KR960016868B1

KR960016868B1 - 2-아릴프로피온산의 제조방법

Info

Publication number: KR960016868B1
Application number: KR1019870000048A
Authority: KR
Inventors: 아틸리오 베르톨라 마우로; 프리드리히 마르크스 아아더; 시몬 코우거어 하인; 요하네스 퀵스 위델무스; 쟈쿄부르 반데르라켄 코르넬리스; 토마스 필립스 가제트; 윌리엄 로버어트슨 브라이언; 더글라스 왓츠 피터
Original assignee: 한스 워터 라벤; 기스트-브로카데스 나암로제 베노오트하프; 오노 알베르즈; 셀 인터나쵸 나아레 레사아치 마아츠샤피 비이 브이
Priority date: 1986-01-07
Filing date: 1987-01-07
Publication date: 1996-12-23
Also published as: DE3780184D1; DK172862B1; CN87100031A; ES2051727T3; JPH08242853A; NO914029L; EP0426656A2; NO914029D0; IE61983B1; FI870035A; DK4987A; JP2702915B2; DE3752257T2; EP0426656B1; NO169498B; FI870035A0; IE870024L; EP0233656A1; NO174350B; PT84060A

Abstract

요약없슴

Description

2-아릴프로피온산의 제조방법

제1도는 Bacillus Thai Ⅰ-8 세포 리세이트(Lysate)의 HPLC-SEC 측면도.

: OD 280nm

: 리파제 활성

: 나프록센 메틸 에스테라제 활성

제2도는 실시예 9의 분석조건하에서 S-나프록센 메틸에스테르 가수분해의 pH 의존.

제3도는 에스테라제 반응에 관한 온도의 영향.

□=25℃, +=30℃, ◇=37℃, △=45℃ 및 ×=60℃

제4도는 pNAPT-2의 제한지도.

다수의 제한효소 인식부위는 플라스미드 pNAPT2에서 결정되며, 이는 9.4kb 크기를 갖는다.

: pUN 121 DNA

: Thai Ⅰ-8 DNA 삽입

부분적으로 Thai Ⅰ-8에 침지된 Sau 3a가 pUN 121에 결찰된 부분은 Bcl1/ Sa u3a로 나타난다.

제5도 및 제6도는 각각 pNAPR-7 및 pNAPT-8의 제한지도.

pNAPR-2의 2.2kb 힌드(Hind)Ⅲ 조각은 pPNeo/ori로 무성색식된다. 생성된 플라스미드(plasmid), pNAPT-7 및 pNAPT-8을 여러가지 제한효소로 상세하게 분석하였다. 두 플라스미드는 7.3kb의 크기를 갖고 있다. pNAPT-8가 pNAPT-7의 배향과는 상반되게 2.2HindⅢ 조각을 운반하는 것을 알 수 있다.

: pUC 19 DNA

: pUB 110 DNA

: pUN 121 DNA

: Thai Ⅰ-8 DNA

제7도는 HPLC-SEC 분획의 OD-280nm 흡착 및 에스테라제 활성.

: S-나프록센 메틸 에스테라제 활성

: OD-280nm

제8도는 대장균 pNAPT-7 리텐테이프 및 HPLC-SEC 분획(26)의 Laemmli에 따른 12.6% SDS-PAGE

선 1,5 및 9 : 분자량 마커

선 2 : 대장균 pNAPT-7 리텐테이트

선 3 : HPLC 겔 여과, 활성분획(26)후 대장균 pNAPT-7 리텐테이트

선 4 : 대장균/pUN 121 숙주 균주(菌株)

선 6 : pNAPT-7을 갖는 고초균(故草菌) 1-85

선 7 및 8 : HPLC 겔 여과, 분획 5 및 7후 pNAPT-7을 갖는 고초균 1-85

선 10 : Bacillus Thai Ⅰ-8 리텐테이트

제9도는 대장균 pNAPT-7 리텐테이트의 등전집속(等電集束) 겔(LKB 공동선 PAG판, pH 3.5-9.5)

A. Serva Blle로 염색한 후

B. β-나프티라세테이트/FBB 염색후

선 1 : 공지의 IEP을 갖는 단백질 마커

선 4 : 대장균 pNAPT-7 리텐테이프

선 3 : pNAPT-7 리텐테이트를 갖는 고초균 1-85

선 2 : HPLC 겔 여과, 활성분획후 선 3과 같음

제10도는 HPLC-SEC 분획의 OD-280nm 프로필 및 에스테라제 활성.

: S-나프록센 메틸 에스테라제 활성

: OD-280nm

본 발명은 구조식(Ⅰ)

의 입체특이형 약학적 활성 화합물 또는 그 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염 또는 피발로일 에스테르와 같은 약학적 혀용가능한 상기 화합물의 염 또는 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것으로, 식중 R₁은 선택적으로 치환되는 헤테로고리계에 포함될 수 있는 페닐 또는 나프틸과 같은 선택적으로 치환된 아릴기를 나타내거나, 또는 탄소원자에 부가해서 질소, 황 및 산소로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 원자를 함유하는 헤테로 방향족 고리계를 나타내며, 이와 같은 고리계는 자유로이 치환된다.

대부분의 생물학적 활성화합물은 입체이성질체 혼합물로 존재하는 것으로 공지되어 있다. 지금까지 주로 이와 같은 혼합물이 농업 및 약학에 사용되어 왔다. 통상적으로 원하는 생물학적 활성은 한가지 입체이성질체에 존재하므로 두 입체이성질체 혼합물의 경우에는 역가(力價)가 반으로 줄어든다. 그럼에도 아직까지 입체이성질체 혼합물을 사용하고 있는 주된 이유는 입체이성질체의 분리비용이 활성증가 가능성의 잇점을 능가하기 때문이다. 그러나 현대의 약리학자들은 이성질체 혼합물을 투여시 입체이성질체중 하나가 원하는 치료효과를 가지는 것이 아니라 유독성을 포함하여 기타 원치않는 생리학적 효과를 가질 수도 있는 불순물로서 간주되야 한다는 점을 알게 되었음이 명백하다.

더우기 문헌(S. Adams et al. J. Pharm. Pharmac., 28(1976) 256 and A.J. Hutt and J. Caldwell, Chlinical Pharmacokinetics 9(1984) 371)에 공지된 바와 같이, 이부프로펜이나 나프톡센의 생체외 소염 활성을 살펴본 결과 S-광학이성체(광학적 활성체)의 활성이 그의 대장체에 비하여 150배라고 한다.

S. Iriuchijima와 A. Keiyu(Agric. Biol. Chem., 45(1981) 1389)에 의하면 선택된 미생물은 나프록센 및 케토프로펜의 메틸 에스테르를 가수분해를 할 수 있는 데 전환율이 매우 낮다고 밝혔다. 이스퍼질러스 소재(Aspergillus sojae)는 우선적으로 R-나프톡센의 메틸 에스테르를 가수분해하여 95중량%의 R-형을 갖는 나프록센을 생성시키는 한편, 마이코박테리움 스매그매티스는 우선적으로 S-케토프로펜의 메틸 에스테르를 가수분해하여 69중량%의 S-형만을 갖는 케토프로펜을 생성시킨다.

독일 특허출원 DE 3345660에서는 마세미 나프록센 에스테르로부터 S-나프록센의 생성을 서술하고 있다. 그러나 본 특허출원에 있어서 S-나프록센은 나프록센 에스테르의 라세미 혼합물로부터 직접 형성되지 않고, R-나프폭센 에스테르를 효소가수분해한 후 생성되는 R-나프록센을 S-나프록센 에스테르로부터 분리한 후 남아있는 S-나프록센 에스테르를 비누화 또는 효소가수분해하여 S-나프록센을 생성시킨다.

최근의 공보(Qu-Ming et al., Tetrahedron Letters, vol.27, no.16(1986) p.17-63)에 S-나프록센 에스테르를 입체선택적으로 전환시킬 수 있는 효소를 캔디다 실린드라세아(Candida Cylindraces)로부터 제조하는 방법이 기술되어 있다. 저자는 그들 제조 방법에서 캔디라 리파제가 나프록센 에스테르 가수분해의 원인이 된다고 밝히고 있다. 그러나, 정제된 리파제 제조의 특이적 활성은 매우 낮다(특정조건하에서 mg 리파제에 대한 3×10^-8mol/min).

그러므로 공업적 규모로 S-입체이성질체를 경제적 가치가 있는 수율로 제조할 수 있는 공정의 필요성이 크며, 본 발명의 목적은 그와 같은 공정을 제공하는 것이다.

폭넓은 연구 및 실험결과로 구조식(Ⅰ)의 화합물의 S-광학이성체를 특이적으로 제조하는 방법을 발견하였으며, 구조식(Ⅱ)의 화합물을

(식중 R₁은 앞서 정의한 바와 같고, R₂는 에스테르 잔기 및 바람직하게는 선택적으로 치환된 알킬기이다), 입체선택적으로 가수분해하여 적어도 80중량% 이상인 S-형을 갖는 화합물(Ⅰ)을 생성할 수 있는 미생물 또는 미생물로부터 유도되는 물질과 반응시켜, 구조식(Ⅰ)의 화합물을 얻고, 필요하면 화합물(Ⅰ)을 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 에스테르로 전환하는 것으로 구성된다.

더욱 상세히 말하면, 본 발명은 식(Ⅰ)의 입체특이형의 S-형의 약학적 활성화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 알칼리 금속염 또는 그의 알칼리 토금속염 또는 그의 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이며(식중 R₁은 선택적으로 치환되는 헤테로고리계에 포함될 수 있는 페닐기 또는 나프틸기와 같은 선택적으로 치환된 아릴기, 또는 탄소원자에 부가해서 질소, 황 및 산소로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 원자를 함유하는 헤테로 방향족 고리계를 나타내고 이와 같은 고리계는 임의로 치환되며, 식중 R₂는 선택적으로 치환된 알킬기이다), 식(Ⅱ)의 화합물을 입체 선택적으로 가수분해시킬 수 있는 능력을 갖고 있는 미생물과 반응시켜 식(Ⅰ)의 화합물 제조하는 것으로 구성되어 있다.

바람직하게는 R₂는 1 내지 8개의 탄소원자를 갖는 선형 알킬기이며, 보다 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기이다.

바람직한 화합물(Ⅰ)로는 나프록센, 이부프로펜, 수프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 베녹사프로펜, 카르프로펜, 시크로프로펜, 피르프로렌, 리시프로페늄, 플루르비프로펜, 플루프로펜, 클리다낙, 테프티프로펜, 헥사프로펜, 인도프로펜, 멕소프로펜, 프라노프로펜, R 803, 프로티진산, 티아프로펜산 또는 브로페질 등이 있다.

본 발명의 공정에 따르면 나프록센은 대부분 S-형으로 제조된다.

바람직한 구체예에 따르면, 미생물 또는 미생물에서 유도된 물질을 사용하여 화합물(Ⅰ)의 적어도 90중량% 이상이 S-형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 캔디다 실린드라세아 리파제보다 적어도 10배 및 바람직하게는 100배 이상의 활성이 있는 효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 공정으로 구성되는 적어도 80%의 R 형을 갖는 화합물(Ⅰ)의 제조방법을 제공하는 것으로서, 화합물(Ⅰ)을 분리한 후 잔여부분을 가수분해하여 얻는다.

"적당한 미생물"이란 예를 들면, Bacillus속, 슈우토모나스속, 아드로박터속, 뮤코아속 또는 스트렙토마이세스속에 속하는 미생물을 의미한다.

또한 신규 유전물질 도입을 통해서 화합물(Ⅱ)를 화합물(Ⅰ)로 입체선택적 전환시킬 수 있는 능력을 얻은 미생물도 "적당한 미생물"이라고 한다.

이는 스크린한 미생물중에서 입체선택적 가수분해를 시키는 물질 즉 에스테라제 효소를 코딩하는 유전자를 클론하여 또 다른 미생물 특히 대장균으로 전달하여 얻을 수 있다. 또 다른 미생물에는 사카로마이세스, 클루버로마이세스, 이스퍼질루스, 대장군, 슈우도모나스 및 스트렙토마이세스속이 있다. 크론 유전자는 에스테르 바람직하게는 β-나프틸-아세테이트 및 나프록센 에스테르를 가수분해할 수 있는 효소를 암호화하는 능력이 있는가에 따라 선택될 수 있다. 또는 이미 에스테라제를 코딩하는 유전자로 선택된 유전자와 교차 혼성화하여 선택될 수 있다. 후자의 경우, 관련 미생물에서 대응 효소의 DNA 서열은 상동성을 나타낸다는 것과(Thara et al., 1985, J. Biochem. 98, p.95) 플라스미드 p-NAPT-7(실시예 11을 참조)은 다른 Bacillus 종으로부터 유도된 염색체 DNA와의 교차혼성화한다는 관찰에 근거하고 있다. 또한 본 발명은 화합물(Ⅱ)를 화합물(Ⅰ)로 변환시키는 방법에서 에스테라제를 코딩하는 다중 및/또는 변형된 유전자 복사체를 미생물에 도입하여 미생물 또는 미생물에서 유도된 물질의 활성을 증가시티는 방법을 포함한다. 예를 들면, 이와 같은 미생물에는 고초균이 있다. 미생물은 예를 들면 중합체 겔로 고정시킬 수 있다. 이는 생세포 및/ 또는 사세포도 가능하며, 에스테라제 효소는 보다 높은 특수활성이 필요하다면 어느 정도 정제할 수도 있다.

그러므로 "미생물 또는 그로부터 유도된 물질"은 죽은 또는 살아 있는 미생물이나 농축 또는 정제된 미생물 추출물을 의미한다.

더욱 상세히 말하면, 나프폭센의 에틸 및 메틸 에스테르[각각 에틸 2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피오네이트 및 메틸 2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피오네이트]를 S-나프록센[2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피온산]으로 가수분해하고 이부프로펜의 에틸 및 메틸 에스테르[각각 에틸 2-(4-이소부틸-1-페닐)프로피오네이트 및 메틸 2-(4-이소부틸-1-페닐)프로피오네이트]를 S-이부프로펜[2-(4-이소부틸-1-페닐)프로피온산]으로 가수분해하는 미생물로는 고초균, Pseudomonas fluorescens, Bacillus Lichemiformis(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 11945호로 ATCC에 기탁되어 있다), Paeudomonas putida(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 12996호로 IFO에 기탁되어 있다), Pseudomonas riboflavina(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 제13584호로 IFO에 기탁되어 있다), Pseudomonas ovalis(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 1049호로 IAM에 기탁되어 있다), Pseudomonsa aeruginosa(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 13130호로 IFO에 기탁되어 있다), Mucor angulimacrosporus(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 6149호로 IAM에 기탁되어 있다), Arthrobacter paraffineus(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 21218호로 ATCC에 기탁되어 있다), Strain is Ⅲ25(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 666.86호로 CBS에 기탁되어 있다), Strain LK 3-4(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 667.86호로 CBS에 기탁되어 있다), Strain Sp 4(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 668.86호로 CBS에 기탁되어 있다), StrainThai Ⅲ 18-1(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 669.86호로 CBS에 기탁되어 있다), 및 Strain Thai VI 12(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 670.86호로 CBS에 기탁되어 있다)의 배양균이 있다.

유리하게도, 고초균 종의 배양균으로는 Bacillus 종 Thai 1-8종(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 679.85호로 CBS에 기탁되어 있다), Bacillus 종 In IV-8종(이와 같은 시료는 수탁번호 680.85호로 CBS에 기탁되어 있다), Bacillus 종 Nap 10-M종(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 805.85호로 CBS에 기탁되어 있다), Bacillus 종 Sp Ⅲ-4종(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 806.85호로 CBS에 기탁되어 있다), 고초균 1-85(Yuki, S., 1967, JPn, J. Genet. 42, p.251), 고초균 1-85/pNAPT-7(이와 같은 시료는 기탁번호 673.86호로 CBS에 기탁되어 있다), 고초균 1A-40/pNAPT-8(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 674.86호로 CBS에 기탁되어 있다) 및 고초균 1A-40/pNAPT-7(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 675.86호로 CBS에 기탁되어 있다)의 배양균 등이 있다. Pseudomonas fluorescens의 배양균으로는 Pseudomonas 종 Kor Ⅰ-6종(이와 같은 종의 시료는 수탁번호 807.85호로 CBS에 기탁되어 있다) 및 수탁번호 3081호로 IFO에 기탁된 Pseudomonas fluorescens의 배양액 등이 있다.

IFO=일본 오오사카에 주재하고 있는 발효연구소.

IAM=일본 도쿄대학에 있는 응용 미생물학 연구소.

본 발명의 공정의 바람직한 구체예에 따라, 화합물(Ⅲ)을 적어도 80중량%의 S-형을 갖는 화합물(Ⅰ)로 전환시키는 능력을 갖는 미생물을 약 0.5 내지 10일동안 배양되어야 한다. 그후 세포를 액체영양배지에 현탁시킨후 화합물(Ⅲ)을 세포와 반응시킨다. 또는 세포를 용출배지에 현탁시켜 세포를 죽인후, 화합물(Ⅱ)를 세포에서 용출된 물질과 반응시킨다. 세포를 약 0.5 내지 10일동안 배양시킨후 세포를 배양배지에서 분리시킨후 세포를 액체영양배지에 현탁시키거나 용출배지에 현탁시킨다.

화합물(Ⅱ)을 선택적으로 가수분해하는데 사용되는 미생물을 배양하기 위하여, 동화(同化) 가능한 탄소원(예를 들면, 글루코오스, 락테이트, 수크로스 등), 질소원(예를 들면, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄등)을 함유하는 통상의 배지에 유기영양소(예를 들면, 효모즙, 맥아즙, 펩톤, 고기즙 등) 및 무기영양소(예를 들면, 인산염, 마그네슘, 칼륨, 아연, 철 및 기타 미량의 금속)를 보충하여 사용할 수 있다.

바람직한 배양배지로서 하나 또는 그 이상의 성분이 강화된 잽 배지(Jap medium)를 사용한다.

다음 조성의 잽 배양배지를 사용할 수도 있다 ;

콩가루(30g/1), 질산나트륨(7.5g/1), 황화제일철·7H₂O(0.28g/1), 시트르산나트륨(6g/1) 및 프룩토오스(12.5g/1), pH를 7.2에 맞춤. 사용전에 배양배지를 120℃에서 20분간 살균하였다.

또 다른 바람직한 배양배지로는 하나 또는 그 이상의 성분으로 강화된 TBS-배양배지 2X가 있다. 60g/1 트립티카제 콩즙(옥소이드

)으로 구성되는 배양배지를 사용할 수 있다. 사용전에 배양배지를 120℃에서 20분간 살균하였다. 또 다른 바람직한 배양배지로는 하나 또는 그 이상의 성분으로 강화된 2×TY가 있다. 트립톤(Difco

) 30g/1, 효모즙(Difco

) 20g/1, NaCl 3g/1, (NH₄)₂HPO₄1g/1 및 (NH₄)₂SO₄1g/1로 구성되는 배양배지를 pH 6.8에서 사용할 수 있다. 사용하기 전에 배양배지를 110℃에서 30분간 살균하였다. 보다 바람직한 배양배지로서 하나 또는 그 이상의 성분으로 강화된 탈지유(脫脂乳) 배양배지를 사용한다. 다음 조성의 탈지유 배양배지를 사용하였다. 탈지유 분말로부터 10%의 탈지유를 사용전에 110℃에서 30분간 살균하였다.

탈지유 배양배지에 강화제로서 예를 들면 0.5% 락테이트 PSⅢ염 도는 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 다음 조성의 PSⅢ염 배양배지를 사용하였다 : 인산이수소칼륨(2.1g/1), 인산수호암모늄(1.0g/1), 황산암모늄(0.9g/1), 염화칼륨(0.2g/1), 시트르산나트륨(0.29g/1), 황산칼슘·2H₂O(0.005g/1), 황산마그네슘·7H₂O(0.02g/1), 황산제일철암모늄·6H₂O(2.5mg/1), 황산아연·7H₂O(0.5mg/1), 염화망간·4H₂O(0.3mg/1), 황산구리·5H₂O(0.15mg/1), 염화코발트·6H₂O(0.15mg/1), 오오토-붕산(0.05mg/1), 몰리브덴산나트륨·2H₂O(0.005mg/1) 및 요오드칼륨(0.1mg/1), pH를 6.8에 맞춤. 사용전에 PSⅢ염 배양배지를 120℃에서 20분간 살균하였다.

미생물을 배양하는 동안 온도는 0 내지 45℃, pH는 3.5 내지 9로 유지된다. 20 내지 37℃의 온도와 5 내지 9의 pH가 바람직하다.

미생물 배양중에 필요한 산소조건은 산소공급이 미생물의 신진대사 조건에 충분하다면 기존의 어느 방법을 사용하여도 된다. 산소는 공기형태로 하여 반응액을 진탕하거나 저어주면서 공급한다. 화합물(Ⅱ)을 화합물(Ⅰ)로 전환시키는 동안, 미생물은 상기의 통상의 배양배지를 사용하는 배양단계에 있거나 효소의 분해를 막는 임의의 계(배양배지 또는 완충용액)에서 보존될 수 있다.

화합물(Ⅱ)을 화합물(Ⅰ)로 전환에 사용되는 배지는 통상의 배지에 필요하면 동화가능한 탄소원(예를 들면, 글루코오스, 락테이트, 수크로오스 등), 질소원(예를 들면, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄 등)을 함유하는 통상의 배양배지를, 필요할때 유기영양소(예를 들면, 효모즙, 맥아즙, 펩톤, 고기즙 등) 및 무기영양소(예를 들면, 인산염, 마그네슘, 칼륨, 아연, 철 및 기타 미량의 금속)를 첨가하여 사용할 수 있다.

화합물(Ⅱ)를 화합물(Ⅰ)로의 전환에는 하나 또는 그 이상의 성분으로 강화된 잽 배양배지(상기 서술한 바와 같음)를 사용한다. 보다 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 성분으로 강화된 탈지유 배양배지(상기 서술한 바와 같음)를 사용한다. 또한 미생물은 예를 들면 동화가능한 탄소원을 배제하거나 질소원을 배제하여 미생물을 비배양단계에서 유지시킬 수 있다. 이와 같은 단게에서는 온도는 0 내지 45℃, pH는 3.5 내지 9를 유지한다.

20 내지 37℃의 온도와 5 내지 8의 pH가 바람직하다. 이와 같은 단계중에 필요한 산소조건은 산소의 공급이 미생물의 신진대사 조건에 충분하다면 기존의 어느 방법을 사용해도 된다. 산소는 공기형태로 하여 반응책을 진탕하거나 저어주면서 공급한다. 상기와 같이 미생물에 의해 생성된 화합물(Ⅰ) 또는 그로부터 유도된 물질은 공지방법에 의해 회수 및 정제할 수 있다.

미생물은 한전사면배지, 50% 글리세롤 동결 또는 동결건조시켜 보관할 수 있다. 필요하면 기존의 방법에 따라 예비배양을 할 수 있는데, 예를 들면 맑은 고기스프나 BHI에서 회전진탕기를 사용하여 30℃에서 24시간동안 배양시킨다. 다음의 조성의 맑은 고기스프 배지를 사용할 수 있다 : Lab Lemco L29(고기즙, 옥소이드

), 7.0에 맞춘 염화나트륨(5g/1)및 벡토펩톤(10g/1) pH를 7.0으로 맞춘 0.037g/1 BHI(옥소이드

)을 함유하는 BHL 배지를 사용할 수 있다. 이 배지를 사용전에 120℃ 20분간 살균했다.

Bacullus Thai Ⅰ-8에서 얻는 S-나프록센 메틸 에스테르를 가수분해시키는 효소를 특성화하였다. 에스테라제 활성은 미생물의 리파제 활성과는 관계가 없음을 발견하였다. 사실상 나프록센의 부적당한 이성질체가 소량 가수분해되는 것은 주로 Bacillus 균주의 리파제 활성의 오염때문인 것으로 나타났다. Thai Ⅰ-8의 정제된 나프록센 에스테라제는 Bacillus의 총세포 용출액보다 상당히 높은 에난시오머(enantiomer) 선택도를 갖고 있다.

Thai Ⅰ-8 에스테라제를 함유하는 플라스미드를 갖는 두 균주, 대장균/pNAPT-7 및 고초균/pNAPT-7은 상당한 양의 S-나프록센 에스테라제를 생성한다. SDS-PAGE, HPLC-SEC 및 등전집속에 의해 확인된 바와 같이 에스테라제 활성을 소유하는 단백질은 놀랍게도 미생물의 세포용출액중에 가장 높은 농도의 단백질이다.

유전자 클로닝이 효소의 발현레벨을 향상시킬 수 있다는 것은 공지되어 있지만, 에스테라제 경우의 상승량은 매우 놀랍다.

단백질의 부적당한 접힘, 단백질 분해 및 세포내 침전과 같은 것들이 효소의 유전자를 클로닝할때 자주 접하게 되는 문제점들이다(Harris, T.J.R., 1983, Genetic Engineering Academic Press). 뜻밖에도 이와 같은 문제점들이 에스테라제 유전자를 클로닝할때는 발생하는 것 같지 않다.

명세서를 통해 s-특이도는 다음과 같이 정의된다 :

본 발명은 본 발명의 범위를 이와 같은 실시예에 한정하지 않고, 실시예를 참조로 다시 서술될 것이다.

실시예 1

Bacillus Thai IBacillus In Ⅳ=8, Bacillus Nap 10M, Bacillus Sp Ⅲ-4, Bacillus Licheniformis(ATCC 11945) 및 Pseudomonas Kor Ⅰ-6을 사용하여 RS-나프록센 에틸 에스테르를 S-나프톡센으로 전환

Bacillus Thai Ⅰ-8, Bacillus In Ⅳ-8, Bacillus Nap 10M, Bacillus Sp Ⅲ-4, Bacillus Licheniformis(ATCC 11945) 및 Pseudomonas Kor Ⅰ-6을 각각 500ml 배플 플라스크에 보존한 25ml의 10% 탈지유에 배양하고 회전진탕기 위에 30℃에서 48시간동안 배양하였다. 이와 같이 배양시킨후 100mg의 나프록센 에틸 에스테르를 500mg의 콩기름에 용해하여 110℃에서 1시간동안 살균하고 각각의 배양에 첨가하였다. 미생물에 관련하여 2 내지 5개의 배양물을 사용하였다. 배양을 회전진탕기 위에 30℃에서 또 다른 24시간동안 배양하였다. 배양물을 오트로-인산으로 산성화하여 pH 값을 2 내지 3으로 한후, 소량의 황산암모늄을 첨가하고 20ml 배양배지에 대해 20ml의 클로로포름 또는 에틸아세테이트를 첨가하여 추출하였다. 추출물을 TLC로 분석하였다. TLC로 분석하여 실리카겔판(형광지시약 F₂₅₄이 함유된 실리카겔60)을 클로로포름+1% 아세트산으로 용출하여 나트록센 및 나프록센의 에틸에스테르를 분리하였다. 찾아낸 Rf 값은 나프록센 0.7 및 나프록센 에틸에스테르가 0.2이다. 그후 유기상을 증발시킨후 나프록센을 실리카겔 컬럼 위에서 에테르로 용출하여 얻은 유상으로부터 정제하였다. 얻은 결과를 표 1에 나타내었다.

1 또는 10cm 셀(부피 0.5-5ml)에서 실온을 유지하면서 퍼킨-엘머 141 편광계로 광회전을 측정하였다. 회전은 589nm(나트륨 D-선)에서 기록되었다. 광회전은 형성된 생성물(최대 50mg으로)을 5ml의 메탄올에 용해시킨 측정된다. 상업용 S-나프록센(세시파르마)은 +60°의 ｜α｜

를 갖고 있다.

[표 1]

에틸 2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피오네이트를 2-(6-메톡시-2-나프틸)프로피온산으로의 미생물 가수분해, 기질의 변환 및 생성물의 광활성

* n.d.-불측정

** 분리시킨후 남은 양

실시예 2

미생물 가수분해하여 형성된 R 및 S 나프록센의 광학적 분포

실시예 1에서 서술한 바와 같이, 모든 시험을 100ml 배플 플라스크중에 25ml 배양배지에서 수행하였다. BHI 배양배지에서 24시간동안 예비 배양된 배양물로 모든 배양배지를 접종하였다.

콩기름에 용해된 약 20mg의 라세미 나프록센 에틸에스테르를 사용하여 1시간 및 24시간동안 분석하였다. 추출물을 HPLC로 분석하였다. 에스테르와 산을 실리카 컬럼(CP-Sper-Si, Chrompack) 상에서 분리하였다.

이동상 : 이소옥탄/에틸아세테이트/포름산(875ml/125ml/3.5ml)

유속 : 1.7ml/min

보유시간(retention time)은 나프록센 에틸에스테르에 대해 3.8분이고 나프록센에 대해 9.0분이었다.

에난시오머의 순도를 측정하기 위하여 나프록센을 유도하였다. 나프탈렌 메틸 아마이드로 유도한 나프록센 시료를 키랄 DNBPG 컬럼에서 옥탄/클로로포름/메탄올(900ml/70ml/30ml)로 용출시켰다.

유속 : 2ml/min

유도된 S-나프록센 및 R-나프록센의 보유시간은 각각 28.1분 및 30.7분이었다.

유도과정 :

2ml의 추출물을 N₂흐름하에서 건조시켰다. 건조된 시료를 60℃에서 10분간 200μl의 벤젠+10μl의 염화티오닐과 반응하였다. 반응혼합물을 N₂하에서 건조하였다. 건조된 디클로로메탄에 5% 용해된 200μl의 나프탈렌 메틸아민을 첨가하여 실온에서 1시간동안 반응을 수행하였다. 반응혼합물을 다시 N₂하에서 건조시킨후 2ml의 이소옥탄/클로로포름(2:1, v/v alc 2ml의 HC1, 1N)으로 추출하였다. 유기상을 JPLC 상에서 분석하였다. 결과를 표 2 에 나타내었다.

[표 2]

미생물 가수분해로 형성된 R 및 S-나프록센의 에난시오머 분포

실시예 3

다른 미생물에 의한 RS-나프록센 메틸 에스테르를 S-나프록센으로의 전환

실시예 1 및 2에서 서술한 바와 같이, 100ml 배플 플라스크중에 25ml의 배양배지로 모든 시험을 수행하였다. 그러나 라세미 나프록센 에틸 에스테르 대신에, 라세미 나프록센 메틸 에스테르를 배양물에 첨가하였다. BHI-배양배지에 24시간동안 예비 배양된 배양물로 배양배지를 접종하였다.

결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

실시예 4

Bacillus Thai Ⅰ-8, Bacillus In Ⅳ-8 및 Vacillus Licheniformia(ATCC 11945)를 사용하여 S-나프록센 에틸 에스테르를 S-나프록센으로의 전환

실시예 1에서 서술한 바와 같이, 100ml 배플 플라스크중에 25ml의 배양배지로 모든 시험을 수행하였다. 모든 배양배지를 BHI 배양배지에서 24시간동안 예비 배양된 배양물로 모든 배양배지를 접종하였다.

가수분해된 S-나프록센 에틸 에스테르의 양을 표 4에 나타내고 있다.

[표 4]

강화된 탈지유 배지(PSⅢ 및 락테이트를 첨가)에서 24시간동안 가수분해된 S-나프록센 에틸 에스테르의 양

* 약 30mg의 에스테르를 각각 25ml 배양물에 첨가하였다.

실시예 5

발효조에서 배양한, Bacillus 종 Thai Ⅰ-8에 의한 라세미 나프록센 에틸 에스테르를 S-나프록센으로의 전환

Bacillus 종 Thai Ⅰ-8을 BHI 배양배지에서 24시간동안 예비 배양하였다. 그후 50ml 배양물을 PSⅢ 염 및 5g/1 락테이트로 강화된 10% 탈지유 배양배지 또는 탈지유를 함유하는 10ι 에쉬바일러 발효조에서 접종하였다.

다음의 발효조건을 사용하였다 :

부피 : 5ι배양배지

온도 : 30℃

교반속도 : 500rpm

공기유속 : 501/h

소포 : 플루론 L81의 자동첨가로 제어됨

pH : 규제하지 않음(pH값을 6 내지 9간에서 자유로이 유지됨)

미생물을 70시간동안 배양하고 그와 같은 시간중에 몇가지 시료를 취하여 나프록센 에틸 에스테르의 활성에 대해 분석하였다. 콩기름에 용매한 20mg의 라세미 나프록센 에틸 에스테르를 첨가한 배플 플라스크에 30℃에서 1시간동안 25ml 시료를 접종하여 분석하였다. 이와 같이 배양시간이 지난후 시료를 추출하고, HPLC 상에서 유도화하고 분석하였다.

24시간후에는 미생물의 건조중량 및 부피활성은 일정하게 남아 있었다. 배양물의 pH값은 탈지유를 사용했을때 6.0에서 7.8로, 강화된 탈지유를 사용했을때 6.0에서 8.4로 증가하였다.

결과를 표 5에 요약하였다.

[표 5]

각각 탈지유 및 강화된 탈지유를 사용한 Bacillus 중 Thai Ⅰ-8의 발효결과

실시예 6

발효조에서 배양한 Bacillus 종 In Ⅳ-8에 의한 라세미 나프록센 에틸 에스테르를 S-나프록센으로의 전환

실시예 5에서 서술한 바와 같은 과정을 Bacillus 종 In Ⅳ-8으로 수행하였다. 시료를 배양중에 70시간동안 취하여 전술한 바대로 부피활성뿐 아니라 건조중량을 분석하였으며, 건의 일정한 수치를 유지하였다. pH값은 그 시간중에 탈지유 배양물에서는 6.4에서 7.9로 및 강화된 탈지유 배양물에서는 6.2에서 8.4로 변화시켰다.

결과를 표 6에 요약하고 있다.

[표 6]

각각 탈지유 및 강화된 탈지유를 사용한 Bacillus 종 In Ⅳ-8 발효결과

실시예 7

다른 미생물에 의한 R,S-이부프로펜 에틸 에스테르를 S-이부프로펜으로의 전환

실시예 1 및 2에서 서술한 바와 같이, 100-500ml 배플 플라스크중에 25-100ml 배양배지로 모든 시험을 수행하였다. 강화 복합배양배지(즉, BHI)에서 24시간동안 예비 배양부피에 따라서, 20 도는 80μl 라세미 이부프로펜 에틸 에스테르를 배양배지에 첨가하여 24시간동안 배양하였다.

H₃PO₄와 소량의 황산암모늄을 첨가하여 pH 2.5로 산성화하고 배양물을 CH₂Cl₂로 추출하였다. 추출물중에 존재하는 이부프로펜을 나프탈렌-메틸아미드 유도체로 유도하여 에난시오머 순도를 측정하였다.

3ml 추출물에 디메틸포름아미드(50mg/ml)에 용해시킨 200μl의 요오드 2-브로모-1-메틸피리딘 용액 및 CH₂Cl₂(100mg/ml)에 용해시킨 200μl의 1-나트탈렌-메틸아민용액을 첨가하여 22℃에서 5분간 반응시켰다. 반응혼합물을 60℃에서 N₂하에서 건조시켰다. 남아 있는 잔여물을 3ml 이소옥탄/CH₂Cl₂(2:1 v/v)용해시켜 2ml 1N H₂SO₄를 첨가한후 추출하였다.

유기층을 이소옥탄/이소프로필알코올/메탄올(97/2/1 v/v)로 용출된 chiral DNBPG 컬럼을 사용하거나 불순물이 이소옥탄/이소프로필알코올/메탄올(98/1/1 v/v)의 분석을 저해하는 경우에 HPLC 상에서 분석하였다.

결과를 표 7에 나타내고 있다.

[표 7]

제시한 값은 중복으로 수행한 실험으로부터의 평균이다. *로 나타낸 미생물의 값은 한번의 실험으로부터 얻어졌다. 이와 같은 경우에 있어서 50μl 테트라테칸에 용해한 10μl 이부프로펜만을 배양물에 첨가하였다.

실시예 8

다른 미생물에 의한 S-이부프로펜 메틸 에스테르를 S-이부프로펜으로의 전환

실시예 7에서 서술한 바와 같이 모든 시험을 수행하였다. 라세미 이부프로펜 에틸 에스테르 대신에, 라세미 이부프로펜 메틸 에스테르를 배양물에 첨가하였다.

결과를 표 8에 나타내고 있다.

제시된 값은 중복으로 수행한 실험으로부터의 평균이다. *로 나타낸 미생물의 값은 한번의 실험으로부터 얻어졌다. 이와 같은 경우에 있어서 50μl 테트라데칸에 용해한 10μl 이부프로펜만을 배양물에 첨가하였다.

실시예 9

고초균 Thai Ⅰ-8(CBS 679.85)에 존재하는 나프록센 메틸 에스테라제의 특성화

Bacillus Thai Ⅰ-8을 10% 탈지유를 함유하는 에쉬바일러 발효조에서 배양시켰다. 28시간 배양시킨후 세포를 원심분리하여 수집하였다. 세포를 0.1M 트리스 HC1 pH 8.0)에 용해하여 실온에서 18시간동안 리소심(0.5mg/ml Lysosym, 4mg/ml EDTA)으로 처리한후 같은 온도에서 1시간동안 DN'ase, 3.5mg/ml MgCl₂)를 하였다. 원심분리후 표면에 뜨는 단백질 부분은 70% 황산 암모늄 포화상태에서 침전시켰다. 원심분리후 펠렛을 0.01M MOPS(3-(N-모르포리노)프로판술폰산) 완충 pH 7.5에 용해하여 방부제로서 0.02% NaN₃를 함유하는 동일 완충용액에 대해 18시간 동안 투석하였다.

최종 용액을 6ml/min의 유속에서 0.1M 초산나트륨 pH 5.5로 용출된 예비 HPLC-SEC(크기 축출 크로마토그라피) 컬럼(TSK 2000 SW, 600×21.5cm) 상에서 분석하였다.

리파제 활성을 0.1M MOPS pH 7.5에서 기질로써 1mg/ml P-니트로페닐라우리에이트로 분석하였다. P-니트로페놀 형성에 해당하는 리파제 활성은 405㎚에서 측정될 수 있다.

S-나프록센 메틸 에스테라제를 0.1M MOPS pH 8.0에서 20mg의 S-나프록센 메틸 에스테르/ml로 분석하였다. 18시간 배양후 형성된 S-나프록센의 양을 실시예 2에서 서술한 바와 같이 HPLC로 측정하였다.

제1도는 Bacillus Thai I-8 세포 리세이트의 HPLC-SEC 프로필을 나타내고 있다. S-나프록센 메틸 에스테라제(분획 37)는 이와 같은 미생물에서 나타난 리파제 활성(분획 31)으로부터 뚜렷이 분리된다.

표 9에서는 세포 리세이트의 에난시오머 선택도와 HPLC-SEC의 분획(31) 및 (38)을 비교하였다.

R 및 S-나프록센 메틸 에스테르에 관한 에스테라제 활성을 상기와 같은 방법으로 시험하였다.

S-나프록센 에스테라제 활성을 함유하는 단백질 분획의 겉보기 분자량을 기준으로 27,000의 공지된 분자량의 단백질 혼합물을 사용하여 평가하였다.

분석 조건하에서 S-나프록센 메틸 에스테르 가수분해의 pH의 의존을 제2도에 나타내고 있다. 사용된 완충용액으로는 0.1M 인산(pH 영역 5.5-7.5) 및 0.1M 글리신(pH 영역 9.0-10.0)이 있다.

에스테라제 반응에 관한 온도의존을 제3도에 나타내고 있다. 45℃ 이상의 온도에서 어떠한 효소 가수분해도 거의 발견되지 않는다. 37℃에서의 가수분해는 25℃에서 보다 거의 2배 높다.

[표 9]

실시예 10

R-S 나프록센 에스테르의 입체 선택적 전환의 원인이 되는 유전자의 분자 클로닝

고초균 Thai I-8(CBS 679.85)의 Chromosomal DNA 조각을 함유하는 플라스미드, pNAPT-2를 하기와 같이 준비하였다.

T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Could Spring Harbour Laboratory의 핸드북에 서술된대로 통상적인 클로닝 기술을 사용하였다. 모든 DNA 개질 효소를 상업용 공급자로부터 얻었으며 그들을 제조자 지시에 따라 사용하였다. DNA 분리 및 정제용 재료 및 장치를 공급자로부터 지시에 따라 사용하였다.

양성 선택 벡터 pUN121(Nilsson et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11, p. 8019)을 사용하였다. 이와 같은 벡터는 암피실린 항유전자, 테트라시클린 항유전자 및 C₁-리프레서 유전자를 운반한다. 테트라시클린 유전자의 전사를 C₁-리프레서 유전자의 유전자 생성물로 차단한다.

이질 DNA를 C₁-리프레서 유전자의 Bcll위치에 삽입하여 테트라시클린 유전자를 활성화한다. 이것으로 암피실린/테트라시클론 한전판 의에 재조합체의 양성 선택을 가능하다.

고초균 Thai I-8 DNA를 부분적으로 분해한 Sau 3A는 pUN121 DNA를 분해한 Bcll과 혼합했다. 폴리뉴클레오티드 리파제를 사용하여 재순환시킨후, DNA 혼합물을 서술(T. Maniatis et al., 1983)한 바와 같은 CaCl₂형질전환과정을 이용하여 대장균 DH1(ATCC 33849)로 도입한다.

암피실린 및 테트라시클린에 저항하는 1000 대장균 군체를 얻었다. 모든 형질변환세포를 J.P. Gergen 등(Nucleic Acide Res. 7, p. 2115, 1979)에 따라 축척하여 복제했다. 복제 군체를 에스테라제 활성을 검출하는 전술한 과정에 근거한 연한천 오버레이 기술을 사용하여 스크리인한다(T.B. Higerd and J. Spizizen, 1973, J. Bacteriol. 114, p. 1184).

본질적으로 0.5% 저용융 아가로스, 0.5M 인산칼륨(pH 7.5) , 0.5mg/l 패스트-블루의 혼합물을 형질변환세포에 분산시킨다. 몇분안에 에스테라제 또는 리파제 활성이 있는 군체는 자주빛을 띤다.

그와 같은 군체를 2×YT(16g/l Bactotrytone, 10g/l Yeast Extract, 5g/l NaCl) 배양배지에서 밤새 배양시켰고 그후 S-나프록센 에스테르를 S-나르록센(실시예 1의 방법)으로 전환할 수 있는 능력을 분석하였다. 하나의 대장균 형질변환세포는 S-나프록센 에스테르를 전환시킬 수 있다. pNTPT-2라고 부르는 이와 같은 형질변환세포로부터 고립된 플라스미드를 제4도에 표시하였다. 그의 크기는 9.4kb이다.

2×YT 배양배지에서 밤새 배양시킨 대장균/pNTPT-2 및 대장균/pNTPT-7의 활성(실시예 12에 따라분석함)은 표 10에 나타내고 있다. 플라스미드 pUN121만으로 된 대장균 세포는 S 또는 R-나프록센 에스테르를 가수분해할 수 없다. 이 점은 S-나프록센 가수분해에 필요한 모든 정보가 5kb 고초균 Thai I-8 DNA 삽입체에 전재함을 증명하고 있다.

플라스미드 pNAPT-2를 운반하는 대장균 DH1의 시료를 기탁번호 671.86호로 CBS에 기탁하였다.

[표 10]

실시예 11

고초균에 다중 유전자 복사체를 도입하는 것에 의한 에스테라제 활성의 개선

에스테라제를 기호화한 플라스미드 pNAPT-2는 5kb 고초균 Thai I-8(CBS 679.85) DNA 삽입체를 운반한다. 이는 30kb 부근의 단백질을 기호화하는 유전자의 예정된 최소의 크기보다 훨씬 크기 때문에, 삽입체는 에스테라제 활성을 잃지 않고 줄일 수 있음이 가능하다. 이와 같은 가능성을 시험하기 위하여 pNAPT-2의 HindⅢ 제한효소 조각을 pPNeo/ori로 결합하였다. 이를 하기와 같이 수행하였다. pUC19의 2.7kb EcoR1-Smal 제한조각(C. Yanisch-Perron et al., Gene 33, p. 103, 1985)을 pUB11의 2.5kb EcoR1-SnaB1 제한조각(T.C. Grczan et al., J. Bacteriol., 134, p. 318, 1978)으로 결합하여 pPNeo/ori를 구성 하였다. 얻은 샤틀 플라스미드, pPNeo/ori(5.2kb)는 pUN19원 및 pUB110원 존재로 인해 대장균 및 Bacillus 종에서 복제할 수 있는 능력을 갖고 있다. 부가해서 pPNeo/ori는 암피실린 저항을 기호화하는 유전자 및 네오마이신 저항을 기호화하는 유전자를 운반한다(C. Yanisch-Perron et al., 1985; M. Matsumura et al., J. Bacteriol., 160, p. 413, 1984).

서브크로닝하여 pNAPT-2를 분해한 HindⅢ를 pPNeo/ori를 분해한HindⅢ와 혼합하여 결합하였다. 혼합물을 서술한 대로(Maniatis et al., 1982) 대장균 JM101 hsds로 형질변환시켰다. 대장균 JM101 hsds를 Phabagen Collection(accession number PC 2493 Utrecht, The Netherlands)으로부터 얻었다. 아세트산베타-나프틸을 가수순해할 수 있는 군체를 실시예 10에서 서술한 대로 선택하였다. 두개의 양성 군체로부터 플라스미드 DNA를 분리시켜 몇개의 제한효소인지 위치를 결정하여 상세히 특성화하였다. 이와 같은 플라스미드, PNTPT-7 및 pNAPT-8의 물리적인 지도를 제5도 및 제6도에 나타내고 있다. S-나프록센메틸 에스테르에 대한 대장균/pNAPT-7 및 대장균/pNAPT-8의 활성을 결정하였다(표 11).

두 플라스미드는 그들의 배향이 상반되어도 그들의 삽입체로서 2.2kb의 pNAPT-2의 HindⅢ-HindⅢ조각을 운반하는 것을 알 수 있다. 또한 에스테라제의 유전자를 2.0kb의 Thai I-8 DNA 부분내에 위치해야만 한다.

대장균 JM101 hsds로부터 추출한후 플라스미드 pNAPT-7 및 pNAPT-8을 고초균 1-85 및 고초균 1A-40의 프로토플라스트로 형질전환시켰다(S. Chang and S.N. Cohen, Mol. Gene Genet. 168, p. 111, 1979). 고초균 1-85(Yuki, S., Jpn. J. Genet. 42, p. 251) 및 고초균 1A 40(Bacillus Stock Center B.G.S.C. 1A 40)이 개시되어 있다.

네오마이신 항군체는 서술한 방법(실시예 12 참조)에 따라 2×YT 브로드에서 발효시킨후 S-나프록센메틸 에스테르를 가수분해할 수 있는 능력에 대해 시험되었다.

표 11에 활성을 나타내었다. 다중 유전자 복제를 도입하여 이룩한 향상은 약 300배인 것으로 알 수 있다. 따라서 S-나프록센 에스테르를 가수분해할 공정에서 사용할 미생물 및 그로부터 유도된 물질의 적합성은 매우 향상되고 있다.

유전자 클로닝은 효소의 발현수준을 향상시킬 수 있음이 공지되었어도, 에스테라제의 경우의 증가량은 매우 놀랍다. 부적당한 복재, 단백질 분해 및 세포내 침전과 같은 흔한 문제점들은 효소의 유전자를 무성생식할때 접하게 된다a(Harris, T.J.R., 1983, Genetic Engineering 4, Acedemic Press). 뜻밖에도 이와 같은 문제점중 어느것도 에스테라제 유전자를 무성생식할때 발생하지 않는 것처럼 보인다.

[표 11]

실시예 12

대장균 JM101 hsds/pNAPT-7의 나프록센 메틸 에스테라제의 특성화

실시예 11의 대장균 JM101 hsds/pNAPT-7의 1ℓ 발효액을 사용하였으며 발효액을 원심분리하였다. 펠렛을 0.1M Tris HCl 완충액 pH 8.0에 현탁시켜 30℃에서 60분 동안 1% v/v 옥탄올하에서 1mg/ml 리소심, 4mg/ml EDTA로 배양하였다. DNA를 15mM Mg²⁺에서 0.02mg/ml DN'ase로 가수분해하였다(220℃, 30분).

원심분리후 상청액의 단백질 부분을 60% 황산암모늄 포화용액에 침전시켰다. 원심분리후 펠리트를 10mM MOPS pH 7.5에서 용해한 다음 한외여과(Amicon YM10)에 의해 10회 농축하였다. S-나프록센 메틸 에스테르에 대한 대장균 pNAPT-7 리틴테이트의 특정활성도[ml당 20mg S-나프록센 멜틸 에스테르, 2% 트윈, 1mg/ml BSA(보빈 세럼 알부민)의 존재하에서 0.1M MOPS pH 7.5, 25℃에서 분석된]가 단백질 mg당 1.6단위이었다. 전 명세서를 통하여 1단위(μ)은 특정조건하에서 분당 S-나프록센 메틸 에스테르를 1×10^-6mol 가수분해하는 효소양을 말한다. 특정흡착에 의한 효소의 비활성을 피하기 위해서, 극소수성 에스테르와 BSA의 용해도 향상을 위해 트윈을 첨가하였다. 단백질 농도는 표준으로서 BSA를 사용하여 브래드포드에 따라 측정하였다.

한외여과후 대장균 pNAPT-7 리텐테이트를 실시예 9에 기술된 HPLC-SEC 시스템에 의하여 분석하였다.

2ml의 컬럼분획에 대하여 15분부터 모아서 S-나프록센 에스테라제 활성도에 대해 시험하였다(실시예 9참조).

제7도는 HPLC-SEC 분획의 OD-280nm 흡광도와 에스테라제 활성도를 나타낸다. S-나프록센 에스테라제 활성도(분획 26)는 흡광도 프로필용리의 피이크와 일치한다. 꼭같은 식으로 분석된 고초균(Bacillus subtilis) Thai I-8 에스테라제의 보유시간은 동일하였다(결과 도시안됨).

제8도는 HPLC-SEC의 대장균 pNAPT-7 리텐테이트와 분획 26의 램리(Laemmli)에 따른 12.6% SDS-PAGE를 나타낸다.

레인 4는 대장균 JM101 hsds/pUN121을 내포한다. PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동)은 대장균 pNAPT-7 리텐테이트에서 가장 두드러진 단백질 밴드가 HPLC-SEC의 분획(26)에서나 검출가능한 단 하나의 단백질 밴드일뿐 대장균에서는 없다는 것을 분명히 나타낸다.

제9도는 대장균 pNAPT-7 리텐테이트의 동전점 전기영도 겔(LKB 앰폴린 PAG-플레이트, pH 3.5-9.5)을 나타낸다. A에선 단백질을 서바블루(Serva Blue) R로 염색하였고, B에서는 동일시료의 에스테라제 활성도를 실시예 10에 기술된 β-나프틸아세테이트/FB(패스트블루 RR염) 방법으로 구성화하였다. A에서 가장 현저한 단백질 밴드는 가장 높은 에스테라제 활성도를 신뢰할 수 있도록 나타난다는 것을 제시한다.

실시예 13

대장균 JM101 hsds/pNAPT-7에 의한 이부프로펜의 에틸 에스테르의 이부프로펜으로의 전환

황산암모늄 침전 및 한외여과후 대장균 pNAPT-7 세포 용균액을 R 및 S-이부프로펜의 에틸 에스테르의 가수분해에 대해 시험하였다.

효소활성도를 0.3mg R 또는 S-이부프로펜 에틸 에스테르/ml, 2% 트윈 및 1mg/ml BSA으로 0.1MOPS 완충제 pH 7.5에서 25℃로 분석하였다. 2시간 배양후 반응을 아세토니트릴의 첨가에 의해 정지시켰다.

반응혼합물을 1.5ml/min의 유동속도에서 34 아세토니트릴, 0.05M 인산 pH 3.0으로 용리된 HLC-역상 컬럼(크롬팩 플리고질 60D-10CN, 250×4.6min)에 의해 분석하였다. R 및 S-이부프로펜 및 R 및 S-이부프로펜 에틸 에스테르에 대한 보유시간은 각각 5.98분 및 11.08분이었다. 결과를 표 12에 요약한다.

S-이부프로펜의 에틸 에스테르의 가수분해는 동일조건하에서 시험된 S-나프록센 메틸 에스테르의 가수분해 활성도의 60%이다.

[표 12]

실시예 14

Bacillus 1-85/pNAPT-7의 S-나프록센 에스테라제의 특성화

Bacillus 1-85/pNAPY-7을 2×TY 배지에서 5ι 이차웨일터(Eschweiler) 발효조에서 성장하였다.

세포 페이스트를 원심분리로 분리하였다. 펠렛을 0.1M Tris-HCl pH 8.0에 용해하여 실시예 9에 기술된 방법에 따라 분석하였다.

원심분리후 상청액을 60% 황산암모늄 포화용액으로 되게 하여 다시 원심분리하였다. 펠렛을 0.02M MOPS pH 7.5에 용해하였으며 마이콘 YM10 필터를 사용하여 한외여과하였다. 이 세포 용균액을 유동속도 1ml/min에서 0.01M MES(2-(N-모폴리노)에탄 술폰산) pH 5.6 및 0.1M NaCl로 용리된 분석 HPLC-SEC 컬럼(TSK 2000WS, 2회 300×7.5㎜)에 대해 분석하였다.

컬럼 용리액의 1ml 분획에 대하여 10분부터 수집하여 실시예 12에 기술된 방법을 사용하여 S-나프록센 메틸 에스테라제 활성도를 시험하였다.

제10도는 분획들의 OD-280㎚ 프로파일 및 에스테라제 활성도를 나타낸다. S-나프록센 에스테라제의 보유시간은 겉보기 분자량 27000에 해당한다. 여러 단백질 시료들의 특정활성도를 표 13에 요약한다. 에스테라제 활성도를 실시예 12에 기술된 바와 같이 분석하였다.

Bacillus pNAPT-7 리텐테이트의 에난시오머 선택성을 표 14에 도시하며 활성도는 실시예 12에 기술된 바와 같이 분석하였다.

제8도에서는 램리(Laemmli)에 따른 12.6% SDS-PAGE가 리파제 및 S-나프록센 에스테라제 활성도를 각기 나타내는 HPLC-SEC의 분획(5) 및 (7)과 바실러스 pNAPT-7에 대해 도시되어 있다. 바실러스 리텐테이트에서 주단백질 밴드는 분획(7)에만 내재하는 유일한 단백질이며 분획(5)(리파제 활성)에는 내재하지 않는다. 라인 8에서 단백질 밴드를 겉보기 분자량 31000에 해당한다.

제9도에서 등전점 전기영동겔은 바실러스 pNAPT-7 및 분획(7)(실시예 12의 기술적 설명 참조)에 대해 도시된다.

Bacillus pNAPT-7 리텐테이트에서 등전점(IEP) 4.5를 지니는 리파제 활성도는 나프틸 아세테이트 기질에 대해 뛰어난 활성도이다. HPLC-SEC의 분획 7에서 주단백질 밴드는 B 부분에 도시된 나프틸 아세테이트 가수분해 활성도와 일치하는 IEP 5.4를 지닌다. β-나프틸 페스트-블루 분석은 에스테라제보다 리파제에 대해 보다 더 민감하게 반응한다는 것은 주지해야 된다.

HPLC-SEC의 OD 280㎚ 피이크(분획7)은 나프록센 에스테라제를 내포하는 것을 나타내고 SDS-PAGE에 대한 하나의 주단백질 밴드로 이루어진다. 분획(7)의 주단백질 밴드가 에스테라제 활성도를 지닌 다는 것을 등전점 전기영동겔은 확중한다. 이것은 대장균 및 Bacillus 둘다 고초균 Thai I-8의 에스테라제 활성도의 클로운닝이 에스테라제 생성에 극적인 증가를 발생시킨다는 것을 의미한다. 사실상 대장균 pNAPT-7 및 바실러스 pNAPT-7에서 나프록센 에스테라제는 두 미생물의 세포 용균액에서 최고 농도의 단백질로 되었다.

[표 13]

* 용균, 황산암모늄 침전 및 한외여과후의 세포 용균액

[표 14]

Claims

일반식(Ⅱ)의 화합물을 적어도 80중량% 이상의 S-형을 갖는 일반식(Ⅰ)의 화합물로 입체 선택적으로 가수분해시킬 수 있는 바실루스(Bacillus), 슈우도모나스(Pseudomonas), 아트로박터(Arthrobacter), 뮤코르(Mucor) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 속하는 박테리아로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물 또는 그 미생물에서 유도된 물질과 일반식(Ⅱ)의 화합물을 반응시키거나, 얻어진 일반식(Ⅰ)의 화합물을 약학적으로 허용가능한 염이나 에스테르로 전환시켜서, 입체특이성 약학적 활성을 갖는 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 에스테르를 제조하는 방법.

[상기 식에서, R₁은 선택적으로 치환되는 헤테로고리계에 포함될 수 있는 페닐 또는 나프틸과 같은 선택적으로 치환된 아릴기를 나타내거나, 또는 탄소원자에 추가하여 질소, 황 및 산소에서 선택된 하나 또는 그 이상의 원자를 포함하는 치환가능한 헤테로방향족고리를 나타내고, R₂는 에스테르 잔기이고 바람직하게는 치환가능한 알킬기이다.]
제1항에 있어서, 식 R₂가 1내지 8개의 탄소원자의 선형알킬기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 식중 R₂가 에틸기인 것을 특징으로 하는방법.
제1항에 있어서, 식중 R₂가 메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 화합물(Ⅰ)이 나프록센, 이부프로펜, 시클로프로펜, 수프로펜, 카아프로펜, 케토프로펜, 베녹사프로펜, 페노프로펜, 피르프로펜, 리시프로페늄, 플루르비프로펜, 플루프로펜, 클리다낙, 테르티프로펜, 헥사프로펜, 인도프로펜, 멕소프로펜, 프라노프로펜, R803. 프로티진산, 티아프로펜산 또는 브로페질인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 화합물(Ⅰ)이 나프록센인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 화합물(Ⅰ)이 이부프로펜인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기의 미생물이 화합물(Ⅱ)을 적어도 90중량% 이상의 S-형을 갖는 화합물(Ⅰ)로 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 결과의 화합물(Ⅰ)을 분리하고 그 잔부를 가수분해하는 공정을 더 포함하며, 여기에서 상기 잔부의 가수분해로 얻어진 화합물(Ⅰ)은 적어도 80%의 R 형을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 미생물이 생세포 또는 사세포로서 고정화된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 화합물(Ⅱ)을 화합물(Ⅰ)로 전환시킬 수 있는 물질을 상기 미생물로부터 분리하여 그 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 사용된 상기 미생물이 고초균(Bacillus subtilis)또는 바칠루스 리체니포르미스(Bacillus Licheniformis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 사용된 상기 미생물이 뮤코르 안구리매크로스포러스(Mucor angulimacrosporus)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 사용된 상기 미생물이 슈유도모나스 플루오레슨스Pseudomonas fluorescens), 슈우도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa ), 슈우도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈우도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis) 또는 슈우도모나스 리보플라비나(Pseudomonas riboflavina)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 사용된 상기의 미생물이 스트렙토마이세스 플라보비렌스(Streptomyces flavovirens)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 도는 제9항에 있어서, 사용된 상기 미생물이 아트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus)인 것을 특징으로 하는 방법.
일반식(Ⅱ)의 화합물을 적어도 80중량%의 S 형을 갖는 일반식(Ⅰ)의 화합물로 입체선택적 가수분해 시킬 수 있는 효소를, 바실루스(Bacillus), 슈우도모나스(Pseudomonas), 아트로박터(Arthrobacter), 뮤코르(Mucor), 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 속하는 박테리아로부터 선택되는 적어도 하나의 미생물에서 분리시키는 것을 특징으로 하는 에스테라제 효소의 제조방법.

(상기 식에서 R₁은 선택적으로 치환된 헤테로고리계내에 포함될 수 있는 페닐이나 나프틸기와 같은 선택적으로 치환된 아릴기를 표시하거나, 또는 탄소원자에 추가하여 질소, 황 또는 산소에서 선택된 하나 또는 그이상의 원자를 치환가능한 헤테로방향족고리계를 나타내고, R₂는 에스테를 잔기이고, 바람직하기는 치환가능한 알킬기이다.)
제17항에 있어서, 상기 미생물이 고초균(Bacillus subtilis), 바실루스 리체니포르미스(Bacillus Licheniformis), 뮤코르 안구리매크로스포러스(Mucor angulimacr osporus), 슈우도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 슈우도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈우도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈우도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 슈우도모나스 리보플라비나(Pseudomonas riboflavina), 스트렙토마이세스 플라보비렌스(Streptomyces flavovi rens) 및 아트로박터 파라피네우스(Arthrobacter paraffineus)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 에스테라제 효소의 제조방법.
제17항 도는 제18항에 있어서, 화합물(Ⅰ)이 나프록센 또는 이부프로펜인 것을 특징으로 하는 에스테라제 효소의 제조방법.
제17항 도는 제18항에 있어서, 화합물(Ⅰ)이 적어도 95중량%의 S-형을 갖는 것을 특징으로 하는 에스테라제 효소의 제조방법.
제17항 도는 제18항에 있어서, 적어도 0.1 단위의 특이적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 에스테라제 효소의 제조방법.
제21항에 있어서, 적어도 1단위의 특이적 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 에스테라제 효소의 제조방법.