JPH08242853A - 立体選択的に加水分解する微生物エステラーゼ及びその利用 - Google Patents
立体選択的に加水分解する微生物エステラーゼ及びその利用Info
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- JPH08242853A JPH08242853A JP7312840A JP31284095A JPH08242853A JP H08242853 A JPH08242853 A JP H08242853A JP 7312840 A JP7312840 A JP 7312840A JP 31284095 A JP31284095 A JP 31284095A JP H08242853 A JPH08242853 A JP H08242853A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 例えば、ナプロキセンエステルをナプロキセ
ンに立体選択的に加水分解する方法の提供。 【解決手段】 式（Ｉ）： （ただし、Ｒ1 は、任意に置換し得るフェニル又はナフ
チル基のような任意に置換しうるアリール基又はヘテロ
環システム、もしくは炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素
から選ばれた１以上の原子とを含む、任意に置換されて
いてもよいヘテロ芳香環システム。）で示され、かつ少
なくとも８０重量％のＳ−配置を有する薬学的に活性な
化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容し得る塩又はエステ
ルの製造方法であって、式（II) ： （ただし、Ｒ1 は上記定義通り、Ｒ2 はエステル残基、
好ましくは任意に置換されうるアルキル基。）で示され
る化合物(II)、例えばナプロキセンエステルをナプロキ
センに立体選択的に加水分解する形質転換微生物より得
られたバチルス属由来エステラーゼにより、化合物
（Ｉ）を薬学的に許容し得る塩又はエステルに変換す
る。
ンに立体選択的に加水分解する方法の提供。 【解決手段】 式（Ｉ）： （ただし、Ｒ1 は、任意に置換し得るフェニル又はナフ
チル基のような任意に置換しうるアリール基又はヘテロ
環システム、もしくは炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素
から選ばれた１以上の原子とを含む、任意に置換されて
いてもよいヘテロ芳香環システム。）で示され、かつ少
なくとも８０重量％のＳ−配置を有する薬学的に活性な
化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容し得る塩又はエステ
ルの製造方法であって、式（II) ： （ただし、Ｒ1 は上記定義通り、Ｒ2 はエステル残基、
好ましくは任意に置換されうるアルキル基。）で示され
る化合物(II)、例えばナプロキセンエステルをナプロキ
センに立体選択的に加水分解する形質転換微生物より得
られたバチルス属由来エステラーゼにより、化合物
（Ｉ）を薬学的に許容し得る塩又はエステルに変換す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の薬学的に活
性エステル、例えばナプロキセンエステルを、少なくと
も８０重量％のＳ−配置を有する例えば、ナプロキセン
に立体選択的に加水分解することのできる微生物由来の
エステラーゼ及びその利用方法に関する。
性エステル、例えばナプロキセンエステルを、少なくと
も８０重量％のＳ−配置を有する例えば、ナプロキセン
に立体選択的に加水分解することのできる微生物由来の
エステラーゼ及びその利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】数多くの生物学的に活性な化合物が、立
体異性体の混合物の形で存在することが知られている。
現在に至るまで、これらの混合物はしばしば、農業的又
は薬学的目的で利用されている。通常、望ましい生物学
的活性残基は、一方の立体異性体に存在するので、その
結果、２ヶの立体異性体の混合物の場合、その混合物の
能力は半分に減ってしまう。しかし、立体異性体を混合
物のまま使用する大きな理由は、立体異性体の分離のた
めのコストが、それによる活性の増加による潜在的利点
を越えてしまうことにある。しかし、現代の薬学者は徐
々に、いくつかの立体異性体中の１つは望ましい治療的
効果をもたないだけでなく、他の望ましくない、毒性も
含む生理学的効果をもつかもしれないというような、混
合物の投与に対する他の意味にも気付きはじめてきてい
る。特に、Ｓ．アダムス（S. Adams) 等によりジャーナ
ル・オブ・ファーム・アンド・ファーマキューティック
（J. Pharm. Pharmac.) ２８巻２５６頁（１９７６年）
及び、Ａ．Ｊ．ハット（A. J. Hutt) 及びＪ．コールド
ウェル（J. Caldwell)による、クリニカル・ファーマコ
キネティクス（Clinical Phamacokinetics)９巻３７１
頁（１９８４年）の報告で知られているように、ナプロ
キセン（naproxen) 及びイブプロフェン（ibuprofen)の
試験管内における抗炎症活性は、Ｓ−エナンチオマー
（光学活性立体異性体）にあり、その対掌体の１５０倍
にも及ぶことが発見された。
体異性体の混合物の形で存在することが知られている。
現在に至るまで、これらの混合物はしばしば、農業的又
は薬学的目的で利用されている。通常、望ましい生物学
的活性残基は、一方の立体異性体に存在するので、その
結果、２ヶの立体異性体の混合物の場合、その混合物の
能力は半分に減ってしまう。しかし、立体異性体を混合
物のまま使用する大きな理由は、立体異性体の分離のた
めのコストが、それによる活性の増加による潜在的利点
を越えてしまうことにある。しかし、現代の薬学者は徐
々に、いくつかの立体異性体中の１つは望ましい治療的
効果をもたないだけでなく、他の望ましくない、毒性も
含む生理学的効果をもつかもしれないというような、混
合物の投与に対する他の意味にも気付きはじめてきてい
る。特に、Ｓ．アダムス（S. Adams) 等によりジャーナ
ル・オブ・ファーム・アンド・ファーマキューティック
（J. Pharm. Pharmac.) ２８巻２５６頁（１９７６年）
及び、Ａ．Ｊ．ハット（A. J. Hutt) 及びＪ．コールド
ウェル（J. Caldwell)による、クリニカル・ファーマコ
キネティクス（Clinical Phamacokinetics)９巻３７１
頁（１９８４年）の報告で知られているように、ナプロ
キセン（naproxen) 及びイブプロフェン（ibuprofen)の
試験管内における抗炎症活性は、Ｓ−エナンチオマー
（光学活性立体異性体）にあり、その対掌体の１５０倍
にも及ぶことが発見された。
【０００３】Ｓ．イリウチジマ（S. Iriuchijima) と、
Ａ．ケイユ（A. Keiyu) （アグリカルチャナレ・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chr
m.）45巻、１３８９頁（１９８１年））は、ある選ばれ
た微生物は、低い転換率ではあるが、ナプロキセン及び
ケトプロフェンのメチルエステルを加水分解することが
できることを示した。アスペルギルス・ソジャエ（Aspe
rgillus sojae)は、選択的に、Ｒ型ナプロキセンのメチ
ルエステルを加水分解し、９５重量パーセントのＲ−配
置をもつナプロキセンを生産し、一方、ミクロバクテリ
ウム・スメグマティス（Mycrobacterium smegmatis) は
選択的にＳ型ケトプロフェン（ketoprofen）のメチルエ
ステルを加水分解し、６９重量パーセントではあるがＳ
−配置をもつケトプロフェンを与える。ドイツ特許出願
DE 3345660号中には、ナプロキセン・エステルのラセミ
体からのＳ−ナプロキセンの生産が述べられている。し
かし、この特許出願中では、Ｓ型ナプロキセンが、ナプ
ロキセンエステルのラセミ体から直接形成されるのでは
なく、Ｒ型のナプロキセンエステルを酵素的に加水分解
し、生じたＲ−ナプロキセンを、Ｓ型ナプロキセンのエ
ステルと分解した後、反応混合物中に残存するＳ型ナプ
ロキセンエステルのけん化又は酵素的加水分解によって
形成するものである。
Ａ．ケイユ（A. Keiyu) （アグリカルチャナレ・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chr
m.）45巻、１３８９頁（１９８１年））は、ある選ばれ
た微生物は、低い転換率ではあるが、ナプロキセン及び
ケトプロフェンのメチルエステルを加水分解することが
できることを示した。アスペルギルス・ソジャエ（Aspe
rgillus sojae)は、選択的に、Ｒ型ナプロキセンのメチ
ルエステルを加水分解し、９５重量パーセントのＲ−配
置をもつナプロキセンを生産し、一方、ミクロバクテリ
ウム・スメグマティス（Mycrobacterium smegmatis) は
選択的にＳ型ケトプロフェン（ketoprofen）のメチルエ
ステルを加水分解し、６９重量パーセントではあるがＳ
−配置をもつケトプロフェンを与える。ドイツ特許出願
DE 3345660号中には、ナプロキセン・エステルのラセミ
体からのＳ−ナプロキセンの生産が述べられている。し
かし、この特許出願中では、Ｓ型ナプロキセンが、ナプ
ロキセンエステルのラセミ体から直接形成されるのでは
なく、Ｒ型のナプロキセンエステルを酵素的に加水分解
し、生じたＲ−ナプロキセンを、Ｓ型ナプロキセンのエ
ステルと分解した後、反応混合物中に残存するＳ型ナプ
ロキセンエステルのけん化又は酵素的加水分解によって
形成するものである。
【０００４】最近の刊行されたもの（ク・ミン（Qu−Mi
ng) 等テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letter
s)、２７巻、１６号、１７〜６３頁（１９８６年））に
は、Ｓ型ナプロキセンエステルを、立体選択的に転換し
うる、カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindrace
a)からの１つの酵素の調製法が述べられている。著者ら
は、この調製物中に存在する、カンジダ・リパーゼが、
ナプロキセンの加水分解を任っていることを示してい
る。しかし、彼等が精製したリパーゼ調製物の比活性は
非常に低い（ある条件下で、リパーゼ・ミリグラム当
り、毎分３×１０-8モル）。それ故、Ｓ型立体異性体の
直接的調製に対し、経済的に魅力のある収率を得ること
ができる工業的規模のプロセスに対する大きな需要が存
在し、そのようなプロセスを与えることは有用である。
広範囲な研究と実験との結果、式（Ｉ）：
ng) 等テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letter
s)、２７巻、１６号、１７〜６３頁（１９８６年））に
は、Ｓ型ナプロキセンエステルを、立体選択的に転換し
うる、カンジダ・シリンドラセア（Candida cylindrace
a)からの１つの酵素の調製法が述べられている。著者ら
は、この調製物中に存在する、カンジダ・リパーゼが、
ナプロキセンの加水分解を任っていることを示してい
る。しかし、彼等が精製したリパーゼ調製物の比活性は
非常に低い（ある条件下で、リパーゼ・ミリグラム当
り、毎分３×１０-8モル）。それ故、Ｓ型立体異性体の
直接的調製に対し、経済的に魅力のある収率を得ること
ができる工業的規模のプロセスに対する大きな需要が存
在し、そのようなプロセスを与えることは有用である。
広範囲な研究と実験との結果、式（Ｉ）：
【０００５】
【化３】
【０００６】（ただし、Ｒ1 は、任意に置換し得るフェ
ニル又はナフチル基のような任意に置換しうるアリール
基又はヘテロ環システムであり、もしくは炭素原子と、
窒素、硫黄及び酸素から選ばれた１以上の原子とを含
む、任意に置換されていてもよいヘテロ芳香環システム
である。）で示され、かつ少なくとも８０重量％のＳ−
配置を有する薬学的に活性な化合物（Ｉ）又はその薬学
的に許容し得る塩又はエステルの製造方法であって、式
（II) ：
ニル又はナフチル基のような任意に置換しうるアリール
基又はヘテロ環システムであり、もしくは炭素原子と、
窒素、硫黄及び酸素から選ばれた１以上の原子とを含
む、任意に置換されていてもよいヘテロ芳香環システム
である。）で示され、かつ少なくとも８０重量％のＳ−
配置を有する薬学的に活性な化合物（Ｉ）又はその薬学
的に許容し得る塩又はエステルの製造方法であって、式
（II) ：
【０００７】
【化４】
【０００８】（ただし、Ｒ1 は上記定義の通りであり、
Ｒ2 は、エステル残基、好ましくは任意に置換されうる
アルキル基である。）で示される化合物(II)を、少なく
とも８０重量％のＳ−配置を有する化合物（Ｉ）に立体
選択的に加水分解することのできる微生物のエステラー
ゼであって、等電点が5.４；見かけ分子量が３１００
０；最適Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最適温度が２５
〜４５℃であるエステラーゼをコードし、かつバチルス
属 Thai I-8 (CBS 679.85)から得ることができる DNAフ
ラグメントによって形質転換することによって、化合物
（II）を化合物（Ｉ）に立体選択的に加水分解するエス
テラーゼ活性を取得した又はエステラーゼ活性を増大さ
せた微生物又はその由来物質の作用に付し、必要によ
り、前記化合物（Ｉ）を薬学的に許容し得る塩又はエス
テルに変換する方法が、まさに発見された。従って、本
発明は、化合物（Ｉ）の立体特異的Ｓ−配置の薬学的に
活性な化合物もしくは、好ましくはそのアルカリ金属塩
又はアルカリ土類金属塩である、薬学的に許容し得るそ
の塩又はエステル（ただし、Ｒ1 が任意に置換され得る
ヘテロ環システムに任意に含まれ得るフェニル又はナフ
チル基のような任意に置換しうるアリール基、もくし
は、任意に置換され得るシステムで、炭素原子の他に窒
素、硫黄及び酸素から選ばれた１以上の原子とを含むヘ
テロ環システムを表し、Ｒ2 が任意に置換されるアルキ
ル基である）を優先的に生産するための、化合物(II)を
化合物（Ｉ）に立体選択的に加水分解して、化合物
（Ｉ）に転換する能力を有する微生物を作成させること
を含有する方法に関する。
Ｒ2 は、エステル残基、好ましくは任意に置換されうる
アルキル基である。）で示される化合物(II)を、少なく
とも８０重量％のＳ−配置を有する化合物（Ｉ）に立体
選択的に加水分解することのできる微生物のエステラー
ゼであって、等電点が5.４；見かけ分子量が３１００
０；最適Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最適温度が２５
〜４５℃であるエステラーゼをコードし、かつバチルス
属 Thai I-8 (CBS 679.85)から得ることができる DNAフ
ラグメントによって形質転換することによって、化合物
（II）を化合物（Ｉ）に立体選択的に加水分解するエス
テラーゼ活性を取得した又はエステラーゼ活性を増大さ
せた微生物又はその由来物質の作用に付し、必要によ
り、前記化合物（Ｉ）を薬学的に許容し得る塩又はエス
テルに変換する方法が、まさに発見された。従って、本
発明は、化合物（Ｉ）の立体特異的Ｓ−配置の薬学的に
活性な化合物もしくは、好ましくはそのアルカリ金属塩
又はアルカリ土類金属塩である、薬学的に許容し得るそ
の塩又はエステル（ただし、Ｒ1 が任意に置換され得る
ヘテロ環システムに任意に含まれ得るフェニル又はナフ
チル基のような任意に置換しうるアリール基、もくし
は、任意に置換され得るシステムで、炭素原子の他に窒
素、硫黄及び酸素から選ばれた１以上の原子とを含むヘ
テロ環システムを表し、Ｒ2 が任意に置換されるアルキ
ル基である）を優先的に生産するための、化合物(II)を
化合物（Ｉ）に立体選択的に加水分解して、化合物
（Ｉ）に転換する能力を有する微生物を作成させること
を含有する方法に関する。
【０００９】好ましくは、Ｒ2 は、１〜８個の炭素原子
数を有する線状アルキル基で、更に好ましくはＲ2 はメ
チル基又はエチル基である。化合物（Ｉ）には、ナプロ
キセン、イブプロフェン、スプロフェン、フェノプロフ
ェン、ケトプロフェン、ベノキサプロフェン、カープロ
フェン、シクロプロフェン、パープロフェン、リシプロ
フェン、フルービプロフェン、クリダナック、ターチプ
ロフェン、ヘキサプロフェン、インドプロフェン、メキ
ソプロフェン、プラノプロフェン、Ｒ８０３、プロチジ
ン酸、チアプロフェン酸又はブロフェジルが挙げられ
る。更に好ましくは、本発明に沿って、ナプロキセンが
優先的にＳ−配置で精製される。好ましい具体例による
と、本発明は、化合物（Ｉ）が少なくとも９０重量パー
セントＳ配置で形成されるような適当な微生物又はそれ
に由来するエステラーゼを選択することにより実行され
る。本発明のもう１つの目的は、前述のカンジダ・シリ
ントラセアのリパーゼの少なくとも１０倍以上、望まし
くは１００倍以上の活性のあるエステラーゼを提供する
ことにある。
数を有する線状アルキル基で、更に好ましくはＲ2 はメ
チル基又はエチル基である。化合物（Ｉ）には、ナプロ
キセン、イブプロフェン、スプロフェン、フェノプロフ
ェン、ケトプロフェン、ベノキサプロフェン、カープロ
フェン、シクロプロフェン、パープロフェン、リシプロ
フェン、フルービプロフェン、クリダナック、ターチプ
ロフェン、ヘキサプロフェン、インドプロフェン、メキ
ソプロフェン、プラノプロフェン、Ｒ８０３、プロチジ
ン酸、チアプロフェン酸又はブロフェジルが挙げられ
る。更に好ましくは、本発明に沿って、ナプロキセンが
優先的にＳ−配置で精製される。好ましい具体例による
と、本発明は、化合物（Ｉ）が少なくとも９０重量パー
セントＳ配置で形成されるような適当な微生物又はそれ
に由来するエステラーゼを選択することにより実行され
る。本発明のもう１つの目的は、前述のカンジダ・シリ
ントラセアのリパーゼの少なくとも１０倍以上、望まし
くは１００倍以上の活性のあるエステラーゼを提供する
ことにある。
【００１０】本発明の別の目的は、後に、化合物（Ｉ）
を分離し、残りの部分を加水分解する、本発明に従った
工程を含む、少なくとも８０重量％のＲ−配置を有する
化合物（Ｉ）の精製に対する工程を提供する。“適当な
微生物”という言葉は、例えば、バチルス属、シュード
モナス属、アースロバクター属、ムコール属、ストレプ
トマイセス属に属する微生物を意味している。また、新
しい遺伝的物質の導入を通して、化合物(II)を化合物
（Ｉ）に立体選択的に転換する能力を得た微生物も“適
当な微生物”という言葉の具体例となる。これは、立体
選択的加水分解を任うエステラーゼをコードするクロー
ン化した遺伝子を、スクリーニングした微生物から他の
微生物、特に大腸菌に形質転換することにより行うこと
ができる。他の微生物は、サッカロミセス、クルイベロ
ミセス、アスペルギラス、エシェリシア、シュードモナ
ス及びストレプロミセス属に属するものである。クロー
ン化した遺伝子は、エステル、好ましくは、β−ナフチ
ルアセテート又はナプロキセンエステルを加水分解する
ことのできる酵素をコードする能力により選択すること
ができる。一方、それらは、すでに選択されている、エ
ステラーゼの遺伝子とクロス・ハイブリダイゼーション
させることにより選択することができる。後者の仮定
は、関連する微生物は、対応する酵素のＤＮＡ配列中に
相同性を示すという観察（イハラ（Ihara)等、ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（J. Biochem.)９８巻、
９５頁（１９８５年））及び、プラスミドｐＮＡＰＴ−
７（実施例１１参照）は、他のバチルス種から誘導した
染色体ＤＮＡとクロス・ハイブリダイゼーションをする
という観察結果に基づいている。加えて、本発明は、化
合物(II)を化合物（Ｉ）に転換する方法において、微生
物及びその由来物質の活性を増加する目的で、微生物中
に、そのエステラーゼをコードする遺伝子コピーを多
数、若しくは修正した形で導入する方法を開示してい
る。この微生物は、例えば、枯草菌である。
を分離し、残りの部分を加水分解する、本発明に従った
工程を含む、少なくとも８０重量％のＲ−配置を有する
化合物（Ｉ）の精製に対する工程を提供する。“適当な
微生物”という言葉は、例えば、バチルス属、シュード
モナス属、アースロバクター属、ムコール属、ストレプ
トマイセス属に属する微生物を意味している。また、新
しい遺伝的物質の導入を通して、化合物(II)を化合物
（Ｉ）に立体選択的に転換する能力を得た微生物も“適
当な微生物”という言葉の具体例となる。これは、立体
選択的加水分解を任うエステラーゼをコードするクロー
ン化した遺伝子を、スクリーニングした微生物から他の
微生物、特に大腸菌に形質転換することにより行うこと
ができる。他の微生物は、サッカロミセス、クルイベロ
ミセス、アスペルギラス、エシェリシア、シュードモナ
ス及びストレプロミセス属に属するものである。クロー
ン化した遺伝子は、エステル、好ましくは、β−ナフチ
ルアセテート又はナプロキセンエステルを加水分解する
ことのできる酵素をコードする能力により選択すること
ができる。一方、それらは、すでに選択されている、エ
ステラーゼの遺伝子とクロス・ハイブリダイゼーション
させることにより選択することができる。後者の仮定
は、関連する微生物は、対応する酵素のＤＮＡ配列中に
相同性を示すという観察（イハラ（Ihara)等、ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（J. Biochem.)９８巻、
９５頁（１９８５年））及び、プラスミドｐＮＡＰＴ−
７（実施例１１参照）は、他のバチルス種から誘導した
染色体ＤＮＡとクロス・ハイブリダイゼーションをする
という観察結果に基づいている。加えて、本発明は、化
合物(II)を化合物（Ｉ）に転換する方法において、微生
物及びその由来物質の活性を増加する目的で、微生物中
に、そのエステラーゼをコードする遺伝子コピーを多
数、若しくは修正した形で導入する方法を開示してい
る。この微生物は、例えば、枯草菌である。
【００１１】その微生物を、例えば、高分子ゲル中にう
まく固定化することができる。これは生菌又は死菌の状
態でも、また、もし、高い比活性が必要な場合には、あ
る程度精製したエステラーゼを用いて行うことができ
る。それ故、“微生物又は、それから誘導された物質”
という言葉は、死んでから、もしくは生きている微生
物、又はそれに由来する、任意の濃度と精製度の抽出物
を意味している。特に、ナプロキセンのエチル及びメチ
ルエステル〔エチル２−（６−メトキシ−２−ナフチ
ル）プロピオネート及びメチル２−（６−メトキシ−２
−ナフチル）プロピオネート〕をＳ−ナプロキセン〔２
−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸〕に加
水分解する、そして、イブプロフェンのエチル及びメチ
ルエステル〔エチル２−（４−イソブチル−１−フェニ
ル）プロピオネート及びメチル２−（４−イソブチル−
１−フェニル）プロピオネート〕をＳ−イブプロフェン
〔２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロピオン酸
に加水分解する微生物は、枯草菌（Bacillus subtili
s)、バチルス・リチェニホルミス（Bacillus Iichenifo
rmis) （この種の試料は、ＡＴＣＣ受理番号１１９４５
号に保管されている）、シュードモナス・フルオレセン
ス（Pseudomonas fluorescence）、シュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）（この種の試料はＩＦＯ受
理番号１２９９６号で保管されている）、シュードモナ
ス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflavina)（この種
の試料はＩＦＯ受理番号１３５８４号で保管されてい
る）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovali
s）（この種の試料はＩＡＭ受理番号１０４９号で保管
されている）、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudo
monas aeruginosa) （この種の試料はＩＦＯ受理番号１
３１３０号で保管されている）、ムコール・アングリマ
クロスポラス（Mucor angulimacrosporus)（この種の試
料はＩＡＭ受理番号６１４９号で保管されている）、ア
ースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraf
finaus）（この種の試料はＡＴＣＣ受理番号２１２１８
号で保管されている）、IS III−２５株（この種の試料
はＣＢＳ受理番号６６６．８６号で保管されている）、
ＬＫ３−４株（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６７．
８６号で保管されている）、ＳＰ４株（この種の試料は
ＣＢＳ受理番号６６８．８６号で保管されている）、TH
AI III-18-1 株（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６
９．８６号で保管されている）、THAI VI-12株（この種
の試料はＣＢＳ受理番号６７０．８６号で保管されてい
る）の培養物を含んでいる。好ましくは、枯草菌の培養
物は、バチルス種 Thai I-8 （この種の試料は、ＣＢＳ
に受理番号６７９．８５号で保管されている）、バチル
ス種 IN IV−８（この種の試料は、ＣＢＳに受理番号６
８０．８５号で保管されている）、バチルス種 Nap 10
M （この種の試料はＣＢＳに受理番号８０５．８５号で
保管されている）、バチルス種Sp III−４（この種の試
料は、ＣＢＳに受理番号８０６．８５号で保管されてい
る）、枯草菌１−８５（ユキ（Yuki) 等、日本遺伝学雑
誌（Jpn. J. Genet.) ４２巻、２５１頁（１９６７
年）、枯草菌１−８５／ｐＮＡＰＴ−７（この種の試料
はＣＢＳに受理番号６７３．８６号で保管されてい
る）、枯草菌 1A40 ／ｐＮＡＰＴ−８（この種の試料
は、ＣＢＳに受理番号６７４．８６号で保管されてい
る）及び枯草菌 1A40 ／ｐＮＡＰＴ−７（この種の試料
は、ＣＢＳに受理番号６７５．８６号で保管されてい
る）の培養物を含んでいる。シュードモナス・フルオレ
センス（Pseudomonas Fluorescens)の培養物は、シュー
ドモナス種 Kor Ｉ-6（この種の試料はＣＢＳに受理番
号８０７．８５号で保管されている）及び、ＩＦＯに受
理番号３０８１号で保管されているシュードモナス・フ
ルオレセンスの培養物を含んでいる。ＩＦＯとは日本の
大阪にある発酵研究所を示し、ＩＡＭは、日本の東京大
学の応用微生物学研究所のことである。本発明の工程の
好ましい具体例によると、化合物(II)を、少なくとも８
０重量パーセントＳ−配置をもつ化合物（Ｉ）に転換で
きる微生物は、約半日から１０日間培養しなければなら
ない。その後、その細胞を、液体栄養培地に懸濁し、化
合物(II)をその細胞の作用を受けさせる。一方では、そ
の細胞を例えば、細胞破壊培養地に懸濁させることで殺
ろし、さらに化合物(II)を、その細胞由来の物質の作用
を受けさせる。
まく固定化することができる。これは生菌又は死菌の状
態でも、また、もし、高い比活性が必要な場合には、あ
る程度精製したエステラーゼを用いて行うことができ
る。それ故、“微生物又は、それから誘導された物質”
という言葉は、死んでから、もしくは生きている微生
物、又はそれに由来する、任意の濃度と精製度の抽出物
を意味している。特に、ナプロキセンのエチル及びメチ
ルエステル〔エチル２−（６−メトキシ−２−ナフチ
ル）プロピオネート及びメチル２−（６−メトキシ−２
−ナフチル）プロピオネート〕をＳ−ナプロキセン〔２
−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸〕に加
水分解する、そして、イブプロフェンのエチル及びメチ
ルエステル〔エチル２−（４−イソブチル−１−フェニ
ル）プロピオネート及びメチル２−（４−イソブチル−
１−フェニル）プロピオネート〕をＳ−イブプロフェン
〔２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロピオン酸
に加水分解する微生物は、枯草菌（Bacillus subtili
s)、バチルス・リチェニホルミス（Bacillus Iichenifo
rmis) （この種の試料は、ＡＴＣＣ受理番号１１９４５
号に保管されている）、シュードモナス・フルオレセン
ス（Pseudomonas fluorescence）、シュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）（この種の試料はＩＦＯ受
理番号１２９９６号で保管されている）、シュードモナ
ス・リボフラビナ（Pseudomonas riboflavina)（この種
の試料はＩＦＯ受理番号１３５８４号で保管されてい
る）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovali
s）（この種の試料はＩＡＭ受理番号１０４９号で保管
されている）、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudo
monas aeruginosa) （この種の試料はＩＦＯ受理番号１
３１３０号で保管されている）、ムコール・アングリマ
クロスポラス（Mucor angulimacrosporus)（この種の試
料はＩＡＭ受理番号６１４９号で保管されている）、ア
ースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraf
finaus）（この種の試料はＡＴＣＣ受理番号２１２１８
号で保管されている）、IS III−２５株（この種の試料
はＣＢＳ受理番号６６６．８６号で保管されている）、
ＬＫ３−４株（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６７．
８６号で保管されている）、ＳＰ４株（この種の試料は
ＣＢＳ受理番号６６８．８６号で保管されている）、TH
AI III-18-1 株（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６
９．８６号で保管されている）、THAI VI-12株（この種
の試料はＣＢＳ受理番号６７０．８６号で保管されてい
る）の培養物を含んでいる。好ましくは、枯草菌の培養
物は、バチルス種 Thai I-8 （この種の試料は、ＣＢＳ
に受理番号６７９．８５号で保管されている）、バチル
ス種 IN IV−８（この種の試料は、ＣＢＳに受理番号６
８０．８５号で保管されている）、バチルス種 Nap 10
M （この種の試料はＣＢＳに受理番号８０５．８５号で
保管されている）、バチルス種Sp III−４（この種の試
料は、ＣＢＳに受理番号８０６．８５号で保管されてい
る）、枯草菌１−８５（ユキ（Yuki) 等、日本遺伝学雑
誌（Jpn. J. Genet.) ４２巻、２５１頁（１９６７
年）、枯草菌１−８５／ｐＮＡＰＴ−７（この種の試料
はＣＢＳに受理番号６７３．８６号で保管されてい
る）、枯草菌 1A40 ／ｐＮＡＰＴ−８（この種の試料
は、ＣＢＳに受理番号６７４．８６号で保管されてい
る）及び枯草菌 1A40 ／ｐＮＡＰＴ−７（この種の試料
は、ＣＢＳに受理番号６７５．８６号で保管されてい
る）の培養物を含んでいる。シュードモナス・フルオレ
センス（Pseudomonas Fluorescens)の培養物は、シュー
ドモナス種 Kor Ｉ-6（この種の試料はＣＢＳに受理番
号８０７．８５号で保管されている）及び、ＩＦＯに受
理番号３０８１号で保管されているシュードモナス・フ
ルオレセンスの培養物を含んでいる。ＩＦＯとは日本の
大阪にある発酵研究所を示し、ＩＡＭは、日本の東京大
学の応用微生物学研究所のことである。本発明の工程の
好ましい具体例によると、化合物(II)を、少なくとも８
０重量パーセントＳ−配置をもつ化合物（Ｉ）に転換で
きる微生物は、約半日から１０日間培養しなければなら
ない。その後、その細胞を、液体栄養培地に懸濁し、化
合物(II)をその細胞の作用を受けさせる。一方では、そ
の細胞を例えば、細胞破壊培養地に懸濁させることで殺
ろし、さらに化合物(II)を、その細胞由来の物質の作用
を受けさせる。
【００１２】上述のような約半日から１０日間の培養の
後、その細胞を、その培地から単離した後、その細胞を
液体栄養培地もしくは、細胞破壊培地に懸濁する。化合
物(II)の選択的加水分解に用いる微生物の生育のため
に、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテー
ト、スクロース他）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム他）に、有機
栄養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプト
ン、肉エキス他）、無機栄養源（例えば、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、亜鉛、鉄及び他の金属痕跡量）の
ための試薬を補った通常の培地が用いられる。より好ま
しい培地として、いくつかの成分を任意に補ったジャッ
プ培地（Japmedium) が用いられた。次の組成で示され
るジャップ培地を用いた；大豆粉（30ｇ／リットル）、
硝酸ナトリウム（７．５ｇ／リットル）、硫酸鉄・７水
（0.２８ｇ／リットル）、クエン酸ナトリウム（６ｇ／
リットル）及びフラクトース（１2.５ｇ／リットル）pH
7.２に調整。使用前に、培地を１２０℃、２０分で滅
菌する。もう１つの好ましい培地としては、任意にいく
つかの成分を補ったＴＳＢ−培地２Ｘがある。６０ｇ／
リットルのトリプチカーゼ・イソ・ブロス（オクソイド
（Oxoid R ))を含む培地を使用した。使用前にその培地
を１２０℃で２０分間滅菌した。もう１つの好ましい培
地は、いくつかの成分を補った２ＸＴＹ培地である。ト
リプトン（ディフコ（DifcR ))３０ｇ／リットル、イー
スト・イクストラクト（ディフコ（Difco R ))２０ｇ／
リットル、塩化ナトリウム３ｇ／リットル、リン酸アン
モニウム１ｇ／リットル、及び硫酸アンモニウム１ｇ／
リットルを含むpH 6.8の培地を用いた。使用前に、１１
０℃で３０分間滅菌した。また、さらに好ましい培地と
して、いくつかの成分を任意に補ったスキム・ミルク培
地を用いた。次の組成のスキム・ミルク培地を用いた；
スキムミルク粉から作った１０％スキムミルクを使用前
に１１０℃で３０分間滅菌した。
後、その細胞を、その培地から単離した後、その細胞を
液体栄養培地もしくは、細胞破壊培地に懸濁する。化合
物(II)の選択的加水分解に用いる微生物の生育のため
に、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテー
ト、スクロース他）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム他）に、有機
栄養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプト
ン、肉エキス他）、無機栄養源（例えば、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、亜鉛、鉄及び他の金属痕跡量）の
ための試薬を補った通常の培地が用いられる。より好ま
しい培地として、いくつかの成分を任意に補ったジャッ
プ培地（Japmedium) が用いられた。次の組成で示され
るジャップ培地を用いた；大豆粉（30ｇ／リットル）、
硝酸ナトリウム（７．５ｇ／リットル）、硫酸鉄・７水
（0.２８ｇ／リットル）、クエン酸ナトリウム（６ｇ／
リットル）及びフラクトース（１2.５ｇ／リットル）pH
7.２に調整。使用前に、培地を１２０℃、２０分で滅
菌する。もう１つの好ましい培地としては、任意にいく
つかの成分を補ったＴＳＢ−培地２Ｘがある。６０ｇ／
リットルのトリプチカーゼ・イソ・ブロス（オクソイド
（Oxoid R ))を含む培地を使用した。使用前にその培地
を１２０℃で２０分間滅菌した。もう１つの好ましい培
地は、いくつかの成分を補った２ＸＴＹ培地である。ト
リプトン（ディフコ（DifcR ))３０ｇ／リットル、イー
スト・イクストラクト（ディフコ（Difco R ))２０ｇ／
リットル、塩化ナトリウム３ｇ／リットル、リン酸アン
モニウム１ｇ／リットル、及び硫酸アンモニウム１ｇ／
リットルを含むpH 6.8の培地を用いた。使用前に、１１
０℃で３０分間滅菌した。また、さらに好ましい培地と
して、いくつかの成分を任意に補ったスキム・ミルク培
地を用いた。次の組成のスキム・ミルク培地を用いた；
スキムミルク粉から作った１０％スキムミルクを使用前
に１１０℃で３０分間滅菌した。
【００１３】例えば、スキムミルク栄養添加としては、
0.５％ラクテート又はＰＳ III塩、もしくはその双方の
組合せで行った。次の組成のＰＳ III塩培地を用いた；
リン酸二水素カリウム（2.１ｇ／リットル）、リン酸１
水素アンモニウム（1.０ｇ／リットル）、硫酸アンモニ
ウム（0.９ｇ／リットル）、塩化カリウム（0.２ｇ／リ
ットル）、クエン酸ナトリウム（0.２９ｇ／リット
ル）、硫酸カルシウム・２水（0.００５ｇ／リット
ル）、硫酸マグネシウム・７水（0.２ｇ／リットル）、
硫酸鉄アンモニウム・６H2O （2.５mg／リットル）、硫
酸亜鉛・７水（0.５mg／リットル）、塩化マンガン・４
H2O （0.３mg／リットル）、硫酸銅・５H2O （0.１５mg
／リットル）、塩化コバルト・６H2O （0.１５mg／リッ
トル）、オルトーホウ酸（0.０５mg／リットル）、モリ
ブデン酸ナトリウム・２水（0.０５５mg／リットル）、
ヨウ化カリウム（0.１mg／リットル）、pH 6.8に調整。
ＰＳ III塩培地は使用前に１２０℃２０分間滅菌した。
微生物の生長の間、０から４５℃の間の温度と、3.５か
ら９の間のpHが維持された。微生物の生育には、２０か
ら３７℃の間の温度と、５から９の間のpHが望ましい。
0.５％ラクテート又はＰＳ III塩、もしくはその双方の
組合せで行った。次の組成のＰＳ III塩培地を用いた；
リン酸二水素カリウム（2.１ｇ／リットル）、リン酸１
水素アンモニウム（1.０ｇ／リットル）、硫酸アンモニ
ウム（0.９ｇ／リットル）、塩化カリウム（0.２ｇ／リ
ットル）、クエン酸ナトリウム（0.２９ｇ／リット
ル）、硫酸カルシウム・２水（0.００５ｇ／リット
ル）、硫酸マグネシウム・７水（0.２ｇ／リットル）、
硫酸鉄アンモニウム・６H2O （2.５mg／リットル）、硫
酸亜鉛・７水（0.５mg／リットル）、塩化マンガン・４
H2O （0.３mg／リットル）、硫酸銅・５H2O （0.１５mg
／リットル）、塩化コバルト・６H2O （0.１５mg／リッ
トル）、オルトーホウ酸（0.０５mg／リットル）、モリ
ブデン酸ナトリウム・２水（0.０５５mg／リットル）、
ヨウ化カリウム（0.１mg／リットル）、pH 6.8に調整。
ＰＳ III塩培地は使用前に１２０℃２０分間滅菌した。
微生物の生長の間、０から４５℃の間の温度と、3.５か
ら９の間のpHが維持された。微生物の生育には、２０か
ら３７℃の間の温度と、５から９の間のpHが望ましい。
【００１４】微生物の生育に必要な好気的条件は、も
し、酸素の供給が、その微生物の代謝必要量にみあうな
ら、既存のいかなる操作によっても提供することができ
る。このことは、空気の形でうまく酸素を供給し、同時
に任意に反応液体を振盪又は攪拌することにより、最も
簡単に行うことができる。化合物(II)の化合物（Ｉ）へ
の転換の間、微生物は上記の通常の培地中で生長期にあ
るか、又は、酵素の分解を防ぐべく、システム（培地又
はバッファー）中に維持されなければならない。化合物
(II)の化合物（Ｉ）への転換の間、必要なときは、同化
可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテート、スク
ロース他）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機栄養源（例え
ば、酵素抽出物、モルト抽出物、ペプトン、肉エキス
等）、及び無機栄養源（例えば、リン酸、マグネシウ
ム、カリウム、亜鉛、鉄、他の微量金属）を含有するよ
うな通常の培地が用いられる。好ましくは、化合物(II)
の化合物（Ｉ）への転換の間、いくつかの成分を補った
ジャップ培地（前述）を使用した。またさらに好ましく
は、いくつかの成分を補ったスキムミルク培地（前述）
を用いた。
し、酸素の供給が、その微生物の代謝必要量にみあうな
ら、既存のいかなる操作によっても提供することができ
る。このことは、空気の形でうまく酸素を供給し、同時
に任意に反応液体を振盪又は攪拌することにより、最も
簡単に行うことができる。化合物(II)の化合物（Ｉ）へ
の転換の間、微生物は上記の通常の培地中で生長期にあ
るか、又は、酵素の分解を防ぐべく、システム（培地又
はバッファー）中に維持されなければならない。化合物
(II)の化合物（Ｉ）への転換の間、必要なときは、同化
可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテート、スク
ロース他）、窒素源（例えば硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機栄養源（例え
ば、酵素抽出物、モルト抽出物、ペプトン、肉エキス
等）、及び無機栄養源（例えば、リン酸、マグネシウ
ム、カリウム、亜鉛、鉄、他の微量金属）を含有するよ
うな通常の培地が用いられる。好ましくは、化合物(II)
の化合物（Ｉ）への転換の間、いくつかの成分を補った
ジャップ培地（前述）を使用した。またさらに好ましく
は、いくつかの成分を補ったスキムミルク培地（前述）
を用いた。
【００１５】その微生物は、同化可能な炭素源又は、窒
素源を除去することにより、非生長期に維持することが
できる。この段階の間、温度は０から４５℃に、pHは3.
５から９の間に維持される。好ましくは、その微生物を
２０から３７℃の間の温度、５から８の間のpHに維持す
る。この段階で必要とされる好気的条件は、もし酸素の
供給が、その微生物の代謝に必要にみあうのに十分なら
ば、既存のいかなる操作でも供給することができる。こ
のことは、空気の形でうまく酸素を供給し、同時に任意
にその反応液を振盪又は攪拌することにより、最も簡単
に行うことができる。前述したように、微生物もしく
は、それから誘導した物質によって作られた化合物
（Ｉ）は、そのような生産物に対してしられている従来
の操作に従って、回収及び精製される。その微生物は寒
天スラント、５０％グリセリン保存、もしくは、凍結乾
燥により保存することができる。もし必要なら、これら
の微生物の前培養を、例えば、その微生物を、ロータリ
ーシェーカーにより、３０℃で２４時間ブイヨン又はＢ
ＨＩ中でインキュベートするといった、確立した操作に
より行なわれる。ブイヨン培地は次の組成で用いること
ができる。；ラブ・レムコ２９（肉エキス、オクソイド
（Oxoid R ) （９ｇ／リットル）、バクトペプトン（１
０ｇ／リットル）、塩化ナトリウム（５ｇ／リット
ル）、pH 7.6 に調整。使用前に、培地を１２０℃で２
０分間滅菌する。
素源を除去することにより、非生長期に維持することが
できる。この段階の間、温度は０から４５℃に、pHは3.
５から９の間に維持される。好ましくは、その微生物を
２０から３７℃の間の温度、５から８の間のpHに維持す
る。この段階で必要とされる好気的条件は、もし酸素の
供給が、その微生物の代謝に必要にみあうのに十分なら
ば、既存のいかなる操作でも供給することができる。こ
のことは、空気の形でうまく酸素を供給し、同時に任意
にその反応液を振盪又は攪拌することにより、最も簡単
に行うことができる。前述したように、微生物もしく
は、それから誘導した物質によって作られた化合物
（Ｉ）は、そのような生産物に対してしられている従来
の操作に従って、回収及び精製される。その微生物は寒
天スラント、５０％グリセリン保存、もしくは、凍結乾
燥により保存することができる。もし必要なら、これら
の微生物の前培養を、例えば、その微生物を、ロータリ
ーシェーカーにより、３０℃で２４時間ブイヨン又はＢ
ＨＩ中でインキュベートするといった、確立した操作に
より行なわれる。ブイヨン培地は次の組成で用いること
ができる。；ラブ・レムコ２９（肉エキス、オクソイド
（Oxoid R ) （９ｇ／リットル）、バクトペプトン（１
０ｇ／リットル）、塩化ナトリウム（５ｇ／リット
ル）、pH 7.6 に調整。使用前に、培地を１２０℃で２
０分間滅菌する。
【００１６】ＢＨＩ（ブレイン・ハート・インフュージ
ョン）培地は0.０３７ｇ／リットルのＢＨＩ（オクソイ
ド（Oxoid R ))を含み、pH 7.0に調整したものを使用し
た。使用前にこの培地を１２０℃、２０分間滅菌した。
ナプロキセンのメチルエステルの加水分解を任う、バチ
ルスThaiＩ−８の酵素が特性づけられた。そのエステラ
ーゼ活性はその微生物中に存在するリパーゼ活性とは無
関係であることがわかった。事実、ナプロキセンの不適
正な異性体が低レベル加水分解を起こすのは、主にバチ
ルス株の混入したリパーゼ活性によるものと思われる。
ThaiＩ−８の精製したナプロキセンエステラーゼは、バ
チルスの全細胞破壊物よりも有意に高い立体異性選択性
をもっている。Thai I-8エステラーゼを含むプラスミド
をもつ、大腸菌／pNAPT −７及びバチルス／pNAPT −７
は、有意なＳ−ナプロキセンエステラーゼを生産する。
驚くべきことに、SDS-PAGE、HPLC-SEC及びアイソエレク
トリックフォーカシングにより確証されたように、エス
テラーゼ活性をもつタンパク質はその微生物の細胞破壊
物中に最も高い濃度で存在するタンパク質である。遺伝
子クローニングは、ある酵素の発現レベルを改良するこ
とが知られているが、エステラーゼの場合のような促進
は驚くべきことである。酵素の遺伝子をクローニングす
るときには、不適正な折りたたみ、タンパク質の変性及
び細胞内の沈殿というような問題にしばしば出くわす
（ハリス、Ｔ．Ｊ．Ｒ、遺伝子工学（Genetic. Enginee
ring) 、又、１９８３年、アカデミック・プレス（Acad
emicPress)) 、予期できなかったことに、エステラーゼ
遺伝子のクローニングに際しては、これらの問題のどれ
もが生じなかった。
ョン）培地は0.０３７ｇ／リットルのＢＨＩ（オクソイ
ド（Oxoid R ))を含み、pH 7.0に調整したものを使用し
た。使用前にこの培地を１２０℃、２０分間滅菌した。
ナプロキセンのメチルエステルの加水分解を任う、バチ
ルスThaiＩ−８の酵素が特性づけられた。そのエステラ
ーゼ活性はその微生物中に存在するリパーゼ活性とは無
関係であることがわかった。事実、ナプロキセンの不適
正な異性体が低レベル加水分解を起こすのは、主にバチ
ルス株の混入したリパーゼ活性によるものと思われる。
ThaiＩ−８の精製したナプロキセンエステラーゼは、バ
チルスの全細胞破壊物よりも有意に高い立体異性選択性
をもっている。Thai I-8エステラーゼを含むプラスミド
をもつ、大腸菌／pNAPT −７及びバチルス／pNAPT −７
は、有意なＳ−ナプロキセンエステラーゼを生産する。
驚くべきことに、SDS-PAGE、HPLC-SEC及びアイソエレク
トリックフォーカシングにより確証されたように、エス
テラーゼ活性をもつタンパク質はその微生物の細胞破壊
物中に最も高い濃度で存在するタンパク質である。遺伝
子クローニングは、ある酵素の発現レベルを改良するこ
とが知られているが、エステラーゼの場合のような促進
は驚くべきことである。酵素の遺伝子をクローニングす
るときには、不適正な折りたたみ、タンパク質の変性及
び細胞内の沈殿というような問題にしばしば出くわす
（ハリス、Ｔ．Ｊ．Ｒ、遺伝子工学（Genetic. Enginee
ring) 、又、１９８３年、アカデミック・プレス（Acad
emicPress)) 、予期できなかったことに、エステラーゼ
遺伝子のクローニングに際しては、これらの問題のどれ
もが生じなかった。
【００１７】Ｓ型特異性は以下のように定義した： Ｓ（生成）/(Ｒ（生成）＋ Ｓ（生成)) 本発明は、さらに実施例について述べていくが、これは
本発明の範囲をこれら実施例に制限するものではない。
本発明の範囲をこれら実施例に制限するものではない。
【００１８】
【実施例１】 バチルスThai I-8、バチルス IN IV−８、バチルスＮａ
ｐ１０Ｍ、バチルスＳｐ III−４、バチルス・リチェニ
ホルミス（ATCC１１９４５）及びシュードモナスＫorＩ
−６を用いたＲＳ−ナプロキセンエチルエステルのＳ−
ナプロキセンへの転換 バチルスThai I-8、バチルス IN IV−８、バチルスＮａ
ｐ１０Ｍ、バチルスＳｐ III−４、バチルス・リチェニ
ホルミス（ATCC１１９４５）及びシュードモナスＫorＩ
−６を５００mlバッフルフラスコ中の２５mlの１０％ス
キムミルクで各々インキュベートし、ロータリーシェー
カー上で３０℃、４８時間インキュベートした。この増
殖後、１００mgのナプロキセンエチルエステルを５００
mlの大豆油にとかし、１１０℃、１時間の滅菌の後、各
培養液に加えた。微生物に応じて、２〜５回分の培養物
を使用した。この培養物を、ロータリーシェカー上、３
０℃でさらに２４時間インキュベートした。その後、そ
の培養物をオルトリン酸でpH２〜３に酸性化し、少量の
硫酸アンモニウムを添加し、２５ml培地当り、２０mlの
クロロホルム又は酢酸エチルを添加して抽出した。その
抽出物はＴＬＣで分析した。ＴＬＣ分析は、シリカゲル
プレート（蛍光指示薬Ｆ254 を含むシリカゲル６０）を
クロロホルム＋１％酢酸で展開し、ナプロキセンとナプ
ロキセンエチルエステルの分離を行った。Ｒｆ値は、ナ
プロキセンのエチルエステルが0.７でナプロキセンが0.
２であった。有機層はその後エバポレートし、ナプロキ
センはシリカゲルカラムをエーテルで溶出する方法で、
残査油から精製した。得られた結果を表１に示す。
ｐ１０Ｍ、バチルスＳｐ III−４、バチルス・リチェニ
ホルミス（ATCC１１９４５）及びシュードモナスＫorＩ
−６を用いたＲＳ−ナプロキセンエチルエステルのＳ−
ナプロキセンへの転換 バチルスThai I-8、バチルス IN IV−８、バチルスＮａ
ｐ１０Ｍ、バチルスＳｐ III−４、バチルス・リチェニ
ホルミス（ATCC１１９４５）及びシュードモナスＫorＩ
−６を５００mlバッフルフラスコ中の２５mlの１０％ス
キムミルクで各々インキュベートし、ロータリーシェー
カー上で３０℃、４８時間インキュベートした。この増
殖後、１００mgのナプロキセンエチルエステルを５００
mlの大豆油にとかし、１１０℃、１時間の滅菌の後、各
培養液に加えた。微生物に応じて、２〜５回分の培養物
を使用した。この培養物を、ロータリーシェカー上、３
０℃でさらに２４時間インキュベートした。その後、そ
の培養物をオルトリン酸でpH２〜３に酸性化し、少量の
硫酸アンモニウムを添加し、２５ml培地当り、２０mlの
クロロホルム又は酢酸エチルを添加して抽出した。その
抽出物はＴＬＣで分析した。ＴＬＣ分析は、シリカゲル
プレート（蛍光指示薬Ｆ254 を含むシリカゲル６０）を
クロロホルム＋１％酢酸で展開し、ナプロキセンとナプ
ロキセンエチルエステルの分離を行った。Ｒｆ値は、ナ
プロキセンのエチルエステルが0.７でナプロキセンが0.
２であった。有機層はその後エバポレートし、ナプロキ
センはシリカゲルカラムをエーテルで溶出する方法で、
残査油から精製した。得られた結果を表１に示す。
【００１９】旋光性が、室温で、１又は１０cm光路長セ
ル（体積0.５〜５ml）を用い、パーキン−エルマー１４
１ポーラリメーター（Parkin Elmer 141 polarimeter)
を用いて測定された。旋光度は５８９nmで記録した（ナ
トリウムＤ−線）。旋光性は生成物を５mlメタノールに
溶解（最高５０mg）して測定した。市販のＳ−ナプロキ
セン（セシファーマ（Secifarma)) は＋６０°の｜α｜
p rt 値をもっている。
ル（体積0.５〜５ml）を用い、パーキン−エルマー１４
１ポーラリメーター（Parkin Elmer 141 polarimeter)
を用いて測定された。旋光度は５８９nmで記録した（ナ
トリウムＤ−線）。旋光性は生成物を５mlメタノールに
溶解（最高５０mg）して測定した。市販のＳ−ナプロキ
セン（セシファーマ（Secifarma)) は＋６０°の｜α｜
p rt 値をもっている。
【００２０】
【表１】 表 １ エチル２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオネートから２− （６−メトキシ−２−ナフチル）−プロピオン酸への微生物による 加水分解、基質の転換量及び生成物の旋光性 添加した 反応後に 生成した 微 生 物 全エステル 回収された ナプロキ ｜α｜rt D エステル セン （mg) (mg) バチルス Thai I-8 ４００ n.d.* 2 3** ＋５７° バチルス IN IV-8 ５００ 2 1 0 7 5 ＋６０° バチルス・リチェニホルミス ２００ 5 3 3 2 ＋５２° ＡＴＣＣ １１９４５ バチルス Ｓp III −４ ４００ n.d.* 3 3** ＋３７° バチルス Ｎap 1０Ｍ ２００ 1 1 0 3 0 ＋４４°シュードモナス Ｋor I−6 ２００ 9 3 2 5 ＋４３° * n.d.−測定しなかったもの ** −単離後の量
【００２１】
【実施例２】 微生物による加水分解により生じたＲ及びＳ型ナプロキ
センの立体異性体の分布 実施例１に述べたように、すべてのテストは、１００ml
バッフルフラスコ中25mlの培地をつかって行った。すべ
ての培地は、ＢＨＩ培地中２４時間前培養した培養物を
イノキュレートされた。検定は、およそ２０mgのナプロ
キセンエチルエステルのラセミ体を大豆油に溶かしたも
のを使って、１から２４時間かけて行った。抽出物はＨ
ＰＬＣで分析した。そのエステルと酸はシリカカラム
（ＣＰ−Ｓper-Si、クロムパク（Chrompack)) で分析し
た。移動相：イソオクタン／エチルアセテート／ギ酸
（８７５ml／１２５ml／3.５ml）。流速：1.７ml／min
、溶出時間は、ナプロキセンエチルエステルが3.８
分、ナプロキセンが9.０分であった。その立体異性的純
度を測定するためにナプロキセンを誘導体化した。ナフ
タレンメチルアミドに誘導したナプロキセン試料は、キ
ラルＤＮＢＰＧカラムで、イソオクタン／クロロホルム
／メタノール（９００ml／７０ml／３０ml）の溶出液で
分離した。流速は２０ml／min 。誘導体化したＳ−ナプ
ロキセン及びＲ−ナプロキセンの溶出時間は、それぞれ
２8.１分及び３0.７分であった。
センの立体異性体の分布 実施例１に述べたように、すべてのテストは、１００ml
バッフルフラスコ中25mlの培地をつかって行った。すべ
ての培地は、ＢＨＩ培地中２４時間前培養した培養物を
イノキュレートされた。検定は、およそ２０mgのナプロ
キセンエチルエステルのラセミ体を大豆油に溶かしたも
のを使って、１から２４時間かけて行った。抽出物はＨ
ＰＬＣで分析した。そのエステルと酸はシリカカラム
（ＣＰ−Ｓper-Si、クロムパク（Chrompack)) で分析し
た。移動相：イソオクタン／エチルアセテート／ギ酸
（８７５ml／１２５ml／3.５ml）。流速：1.７ml／min
、溶出時間は、ナプロキセンエチルエステルが3.８
分、ナプロキセンが9.０分であった。その立体異性的純
度を測定するためにナプロキセンを誘導体化した。ナフ
タレンメチルアミドに誘導したナプロキセン試料は、キ
ラルＤＮＢＰＧカラムで、イソオクタン／クロロホルム
／メタノール（９００ml／７０ml／３０ml）の溶出液で
分離した。流速は２０ml／min 。誘導体化したＳ−ナプ
ロキセン及びＲ−ナプロキセンの溶出時間は、それぞれ
２8.１分及び３0.７分であった。
【００２２】誘導操作：抽出物２mlを窒素気流中で乾燥
させた。その乾燥試料を２００μｌのベンゼンと１０μ
l のチオニルクロライドと６０℃で１０分間反応させ
た。反応混合物を窒素気流中で乾燥させた。乾燥したジ
クロロメタン中に溶かした５％ナフタレンメチルアミン
２００μl を加え、反応を室温で１時間行った。反応混
合物を再び窒素で乾燥し、それから２ ml のイソオクタ
ン／クロロホルム（２：１、ｖ／ｖ及び２ml １Ｎ塩
酸）で抽出した。有機層をＨＰＬＣで分析した。結果を
表２に示す。
させた。その乾燥試料を２００μｌのベンゼンと１０μ
l のチオニルクロライドと６０℃で１０分間反応させ
た。反応混合物を窒素気流中で乾燥させた。乾燥したジ
クロロメタン中に溶かした５％ナフタレンメチルアミン
２００μl を加え、反応を室温で１時間行った。反応混
合物を再び窒素で乾燥し、それから２ ml のイソオクタ
ン／クロロホルム（２：１、ｖ／ｖ及び２ml １Ｎ塩
酸）で抽出した。有機層をＨＰＬＣで分析した。結果を
表２に示す。
【００２３】
【表２】 表 ２ 微生物による加水分解で生成したＲ及びＳ−ナプロキセンの 立体異性体の分布 インキュ 生成した 生成した ％ ％ ベート 微 生 物 時間 S-ナプロ R-ナプロ S-ナプロ R-ナプロ キセン キセン キセン キセン (h) (mg/培養） (mg/培養） バチルス 1 1.26 0.014 99 １Thai I−８ 24 7.14 0.59 92 ８ バチルス 1 0.48 0.008 98 ２ IN IV-8 24 4.18 0.40 91 ９ バチルス・ 1 0.28 0.014 95 ５ リチェニホルミス 24 4.76 0.086 98 ２（ATCC 11945) シュードモナス 24 2.8 0.07 98 ２Kor Ｉ−６ バチルス 24 1.3 0.01 99 １Nap １０Ｍ バチルス 24 2.5 0.3 89 11Ｓp III −４
【００２４】
【実施例３】 種々の微生物を用いたＲＳ−ナプロキセンのメチルエス
テルのＳ−ナプロキセンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは１０
０mlのバッフルフラスコ中、２５mlの培地をつかって行
った。しかし、ラセミ体のナプロキセンエチルエステル
の代りに、ラセミ体のナプロキセンメチルエステルを培
養液に添加した。その培地は、ＢＨＩ培地中で２４時間
前培養した培養液がイノキュレートされた。結果を表3
示す。
テルのＳ−ナプロキセンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは１０
０mlのバッフルフラスコ中、２５mlの培地をつかって行
った。しかし、ラセミ体のナプロキセンエチルエステル
の代りに、ラセミ体のナプロキセンメチルエステルを培
養液に添加した。その培地は、ＢＨＩ培地中で２４時間
前培養した培養液がイノキュレートされた。結果を表3
示す。
【００２５】
【表３】 表 ３ 生成した 微 生 物 ナプロキセン ％Ｓ ％Ｒ （mg／培養） バチルスThai I−８ 6.９ 96 4 バチルス IN IV−８ 2.0 90 10 バチルスリチュニ 8.6 98 2 ホルミス(ATCC11945) バチルス Nap 1０Ｍ 3.2 99 1 バチルス Sp III-４ 5.8 82 18
【００２６】
【実施例４】 バチルスThai I−８、バチルス IN IV-8及びバチルス・
リチュニホルミス（ATCC １１９４５）を用いた、Ｓ−
ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセンへの転
換。 実施例１で述べたようにすべてのテストは１００mlバッ
フルフラスコ中２５mlの培地をつかって行った。すべて
の培地は、ＢＨＩ培地で２４時間前培養した培養液がイ
ノキュレートされた。加水分解したＳ−ナプロキセンエ
チルエステルの量は表４に示した。
リチュニホルミス（ATCC １１９４５）を用いた、Ｓ−
ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセンへの転
換。 実施例１で述べたようにすべてのテストは１００mlバッ
フルフラスコ中２５mlの培地をつかって行った。すべて
の培地は、ＢＨＩ培地で２４時間前培養した培養液がイ
ノキュレートされた。加水分解したＳ−ナプロキセンエ
チルエステルの量は表４に示した。
【００２７】
【表４】 表 ４ 栄養添加スキムミルク培地（ＰＳIII 及びラクテート添加）中２４時間 加水分解をうけたＳ−ナプロキセンエチルエステルの量 ２４時間後に残存 生成した 微 生 物 するエステル ナプロキセン （mg） （mg） バチルスThai I−８ 7.9 18.6 バチルス IN IV-8 15.0 10.5 バチルスリチュニホルミス 11.6 10.2 ATCC11945 ＊エステルの約３０mgを２５ml培養液に加えた。
【００２８】
【実施例５】 ファーメンタ中で生育したバチルスThai I−８によるラ
セミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセン
への転換。 バチルスThai I−８をＢＨＩ培地中２４時間前培養し
た。その後、５０mlの培養物を、１０％スキムミルク培
地又は、ＰＳIII 塩及び５ｇ／リットルのラクテートを
補った１０％スキムミルクを含む１リットル エッヒウ
ェィラー・ファーメンター（Eschweiler Fermenter) に
イノキュレートした。次の培養条件を使用した。 容 積 ： ５リットル培地 温 度 ： ３０℃ 攪拌速度： ５００rpm 空気流量： ５０リットル／ｈ 消泡剤 ： プルロニックＬ８１の自動添加でコントロ
ール pH ： 制御せず（pH値は６〜９の間に保たれた） 微生物は７０時間生育させ、その間、いくつかの試料が
取り出され、ナプロキセンのエチルエステルに対する活
性の検定をした。その検定は、２５mlの試料に、大豆油
に溶かした２０mgのラセミ体ナプロキセンエチルエステ
ルを添加し、バッフルフラスコ中３０℃、１時間インキ
ュベートすることにより行った。このインキュベーショ
ン後、その試料を抽出、誘導体化そして、ＨＰＬＣで分
析した。
セミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセン
への転換。 バチルスThai I−８をＢＨＩ培地中２４時間前培養し
た。その後、５０mlの培養物を、１０％スキムミルク培
地又は、ＰＳIII 塩及び５ｇ／リットルのラクテートを
補った１０％スキムミルクを含む１リットル エッヒウ
ェィラー・ファーメンター（Eschweiler Fermenter) に
イノキュレートした。次の培養条件を使用した。 容 積 ： ５リットル培地 温 度 ： ３０℃ 攪拌速度： ５００rpm 空気流量： ５０リットル／ｈ 消泡剤 ： プルロニックＬ８１の自動添加でコントロ
ール pH ： 制御せず（pH値は６〜９の間に保たれた） 微生物は７０時間生育させ、その間、いくつかの試料が
取り出され、ナプロキセンのエチルエステルに対する活
性の検定をした。その検定は、２５mlの試料に、大豆油
に溶かした２０mgのラセミ体ナプロキセンエチルエステ
ルを添加し、バッフルフラスコ中３０℃、１時間インキ
ュベートすることにより行った。このインキュベーショ
ン後、その試料を抽出、誘導体化そして、ＨＰＬＣで分
析した。
【００２９】２４時間後、微生物の乾燥重量と、容量活
性は一定に保たれた。培養液のpH値は、培養の間、スキ
ムミルクが用いられたときは6.０から7.８に、栄養添加
したスキムミルクを用いたときは6.０から8.４に増加し
た。その結果を表５に示す。
性は一定に保たれた。培養液のpH値は、培養の間、スキ
ムミルクが用いられたときは6.０から7.８に、栄養添加
したスキムミルクを用いたときは6.０から8.４に増加し
た。その結果を表５に示す。
【００３０】
【表５】 表 ５ スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いたときの、 バチルスThai I−８の培養結果 スキムミルクを ＰＳIII とラクテート 用いた培養 を補ったスキムミルク を用いた培養 乾燥重量 1.2 〜1.3 ｇ／リッ 2.5 〜2.6 ｇ／リッ トル トル 容量活性 30mgの生成ナプロキ 53mgの生成ナプロキ セン／リットル／ｈ セン／リットル／ｈ立体異性体分布 96％Ｓ、４％Ｒ 91％Ｓ、９％Ｒ
【００３１】
【実施例６】 ファーメンターで生育させたバチルス IN IV-8による、
ラセミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセ
ンへの転換 実施例５で述べたのと同じ操作を、バチルス IN IV-8に
行った。７０時間のインキュベーションの間、いくつか
の試料を取り、その時間内に、容量活性同様乾燥重量が
実質的に一定になるまで、先に述べた検定を行った。そ
の間、pH値は、スキムミルクの場合6.４から7.９に、栄
養添加スキムミルクの場合、6.2 から8.４に変化した。
結果を表６にまとめた。
ラセミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプロキセ
ンへの転換 実施例５で述べたのと同じ操作を、バチルス IN IV-8に
行った。７０時間のインキュベーションの間、いくつか
の試料を取り、その時間内に、容量活性同様乾燥重量が
実質的に一定になるまで、先に述べた検定を行った。そ
の間、pH値は、スキムミルクの場合6.４から7.９に、栄
養添加スキムミルクの場合、6.2 から8.４に変化した。
結果を表６にまとめた。
【００３２】
【表６】 表 ６ スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いた、 バチルス IN IV-8の培養結果 スキムミルクを ＰＳIII とラクテート 用いた培養 を補ったスキムミルク を用いた培養 乾燥重量 0.７ｇ／リットル 2.5 ｇ／リットル 容量活性 10mgの生成ナプロキ 25mgの生成ナプロキ セン／リットル／ｈ セン／リットル／ｈ立体異性体分布 ４％Ｓ、６％Ｒ 測定せず
【００３３】
【実施例７】 種々の微生物を用いた、Ｒ、Ｓ−イブプロフェンのエチ
ルエステルのＳ−イブプロフェンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは、１
００〜５００mlのバッフルフラスコ中、２５〜１００ml
の培地で行った。その培地は栄養混合培地（例えばＢＨ
Ｉ）で２４時間前培養した培養液をイノキュレートし、
４８時間培養した。その後、培地体積に応じて、２０〜
８０μl のラセミ体イブプロフェンのエチルエステルを
その培養液に添加し、２４時間インキュベートした。そ
の培養液を、H3PO4 でpH2.５に酸性化し、少量の硫酸ア
ンモニウムを添加後、CH2Cl2で抽出した。抽出物中に存
在するイブプロフェンをナフタレンーメチルアミド誘導
体に誘導し、その立体異性的純度を測定した。３mlの抽
出物に、２−ブロモ−１−メチルピリジン・ヨーダイド
のジメチルホルムアミド溶液（５０mg／ml）２００μl
と、１−ナフタレン−メチルアミンのCH2Cl2溶液（１０
０mg／ml）２００μl を加え、２２℃で５分間反応させ
た。この反応溶液を窒素気流中６０℃で乾燥させた。残
査を３mlのイソオクタン／CH2Cl2 （２：１、ｖ／ｖ）
にとかし、２mlの１Ｎ H2SO4を添加後抽出した。
ルエステルのＳ−イブプロフェンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは、１
００〜５００mlのバッフルフラスコ中、２５〜１００ml
の培地で行った。その培地は栄養混合培地（例えばＢＨ
Ｉ）で２４時間前培養した培養液をイノキュレートし、
４８時間培養した。その後、培地体積に応じて、２０〜
８０μl のラセミ体イブプロフェンのエチルエステルを
その培養液に添加し、２４時間インキュベートした。そ
の培養液を、H3PO4 でpH2.５に酸性化し、少量の硫酸ア
ンモニウムを添加後、CH2Cl2で抽出した。抽出物中に存
在するイブプロフェンをナフタレンーメチルアミド誘導
体に誘導し、その立体異性的純度を測定した。３mlの抽
出物に、２−ブロモ−１−メチルピリジン・ヨーダイド
のジメチルホルムアミド溶液（５０mg／ml）２００μl
と、１−ナフタレン−メチルアミンのCH2Cl2溶液（１０
０mg／ml）２００μl を加え、２２℃で５分間反応させ
た。この反応溶液を窒素気流中６０℃で乾燥させた。残
査を３mlのイソオクタン／CH2Cl2 （２：１、ｖ／ｖ）
にとかし、２mlの１Ｎ H2SO4を添加後抽出した。
【００３４】有機層をキラルＤＮＢＰＧカラムでイソオ
クチル／イソプロピルアルコール／メタノール（９２／
２／１ｖ／ｖ）を用いて、また不純物が分析を妨害する
ときには、イソオクタン／イソプロピルアルコール／メ
タノール（９８／１／１、ｖ／ｖ）を用いてＨＰＬＣ分
析した。結果を表７に示す。
クチル／イソプロピルアルコール／メタノール（９２／
２／１ｖ／ｖ）を用いて、また不純物が分析を妨害する
ときには、イソオクタン／イソプロピルアルコール／メ
タノール（９８／１／１、ｖ／ｖ）を用いてＨＰＬＣ分
析した。結果を表７に示す。
【００３５】
【表７】 表 ７ 微 生 物 生成したイブプ 培地体積 ロフェン mg／培養 ％Ｓ ％Ｒ （μl ） アースロバクタ・ ATCC 21218 9.8 85 15 25 パラフィネウス バチルス・リチェニ ATCC 11945 0.8 99 1 25 ホルミス* 枯草菌 IN IV-8 * CBS 680.85 0.4 89 11 25 枯草菌 Nap 10-M CBS 805.85 1.4 92 8 25 枯草菌 Sp III-4 CBS 806.85 4.2 88 12 25 枯草菌 Thai I-8 CBS 679.85 4.3 96 4 25 ムコール・アングリ IAM 6149 4.3 96 4 25 マクロスポラス シュードモナス IFO 13130 5.5 81 9 25 ・アエルギノサ シュードモナス・ IFO 3081 3.4 ≧ 95 ≦5 25 フルオレセンス シュードモナス・Kor I-6 CBS 807.85 3.9 94 6 100 フルオレセンス シュードモナス IFO 1049 1.6 98 2 100 ・オバリス シュードモナス IFO 12996 1.6 ≧ 95 ≦5 25 ・ブチダ シュードモナス・ IFO 13584 0.7 98 2 100 リボフラビナ ストレプトマイセス IFO 3412 0.6 ≧ 95 ≦5 25 ・フラボビレンス IS III−25株 CBS 666.86 1.0 82 18 100 LK ３−４株 CBS 667.86 0.4 ≧ 95 ≦5 25 SP ４株 CBS 668.86 0.9 95 5 25 THAI III-18-１株 CBS 669.86 7.0 87 13 25 THAI IV-12 株 CBS 670.86 8.6 97 3 25 表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊で示されている微生物を 用いた値は単一の実験の結果である。この場合には、５０μl のテトラデカンに １０μl のイブプロフェンを培養液に添加した。
【００３６】
【実施例８】 種々の微生物を用いた、Ｓ−イブプロフェンメチルエス
テルのＳ−イブプロフェンの転換 すべてにテストは、実施例７と同様に行った。ラセミ体
のイブプロフェンエチルエステルの代りに、ラセミ体の
イブプロフェンメチルエステルを培養液に加えた。結果
を表８に示した。
テルのＳ−イブプロフェンの転換 すべてにテストは、実施例７と同様に行った。ラセミ体
のイブプロフェンエチルエステルの代りに、ラセミ体の
イブプロフェンメチルエステルを培養液に加えた。結果
を表８に示した。
【００３７】
【表８】 表 ８ 微 生 物 生成したイブプ 培地体積 ロフェン mg／培養 ％Ｓ ％Ｒ （μl ） アースロバクタ ATCC 21218 9.1 87 15 25 ・パラフィネウス バチルス・ ATCC 11945 1.5 99 1 25 リチェニホルミス* 枯草菌 IN IV-8 * CBS 680.85 0.5 90 10 25 枯草菌 Nap 10-M CBS 805.85 2.2 93 7 25 枯草菌 Sp III-4 CBS 806.85 5.5 89 11 25 枯草菌 Thai I-8 CBS 679.85 5.7 97 3 25 ムコール・アングリ IAM 6149 6.1 93 7 25 マクロスポラス シュードモナス・ IFO 3081 3.1 93 7 25 フルオレセンス シュードモナス IFO 12996 0.7 ≧ 95 ≦5 25 ・プチダ シュードモナス IFO 13584 1.3 88 12 25 ・リボフラビナ ストレプトマイセス IFO 3412 0.2 ≧ 95 ≦5 25 ・フラボビレンス LK ３−４株 CBS 667.86 0.2 ≧ 95 ≦5 25 THAI III-18-１ CBS 669.86 3.1 88 12 25 THAI IV-12 CBS 670.86 4.0 ≧ 93 ≦7 25 表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊で示した微生物を用いた ときは、単一の実験から得られた値である。この場合には、５０μl のテトラデ カンに溶かした１０μl のイブプロフェンを培養液に添加した。
【００３８】
【実施例９】 枯草菌Thai I-8（ＣＢＳ ６７9.８５）中に存在するナ
プロキセンメチルエステラーゼの特性化 バチルスThaiＩ−８を１０％のスキムミルクを含むエス
ヒワイラー・ファーメンター（Esch weiler fermenter)
で生育させた（実施例５参照） ２８時間の増殖後、細胞を遠心で集菌した。その細胞を
0.１Ｍトリス−塩酸（pH8.０）に溶解し、リゾチーム
（0.５mg／mlリゾチーム、４mg／mlＥＤＴＡ）で室温１
８時間処理し、ついでＤＮase （0.０１mg／ml ＤＮas
e 、3.５mg／mlMgCl2 ）で同温度で１時間処理した。遠
心後、上清のタンパク画分を７０％硫酸アンモニウム飽
和により沈殿させた。遠心後、そのペレットを0.０１Ｍ
ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸）パッファ（pH7.５）で溶解し、保存剤として0.０２
％アジ化ナトリウムを含む同パッファーで１８時間透析
した。最終溶液を精製用ＨＰＬＣ−ＳＥＣ（サイスーエ
クスクルージョン・クロマトグラフィー）カラム（ＴＳ
Ｋ２０００ＳＷ、６００×２1.５mm）で、0.１Ｍ酢酸ナ
トリウム（pH5.５）を６ml／min の流速で溶出すること
により分析した。１０分後から、２mlづつのフラクショ
ンを集め、リパーゼ及びＳ−ナプロキセンメチルエステ
ラーゼ活性の検定を行った。
プロキセンメチルエステラーゼの特性化 バチルスThaiＩ−８を１０％のスキムミルクを含むエス
ヒワイラー・ファーメンター（Esch weiler fermenter)
で生育させた（実施例５参照） ２８時間の増殖後、細胞を遠心で集菌した。その細胞を
0.１Ｍトリス−塩酸（pH8.０）に溶解し、リゾチーム
（0.５mg／mlリゾチーム、４mg／mlＥＤＴＡ）で室温１
８時間処理し、ついでＤＮase （0.０１mg／ml ＤＮas
e 、3.５mg／mlMgCl2 ）で同温度で１時間処理した。遠
心後、上清のタンパク画分を７０％硫酸アンモニウム飽
和により沈殿させた。遠心後、そのペレットを0.０１Ｍ
ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸）パッファ（pH7.５）で溶解し、保存剤として0.０２
％アジ化ナトリウムを含む同パッファーで１８時間透析
した。最終溶液を精製用ＨＰＬＣ−ＳＥＣ（サイスーエ
クスクルージョン・クロマトグラフィー）カラム（ＴＳ
Ｋ２０００ＳＷ、６００×２1.５mm）で、0.１Ｍ酢酸ナ
トリウム（pH5.５）を６ml／min の流速で溶出すること
により分析した。１０分後から、２mlづつのフラクショ
ンを集め、リパーゼ及びＳ−ナプロキセンメチルエステ
ラーゼ活性の検定を行った。
【００３９】リパーゼ活性は、基質として、pH8.０の0.
１Ｍ ＭＯＰＳ中で２０mg／mlのＳ−ナプロキセンメチ
ルエステルを用いて検定した。１８時間のインキュベー
ションの後、生成したＳ−ナプロキセンの量を実施例２
で述べたようにＨＰＬＣにより測定した。図１は、バチ
ルスThai I-8細胞破壊物のＨＰＬＣ−ＳＥＣ溶出パター
ンを示している。Ｓ−ナプロキセンメチルエステラーゼ
（フラクション３７）は、この微生物中に存在するリパ
ーゼ活性（フラクション３１）と明らかに分離してい
る。表９では、細胞破壊物、ＨＰＬＣ−ＳＥＣのフラク
ション３１及びフラクション３８の立体異性選択性の比
較がしてある。Ｒ及びＳ−ナプロキセンメチルエステル
のエステラーゼ活性は前述の方法でテストした。Ｓ−ナ
プロキセンエステラーゼ活性を含むタンパク画分の見か
けの分子量は、標準物質として、２７０００までの既知
の分子量のタンパク質混合物を用いて見積もった。検定
条件下での、Ｓ−ナプロキセンメチルエステルの加水分
解反応のpH依存性が図２に示してある。用いたバッファ
ーは0.１Ｍリン酸（pH領域5.５〜7.５）、0.１Ｍトリス
−塩酸（pH領域7.５〜9.０）、0.１Ｍグリシン（pH領域
9.０〜１0.０）である。図２より、最適pHは6.５〜１0.
０であることが分る。
１Ｍ ＭＯＰＳ中で２０mg／mlのＳ−ナプロキセンメチ
ルエステルを用いて検定した。１８時間のインキュベー
ションの後、生成したＳ−ナプロキセンの量を実施例２
で述べたようにＨＰＬＣにより測定した。図１は、バチ
ルスThai I-8細胞破壊物のＨＰＬＣ−ＳＥＣ溶出パター
ンを示している。Ｓ−ナプロキセンメチルエステラーゼ
（フラクション３７）は、この微生物中に存在するリパ
ーゼ活性（フラクション３１）と明らかに分離してい
る。表９では、細胞破壊物、ＨＰＬＣ−ＳＥＣのフラク
ション３１及びフラクション３８の立体異性選択性の比
較がしてある。Ｒ及びＳ−ナプロキセンメチルエステル
のエステラーゼ活性は前述の方法でテストした。Ｓ−ナ
プロキセンエステラーゼ活性を含むタンパク画分の見か
けの分子量は、標準物質として、２７０００までの既知
の分子量のタンパク質混合物を用いて見積もった。検定
条件下での、Ｓ−ナプロキセンメチルエステルの加水分
解反応のpH依存性が図２に示してある。用いたバッファ
ーは0.１Ｍリン酸（pH領域5.５〜7.５）、0.１Ｍトリス
−塩酸（pH領域7.５〜9.０）、0.１Ｍグリシン（pH領域
9.０〜１0.０）である。図２より、最適pHは6.５〜１0.
０であることが分る。
【００４０】エステラーゼ反応の温度依存性は図３に示
してある。４５℃以上の温度では、エステラーゼ反応は
ほとんどみられなかった。３７℃での加水分解は大ざっ
ぱにいって２５℃での反応の２倍である。従って、最適
温度は２５〜４５℃である。
してある。４５℃以上の温度では、エステラーゼ反応は
ほとんどみられなかった。３７℃での加水分解は大ざっ
ぱにいって２５℃での反応の２倍である。従って、最適
温度は２５〜４５℃である。
【００４１】
【表９】 表 ９ S-エステル R-エステル から生成し から生成し たS-ナプロ たR-ナプロ 酵 素 活 性 キセン キセン S-特異性 (mM) (mM) （％） Thai 細胞分解物 2.891 0.087 97.1 フラクション 31 “リパーゼ ” 0.090 0.119 43.1フラクション 38 “エステラーゼ” 5.264 0.064 98.8
【００４２】
【実施例１０】 Ｒ−Ｓナプロキセンエステルの立体選択的転換を任う遺
伝子の分子クローニング 枯草菌Thai I-8（ＣＢＳ６７9.８５）の染色体ＤＮＡフ
ラグメントを含むプラスミド、ｐＮＡＰＴ−２を以下の
ように調製した。Ｔ．マニアチス（Maniatis) 等が１９
８２年コールド・スプリングハーバー、ラボラトリーか
ら出版した分子クローニングのハンドブックに述べられ
ているように、一般的なクローニング技術を用いた。全
てのＤＮＡ修飾酵素は市販されているもので、製造業者
の指示に従って用いた。ＤＮＡの分離及び精製のための
物質及び器具は、業者の指示に従って用いた。ポジティ
ブ・セレクション・ベクターｐＵＮ１２１（ニルソン
（Nilsson)等、１９８３年、核酸研究（Nucleic Acids
Research) １１巻、８０１９頁）を用いた。このプラス
ミドは、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐
性遺伝子及びＣ１−リプレッサー遺伝子を持っている。
このテトラサイクル遺伝子の転写は、Ｃ１−リプレッサ
ー遺伝子の遺伝子産物によって阻害される。Ｃ１−リプ
レッサー遺伝子のBcl １部位への外来ＤＮＡの装入は、
テトラサイクリン遺伝子の活性化をうながす。これは、
アンピシリン／テトラサイクリン寒天プレート上での組
換えのポジティブ・セレクションを可能にする。
伝子の分子クローニング 枯草菌Thai I-8（ＣＢＳ６７9.８５）の染色体ＤＮＡフ
ラグメントを含むプラスミド、ｐＮＡＰＴ−２を以下の
ように調製した。Ｔ．マニアチス（Maniatis) 等が１９
８２年コールド・スプリングハーバー、ラボラトリーか
ら出版した分子クローニングのハンドブックに述べられ
ているように、一般的なクローニング技術を用いた。全
てのＤＮＡ修飾酵素は市販されているもので、製造業者
の指示に従って用いた。ＤＮＡの分離及び精製のための
物質及び器具は、業者の指示に従って用いた。ポジティ
ブ・セレクション・ベクターｐＵＮ１２１（ニルソン
（Nilsson)等、１９８３年、核酸研究（Nucleic Acids
Research) １１巻、８０１９頁）を用いた。このプラス
ミドは、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐
性遺伝子及びＣ１−リプレッサー遺伝子を持っている。
このテトラサイクル遺伝子の転写は、Ｃ１−リプレッサ
ー遺伝子の遺伝子産物によって阻害される。Ｃ１−リプ
レッサー遺伝子のBcl １部位への外来ＤＮＡの装入は、
テトラサイクリン遺伝子の活性化をうながす。これは、
アンピシリン／テトラサイクリン寒天プレート上での組
換えのポジティブ・セレクションを可能にする。
【００４３】San ３Ａで部分分解した枯草菌ThaiＩ−８
ＤＮＡを、Bcl １で消化したｐＵＮ１２１ＤＮＡと混
合した。ポリヌクレオチドリガーゼの使用による再環状
化の後、そのＤＮＡ混合物を、前述の（Ｔ．マニアチス
（Maniatis) 等、１９８２年）CaCl2 のトランスフォー
メーション操作によって大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８
４９）に導入した。アンピシリン及びテトラサイクリン
に耐性な１０００個の大腸菌コロニーを得た。すべての
トランスフォーマントを保存し、Ｊ．Ｐ．ジャーゲン
（Gergen) 等の方法に従って、レプリカプレートを作っ
た。複製コロニーは、以前に述べられた手順に基づく、
軟寒天重層技術によって、エステラーゼ活性の検出を行
なった（Ｔ．Ｂ．ハイガード（Higerd) とＪ．スピジゼ
ン（Spizizen) 、１９７３年、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（J. Bacteriol.)１１４巻、１１８４頁）
基本的には、0.５％の低融点アガロース、0.５Ｍリン酸
カリウム（pH7.５）、0.５mg／リットルのベーターナフ
チルアセテート及び0.５mg／mlのファースト・ブルーを
トランスフォーマーの上に散布する。数分後、エステラ
ーゼ又はリパーゼ活性をもつコロニーは紫色を呈す。そ
のコロニーを２×ＴＹ培地（１６ｇ／リットル バクト
トリプトン、１０ｇ／リットル イースト・エクストラ
クト、５ｇ／リットル 塩化ナトリウム）中で１晩増殖
させ、つづいてＳ−ナプロキシエステルをＳ−ナプロキ
センに転換する（実施例１の方法）能力を検定する。１
つの大腸菌トランスフォーマントは、Ｓ−ナプロキセン
エステルを転換することができた。ｐＮＡＰＴ−２と呼
ばれる、このトランスフォーマントから単離したプラス
ミドを図４に示した。その大きさは9.４kbである。
ＤＮＡを、Bcl １で消化したｐＵＮ１２１ＤＮＡと混
合した。ポリヌクレオチドリガーゼの使用による再環状
化の後、そのＤＮＡ混合物を、前述の（Ｔ．マニアチス
（Maniatis) 等、１９８２年）CaCl2 のトランスフォー
メーション操作によって大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８
４９）に導入した。アンピシリン及びテトラサイクリン
に耐性な１０００個の大腸菌コロニーを得た。すべての
トランスフォーマントを保存し、Ｊ．Ｐ．ジャーゲン
（Gergen) 等の方法に従って、レプリカプレートを作っ
た。複製コロニーは、以前に述べられた手順に基づく、
軟寒天重層技術によって、エステラーゼ活性の検出を行
なった（Ｔ．Ｂ．ハイガード（Higerd) とＪ．スピジゼ
ン（Spizizen) 、１９７３年、ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（J. Bacteriol.)１１４巻、１１８４頁）
基本的には、0.５％の低融点アガロース、0.５Ｍリン酸
カリウム（pH7.５）、0.５mg／リットルのベーターナフ
チルアセテート及び0.５mg／mlのファースト・ブルーを
トランスフォーマーの上に散布する。数分後、エステラ
ーゼ又はリパーゼ活性をもつコロニーは紫色を呈す。そ
のコロニーを２×ＴＹ培地（１６ｇ／リットル バクト
トリプトン、１０ｇ／リットル イースト・エクストラ
クト、５ｇ／リットル 塩化ナトリウム）中で１晩増殖
させ、つづいてＳ−ナプロキシエステルをＳ−ナプロキ
センに転換する（実施例１の方法）能力を検定する。１
つの大腸菌トランスフォーマントは、Ｓ−ナプロキセン
エステルを転換することができた。ｐＮＡＰＴ−２と呼
ばれる、このトランスフォーマントから単離したプラス
ミドを図４に示した。その大きさは9.４kbである。
【００４４】２×ＴＹ培地で１晩増殖した大腸菌／ｐＮ
ＡＰＴ−２及び大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７の活性を表１０
に示した。プラスミドｐＮＡＰＴ１２１のみをもつ大腸
菌は、Ｓ又はＲ−ナプロキセンエステルを加水分解する
ことができない。これは、Ｓ−ナプロキセンの加水分解
に必要な全ての情報は、５ kb の枯草菌ThaiＩ−８ＤＮ
Ａ挿入物中に存在することを示している。ｐＮＡＰＴ−
２を持つ大腸菌ＤＨＩの試料はＣＢＳ受理番号６７1.８
６号に保管されている。
ＡＰＴ−２及び大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７の活性を表１０
に示した。プラスミドｐＮＡＰＴ１２１のみをもつ大腸
菌は、Ｓ又はＲ−ナプロキセンエステルを加水分解する
ことができない。これは、Ｓ−ナプロキセンの加水分解
に必要な全ての情報は、５ kb の枯草菌ThaiＩ−８ＤＮ
Ａ挿入物中に存在することを示している。ｐＮＡＰＴ−
２を持つ大腸菌ＤＨＩの試料はＣＢＳ受理番号６７1.８
６号に保管されている。
【００４５】
【表１０】 表 １０ 活 性 Ｓ−特異性 （ｕ／リットル） （％） 大腸菌／pUN 121 0 − 大腸菌／pNAPT −２ 45 ＞95 大腸菌／pNAPT −７ 761 99.4
【００４６】
【実施例１１】 枯草菌中に多数の遺伝子コピーを導入することによるエ
ステラーゼ活性の改良 エステラーゼをコードするプラスミドｐＮＡＰＴ−２
は、５ kb の枯草菌ThaiＩ−８（ＣＢＳ６７9.８５）の
ＤＮＡ挿入物を持っている。これは、約３０ kbのタン
パク質をコードする遺伝子に対して予期されるに十分小
さい大きさであるので、その挿入物は、エステラーゼ活
性を失うことなしに短かくなっているということが考え
られる。この可能性を試すために、ｐＮＡＰＴ−２の H
ind III 制限酵素断片をｐＰＮeo／ori に連結した。こ
れは以下のように行った。ｐＰＮeo／ori は、ｐＵＢ１
１０（Ｔ．Ｃ．グリクザン（Gryczan)等、１９７８年、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.)
１３４巻、３１８頁）の2.5kbのＥcoＲＩ−ＳnaＢ１制
限断片に、ｐＵＣ１９（Ｃ．ヤニッシュ−ペロン（C.Ya
nisch-Perron) 等、ジーン（Jene) 、３３巻、１０３
頁、１９８５年）の2.7kbEcoRI −ＳmaＩ制限断片を連
結することにより構築した。生じたシャトル・プラスミ
ドｐＰＮeo／ori （5.２ kb ）はｐＵＣ１９オリジンと
ｐＵＢ１１０オリジンの存在のために、大腸菌中及びバ
チルス種中で複製する能力をもっている。さらにｐＰＮ
eo／ori は、アンピシリン耐性遺伝子と、ネオマイシン
耐性遺伝子を持っている（Ｃ．ヤニッシューペロン（C.
Yanisch-Perron) 等、１９８５年、M.マツムラ（Matsum
ura)等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacte
riol.)１６０巻、４１３頁、１９８４年）。
ステラーゼ活性の改良 エステラーゼをコードするプラスミドｐＮＡＰＴ−２
は、５ kb の枯草菌ThaiＩ−８（ＣＢＳ６７9.８５）の
ＤＮＡ挿入物を持っている。これは、約３０ kbのタン
パク質をコードする遺伝子に対して予期されるに十分小
さい大きさであるので、その挿入物は、エステラーゼ活
性を失うことなしに短かくなっているということが考え
られる。この可能性を試すために、ｐＮＡＰＴ−２の H
ind III 制限酵素断片をｐＰＮeo／ori に連結した。こ
れは以下のように行った。ｐＰＮeo／ori は、ｐＵＢ１
１０（Ｔ．Ｃ．グリクザン（Gryczan)等、１９７８年、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.)
１３４巻、３１８頁）の2.5kbのＥcoＲＩ−ＳnaＢ１制
限断片に、ｐＵＣ１９（Ｃ．ヤニッシュ−ペロン（C.Ya
nisch-Perron) 等、ジーン（Jene) 、３３巻、１０３
頁、１９８５年）の2.7kbEcoRI −ＳmaＩ制限断片を連
結することにより構築した。生じたシャトル・プラスミ
ドｐＰＮeo／ori （5.２ kb ）はｐＵＣ１９オリジンと
ｐＵＢ１１０オリジンの存在のために、大腸菌中及びバ
チルス種中で複製する能力をもっている。さらにｐＰＮ
eo／ori は、アンピシリン耐性遺伝子と、ネオマイシン
耐性遺伝子を持っている（Ｃ．ヤニッシューペロン（C.
Yanisch-Perron) 等、１９８５年、M.マツムラ（Matsum
ura)等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacte
riol.)１６０巻、４１３頁、１９８４年）。
【００４７】サブクローニングのために、 Hind III で
消化したｐＮＡＰＴ−２を Hind III で消化したｐＰＮ
eo／ori と混合し、連結した。その混合物を先に述べた
ように（マニアチス（Maniatis) 等、１９８２年）大腸
菌ＪＭ１０１ hsds にトランスフォームした。大腸菌Ｊ
Ｍ１０１hsdsは、ファーバゲン・コレクション（Phabag
en collection)から入手した（オランダ、ウトレクト
（Utrecht)受理番号ＰＣ２４９３）。ベータナフチルア
セテートを加水分解することのできるコロニーを実施例
10で述べたように選択した。２ヶの陽性コロニーから、
プラスミドＤＮＡを単離し、いくつかの制限酵素認識部
位を決定することにより詳細に特徴づけた。これらのプ
ラスミド、ｐＮＡＰＴ−７及びｐＮＡＰＴ−８の遺伝子
を図５と図６に示した、Ｓ−ナプロキセンメチルエステ
ルに対する、大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７及び大腸菌／ｐＮ
ＡＰＴ−８の活性を測定した（表１１）。両方のプラス
ミドは、挿入物として、方向は逆であるが、2.２ kb の
ｐＮＡＰＴ−２の Hind III − Hind III フラグメント
を有していることがわかろう。また、エステラーゼの遺
伝子は、それらのThaiＩ−８ＤＮＡの2.０ kb 領域に存
在しなければならないであろう。大腸菌ＪＭ１０１hsds
から抽出後、そのプラスミドｐＮＡＰＴ−７及びｐＮ
ＡＰＴ−８を、枯草菌１−８５及び枯草菌１Ａ−４０の
プロトプラストにトランスフォームした（Ｃ．チャング
（Chang)とＳ．Ｎ．コーエン（Cohen)、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティクス（J.Gene. Gene
t.) 、１６８巻、１１１頁、１９７９年）、枯草菌１−
８５（ユキ（Yuki)、Ｓ．ジャパニーズ・ジャーナル・オ
ブ・ジェネティクス（Jpn. J. Genet.)４２巻、２５１
頁、１９６７年）と、枯草菌１Ａ４０（バチルス・スト
ック・センター B.G.S.C. １Ａ４０）はすでに述べられ
てきている。
消化したｐＮＡＰＴ−２を Hind III で消化したｐＰＮ
eo／ori と混合し、連結した。その混合物を先に述べた
ように（マニアチス（Maniatis) 等、１９８２年）大腸
菌ＪＭ１０１ hsds にトランスフォームした。大腸菌Ｊ
Ｍ１０１hsdsは、ファーバゲン・コレクション（Phabag
en collection)から入手した（オランダ、ウトレクト
（Utrecht)受理番号ＰＣ２４９３）。ベータナフチルア
セテートを加水分解することのできるコロニーを実施例
10で述べたように選択した。２ヶの陽性コロニーから、
プラスミドＤＮＡを単離し、いくつかの制限酵素認識部
位を決定することにより詳細に特徴づけた。これらのプ
ラスミド、ｐＮＡＰＴ−７及びｐＮＡＰＴ−８の遺伝子
を図５と図６に示した、Ｓ−ナプロキセンメチルエステ
ルに対する、大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７及び大腸菌／ｐＮ
ＡＰＴ−８の活性を測定した（表１１）。両方のプラス
ミドは、挿入物として、方向は逆であるが、2.２ kb の
ｐＮＡＰＴ−２の Hind III − Hind III フラグメント
を有していることがわかろう。また、エステラーゼの遺
伝子は、それらのThaiＩ−８ＤＮＡの2.０ kb 領域に存
在しなければならないであろう。大腸菌ＪＭ１０１hsds
から抽出後、そのプラスミドｐＮＡＰＴ−７及びｐＮ
ＡＰＴ−８を、枯草菌１−８５及び枯草菌１Ａ−４０の
プロトプラストにトランスフォームした（Ｃ．チャング
（Chang)とＳ．Ｎ．コーエン（Cohen)、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティクス（J.Gene. Gene
t.) 、１６８巻、１１１頁、１９７９年）、枯草菌１−
８５（ユキ（Yuki)、Ｓ．ジャパニーズ・ジャーナル・オ
ブ・ジェネティクス（Jpn. J. Genet.)４２巻、２５１
頁、１９６７年）と、枯草菌１Ａ４０（バチルス・スト
ック・センター B.G.S.C. １Ａ４０）はすでに述べられ
てきている。
【００４８】ネオマイシン耐性コロニーを、述べた方法
に従って（実施例１２参照）２×ＴＹ培地で増殖後、Ｓ
−ナプロキセンメチルエステルを加水分解する能力をテ
ストした。表１１にその活性を示した。多数の遺伝子コ
ピーの導入によって、約３００倍の改良が成遂げられ
た。それ故、この微生物及びこれらが誘導された物質
の、Ｓ−ナプロキセンエステルを加水分解するための工
程に用いるための適性が大巾に改良されたことになる。
遺伝子クローニングがある酵素の発現レベルを改善する
ことは知られてはいるが、エステラーゼの場合の、この
促進度には、驚くべきものがある。酵素に対する遺伝子
のクローニングの際には、不適正な折りたたみ、タンパ
ク質の変性及び細胞内沈殿といった問題に、非常にしば
しば出くわす。（ハリス（Harris) 、T.J.R.１９８３
年、遺伝子工学４アカデミックプレス）予想に反して、
エステラーゼ遺伝子のクローニングの場合、これらの問
題は１つも生じなかったようである。
に従って（実施例１２参照）２×ＴＹ培地で増殖後、Ｓ
−ナプロキセンメチルエステルを加水分解する能力をテ
ストした。表１１にその活性を示した。多数の遺伝子コ
ピーの導入によって、約３００倍の改良が成遂げられ
た。それ故、この微生物及びこれらが誘導された物質
の、Ｓ−ナプロキセンエステルを加水分解するための工
程に用いるための適性が大巾に改良されたことになる。
遺伝子クローニングがある酵素の発現レベルを改善する
ことは知られてはいるが、エステラーゼの場合の、この
促進度には、驚くべきものがある。酵素に対する遺伝子
のクローニングの際には、不適正な折りたたみ、タンパ
ク質の変性及び細胞内沈殿といった問題に、非常にしば
しば出くわす。（ハリス（Harris) 、T.J.R.１９８３
年、遺伝子工学４アカデミックプレス）予想に反して、
エステラーゼ遺伝子のクローニングの場合、これらの問
題は１つも生じなかったようである。
【００４９】
【表１１】 表 １１ 活性（ｕ／リットル ） 大腸菌ＪＭ１０１ hsds／pNAPT −７（ＣＢＳ ７１2.８６） １０６４ 大腸菌ＪＭ１０１ hsds／pNAPT −８（ＣＢＳ ６７2.８６） １１６０ 枯草菌１−８５／pNAPT −７（ＣＢＳ ６７3.８６） １０１１ 枯草菌１Ａ４０／pNAPT −７（ＣＢＳ ６７5.８６） ９６５ 枯草菌１Ａ４０／pNAPT −８（ＣＢＳ ６７4.８６） １２２８ 大腸菌ＪＭ１０１ hsds ／ｐUN１２１ 0.０ 枯草菌１−８５ 8.０ 枯草菌１Ａ４０（ＢＧＳＣ １Ａ４０） 0.０枯草菌 Thai I −８（ＣＢＳ ６７9.８５） 3.５
【００５０】
【実施例１２】 大腸菌ＪＭ１０１ hsds/ｐＮＡＰＴ−７のナプロキセン
メチルエステラーゼの特性化 実施例１１の大腸菌ＪＭ１０１ hsds ／ｐＮＡＰＴ−７
の１リットル培養培地を用いた。その培地を遠心し、ペ
レットをpH8.０の0.１Ｍトリス−塩酸バッファに懸濁、
１％v/v オクタノールの存在下、1 mg／mlリゾチーム、
４mg／mlＥＤＴＡと、３０℃で１時間、インキュベート
した。そのＤＮＡを１５mM Ｍｇ2+の存在下0.０２mg／
mlのＤＮase で加水分解した（３０分、２２℃）。遠心
後、上清のタンパク質画分を６０％硫酸アンモニウム飽
和で沈殿させた。遠心後、そのペレットをpH7.５の１０
mM ＭＯＰＳ溶解し、超遠心により１０倍に濃縮した
（アミコン（Amicon) ＹＭ１０）。１ミリリットル中２
０mgのＳ−ナプロキセンメチルエステル、２％トウィー
ン、１mg／ml ＢＳＡ（仔牛血清アルブミン）の存在
下、２５０℃、pH7.５の0.１Ｍ ＭＯＰＳ中で検定した
大腸菌ｐＮＡＰＴ−７のＳ−ナプロキセンエステルに関
する比活性はタンパク質１ミリグラム当り、1.６ユニッ
トであることがわかった。明細書をとおして、１ユニッ
ト（ｕ）とは、特定条件下で、分当り１×１０-6モルの
Ｓ−ナプロキセンメチルエステルを加水分解する酵素量
である。トウィーンは、強い疎水性エステルとＢＳＡの
溶解度を変え、特異的吸着による酵素の不活性化を妨ぐ
目的で加えた。タンパク質濃度は、ＢＳＡを標準物質と
したブラッドフォード（Bradford) の方法に従がい決定
した。
メチルエステラーゼの特性化 実施例１１の大腸菌ＪＭ１０１ hsds ／ｐＮＡＰＴ−７
の１リットル培養培地を用いた。その培地を遠心し、ペ
レットをpH8.０の0.１Ｍトリス−塩酸バッファに懸濁、
１％v/v オクタノールの存在下、1 mg／mlリゾチーム、
４mg／mlＥＤＴＡと、３０℃で１時間、インキュベート
した。そのＤＮＡを１５mM Ｍｇ2+の存在下0.０２mg／
mlのＤＮase で加水分解した（３０分、２２℃）。遠心
後、上清のタンパク質画分を６０％硫酸アンモニウム飽
和で沈殿させた。遠心後、そのペレットをpH7.５の１０
mM ＭＯＰＳ溶解し、超遠心により１０倍に濃縮した
（アミコン（Amicon) ＹＭ１０）。１ミリリットル中２
０mgのＳ−ナプロキセンメチルエステル、２％トウィー
ン、１mg／ml ＢＳＡ（仔牛血清アルブミン）の存在
下、２５０℃、pH7.５の0.１Ｍ ＭＯＰＳ中で検定した
大腸菌ｐＮＡＰＴ−７のＳ−ナプロキセンエステルに関
する比活性はタンパク質１ミリグラム当り、1.６ユニッ
トであることがわかった。明細書をとおして、１ユニッ
ト（ｕ）とは、特定条件下で、分当り１×１０-6モルの
Ｓ−ナプロキセンメチルエステルを加水分解する酵素量
である。トウィーンは、強い疎水性エステルとＢＳＡの
溶解度を変え、特異的吸着による酵素の不活性化を妨ぐ
目的で加えた。タンパク質濃度は、ＢＳＡを標準物質と
したブラッドフォード（Bradford) の方法に従がい決定
した。
【００５１】大腸菌ｐＮＡＰＴ保持体は超遠心後、実施
例９で述べた、ＨＰＬＣ−ＳＥＣシステムで分析した。
１５分後から、カラムからのフラクションを２mlづつ集
め、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性をテストした
（実施例９参照）。図７は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣフラクシ
ョンのＯＤ−２８０nm 吸光度とエステラーゼ活性を示
してある。Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性は、吸光
度溶出プロフィールのピークのところに存在する。まっ
たく同様に分析した、枯草菌ThaiＩ−８エステラーゼの
溶出時間も同じであった（結果は示していない）。図８
は、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体と、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ
のフラクション２６の、リームリ（Laemmli)の方法によ
る１2.６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示してある。レー
ン４は大腸菌ＪＭ１０１ hsds ／ｐＵＮ１２１を含ん
でいる。ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
によって、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体中のもっとも顕
著なタンパク質バンドは大腸菌にはみられないが、ＨＰ
ＬＣ−ＳＥＣのフラクション２６に検出される唯一のタ
ンパク質バンドである。
例９で述べた、ＨＰＬＣ−ＳＥＣシステムで分析した。
１５分後から、カラムからのフラクションを２mlづつ集
め、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性をテストした
（実施例９参照）。図７は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣフラクシ
ョンのＯＤ−２８０nm 吸光度とエステラーゼ活性を示
してある。Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性は、吸光
度溶出プロフィールのピークのところに存在する。まっ
たく同様に分析した、枯草菌ThaiＩ−８エステラーゼの
溶出時間も同じであった（結果は示していない）。図８
は、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体と、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ
のフラクション２６の、リームリ（Laemmli)の方法によ
る１2.６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示してある。レー
ン４は大腸菌ＪＭ１０１ hsds ／ｐＵＮ１２１を含ん
でいる。ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
によって、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体中のもっとも顕
著なタンパク質バンドは大腸菌にはみられないが、ＨＰ
ＬＣ−ＳＥＣのフラクション２６に検出される唯一のタ
ンパク質バンドである。
【００５２】図９は、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７の等電点ゲ
ル電気泳動（ＬＫＢアムホリン（Ampholine ＰＡＧ−プ
レート、pH3.５〜9.５）の結果を示した。Ａでは、タン
パク質をサーバ・ブルＲ（Serva Blue Ｒ）で染色し
た。Ｂでは、同試料のエステラーゼ活性を、実施例１０
に述べたβ−ナフチルアセテート／ＦＢ（ファースト・
ブルーＲＲ塩）により視覚化した。Ａ中も顕著なタンパ
ク質バンドが、最も高いエステラーゼ活性を任うことが
示された。
ル電気泳動（ＬＫＢアムホリン（Ampholine ＰＡＧ−プ
レート、pH3.５〜9.５）の結果を示した。Ａでは、タン
パク質をサーバ・ブルＲ（Serva Blue Ｒ）で染色し
た。Ｂでは、同試料のエステラーゼ活性を、実施例１０
に述べたβ−ナフチルアセテート／ＦＢ（ファースト・
ブルーＲＲ塩）により視覚化した。Ａ中も顕著なタンパ
ク質バンドが、最も高いエステラーゼ活性を任うことが
示された。
【００５３】
【実施例１３】 大腸菌ＪＭ１０１ hsds ／ｐＮＡＰＴ−７によるイブプ
ロフェンのエチルエステルのイブプロフェンへの転換 硫安沈殿と超遠心の後、大腸菌ｐＮＡＰＴ細胞破壊物
は、Ｒ−及びＳ−イブプロフェンエチルエステルの加水
分解に関するテストを行った。酵素活性は、0.３mg／ml
のＲ又はＳ−イブプロフェンエテルエステル、２％トウ
ィーン及び１mg／mlＢＳＡの存在下pH7.５の0.１Ｍ MOP
S バッファ中２５℃で検定した。２時間後、アセトニト
リルを添加することにより反応を停止した。反応混合物
は、ＨＰＬＣ逆相カラム（クロムパックポリゴシル６０
Ｄ−１０ＣＮ（chrompack polygosil)、２５０×4.６m
m）、を使い、1.５ml／min の流速で、３４％アセトニ
トリル、0.０５Ｍリン酸（pH3.０）を流すことにより分
析した。Ｒ、Ｓ−イブプロフェン及びＲ、Ｓ−イブプロ
フェンエチルエステルの溶出時間は5.９８分及び１1.０
８分であった。結果を表１２にまとめた。Ｓ−イブプロ
フェンのエチルエステルの加水分解は同条件下でテスト
したＳ−ナプロキセンメチルエステルの加水分解活性の
６０％であった。
ロフェンのエチルエステルのイブプロフェンへの転換 硫安沈殿と超遠心の後、大腸菌ｐＮＡＰＴ細胞破壊物
は、Ｒ−及びＳ−イブプロフェンエチルエステルの加水
分解に関するテストを行った。酵素活性は、0.３mg／ml
のＲ又はＳ−イブプロフェンエテルエステル、２％トウ
ィーン及び１mg／mlＢＳＡの存在下pH7.５の0.１Ｍ MOP
S バッファ中２５℃で検定した。２時間後、アセトニト
リルを添加することにより反応を停止した。反応混合物
は、ＨＰＬＣ逆相カラム（クロムパックポリゴシル６０
Ｄ−１０ＣＮ（chrompack polygosil)、２５０×4.６m
m）、を使い、1.５ml／min の流速で、３４％アセトニ
トリル、0.０５Ｍリン酸（pH3.０）を流すことにより分
析した。Ｒ、Ｓ−イブプロフェン及びＲ、Ｓ−イブプロ
フェンエチルエステルの溶出時間は5.９８分及び１1.０
８分であった。結果を表１２にまとめた。Ｓ−イブプロ
フェンのエチルエステルの加水分解は同条件下でテスト
したＳ−ナプロキセンメチルエステルの加水分解活性の
６０％であった。
【００５４】
【表１２】 表 １２ 基 質 エステル基 ｕ／リットル Ｓ−特異性（％） Ｓ−イブプロフェン エチル ３９６００ ９5.３ Ｒ−イブプロフェン エチル １８６５ Ｓ−ナプロキセン メチル ６５０００
【００５５】
【実施例１４】バチルス１−８５／ｐＮＡＰＴ−７のＳ
−ナプロキセンエステラーゼの特性化バチルス１−８５
／ｐＮＡＰＴ−７を２×ＴＹ培地で５リットルエスヒバ
イラ・ファーメンターを用いて増殖させた。細胞ペース
トを遠心で単離した。そのペレットをpH8.０の0.１Ｍト
リス−塩酸に溶解し、実施例９に述べた方法で分解し
た。遠心後、上清を６０％飽和硫酸アンモニウムにし、
再び遠心した。ペレットをpH7.５ 0.０２Ｍ ＭＯＰＳ
に溶かし、アミコンＹＭ１０（Amicon ＹＭ１０）フィ
ルターで濾過した。この細胞分解物を分析ＨＰＬＣ−Ｓ
ＥＣカラム（ＴＳＫ２０００ SW、２×（３００×7.５
mm））を用い、pH5.６の0.０１Ｍ ＭＥＳ（２−モルホ
リノ）エタンスルホン酸、0.１Ｍ ＮａＣｌで溶出し
た。流速は１ml／min 。１０分後から１mlづつフラクシ
ョンを集め、実施例１２の方法に従がいＳ−ナプロキセ
ンメチルエステラーゼ活性をテストした。図１０は、そ
のフラクションのＯＤ−２８０nmのプロフィールとエス
テラーゼ活性を示してある。Ｓ−ナプロキセンエステラ
ーゼの溶出時間は、見かけの分子量２７０００に相当す
る。種々のタンパク質試料の比活性を表１３にまとめ
た。エステラーゼ活性は実施例１２に述べた方法で検定
した。
−ナプロキセンエステラーゼの特性化バチルス１−８５
／ｐＮＡＰＴ−７を２×ＴＹ培地で５リットルエスヒバ
イラ・ファーメンターを用いて増殖させた。細胞ペース
トを遠心で単離した。そのペレットをpH8.０の0.１Ｍト
リス−塩酸に溶解し、実施例９に述べた方法で分解し
た。遠心後、上清を６０％飽和硫酸アンモニウムにし、
再び遠心した。ペレットをpH7.５ 0.０２Ｍ ＭＯＰＳ
に溶かし、アミコンＹＭ１０（Amicon ＹＭ１０）フィ
ルターで濾過した。この細胞分解物を分析ＨＰＬＣ−Ｓ
ＥＣカラム（ＴＳＫ２０００ SW、２×（３００×7.５
mm））を用い、pH5.６の0.０１Ｍ ＭＥＳ（２−モルホ
リノ）エタンスルホン酸、0.１Ｍ ＮａＣｌで溶出し
た。流速は１ml／min 。１０分後から１mlづつフラクシ
ョンを集め、実施例１２の方法に従がいＳ−ナプロキセ
ンメチルエステラーゼ活性をテストした。図１０は、そ
のフラクションのＯＤ−２８０nmのプロフィールとエス
テラーゼ活性を示してある。Ｓ−ナプロキセンエステラ
ーゼの溶出時間は、見かけの分子量２７０００に相当す
る。種々のタンパク質試料の比活性を表１３にまとめ
た。エステラーゼ活性は実施例１２に述べた方法で検定
した。
【００５６】バチルスｐＮＡＰＴ−７保持体の立体異性
選択性を表１４に示した。その活性は、実施例１２に従
って検定した。図８に、リームリ（Laemmli)の方法に従
った、バチルスｐＮＡＰＴ−７と、各々、リパーゼ活性
と、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を示すＨＰＬＣ
−ＳＥＣのフラクション５及び７の１2.６％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果を示す。バチルス保持体におけるタンパク
質の主なバンドは、フラクション５中には存在せず（リ
パーゼ活性）、フラクション７中に存在する唯一のバン
ドである。レーン８のタンパク質バンドは、見かけの分
子量３１０００に相当する。図９には、バチルスｐＮＡ
ＰＴ−７とフラクション７の等電点ゲル電気泳動の結果
が示されている。（技術的な詳細は実施例１２参照）。
バチルスｐＮＡＰＴ−７保持体では、等電点（ＩＥＰ）
4.５をもつリパーゼ活性がナフチルアセテートの基質に
関するもっとも卓越した活性である。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ
のフラクション７においては、タンパク質の主バンドは
ＩＥＰ5.４を有しており、パートＢ中に示したナフチル
アセテート加水分解活性と共存する。β−ナフチル・フ
ァースト・ブルー検定方は、エステラーゼよりも、リパ
ーゼに対し、より感受性が高いことに注意しなければな
らない。
選択性を表１４に示した。その活性は、実施例１２に従
って検定した。図８に、リームリ（Laemmli)の方法に従
った、バチルスｐＮＡＰＴ−７と、各々、リパーゼ活性
と、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を示すＨＰＬＣ
−ＳＥＣのフラクション５及び７の１2.６％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの結果を示す。バチルス保持体におけるタンパク
質の主なバンドは、フラクション５中には存在せず（リ
パーゼ活性）、フラクション７中に存在する唯一のバン
ドである。レーン８のタンパク質バンドは、見かけの分
子量３１０００に相当する。図９には、バチルスｐＮＡ
ＰＴ−７とフラクション７の等電点ゲル電気泳動の結果
が示されている。（技術的な詳細は実施例１２参照）。
バチルスｐＮＡＰＴ−７保持体では、等電点（ＩＥＰ）
4.５をもつリパーゼ活性がナフチルアセテートの基質に
関するもっとも卓越した活性である。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ
のフラクション７においては、タンパク質の主バンドは
ＩＥＰ5.４を有しており、パートＢ中に示したナフチル
アセテート加水分解活性と共存する。β−ナフチル・フ
ァースト・ブルー検定方は、エステラーゼよりも、リパ
ーゼに対し、より感受性が高いことに注意しなければな
らない。
【００５７】ＨＰＬＣ−ＳＥＣのＯＤ２８０nmピーク
（フラクション７）は、ナプロキセンエステラーゼ活性
を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１つの主タンパク質バンド
からなるようである。等電点ゲル電気泳動は、フラクシ
ョン７の主タンパク質バンドがエステラーゼ活性をもつ
ことを示した。これは、大腸菌及びバチルスの両方に存
在する枯草菌ThaiＩ−８のエステラーゼ活性のクローニ
ングがエステラーゼ産生を増加していることを意味す
る。事実、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７及びバチルスｐＮＡＰ
Ｔ−７中のナプロキセンエステラーゼは、両方の微生物
の細胞分解物中、もっとも高い濃度をもつタンパク質で
ある。
（フラクション７）は、ナプロキセンエステラーゼ活性
を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１つの主タンパク質バンド
からなるようである。等電点ゲル電気泳動は、フラクシ
ョン７の主タンパク質バンドがエステラーゼ活性をもつ
ことを示した。これは、大腸菌及びバチルスの両方に存
在する枯草菌ThaiＩ−８のエステラーゼ活性のクローニ
ングがエステラーゼ産生を増加していることを意味す
る。事実、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７及びバチルスｐＮＡＰ
Ｔ−７中のナプロキセンエステラーゼは、両方の微生物
の細胞分解物中、もっとも高い濃度をもつタンパク質で
ある。
【００５８】
【表１３】 表 １３ タンパク 質濃度 ｕ／mg 試 料 u／ml （mg／ml） タンパク質 バチルス 1-80／ｐＮＡＰＴ−７＊ 196 120 1.2 フラクション６ ＨＰＬＣ−ＳＥＣ 6.7 1.1 6.1 フラクション７ ＨＰＬＣ−ＳＥＣ 6 0.95 6.3 バチルス Thai Ｉ−８＊ 0.221 107 0.002 ＊細胞破壊、硫安沈殿、限外濾過後の細胞分解物
【００５９】
【表１４】 表 １４ 添加した Ｓ−特異性 メチルエステル ｕ／ml （％） Ｓ−ナプロキセン 105000 99.4 バチルス 1-85／pNAPT-7 Ｒ−ナプロキセン 577
【図１】バチルスThaiＩ−８細胞分解物のＨＰＬＣ−Ｓ
ＥＣの結果を示す図である。
ＥＣの結果を示す図である。
【図２】実施例７の検定条件下におけるＳ−ナプロキセ
ンメチルエステルの加水分解のpH依存性を示す図であ
る。
ンメチルエステルの加水分解のpH依存性を示す図であ
る。
【図３】エステラーゼ反応における温度の影響を示す図
である。
である。
【図４】ｐＮＡＰＴ−２の制限地図であって、制限酵素
認識部位の数は9.４ kb の大きさをもつプラスミドｐＮ
ＡＰＴ−２において決定され、Ｓan３ａで部分消化した
ThaiＩ−８ＤＮＡとｐＵＮ１２１との連結部位はＢcl
１／Ｓan３ａと表わされる。
認識部位の数は9.４ kb の大きさをもつプラスミドｐＮ
ＡＰＴ−２において決定され、Ｓan３ａで部分消化した
ThaiＩ−８ＤＮＡとｐＵＮ１２１との連結部位はＢcl
１／Ｓan３ａと表わされる。
【図５】各々、ｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８の制限
地図を示す。ｐＮＡＰＴ−２の2.２ kb の Hind III フ
ラグメントをｐＰＮeo／ori にクローン化した。生じた
プラスミドｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８を、いくつ
かの制限酵素をつかって詳細に解析した。双方のプラス
ミドとも 7.3 kb の大きさをもっている。ｐＮＡＰＴ−
８は2.２ kb の Hind III フラグメントをｐＮＡＰＴ−
７と逆方向の向きにもっていることがわかる。
地図を示す。ｐＮＡＰＴ−２の2.２ kb の Hind III フ
ラグメントをｐＰＮeo／ori にクローン化した。生じた
プラスミドｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８を、いくつ
かの制限酵素をつかって詳細に解析した。双方のプラス
ミドとも 7.3 kb の大きさをもっている。ｐＮＡＰＴ−
８は2.２ kb の Hind III フラグメントをｐＮＡＰＴ−
７と逆方向の向きにもっていることがわかる。
【図６】各々、ｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８の制限
地図を示す。ｐＮＡＰＴ−２の2.２ kb の Hind III フ
ラグメントをｐＰＮeo／ori にクローン化した。生じた
プラスミドｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８を、いくつ
かの制限酵素をつかって詳細に解析した。双方のプラス
ミドとも 7.3 kb の大きさをもっている。ｐＮＡＰＴ−
８は2.２ kb の Hind III フラグメントをｐＮＡＰＴ−
７と逆方向の向きにもっていることがわかる。
地図を示す。ｐＮＡＰＴ−２の2.２ kb の Hind III フ
ラグメントをｐＰＮeo／ori にクローン化した。生じた
プラスミドｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８を、いくつ
かの制限酵素をつかって詳細に解析した。双方のプラス
ミドとも 7.3 kb の大きさをもっている。ｐＮＡＰＴ−
８は2.２ kb の Hind III フラグメントをｐＮＡＰＴ−
７と逆方向の向きにもっていることがわかる。
【図７】ＨＰＬＣ−ＳＥＣフラクションのＯＤ−２８０
nm吸光度とエステラーゼ活性とを示す図である。
nm吸光度とエステラーゼ活性とを示す図である。
【図８】大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体と、ＨＰＬＣ−Ｓ
ＥＣのフラクション２６の、リムリー（Laemmli) の方
法による１2.６％ SDS-PAGE の図である。
ＥＣのフラクション２６の、リムリー（Laemmli) の方
法による１2.６％ SDS-PAGE の図である。
【図９】大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体の等電点ゲル電気
泳動（ＬＫＢアンホリン（Ampholine PAG プレート、pH
3.５〜9.５）の結果を示す図である。
泳動（ＬＫＢアンホリン（Ampholine PAG プレート、pH
3.５〜9.５）の結果を示す図である。
【図１０】ＨＰＬＣ−ＳＥＣフラクションのＯＤ−２８
０nmプロフィールと、エステラーゼ活性を示す図であ
る。
０nmプロフィールと、エステラーゼ活性を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｐ 7/40 Ａ６１Ｋ 31/19 ＡＢＥ // Ａ６１Ｋ 31/19 ＡＢＥ 31/33 ＡＡＨ 31/33 ＡＡＨ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:10） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:785） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 595168945 シェル インターナショナル リサーチ マーチャッピー ベスローテン フェンノ ートチャップ オランダ 2501 アエヌ デン ハーフ ペーオーボックス 162 カールイ ファ ン ビーラントラーン 30 (72)発明者 マウロ アッティリオ ベルトラ オランダ国 2624 ペーイェー デルフト ア ファン シェルトマプレイン 91 (72)発明者 アーサー フリードリッヒ マルクス オランダ国 2614 ヘーエム デルフト エフエル ナイティンゲールラーン 12 (72)発明者 ヘイン シモン コーヘル オランダ国 2064 イックス エル スパ ールンダム ヘー フェルモーテンストラ ート 32 (72)発明者 ウィルヘルムス ヨハネス クワックス オランダ国 2253 ヴェーベー フォール ショーテン ヤン ファン ハーレンラー ン ８ (72)発明者 コーネリス ヤコブス ファン デル ラ ーケン オランダ国 2315 テーハー レイデン ヘームスケルクストラート 103 (72)発明者 ガーレス トーマス フィリップス 英国 ケント シッティングボーン ザ フィンチェス ５ (72)発明者 ブライアン ウィリアム ロバートソン 英国 ケント ＭＥ９ ８ＡＧ シッティ ングボーン バップチャイルド ローズ クローズ 16 (72)発明者 ピーター ダグラス ワッツ 英国 ケント シッティングボーン ウー レットロード ９
Claims (22)
- 【請求項１】 ナプロキセンエステルを、少なくとも８
０重量％のＳ−配置を有するナプロキセンに立体選択的
に加水分解することのできる微生物のエステラーゼであ
って、等電点が5.４；見かけ分子量が３１０００；最適
Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最適温度が２５〜４５℃
であることを特徴とするエステラーゼ。 - 【請求項２】 前記ナプロキセンエステルのエステル残
基が置換されていてもよいアルキル基である請求項１記
載のエステラーゼ。 - 【請求項３】 バチルス属から得られ得る請求項１記載
のエステラーゼ。 - 【請求項４】 枯草菌から得られ得る請求項３記載のエ
ステラーゼ。 - 【請求項５】 バチルス種Thai I-8（ＣＢＳ６７９．８
５）、バチルス種 IN IV-8（ＣＢＳ６８０．８５）、バ
チルス種Nap １０Ｍ（ＣＢＳ８０５．８５）、バチルス
種Ｓｐ III−４（ＣＢ８０６．８５）、シュードモナス
種Kor Ｉ−６（ＣＢＳ８０７．８５）、大腸菌ＤＨ１／
ｐＮＡＰＴ−２（ＣＢＳ６７1.８６）、大腸菌ＪＭ１０
１hsds/pＮＡＰＴ−７（ＣＢＳ７１２．８６）、枯草菌
１−８５／ｐＮＡＰＴ−７（ＣＢＳ６７３．８６）、枯
草菌１Ａ４０／ｐＮＡＰＴ−７（ＣＢＳ６７５．８
６）、枯草菌１Ａ４０／ｐＮＡＰＴ−８（ＣＢＳ６７
４．８６）、大腸菌ＪＭ101 hsds／ｐＮＡＰＴ−８（Ｃ
ＢＳ６７２．８６）、ＬＫ３−４株（ＣＢＳ６６７．８
６）、ＳＰ４株（ＣＢＳ６６８．８６）、THAI III-1８
−１株（ＣＢＳ６６９．８６）、THAI VI-12株（ＣＢＳ
６７０．８６）、及びISIII−２５株（ＣＢＳ６６６．
８６）からなる群から選択される微生物から得ることの
できる請求項１に記載のエステラーゼ。 - 【請求項６】 ｍｇタンパク質当り、少なくとも１の比
活性を有する請求項１記載のエステラーゼ。 - 【請求項７】 ナプロキセンエステルを、少なくとも８
０重量％のＳ−配置を有するナプロキセンに立体選択的
に加水分解することのできる微生物のエステラーゼであ
って、等電点が5.４；見かけ分子量が３１０００；最適
Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最適温度が２５〜４５℃
であるエステラーゼをコードし、かつバチルス属 Thai
I-8 (CBS 679.85)から得られ得ることを特徴とする DNA
フラグメント。 - 【請求項８】 ナプロキセンエステルを、少なくとも８
０重量％のＳ−配置を有するナプロキセンに立体選択的
に加水分解することのできる微生物のエステラーゼであ
って、等電点が5.４；見かけ分子量が３１０００；最適
Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最適温度が２５〜４５℃
であるエステラーゼをコードし、かつバチルス属 Thai
I-8 (CBS 679.85)から得られ得る DNAフラグメントを含
有することを特徴とするプラスミド。 - 【請求項９】 pNAPT-7 (CBS 712.86)又はpNAPT-8 (CBS
672.86)である、請求項８に記載のプラスミド。 - 【請求項１０】 ナプロキセンエステルから、少なくと
も８０重量％のＳ−配置を有するナプロキセンに立体選
択的に加水分解することのできる微生物のエステラーゼ
であって、等電点が5.４；見かけ分子量が３１０００；
最適Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最適温度が２５〜４
５℃であるエステラーゼをコードし、かつバチルス属 T
hai I-8 (CBS 679.85)から得られ得る DNAフラグメント
によって形質転換することにより、ナプロキセンエステ
ルをナプロキセンに立体選択的に加水分解するエステラ
ーゼ活性を取得した又はエステラーゼ活性を増大させた
ことを特徴とする微生物。 - 【請求項１１】 ナプロキセンエステルを、少なくとも
８０重量％のＳ−配置を有するナプロキセンに立体選択
的に加水分解することのでき、かつ等電点が5.４；見か
け分子量が３１０００；最適Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そ
して最適温度が２５〜４５℃である微生物のエステラー
ゼを製造する方法であって、前記エステラーゼをコード
し、かつバチルス属 Thai I-8 (CBS 679.85)から得るこ
とのできる DNAフラグメントによって形質転換すること
によって、ナプロキセンエステルをナプロキセンに立体
選択的に加水分解するエステラーゼ活性を取得した、又
はエステラーゼ活性を増大させた微生物を培養すること
を特徴とする方法。 - 【請求項１２】 式（Ｉ）： 【化１】 （ただし、Ｒ1 は、任意に置換し得るフェニル又はナフ
チル基のような任意に置換しうるアリール基又はヘテロ
環システムであり、もしくは炭素原子と、窒素、硫黄及
び酸素から選ばれた１以上の原子とを含む、任意に置換
されていてもよいヘテロ芳香環システムである。）で示
され、かつ少なくとも８０重量％のＳ−配置を有する薬
学的に活性な化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容し得る
塩もしくはエステルの製造方法であって、式（II) ： 【化２】 （ただし、Ｒ1 は上記定義の通りであり、Ｒ2 は、エス
テル残基、好ましくは任意に置換されうるアルキル基で
ある。）で示される化合物(II)を、ナプロキセンエステ
ルから、少なくとも８０重量％のＳ−配置を有するナプ
ロキセンに立体選択的に加水分解することのできる微生
物のエステラーゼであって、等電点が5.４；見かけ分子
量が３１０００；最適Ｈｐ値が6.５〜１0.０；そして最
適温度が２５〜４５℃であるエステラーゼをコードし、
かつバチルス属 Thai I-8 (CBS 679.85)から得ることが
できる DNAフラグメントによって形質転換することによ
って、ナプロキセンエステルをナプロキセンに立体選択
的に加水分解するエステラーゼ活性を取得した又はエス
テラーゼ活性を増大させた微生物又はその由来物質の作
用に付し、必要により、前記化合物（Ｉ）を薬学的に許
容し得る塩又はエステルに変換することを特徴とする方
法。 - 【請求項１３】 Ｒ2 が、炭素数が１〜８の直鎖状アル
キル基である請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｒ2 が、エチル基である請求項１２又
は１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｒ2 が、メチル基である請求項１２又
は１３に記載の方法。 - 【請求項１６】 Ｒ1 が、置換フェニル基又はナフチル
基である請求項１２〜１５の何れかに記載の方法。 - 【請求項１７】 前記化合物（Ｉ）が、ナプロキセンで
ある請求項１２〜１５の何れかに記載の方法。 - 【請求項１８】 前記化合物（Ｉ）が、イブプロフェン
である請求項１２〜１５の何れかに記載の方法。 - 【請求項１９】 請求項１２〜１８の何れかに記載の方
法を含有し、次いで、化合物（Ｉ）を分離し、残りを加
水分解することを特徴とする、少なくとも８０重量％Ｒ
−配置の化合物（Ｉ）を製造する方法。 - 【請求項２０】 前記化合物(II)を前記化合物(I) に変
換する能力を有する物質が、前記微生物から遊離され、
そのようなものとして使用される、請求項１２〜１８の
何れかに記載の方法。 - 【請求項２１】 前記微生物が、大腸菌、好ましくは大
腸菌 JM 101 hsds又は大腸菌 DH1である請求項１２〜１
８の何れかに記載の方法。 - 【請求項２２】 前記微生物が、バチルス属、好ましく
は枯草菌、更に好ましくは枯草菌 1-85 又は1A40である
請求項１２〜１８の何れかに記載の方法。
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