるグリセロール誘導体に微生物処理または酵素処理を加えて光学純度の高いグリセロール誘導体を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
数多くの生物学的に活性な化合物において、光学異性体が存在することは広く知られている。そして通常、目的とする生物学的活性を呈する光学異性体は一方の異性体に限定され、他方の光学異性体は、所望の生物学的活性を有していないか、あるいは毒性などの好ましくない生理作用を伴う場合もある。
【０００３】
このような光学異性体を有する生物学的に活性な化合物において、所望の光学活性体を得るための適当な手段あるいは手法がない場合には、ラセミ体のままで医薬あるいは農薬の用途にしばしば用いられている。このような場合、往々にして、目的とする生物学的活性が著しく低減したり、毒性などの望ましくない生理作用を伴うという問題があった。
【０００４】
この問題を解消するために、光学異性体の分割法が種々検討されている。例えば、分割される光学異性体の各種エステル誘導体を調製し、エステルを光学選択的に加水分解する酵素を該エステル誘導体に作用させ、そして、反応系の溶媒に対する溶解度の差などを利用して光学異性体を互いに分離する方法が提案されている。そして、この方法を実現させるための、種々の光学選択性をもつエステル分解酵素を生産する微生物の開発が行われている。
【０００５】
このような技術的背景において、光学活性な下記式(Ｉ)で示されるグリセロール誘導体、ならびに、それから例えばアルカリ処理によって導かれる光学活性な下記式(II)で示されるグリシドール誘導体は、従来より、医薬もしくは農薬用の有用な生理活性物質あるいは液晶材料などを合成する際の中間体として重要である：
【化２】
【化３】
[式中、Ｒは水素またはアルキル基を表し、＊は不斉炭素原子の位置を示す]。
【０００６】
これら光学活性なグリセロール誘導体およびグリシドール誘導体は、Ｄ−マンニトールを出発原料として合成できることが知られている[ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、43、4876 (1978)]。しかし、この方法は工程が長くかつ重金属を用いなければならないことから、工業的生産への適用には不向きである。
【０００７】
一方、最近では、微生物や酵素の光学選択的反応を利用した光学活性グリセロール誘導体の生産が報告されている。例えば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロコッカス属の微生物を利用する光学活性３−クロロ−１,２−プロパンジオール誘導体の製造方法(特開平７−１１５９９１)、リパーゼによるトリチル−１,２−ジオールの光学選択的エステル化[ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、57、1605 (1992)]、３−ハロ−２−アシロキシ−１−アルキルスルホニルオキシプロパンの光学選択的エステル化(特開平１−９６１７６)、１−ハロゲノ−３−(４−メトキシフェニルオキシ)−２−プロパノールの光学選択的エステル化(特開平５−１９４２９９)、３−クロロ−２−アセトキシ−１−p−トルエンスルホニルオキシプロパンの光学選択的加水分解(特公平４−７５０００；特公平５−１３６３６)、２−ブタノイル−１−フェニルメチル−３−クロロ−１,２−プロパンジオールの光学選択的加水分解[テトラヘドロン：アシメトリー(Ｔetrahedron：Ａsymmetry)、4、961 (1993)]などが報告されている。
【０００８】
また、微生物や酵素の光学選択的反応を利用した光学活性グリシドール誘導体の生産が報告されている。例えば、ブタ膵臓リパーゼによるラセミ体グリシジルブチレートの光学選択的加水分解[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.)、106、7252 (1984)；特開平１−２８５１９９]、ベンジルグリシドール前駆体の光学分割[ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、55、4897 (1990)]、あるいは、アセトバクター(Ａcetobacter)属やグルコノバクター(Ｇluconobacter)属などのアルコールデヒドロゲナーゼによる不斉酸化(EP 0 464 905 A1)などが報告されている。
【０００９】
しかし、これら従来の微生物や酵素を利用する方法は合成法と比較した場合、光学純度の高いグリセロール誘導体およびグリシドール誘導体を与えることは可能であるが、使用する酵素が高価であったり、生産技術的に大量生産が容易でないなどの問題点を含むものであった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の従来技術が抱えていた問題に鑑みて為されたものであり、その目的とするところは、光学純度の高い上記式(Ｉ)で示されるグリセロール誘導体および上記式(II)で示されるグリシドール誘導体を簡便かつ効率よく工業的に製造し得る方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討した結果、ラセミ体または光学純度の低い上記(Ｉ)で示される１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに特定のエステル分解酵素または該酵素を含有する微生物を作用させ、加水分解産物を除去することによって、光学純度の高い該コハク酸モノエステルが容易に得られることを見い出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、式：
【化４】
[式中、Ｒは水素またはアルキル基を表す]
で示されるラセミ体または光学純度の低い１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、該コハク酸モノエステルを光学選択的に加水分解する能力を有するセラチア属、ムコア属、リゾプス属、キャンディダ属、シュードモナス属、バチルス属、アスパジーラス属、スタフィロコッカス属に属する微生物に由来するエステル分解酵素または該酵素を含有する微生物を作用させ、加水分解産物を除去することを特徴とする、光学純度の高い式(Ｉ)で示される１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造法を提供するものである。
【００１３】
光学純度の高い上記式(II)で示されるグリシドール誘導体は、本方法によって得られる光学純度の高い１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを通常のアルカリ処理に付すことによって製造することができる。
【００１４】
本発明において式(Ｉ)および式(II)中のＲがアルキル基である場合、このアルキル基は、１〜２０個、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキル基であってよい。さらに好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル基などであってよい。また、このアルキル基はオルト、メタ、パラ位のいずれの位置に結合していてもよい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明方法において使用するエステル分解酵素は、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに対して高い光学選択性を有するエステル分解酵素である。このようなエステル分解酵素は、セラチア(Ｓerratia)属、ムコア(Ｍucor)属、リゾプス(Ｒhizopus)属、キャンディダ(Ｃandida)属、シュードモナス(Ｐseudomonas)属、バチルス(Ｂacillus)属、アスパジーラス(Ａspergillus)属、スタフィロコッカス(Ｓtaphylococcus)属に属する微生物から得ることができる。
【００１６】
好ましくは、セラチア・マルセッセンス(Ｓerratia marcescens)、ムコア・ミエヘイ(Ｍucor miehei)、リゾプス・ジャポニカス(Ｒhizopus japonicus)、キャンディダ・リポリティカ(Ｃandida lipolytica)、シュードモナス・フラジー(Ｐseudomonas fragi)、バチルス・サブティリス(Ｂacillus subtilis)、アスパジーラス・オクラセウス(Ａspergillus ochraceus)、バチルス・リケニフォルミス(Ｂacillus licheniformis)、バチルス・バディウス(Ｂacillus badius)、バチルス・ブレビス(Ｂacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Ｂacillus circulans)、バチルス・セレウス(Ｂacillus cereus)、バチルス・メガテリウム(Ｂacillus megaterium)、およびスタフィロコッカス・キシローサス(Ｓtaphylococcus xylosus)からなる群から選択された微生物によって産生されたエステル分解酵素を使用する。
【００１７】
さらに好ましくは、バチルス・バディウス ＩＡＭ １１０５９、バチルス・ブレビス ＩＦＯ ３３３１、バチルス・セレウス ＩＡＭ １０２９、バチルス・サーキュランス ＡＴＣＣ ９５００、バチルス・サーキュランス ＩＦＯ ３３２９、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１０７、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９５、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９９、バチルス・メガテリウム ＩＡＭ １２２７、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １２８６、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １０６９、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １１８６、およびスタフィロコッカス・キシローサス ＪＣＭ ２４１８からなる群から選択された微生物によって産生されたエステル分解酵素を使用する。
【００１８】
また、上記式(Ｉ)で示される光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのうち、Ｒ体のモノエステルを得るためには、バチルス属に属する微生物、特にバチルス・リケニフォルミスＩＦＯ １２１０７、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９５、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９９、バチルス・サーキュランス ＡＴＣＣ ９５００、バチルス・サーキュランス ＩＦＯ ３３２９、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １２８６、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １０６９、およびバチルス・サブティリス ＩＡＭ １１８６からなる群から選択された微生物によって産生されたエステル分解酵素を使用するのが好ましい。
一方、Ｓ体のモノエステルを得るためには、スタフィロコッカス属に属する微生物、特にスタフィロコッカス・キシローサス ＪＣＭ ２４１８によって産生されたエステル分解酵素を使用するのが好ましい。
【００１９】
これら微生物は、東京大学応用微生物研究所微生物微細藻類総合センター(ＩＡＭ)、(財)発酵研究所(ＩＦＯ)、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ＡＴＣＣ)、または理化学研究所微生物系統保存施設(ＪＣＭ)から入手することができる。
【００２０】
本発明方法においては、上記微生物に由来する粗製または精製したエステル分解酵素だけでなく、該酵素を産生する微生物菌体、菌体培養物もしくは菌体処理物なども使用することができる。また、該酵素を産生するものであれば、これら微生物の人為的変異法によって得られる微生物菌株を使用することもできる。
【００２１】
本発明方法において使用し得る市販品から入手可能なエステル分解酵素としては、ＳＭエステラーゼ[セラチア・マルセッセンス由来、ナガセ生化学工業社製]、リパーゼＦ７[ムコア・ミエヘイ由来、エンザイマティックス(Ｅnzymatix)社製]、リリパーゼＡ５[リゾプス・ジャポニカス由来、ナガセ生化学工業社製]、リパーゼＦ６[キャンディダ・リポリティカ由来、エンザイマティックス社製]、マルチフェクトＰ５３[バチルス・サブティリス由来、ジー・シー・アイ(ＧＣＩ)社製]、リパーゼＢ[シュードモナス・フラジー由来、和光純薬社製]、ビオプシン[アスパジーラス・オクラセウス由来、ナガセ生化学工業社製]、耐熱性アルカリプロテアーゼ[バチルス属由来、栗田工業社製]、およびタリパーゼ[田辺製薬社製]などが挙げられる。
特にＳＭエステラーゼまたはリパーゼＦ７を用いることにより、上記式(Ｉ)で示される光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのうち、Ｓ体のモノエステルを効率よく得ることができる。
【００２２】
上記微生物は、通常用いられる固体培地、液体培地のどちらを用いて培養してもよいが、液体培地で培養するのが好ましい。培養培地は、微生物の生育および増殖に要求される通常の炭素源、窒素源および無機物を含有する。炭素源としては、例えばデンプン、スクロースまたはグルコースを用いることができる。窒素源としては、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキスなどの天然窒素源や硫安、塩安、尿素などの無機窒素化合物を用いることができる。無機物としては、リン酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウムなどの無機塩を用いることができる。
【００２３】
培地中の炭素源、窒素源および無機物の濃度はそれぞれ１〜２０％、１〜２０％および１〜１０００ppmの範囲であってよく、培養時間は１６〜４８時間程度である。静置培養、通気撹拌培養または振盪培養のいずれの方法を用いて培養してもよい。
【００２４】
本発明方法における酵素反応の基質となるラセミ体の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルは、公知の方法により容易に合成することができる。例えば、トルエン中、ＢＦ3・Ｅt2Ｏの存在下にラセミ体のエピクロロヒドリンを置換または未置換ベンジルアルコールと反応させ、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを合成する。次いで、この生成物を無水コハク酸でエステル化することにより目的のコハク酸モノエステルが得られる。
【００２５】
本方法においては、ラセミ体の基質を使用するのが普通であるが、例えば光学分割処理を行った後の(Ｓ)−体または(Ｒ)−体の一方に富む光学純度の低い混合物を使用することもできる。
【００２６】
本発明の方法は、ラセミ体または光学純度の低い１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを含有する水または緩衝液に、前記微生物に由来するエステル分解酵素、または該酵素を含む微生物自体もしくはその培養物などを添加し、撹拌することにより実施する。反応液のpＨは５〜９、好ましくは６〜８である。反応温度は５℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜３０℃である。反応に用いるエステル分解酵素または微生物もしくはその培養物などの量に特に限定はないが、基質１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに対し、酵素が５０〜５００mg／基質モルの範囲になるように添加するのが好ましい。反応時間は、用いる酵素の量、反応温度、反応pＨなどにより変動するが、通常は１〜２４時間程度で完了する。
【００２７】
反応終了後、生成した１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを溶媒抽出法、結晶析出法、カラムクロマトグラフ法などの通常用いられる分離操作で分取する。
【００２８】
溶媒抽出法では、酸性条件下で酢酸エチルを用い、生成した１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを反応液から抽出する。次いで、pＨ８のリン酸カリウム緩衝液で未反応の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを抽出することにより、このエステルを反応液から９５％以上の回収率で回収することができる。
【００２９】
さらに、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを含む水溶液に、適当量のアルカリ(例えば、２Ｎ水酸化ナトリウム)を添加し、エポキシ環を形成させることにより、光学活性な置換または未置換ベンジルグリシドールを９５％以上の収率で生成させることができる。
【００３０】
これらの反応を、以下の反応式Ｉにまとめて示す。
【化５】
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、実施例における反応液中の１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルと１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールの定量および光学純度の測定は、以下の分析条件下、高速液体クロマトグラフィーにより行った。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
使用装置：ウォーターズ(Ｗaters)社製 ＬＣ モジュール１ 高速液体クロマトグラフィー；
カラム：キラルパック(CHIRALPAK) ＡＳ ０.４６φ×２５０mm(ダイセル化学工業社製)；
溶離液：ヘキサン・イソプロピルアルコール・酢酸(９７：３：０.３)；
温度：室温；
流速：１ml／分；
検出器：ＵＶ２５４nm 。
【００３２】
実施例１ 微生物の培養
本発明の方法に用いる微生物は、次のように培養した。即ち、５００mＬ容の三角フラスコに下記組成の培地１００mＬをとり、予め同培地で前培養しておいた上記微生物の培養液１mＬを接種し、３０℃で１６時間、ロータリーシェーカーで振盪培養(１６０rpm)を行った。培養終了後、ＯＤ660が１０〜３０の菌体培養液を得た。
【表１】
【００３３】
実施例２ (Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造(その１)
３００mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)５mＬを入れたバイアル瓶に、１００mＭの濃度になるように１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを加えた。これにセラチア・マルセッセンス由来のＳＭエステラーゼ５０mgを加え、３０℃で１６時間撹拌した。この反応液に２Ｎ塩酸１mＬを加えて反応を停止させた後、酢酸エチル５mＬで１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを抽出した。この抽出液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが収率４５％で得られたことがわかった。この酢酸エチル抽出液に５０mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ８.０)５mＬを加え、(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを抽出し、光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを収率４１％で得た。
【００３４】
実施例３ (Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造(その２)
セラチア・マルセッセンス由来のＳＭエステラーゼ２００mgを溶解した３００mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)３０mＬを入れたバイアル瓶に、２Ｍの濃度になるように１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを溶解させたメチルイソブチルケトン(ＭＩＢＫ)を加え、２５℃で５０時間撹拌した。反応液のpＨは、pＨスタットを用い、２Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ６.６に調整した。反応終了後、４Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ９に調整し、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを含むＭＩＢＫ層と未反応の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを含む水層を分離した。水層を等容量のＭＩＢＫで洗浄し、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが収率４３％で得られたことがわかった。
【００３５】
実施例４ (Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造
３００mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)５mＬを入れたバイアル瓶に、１００mＭの濃度になるように１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを加えた。次いで、実施例１の記載のように培養したバチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１０７の培養液１mＬを加え、３０℃で１６時間撹拌した。反応液に２Ｎ塩酸１mＬを加えて反応を停止させた後、酢酸エチル５mＬで１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを抽出した。この抽出液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、光学純度９８％の(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが収率３７％で得られたことがわかった。この酢酸エチル抽出液に５０mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ８.０)５mＬを加え、(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを抽出し、光学純度９９％の(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを収率３３％で得た。
【００３６】
実施例５ 光学活性ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造
下記表２に示した各種エステル加水分解酵素または下記表３に示した各種微生物を実施例３または４の方法に従って反応させ、光学活性な(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルまたは(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを得た。
【表２】
【表３】
【００３７】
製造例１ (Ｓ)−ベンジルグリシドールの製造
実施例３で得られた光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、５℃以下で５当量の２Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５時間反応させた。反応終了後、生成した(Ｓ)−ベンジルグリシドールをメチル-t-ブチルエーテルで抽出し、これを濃縮することにより、９４％の収率で光学純度９８％ee以上の(Ｓ)−ベンジルグリシドールを得た。
【００３８】
製造例２ (Ｒ)−ベンジルグリシドールの製造
実施例４で得られた光学純度９９％の(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、５℃以下で５当量の２Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５時間反応させた。反応終了後、生成した(Ｒ)−ベンジルグリシドールをメチル-t-ブチルエーテルで抽出し、これを濃縮することにより、９２％の収率で光学純度９８％ee以上の(Ｒ)−ベンジルグリシドールを得た。
【００３９】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明の方法を用いると、光学純度の高いグリセロール誘導体を簡便かつ効率的に製造することができ、本方法は工業的に極めて有利である。また、得られた光学純度の高いグリセロール誘導体を用いて光学純度の高い対応するグリシドール誘導体を容易に製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラセミ体または光学純度の低い後記式(Ｉ)で示されるグリセロール誘導体に微生物処理または酵素処理を加えて光学純度の高いグリセロール誘導体を得る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
数多くの生物学的に活性な化合物において、光学異性体が存在することは広く知られている。そして通常、目的とする生物学的活性を呈する光学異性体は一方の異性体に限定され、他方の光学異性体は、所望の生物学的活性を有していないか、あるいは毒性などの好ましくない生理作用を伴う場合もある。
【０００３】
このような光学異性体を有する生物学的に活性な化合物において、所望の光学活性体を得るための適当な手段あるいは手法がない場合には、ラセミ体のままで医薬あるいは農薬の用途にしばしば用いられている。このような場合、往々にして、目的とする生物学的活性が著しく低減したり、毒性などの望ましくない生理作用を伴うという問題があった。
【０００４】
この問題を解消するために、光学異性体の分割法が種々検討されている。例えば、分割される光学異性体の各種エステル誘導体を調製し、エステルを光学選択的に加水分解する酵素を該エステル誘導体に作用させ、そして、反応系の溶媒に対する溶解度の差などを利用して光学異性体を互いに分離する方法が提案されている。そして、この方法を実現させるための、種々の光学選択性をもつエステル分解酵素を生産する微生物の開発が行われている。
【０００５】
このような技術的背景において、光学活性な下記式(Ｉ)で示されるグリセロール誘導体、ならびに、それから例えばアルカリ処理によって導かれる光学活性な下記式(II)で示されるグリシドール誘導体は、従来より、医薬もしくは農薬用の有用な生理活性物質あるいは液晶材料などを合成する際の中間体として重要である：
【化２】
【０００６】
これら光学活性なグリセロール誘導体およびグリシドール誘導体は、Ｄ−マンニトールを出発原料として合成できることが知られている[ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、43、4876 (1978)]。しかし、この方法は工程が長くかつ重金属を用いなければならないことから、工業的生産への適用には不向きである。
【０００７】
一方、最近では、微生物や酵素の光学選択的反応を利用した光学活性グリセロール誘導体の生産が報告されている。例えば、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロコッカス属の微生物を利用する光学活性３−クロロ−１,２−プロパンジオール誘導体の製造方法(特開平７−１１５９９１)、リパーゼによるトリチル−１,２−ジオールの光学選択的エステル化[ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、57、1605 (1992)]、３−ハロ−２−アシロキシ−１−アルキルスルホニルオキシプロパンの光学選択的エステル化(特開平１−９６１７６)、１−ハロゲノ−３−(４−メトキシフェニルオキシ)−２−プロパノールの光学選択的エステル化(特開平５−１９４２９９)、３−クロロ−２−アセトキシ−１−p−トルエンスルホニルオキシプロパンの光学選択的加水分解(特公平４−７５０００；特公平５−１３６３６)、２−ブタノイル−１−フェニルメチル−３−クロロ−１,２−プロパンジオールの光学選択的加水分解[テトラヘドロン：アシメトリー(Ｔetrahedron：Ａsymmetry)、4、961 (1993)]などが報告されている。
【０００８】
また、微生物や酵素の光学選択的反応を利用した光学活性グリシドール誘導体の生産が報告されている。例えば、ブタ膵臓リパーゼによるラセミ体グリシジルブチレートの光学選択的加水分解[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc.)、106、7252 (1984)；特開平１−２８５１９９]、ベンジルグリシドール前駆体の光学分割[ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、55、4897 (1990)]、あるいは、アセトバクター(Ａcetobacter)属やグルコノバクター(Ｇluconobacter)属などのアルコールデヒドロゲナーゼによる不斉酸化(EP 0 464 905 A1)などが報告されている。
【０００９】
しかし、これら従来の微生物や酵素を利用する方法は合成法と比較した場合、光学純度の高いグリセロール誘導体およびグリシドール誘導体を与えることは可能であるが、使用する酵素が高価であったり、生産技術的に大量生産が容易でないなどの問題点を含むものであった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の従来技術が抱えていた問題に鑑みて為されたものであり、その目的とするところは、光学純度の高い上記式(Ｉ)で示されるグリセロール誘導体および上記式(II)で示されるグリシドール誘導体を簡便かつ効率よく工業的に製造し得る方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討した結果、ラセミ体または光学純度の低い上記(Ｉ)で示される１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに特定のエステル分解酵素または該酵素を含有する微生物を作用させ、加水分解産物を除去することによって、光学純度の高い該コハク酸モノエステルが容易に得られることを見い出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、式：
【化４】
で示されるラセミ体または光学純度の低い１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、該コハク酸モノエステルを光学選択的に加水分解する能力を有するセラチア属、ムコア属、リゾプス属、キャンディダ属、シュードモナス属、バチルス属、アスパジーラス属、スタフィロコッカス属に属する微生物に由来するエステル分解酵素または該酵素を含有する微生物を作用させ、加水分解産物を除去することを特徴とする、光学純度の高い式(Ｉ)で示される１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造法を提供するものである。
【００１３】
光学純度の高い上記式(II)で示されるグリシドール誘導体は、本方法によって得られる光学純度の高い１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを通常のアルカリ処理に付すことによって製造することができる。
【００１４】
本発明において式(Ｉ)および式(II)中のＲがアルキル基である場合、このアルキル基は、１〜２０個、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキル基であってよい。さらに好ましくは、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル基などであってよい。また、このアルキル基はオルト、メタ、パラ位のいずれの位置に結合していてもよい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明方法において使用するエステル分解酵素は、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに対して高い光学選択性を有するエステル分解酵素である。このようなエステル分解酵素は、セラチア(Ｓerratia)属、ムコア(Ｍucor)属、リゾプス(Ｒhizopus)属、キャンディダ(Ｃandida)属、シュードモナス(Ｐseudomonas)属、バチルス(Ｂacillus)属、アスパジーラス(Ａspergillus)属、スタフィロコッカス(Ｓtaphylococcus)属に属する微生物から得ることができる。
【００１６】
好ましくは、セラチア・マルセッセンス(Ｓerratia marcescens)、ムコア・ミエヘイ(Ｍucor miehei)、リゾプス・ジャポニカス(Ｒhizopus japonicus)、キャンディダ・リポリティカ(Ｃandida lipolytica)、シュードモナス・フラジー(Ｐseudomonas fragi)、バチルス・サブティリス(Ｂacillus subtilis)、アスパジーラス・オクラセウス(Ａspergillus ochraceus)、バチルス・リケニフォルミス(Ｂacillus licheniformis)、バチルス・バディウス(Ｂacillus badius)、バチルス・ブレビス(Ｂacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Ｂacillus circulans)、バチルス・セレウス(Ｂacillus cereus)、バチルス・メガテリウム(Ｂacillus megaterium)、およびスタフィロコッカス・キシローサス(Ｓtaphylococcus xylosus)からなる群から選択された微生物によって産生されたエステル分解酵素を使用する。
【００１７】
さらに好ましくは、バチルス・バディウス ＩＡＭ １１０５９、バチルス・ブレビス ＩＦＯ ３３３１、バチルス・セレウス ＩＡＭ １０２９、バチルス・サーキュランス ＡＴＣＣ ９５００、バチルス・サーキュランス ＩＦＯ ３３２９、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１０７、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９５、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９９、バチルス・メガテリウム ＩＡＭ １２２７、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １２８６、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １０６９、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １１８６、およびスタフィロコッカス・キシローサス ＪＣＭ ２４１８からなる群から選択された微生物によって産生されたエステル分解酵素を使用する。
【００１８】
また、上記式(Ｉ)で示される光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのうち、Ｒ体のモノエステルを得るためには、バチルス属に属する微生物、特にバチルス・リケニフォルミスＩＦＯ １２１０７、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９５、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９９、バチルス・サーキュランス ＡＴＣＣ ９５００、バチルス・サーキュランス ＩＦＯ ３３２９、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １２８６、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １０６９、およびバチルス・サブティリス ＩＡＭ １１８６からなる群から選択された微生物によって産生されたエステル分解酵素を使用するのが好ましい。
一方、Ｓ体のモノエステルを得るためには、スタフィロコッカス属に属する微生物、特にスタフィロコッカス・キシローサス ＪＣＭ ２４１８によって産生されたエステル分解酵素を使用するのが好ましい。
【００１９】
これら微生物は、東京大学応用微生物研究所微生物微細藻類総合センター(ＩＡＭ)、(財)発酵研究所(ＩＦＯ)、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ＡＴＣＣ)、または理化学研究所微生物系統保存施設(ＪＣＭ)から入手することができる。
【００２０】
本発明方法においては、上記微生物に由来する粗製または精製したエステル分解酵素だけでなく、該酵素を産生する微生物菌体、菌体培養物もしくは菌体処理物なども使用することができる。また、該酵素を産生するものであれば、これら微生物の人為的変異法によって得られる微生物菌株を使用することもできる。
【００２１】
本発明方法において使用し得る市販品から入手可能なエステル分解酵素としては、ＳＭエステラーゼ[セラチア・マルセッセンス由来、ナガセ生化学工業社製]、リパーゼＦ７[ムコア・ミエヘイ由来、エンザイマティックス(Ｅnzymatix)社製]、リリパーゼＡ５[リゾプス・ジャポニカス由来、ナガセ生化学工業社製]、リパーゼＦ６[キャンディダ・リポリティカ由来、エンザイマティックス社製]、マルチフェクトＰ５３[バチルス・サブティリス由来、ジー・シー・アイ(ＧＣＩ)社製]、リパーゼＢ[シュードモナス・フラジー由来、和光純薬社製]、ビオプシン[アスパジーラス・オクラセウス由来、ナガセ生化学工業社製]、耐熱性アルカリプロテアーゼ[バチルス属由来、栗田工業社製]、およびタリパーゼ[田辺製薬社製]などが挙げられる。
特にＳＭエステラーゼまたはリパーゼＦ７を用いることにより、上記式(Ｉ)で示される光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのうち、Ｓ体のモノエステルを効率よく得ることができる。
【００２２】
上記微生物は、通常用いられる固体培地、液体培地のどちらを用いて培養してもよいが、液体培地で培養するのが好ましい。培養培地は、微生物の生育および増殖に要求される通常の炭素源、窒素源および無機物を含有する。炭素源としては、例えばデンプン、スクロースまたはグルコースを用いることができる。窒素源としては、酵母エキス、カゼイン、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキスなどの天然窒素源や硫安、塩安、尿素などの無機窒素化合物を用いることができる。無機物としては、リン酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウムなどの無機塩を用いることができる。
【００２３】
培地中の炭素源、窒素源および無機物の濃度はそれぞれ１〜２０％、１〜２０％および１〜１０００ppmの範囲であってよく、培養時間は１６〜４８時間程度である。静置培養、通気撹拌培養または振盪培養のいずれの方法を用いて培養してもよい。
【００２４】
本発明方法における酵素反応の基質となるラセミ体の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルは、公知の方法により容易に合成することができる。例えば、トルエン中、ＢＦ3・Ｅt2Ｏの存在下にラセミ体のエピクロロヒドリンを置換または未置換ベンジルアルコールと反応させ、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを合成する。次いで、この生成物を無水コハク酸でエステル化することにより目的のコハク酸モノエステルが得られる。
【００２５】
本方法においては、ラセミ体の基質を使用するのが普通であるが、例えば光学分割処理を行った後の(Ｓ)−体または(Ｒ)−体の一方に富む光学純度の低い混合物を使用することもできる。
【００２６】
本発明の方法は、ラセミ体または光学純度の低い１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを含有する水または緩衝液に、前記微生物に由来するエステル分解酵素、または該酵素を含む微生物自体もしくはその培養物などを添加し、撹拌することにより実施する。反応液のpＨは５〜９、好ましくは６〜８である。反応温度は５℃〜５０℃、好ましくは１０℃〜３０℃である。反応に用いるエステル分解酵素または微生物もしくはその培養物などの量に特に限定はないが、基質１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに対し、酵素が５０〜５００mg／基質モルの範囲になるように添加するのが好ましい。反応時間は、用いる酵素の量、反応温度、反応pＨなどにより変動するが、通常は１〜２４時間程度で完了する。
【００２７】
反応終了後、生成した１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを溶媒抽出法、結晶析出法、カラムクロマトグラフ法などの通常用いられる分離操作で分取する。
【００２８】
溶媒抽出法では、酸性条件下で酢酸エチルを用い、生成した１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを反応液から抽出する。次いで、pＨ８のリン酸カリウム緩衝液で未反応の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを抽出することにより、このエステルを反応液から９５％以上の回収率で回収することができる。
【００２９】
さらに、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを含む水溶液に、適当量のアルカリ(例えば、２Ｎ水酸化ナトリウム)を添加し、エポキシ環を形成させることにより、光学活性な置換または未置換ベンジルグリシドールを９５％以上の収率で生成させることができる。
【００３０】
これらの反応を、以下の反応式Ｉにまとめて示す。
【化５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、実施例における反応液中の１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルと１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールの定量および光学純度の測定は、以下の分析条件下、高速液体クロマトグラフィーにより行った。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
使用装置：ウォーターズ(Ｗaters)社製 ＬＣ モジュール１ 高速液体クロマトグラフィー；
カラム：キラルパック(CHIRALPAK) ＡＳ ０.４６φ×２５０mm(ダイセル化学工業社製)；
溶離液：ヘキサン・イソプロピルアルコール・酢酸(９７：３：０.３)；
温度：室温；
流速：１ml／分；
検出器：ＵＶ２５４nm 。
【００３２】
実施例１ 微生物の培養
本発明の方法に用いる微生物は、次のように培養した。即ち、５００mＬ容の三角フラスコに下記組成の培地１００mＬをとり、予め同培地で前培養しておいた上記微生物の培養液１mＬを接種し、３０℃で１６時間、ロータリーシェーカーで振盪培養(１６０rpm)を行った。培養終了後、ＯＤ660が１０〜３０の菌体培養液を得た。
【表１】
実施例２ (Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造(その１)
３００mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)５mＬを入れたバイアル瓶に、１００mＭの濃度になるように１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを加えた。これにセラチア・マルセッセンス由来のＳＭエステラーゼ５０mgを加え、３０℃で１６時間撹拌した。この反応液に２Ｎ塩酸１mＬを加えて反応を停止させた後、酢酸エチル５mＬで１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを抽出した。この抽出液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが収率４５％で得られたことがわかった。この酢酸エチル抽出液に５０mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ８.０)５mＬを加え、(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを抽出し、光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを収率４１％で得た。
【００３４】
実施例３ (Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造(その２)
セラチア・マルセッセンス由来のＳＭエステラーゼ２００mgを溶解した３００mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)３０mＬを入れたバイアル瓶に、２Ｍの濃度になるように１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを溶解させたメチルイソブチルケトン(ＭＩＢＫ)を加え、２５℃で５０時間撹拌した。反応液のpＨは、pＨスタットを用い、２Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ６.６に調整した。反応終了後、４Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ９に調整し、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを含むＭＩＢＫ層と未反応の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを含む水層を分離した。水層を等容量のＭＩＢＫで洗浄し、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが収率４３％で得られたことがわかった。
【００３５】
実施例４ (Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造
３００mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ７.０)５mＬを入れたバイアル瓶に、１００mＭの濃度になるように１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを加えた。次いで、実施例１の記載のように培養したバチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１０７の培養液１mＬを加え、３０℃で１６時間撹拌した。反応液に２Ｎ塩酸１mＬを加えて反応を停止させた後、酢酸エチル５mＬで１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールと未反応の１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを抽出した。この抽出液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、光学純度９８％の(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが収率３７％で得られたことがわかった。この酢酸エチル抽出液に５０mＭリン酸カリウム緩衝液(pＨ８.０)５mＬを加え、(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを抽出し、光学純度９９％の(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを収率３３％で得た。
【００３６】
実施例５ 光学活性ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造
下記表２に示した各種エステル加水分解酵素または下記表３に示した各種微生物を実施例３または４の方法に従って反応させ、光学活性な(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルまたは(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを得た。
【表２】
製造例１ (Ｓ)−ベンジルグリシドールの製造
実施例３で得られた光学純度９９％の(Ｓ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、５℃以下で５当量の２Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５時間反応させた。反応終了後、生成した(Ｓ)−ベンジルグリシドールをメチル-t-ブチルエーテルで抽出し、これを濃縮することにより、９４％の収率で光学純度９８％ee以上の(Ｓ)−ベンジルグリシドールを得た。
【００３８】
製造例２ (Ｒ)−ベンジルグリシドールの製造
実施例４で得られた光学純度９９％の(Ｒ)−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、５℃以下で５当量の２Ｎ水酸化ナトリウムを加え、５時間反応させた。反応終了後、生成した(Ｒ)−ベンジルグリシドールをメチル-t-ブチルエーテルで抽出し、これを濃縮することにより、９２％の収率で光学純度９８％ee以上の(Ｒ)−ベンジルグリシドールを得た。
【００３９】
【発明の効果】
以上に説明したように、本発明の方法を用いると、光学純度の高いグリセロール誘導体を簡便かつ効率的に製造することができ、本方法は工業的に極めて有利である。また、得られた光学純度の高いグリセロール誘導体を用いて光学純度の高い対応するグリシドール誘導体を容易に製造することができる。
Claims (3)
- 式：
で示されるラセミ体または光学純度の低いコハク酸モノエステルに、該コハク酸モノエステルを光学選択的に加水分解する能力を有するセラチア属、ムコア属、リゾプス属、キャンディダ属、シュードモナス属、バチルス属、アスパジーラス属、スタフィロコッカス属に属する微生物に由来するエステル分解酵素または該酵素を含有する微生物を作用させ、加水分解産物を除去することを特徴とする、光学純度の高い式(Ｉ)で示されるコハク酸モノエステルの製造法。 - 微生物がセラチア・マルセッセンス、ムコア・ミエヘイ、リゾプス・ジャポニカス、キャンディダ・リポリティカ、シュードモナス・フラジー、バチルス・サブティリス、アスパジーラス・オクラセウス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・バディウス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・セレウス、バチルス・メガテリウム、およびスタフィロコッカス・キシローサスからなる群から選択された微生物である請求項１に記載の製造法。
- 微生物が、バチルス・バディウス ＩＡＭ １１０５９、バチルス・ブレビス ＩＦＯ ３３３１、バチルス・セレウス ＩＡＭ １０２９、バチルス・サーキュランス ＡＴＣＣ ９５００、バチルス・サーキュランス ＩＦＯ ３３２９、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１０７、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９５、バチルス・リケニフォルミス ＩＦＯ １２１９９、バチルス・メガテリウム ＩＡＭ １２２７、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １２８６、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １０６９、バチルス・サブティリス ＩＡＭ １１８６、またはスタフィロコッカス・キシローサス ＪＣＭ ２４１８である請求項２に記載の製造法。
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