JPS60501758A - タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ベクタ−宿主生物及びそれらの生産方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ヘクター、宿主生物及びそれらの生産方“法 技術分野 本発明は、クンバク質、医薬構成物、遺伝子、ヘククー、宿主生物及びそれらの 生産方法に関するものである。

背景技術 食餌の脂肪の分解は、高等動物の消化器系の重要な特徴である。

その消化は、脂肪が消化管を通過する間に、酵素を触媒とするトリグリセリドの 加水分解により、モノグリセリド、ジグリーしり１・、グリセリン及び遊離脂Ｈ ７］酸の？Ｉ１合物を４１三成するごとて行ねヵ、る。

この加水分解による生成物は、腸に並んでいる精成細胞の−１−被膜を通過Ｊる ことができる。これらは、−Ｌ！、吸収されると、十ロミクロンに含まれるｌ− ジグリセリドのｌ＋１合成に使用される。これらのキロミクし１ンは、リンパ系 により吸収場所から速く離れた場所へ連ばれる。トリグリセリドの加水分解を行 う酵素は、リパーゼと呼ばれ、胃腸管内に分泌される（デスヌエル、Ｐ、　（Ｄ ｅｓｎｕｅｌｌｅ。

ｐ、）　（１９７２）ザ・エンザイムズ、第７巻第３版、Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓ ｓ、二。

Ｊ、−ヨークとロンドン、Ｐ、５７５−６１６及びバーガー、　Ｒ，（Ｖｅｒｇ ｅｒ。

Ｒ，）　（’＋９８０）メリンス・イン・エンジモロジー、餅、　３４０−３９ ２　）。

トリグリセリドの加水分解に関する酵素の１つは、膵臓のリパーゼ（ＥＣ３，１ ，１，３）である。ブタは酵素の供給源として便利であるため、ブタの膵臓リパ ーゼは詳しく研究されている。ブタの膵液中には全タンパク質の約２．５％の膵 臓リパーゼが含まれており、これは現在均一のものに精製されている（バーガー 、Ｒ，（Ｉｔ（１９６９）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、 　１８影、２７２−２８２　）　、この酵素の完全なアミノ酸配列が決定されて いる（デ・カリ、　Ｊ、　（Ｄｅ　Ｃａｒｏ。

Ｊ、）他（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ、　ｆｊ ７１、＋２４＋−１３８）　、　この酵素は、４４９個のアミノ酸（州４９８５ ９　）より成るタンパク質部分から構成され、このアミノ酸配列中の１６６番目 にあるＡｓｎ残基には炭水化物部分（■約２０００）が結合している。したがっ て、この酵素の全分子量は約５２０００である。膵臓リパーゼの触媒作用は、可 溶性酵素と不溶性１−ジグリセリド基質の間に相分離があるため、複雑である。

酵素を基質と反応させるためには、コυバーゼ（ｃｏｌｉｐａｓｅ）として知ら れ−（いる補酵素が必要である。こｌリバ−セは、低分子量のタンパク質てあり 、これは溶ｌ多と脂ｙＪの界面に吸着した後、リパーゼに刻する固定剤として作 用し、酵素とその脂質基質問に反応を起こさせる。

膵臓リパーゼは、トリグリセリＦの消失又は’ＪｒＶ　離脂肪酸もしくはグリセ リンの存在についての測定を含む種々の力ｌ）、（１，述のデスヌＪ刃し及びバ ーガー参照）によって検定をすることができる。

放射性同位元素による標識、加水分解中のブ［ｌ］−ン放出及び脂質車一層の物 理的性質ＧＪ対するりバーゼの作用も、リパーゼの活性を検定するのに使用でき る。いずれの場合でも、膵臓リパーゼ番才中性からアルカリ性のｐ１１範囲（ず なわぢｐｌ［７〜ｐＨ９）で最も活性である（上述のパーカー外参照）。この酵 素は、酸性のｐＨに対しては非常に敏感であり、低いｐＨでは直ぢに不活性化す る。

人体の脂質吸収不良の多くの病気は、膵）藏リパーゼの分泌が低いレヘルになっ ていることに特徴がある。

嚢胞性繊維症にかかっている患者の約８０％は、膵臓の機能が不充分である。膵 臓リパーゼの不足症状は、誕生後直くに現れ、患者の生涯にわたって続く。

膵臓炎は、膵臓機能が損なわれた状態である。膵臓炎は慢性アれに伴う栄養不良 に罹っている。

発育中の胎児は高炭水化物の栄養に依存しており、膵臓リパーゼを低し、ルでし か生成しない、不充分に発達した膵臓機能を持っている。誕生後、乳児が母乳を 飲み始めるので、胎児期間の高炭水化物栄養は、高脂肪食に代えられる。脂肪に より、乳児は、カロリー摂取量の約半分を取っている。臨月まで胎内にいた乳児 ですら膵臓機能は不充分であり、特に早産の乳児では脂肪を消化することができ ず、これによって脂肪便（脂肪が消化されずに排便されること）が見られ、エネ ルギーの損失が生している。

膵臓リパーゼが不足している患者に対する現在の治療は、ブタの膵臓酵素の未粕 製剤をを大量に経口投与するごとにより行っている。膵臓リパーゼは胃内の低ｐ ｌ＋状態によって不活性化されるため、経口投与された膵臓リパーゼは胃から腸 を通る間にほぼ不活性化される。投与される大量の製剤は、殆んどの患者には不 適当であり、これらは不純物を含みＬｌ、つ味が悪いものである。幾種かの錠剤 は、胃の酸性領域は通過し、空隔のアルカリ４１１゛側の状態においてのみ酵素 を放出するように調製されている（ガラ、Ｒ，＜Ｇｏｈ。

１？、）外（１９８１）ザ・ランセット、第２巻、！−復１０７０−１０７４　 ）。

しかし、膵臓障害に罹っている多くの患者の空隔は界雷な酸性状態となっており 、このような錠剤は酵素の放出かできないため効きｌ」がない。

現在、膵臓リパーゼの欠乏症患者に経口投与することができるリパーゼ製剤に対 する要望は、非常に大きい。

舌の背面後部にある古典液腺（フォノ・エブナー腺）は、舌リパーゼとして知ら れる強いリパーゼを分泌することが見出された。

この酵素は、ラットで（ハモシュ、　Ｍ、　（Ｈａｍｏｓｈ、　Ｍ、）とスカウ ア−，Ｒ，Ｏ，（Ｓｃｏｕｒ、Ｒ，Ｏ，）　（１９７３）　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎ ｖｅｓＬ、５ｇ、８８−９５）　、またヒ１−で（ハモシュ、Ｍ、とハーンス、 讐、へ、　（Ｂｕｒｎｓ、　Ｗ、＾、（１！１７７）Ｌａｂ、Ｔｎｖｅｓｔ、　 ３７．６０３−６０８　）検出されている。この酵素は、吐液と共に飲み込まれ て胃に入り、そこで脂質の部分的な消化を打う。

ラットのフォノ・エブナー腺からのこの酵素は、多少精製されている（フィール ズ、　Ｒ，Ｂ、　（Ｆｉｅｌｄｓ、　Ｒ，Ｂ、）外（１９８３）　Ｊ、Ｒｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ。

η棧−１１４５６３−１４５６９　、ハ％シｚ、Ｍ、外（１９７９）　、Ｊ、Ｒ ｉｏｌ、Ｃｈｃｍ、２５４．１２１２１−１２１２５　）。舌リパーゼは、トリ グリセリドを生体内で及び試験管内でジグリセリド、モノグリセリド及び遊＾１ （脂肪酸に加水分解する（ハモシュ、肥（１９８４）　”ザ・リパーゼ゛、編築 考ポルゲストロム＋　Ｂ、　（Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍ、　Ｂ、　）とブロックマン 、　）１．０．　（Ｂｒｏｃｋｍａｎ。

Ｈ，Ｏ，）エルシビア　アムステルダム）。舌リパーゼと膵臓リパーゼの主要な 相違点は、舌リパーゼが特に食後の胃内のような酸性状態で安定であることであ る。舌リパーゼは、２がら７までの範囲のｐＨでトリグリセリドを加水分解する ことができることが明らかになった。舌リパーゼは、自然の供給源からはごく微 量しが取出せない。例えば、１６匹のラットから調製しても約１．５ｎＢ＋の不 純な酵素しかできない（フィールド−外（１９８３）　２ラ−８−１１４５６３ −１４５６９）。

ヒトの胃から取り出した酸性で安定なリパーゼの精製法Ｇ３１、チルパシ、　Ｃ ，（Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉ、　Ｃ，）外（（１９８２）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、及び Ｒｉｏｐｈｙｓ八ｃｔａ、　へ１２　、６９２−６９７　）により報告され−（ いる。

上記の舌リパーゼについての研究報告は、ずべて専ら学トドＩ的ｌ□１格をもつ ものであり、リパーゼ欠乏症の治療に古リパーゼを用いることに関する何の記載 もない。我々は舌リパーゼをこのように使用することができると考えているが、 ぞれは古リパーゼを大量に且つ比較的安価に生産することができて、そうするこ とが有利な場合だけである。しかし、これを動物やヒ［のＰ；がらの抽出によっ て行うことは明らかに不可能である。

我々は、紹換えＯＮΔ技術を用いた発明によって謁リパーゼを４を産することに より、商業価値のある量の舌リパーゼを提１ｔｉするものである。

発明の開示 本発明の第１の態様においては、リパーゼ欠乏症の治療に用いる舌リパーゼタン パク質を提供する。

本明細書中において使用する“舌リパーゼクンバク質゛という用語は、真正の哺 乳類舌リパーゼ又は機能的に同しクンバク質となるように変更もしくは変換した 真正の哺乳ｆｉ８リパーゼを息味する。この舌リバーセタンバク質は、例えば、 Ｎ末端メチオニン・アミノ酸残基をもつ哺乳類の舌リパーゼ（メチ材ニンー活す パーゼタンパク質）を含んでいる。この舌すパーゼタンパク質番Ｊ、ヒト又はラ ットの古リパーゼタンパク質がよい。

、！；リバーセタンバク質は、組換えＤＮＡ技術によって生産するのが自利であ る。

本発明の第２の態様においては、メチオニン−舌リバーセタンバク質のコートと なる遺伝子を含むヘクターで形質転換された宿−Ｌ生物中にタンパク質を生成さ せることより成る、メチオニン−舌リパーゼタンパク質の生産ツノ法を提供する 。宿主生物としてＧコ、細菌（例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　）又は酵母（例 えばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｃｒｅｒｉ ｓｉａｅ）　）が好ましい。

本発明の第３の態様においては、前駆体タンパク質のコードとなる遺伝子を含む ヘクターで形質転換された宿主生物中に舌リパーゼ前駆体クンバク質を生成させ 、そしてその前駆体タンパク質を切断して舌リパーゼタンパク質を生成させるこ とより成る、舌リパーゼタンパク質の生産方法を提供する。

舌リパーゼ前駆体タンパク質としては、前駆舌リパーゼクンバク質がよく、宿主 生物としては、前駆舌リパーゼタンパク質を切断して古リパーゼクンバク質を生 成することができるものがよい。

また、この宿主生物は、前駆舌リパーゼを切断して舌リパーゼタンパク質を培地 に運び出すものが最もよい。

本発明に係る第３の態様の別の形態では、前駆体舌リパーゼタンパク質は、異種 のクンバク質と舌リパーゼタンパク質より成る融合タンパク質である。この異種 のタンパク質は、宿主生物中で、好ましくは高レベルで生成することができるタ ンパク質の全部又は一部であってもよい。このようなタンパク質は、β−ガラク トシダーゼ及びｔｒｐＥ遺伝子の生成物を含むものが適当である。融合タンパク 質は、異種タンパク質と舌リパーゼタンパク質との間に選択的な化学的又は酵素 的切断を受ける部位を含むものがよい。

この異種のタンパク質は酵母の信号配列とすることができ、また宿主生物は酵母 でもよい。この好ましい実施例では、酵母の宿主生物は、適切に融合タンパク質 を切断して成熟した西リパーゼタンパク質を産生ずる。

本発明の第４の態様においては、前駆古すパーゼタンパク饗を提供する。

本発明の第５の態様においては、メチオニン−舌リパーゼタンパク質を提供する 。

本発明の第６の態様においては、異種タンパク質と西リパーゼタンパク質より成 る融合タンパク質を提供する。

本発明の第７の態様においては、少なくとも舌リパーゼタンパク質のアミノ酸配 列のコートとなる遺伝子を提供する。この遺伝子は、本発明の第４、第５又は第 ６の態様のタンパク質のコートとなるものがよい。更に、添付図面の第５図に示 す、ラットの舌リパーゼの少なくともアミノ酸のコードとなる遺伝子を提供する 。

本発明の第８の態様においては、本発明の第７の態様の遺伝子を含むヘクターを 提供する。ごのヘクターば、適当な選択可能なマーカー、プロモーター及びその 他の調節領域を適切に与えて所定宿主生物内において使用できるようにする。

本発明の第９の態様においては、本発明の第８の態様に基づくヘクターで形質転 換された宿主生物を提供する。この宿主生物は、発現が生じるような、舌リパー ゼタンパク質のコードとなる遺伝子を含むヘクターにより形質転換できるもので あれば、如何なる生物でもよい。このような宿主生物としては、細菌（例えば大 腸菌（Ｒ，ｃｏｌｉ）　）　、酵母（例えばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｇｒｅｖｉｓｉａｅ）　）及び組織培養した哺乳類 の細胞が適当である。宿主生物が細菌又は酵母の場合、ヘクターはメチオニン− 古リパーゼ又は融合タンパク質のコードとなる遺伝子を含むものがよく、また宿 主ｄ゛物が組織培養の咄”７′Ｌ類細胞の場合、ヘククーは前駆舌すパーセのコ ートとなる遺伝子を含むものかＪｙい。

本発明の第１０の態様においては、古リパーゼタンパク質の抗原決定基に対して 特異性をもっている抗体を提供する。この抗体は、ポリクローナル抗体又はモノ クローナル抗体のどららでもよいか、モノクロ−ナル抗体の力がよい。抗体は、 免疫学的検定法で用いるために検出可能なマーカー例えば放射性同位元素でラヘ ルしておくことができる。

本発明の第１１の態様においては、舌リバーセタンバク質及び１ダ楽基準に合っ た賦形剤より成る医薬構成物を提供する。ごのリパーゼタンパク質としては、本 発明の第２又は第３の態様に係る方法で作られたヒト又はラットの古リパーゼか よい。この医薬構成物は、リパーゼ欠乏症の治療用に供される。この構成物は、 経し１投与用に調製されたものがよい。この構成物は、錠剤、カプセル又は糖衣 錠のような単位投薬剤にすることができる・。

単位投薬剤を作るには、適当な形態の古リパーゼをラクトース、ショ糖、ソルビ トール、マンニトール、デンプン、セルロース銹導体又はゼラチン又はその他の 同様の賦形剤のような医薬的にイ・活性な固形粉基剤と混合する。そして、ステ アリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はポリエチレングリコールワ ックスのようなＷ１４？Ｉ！を剤を加えζもよい。得られた構成物は、押し固め て単位投薬剤に形成する。

この単位投薬剤には、タルク、二酸化チタン、ゼラチン又はアラビアゴムのよう な添加物の入った濃縮糖’Ｍ＋？ｇ液を塗ってもよい。

また、この単位投薬剤には、ラッカーを塗ってもよい。単位投薬剤を見分り易く するために上塗りに着色を施すことができる。液体製剤又は固体製剤に応じて舌 リパーゼをカプセル化するため、軟質又は硬質のカプセルを使用することができ る。

代わりに、活リパーゼは液状に調製することができる。液状の製剤を作るために は、適当な形態よなってい、−′ｌ）西リパーゼをｌ＾体基剤に加える。この基 剤は、例えばシロップ又は広濁液がよい。

この液状製剤には、着色料、着香料、１Ｆ味料及び／又は濃化剤を加えてもよい 。

本発明の別の態様においては、占リパーゼタンパク質を医薬基準に適合した基剤 に結合させることより成る医薬構成物の生産方法を提供する。本発明の更に別の 態様においては、有効な量の７ｊリパーゼタンパク質を投与することより成るリ パーゼ欠乏症の治Ｓｔ法を提供する。

使用した操作方法は、先ずう、トの古（ヒトの古と比べて、より豊循で便利な酵 素供給源）からの活リパーゼを精製したことである。精製されたラットの酵素は 、Ｎ末端アミノ酸配列とされて、構造上の特性とポリクローナル抗血清が画めら れた。このう、トの酵素は、ラットのポリクローナル抗血清を使用してツノｈの フォノ・エブナー腺（ヒトの古の組織と比べてｍＲＮＡのよりＪＪ’＋’Ｙ＋な 供給鯨）に由来する、発現されたｃＤＮΔライブラリーをノ、クリ−ニー／グす ることによりクローン化した。ラットの舌リバー、ゼの完全な核酸配列及びタン パク質配列を決定した。発明を実施するための最良の形態において、組織培養し ている適当な微生物又は動物細胞中でラットの酵素のクローンがどのように発現 されるかにつぃ乙また組換えられたラットの舌リパーゼがどのように生産される かについ゛ζ説明する。また、ヒトの舌リパーゼ遺伝子をクローン化し、発現さ せる方法及び組換えられたヒトの舌リパーゼの生産方法についても説明する。

発明を実施するための最良の形態において、図面１を参照して、糾換えＩＩＮＡ 技術を使用した古リパーゼの生産方法を説明する。

図面の簡単な説明 第１図は、精製したラットの舌リパーゼのＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用 した電気泳動図である。

第２図は、精製したラットの舌リパーゼをエンドヌクレアーゼｌ］で水解したも ののＳＯＳポリアクリルアミドゲルを使用した電気泳動図である。

第３図は、プラスミドｐＬＬＩＯの制限部位の地図である。

第４図は、ラットのＬＬ　ＤＮＡの制限地図（第４図１ｌｌ））、ＤＮ＾配列を 有するラットのＬＬタンパク質の直線的配列（第４図ｂ））及びβ＝ガラクトシ ダーゼと前駆舌リパーゼ遺伝子とが連結している（関連するアミノ酸を持ってい る）　ＤＮＡ配列をそれぞれ示す図である。

第５図は、ラットの前駆舌リパーゼ遺伝子のＤＮ八へ列を示す図である。

第６図は、ｐＬＬｌｏによる前駆舌すパーセとβ−ガラクトシダーゼとの融合タ ンパク質が産性されたことを示す、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用した電 気泳動図である。

発明を実施するための最良の形態 １、ラットのフォノ・エブナー腺からの舌リパーゼ酵素の精製法殺したばかりの 与ノドから完全な舌を取り出した後、解剖してフォノ・エブナー腺を取り出した 。ヘルガー外により説明されているよっに、約６００個の腺を均質化した後、有 機ｌ８剤を使用した抽出により脂質を除去し、次に真空乾燥して不純な粉状抽出 物を作った（ヘルガー、　Ｒ，（Ｖｅｒｇｅｒ、　Ｒ，）外（１９６９）　Ｂｉ ｏｃｂｉｍ。

１！１ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　１８８．２７２−２８２　）。

基本的にはヘルガーとノリウス外により説明されζいるように、不純でリパーゼ にｍむクリーム状のものを作ったが、多少の変更を施した（ヘルガー（Ｖｅｒｇ ｅｔ）　（１９６９）とメリウス、Ｐ。

（Ｍｅｌｉｕｓ、　Ｐ、）外（１９６５）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ、匹５　、６０）　、。

この変更とは、最初の粉状物を、プロナイナーゼＢｒ＋害剤と一緒に２％（ｖ／ ｖ））リドン　Ｘ１００　（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００　）　、０．１５ＭＮａＣ １′ＩＪ液に懸濁させた後、遠心分離を行って’ＩＮ／Ｂ、にし、次にブタノー ル−硫酸アンモニウム溶液で抽出した。このクリーム状のものは、（プロティナ ーゼ阻害剤とトリトン　Ｘ　１００を含む）ｐＨ５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム／ ８液で抽出した。懸濁液を、トリトン　Ｘ　１００を含まない試料緩衝液に対し て透析を行った後、遠心分離により清澄にして和製抽出物を作った。この粗製抽 出物を、ＣトセフォロースＣＬ６Ｂを用いてクロマトグラフィにかりた後、Ｏ− ０，７ＭのＮａＣＩａ度勾配となっているｐＨ５の５０ｍ開￥酸ナトリウムｉ　 ｌ＆を用いて溶出した。

リパーゼ活性の単一のピークが約０．２７ＭのＮａＣｌ／Ｗ液で溶出し、これを ためて、濃縮した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム／８液でセファデックスＧ１５０ を用いたゲル濾過を行った。リパーゼ活性の単一のピークは、不要の／８液の約 １．７倍溶出した。リパーゼ活性を持っている試料分画を５Ｏ５−ＰＡＧＥ電気 泳動で分析した後、調製物を一２０°Ｃで保存した。

酵素の脂質分解活性は、精製操作中を通して測定した。舌リパーゼは、電位差測 定法（ヘルガー外、（１９６９）　）を使用し、ヘルガー、Ｒ１とバトン、　Ｆ 、　（Ｐａｔｔｏｎ、　Ｆ、）　（１９８２）ケミストリー・アント・フィズイ クス・オブ・リビング、迎、１８９−２２７　）に記載されているように、脂質 の単層を拡げるという技術により種々のトリグリセリド基質を使用して酸性のｐ ＵＶ４域で測定した。または、之の方法の代わりにハモソシュ外（１９７９）　 Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５↓−１１２１２１４２１２５に記載されているように、〔３Ｈ 〕　トリオレイン基質を使用した放射能検定法を用いることもできる。

この放射能検定法は、変更を施して、バトン外（１９８２）　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

１１ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　７１２□、４００−４０７に記載されているよ うに、乳濁化した無水グリセリンを用い、そしてヘルフリンジ（Ｂｅｌｆｒｉｇ ｅ）とホー７　（Ｖａｕｇｈａｎ　）　（１９［ｉ９）　Ｊ、リピノト、　Ｒｅ ｓ、１０．３４１に記載されているように、ｐ）１１２．５のＯ’、ｉＮグリシ ン溶液を用いた＆離脂肪酸の抽出と有機物相の抽出を行った。

」二連した最初の抽出操作は、脱脂したクリーノ・状抽出物中に通常のように最 初のリパーゼ活性の５０％以上を回収したので満足すべきものであった。しかし ながら、クロマトグラフィを１史用した操作では、最終のリパーゼ活性は低い収 ・率（約１０％）であり、またハツチ間で舌リパーゼの純度にばらつきがあった 。

５１１３、−ＰＡＧＥ電気泳動により分析すると、最終産物である個々のｌＦ＋ Ｉ　製物は、（フィールズ、　Ｒ，Ｂ、外（１９８３）によるラットの占リパー ゼの推定分子量に近い）　５２．０００という見掛けの分子量をもって移３！１ 」する１、（１−９０％の一本のポリペプチド鎖を有していた。

このため、上記のクロマトグラフィによる操作を、セファロースと結合したポリ クローナルウザギ抗うット古リパーゼ抗体を使用した１回の免疫精！！操作に置 き代えるごとにより、精製操作を改善した。

ラットの舌リパーゼは、（上述したように）　ＣＭセファロースＣＬ６Ｂを使用 したクロマトグラフィとセファデックスＧＩ５０を使用したゲル濾過により多少 精製した。分子量約５２．０００．、重量的９０％のタンパク質より成る１００ μｇの調製物を１ｍβの完全なフｍｌイン１−のアジュバントに解がした後、こ れをウサギに辻射した。

１４日後、不完全なフロイントのアジュハン］・を使ってｔＭ　ｌｌｉ　ヲ４’ ＋び行った。２８−３０日後、ウサギから採血して抗血清を作り、これを３０日 おきに繰り返した。抗血清の刀価は、標準的な免疫学的方法により測定した。

免疫グロブリンは、固定硫酸ナトリウムを用いて（１８％ｗ／ｖ）晶力価つザギ 高う／ト舌すバーセ抗血１ｌｌｔがら沈澱させた後、ｐ１１９の０．１Ｍ炭酸水 素すトリウム溶液にＩＩＪ熔解化、次に同し緩衝液に対して完全な透析を行った 。免疫グロブリンは、セファロース製造会社の指示に従って阜化シアンで活性化 さゎ、たセファロース（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｓｉａ　）　）に結合させ た。親和性吸着剤は、室温で２時間、１勅エタノールアミン溶液（＋１）１８に 調′！りで封鎖した後、重炭酸と酢酸の緩衝液を用いて洗浄し、次に使用するま で４°Ｃで０．０２％（Ｗ／　Ｖ　）のアジ化す（・リウム熔〆ｌ）、　［Ｊ− １に保存した。

（−ト述した）リパーゼに富むクリーム状のものから可溶化したタンパク質ば、 ラット抗告リバーセーセファロースの詰まったカラムに充填した。このカラムは リン酸塩緩衝液とＬＭ　ＮａＣｌとなっているこのリン酸塩緩衝液を使用して洗 った。結合しているタンパク質は、０．０１門グリシンＨＣＩ　ｐｌ＋２．３の ン容液で溶出した後、ｐ１１５の５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液に対し“（透析 を行い、次ぎに凍結乾燥を行って一２０℃で粉状で保存した。この操作により、 ５Ｏ５−ＰＡＧＥ亀気泳動法によると約５２，０００の分子量をイｊする純粋な ラット古リパーゼができた。また、この免疫吸着カラムを使用することにより、 精製操作の収率、純度及び再現性が格段乙こ向１−シた。１個のラットの占につ き、約１１００１ｒの亀気泳＋ｈ沈により純粋となったラットの古リパーゼが得 られ、これは約５００　ｒｉ’ｌ−位７’　１１１ｇの比活性を持ゲ（いたく申 イ）旨よ３７°Ｃで１分間に杉成される脂肪酸のマイクロ七ル）。

２、、Ｎ　；ｔｈ　（１７）ラット−の店すパーセの特牲２．１ラノＩ・の古す パーセの分子量の測定免疫親和１１［り［−１マトクラフイによゲ（均一に粕栗 されカニラットの古リパーゼを、分子量のわがっている数種のタンパク質が存７ １し５ているＳＤＳポリアクリルアミ１うル中−ご〒＋１気〆〕ｋＩｒｉＪＪに かりた（しＪ入り　（１，ａｅｍｍｌｉ　）　（１９７０）　２イチャ−１２２ ７、ｆｉ８０−６８５　）　。５１１　ｇのラノ１〜の古すバーレを７５％（ｗ ／ｖ）のアクリルアミ１−ゲル中に４人わ人：、、、これらのタ：／バク質（３ 、クマシブル−（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｒｌｕｅ）を使用して智、Ｙできるよ− ）にした。４１成したゲルを第１図にホす。矢Ｉ’ｌｌ　ｌよ、マーカタンパク 質につい−（の酵素の移動位置を小ずものであり、そこ６、二おおよぞの分Ｙ− 量を示す。この酵素は、５２，０００のＱｆ！）けの分子量を持った１本のハン ドとして移動した。セフアゾ、ラスＧ１５０ζゲル濾過を１１った不純の活リパ ーゼのｉｌｌ定分子惜は、ポリアクリルアミ（−ゲル電気泳動法により得られた 分子量と田と一致しでいた。フィールド外（１９８３）により、セファデックス Ｇ２００によるゲル濾過が１１われ、５１．０００という分子量が（１［定され ている。この結果、精製したラットの占すバーセは、分子量約　５２，０００の モノマーのとき活セ［であるといえる。

２．２ラノ［・の店すバーセにおけるグリフ２ンレーンヨンの存在の確定 アスパラギンが結合したＮ−グリコン［ハーショ１ンの存在は、ストレプトミセ ス・ブリカフス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｐｌｉｃａｔｕｓ　）からのコー ントグリコシタ′−ゼＨ（エンド−β　Ｎ−アセチルグルニｌ′＋ミュダ−ゼＨ ）　を用いて、本？１製し人−ノ、１−の古すバーセを水解することにより確認 した。５０１翔酸す１−リウム、１酵フェニルメチルスルボニルフルメリ１−１ ［０μｊ１の５０１Ｑ４Ａ’ｔ／　ｍ　１のエンドグリコシダーゼＨを含むベゾ スタチンＡ（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ　）のｌ容？（ｋ　（ｐＨ５，５）　１ｍ ／当たりう７１ｏ）−ｉリバーセをｉｍｇ含む溶液を３７℃で培養した。この代 わりに、ラットの舌リパーゼを０．４％（ｗ／　ｖ　）　ＳＤＳの沸）氏液中− ζ力１１　ｐ４＞した後、０．１％（ｗ／ｖ　）　ＳＤＳ　１ｇ液に４釈し、上 述のように培養した。両刀の場合で、ラットの７、リパ二セ氷解産物は、ウサギ 抗うット古すパーセ抗１ｍ清を使用したウェスタン・ゾロノド（Ｗｅｓｔｅｒｎ 旧ｏ１）分析法（プル不））　、　Ｗ、Ｎ、　（ＢｕｒｎｅｔＬｅ。

Ｗ、Ｎ、）　（１，９８１）八ｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、□↓１．２、−１ １ｉ１５−２０３１１により５ｌ）Ｓ、−ＰＡＧＩＥ　（７，５％（皆／ν）ア クリルアミＦ’　）で分ｔ’ｉｌｌ　Ｌ、、観察できるようにした。ラットの占 リパーゼ（分子が約５２．［）ｆ）０）の氷解により、最少の分子量が約４１． ０００である一群の低分子量のものが生成した（第２図）。エントクリコンクー セ＋−１の氷解により、Ｎに結合した炭化水素部分をイｊする糖クンバク質から ごの部分を除去することができた。このよ・ノ乙、−リＪ断−・すると、糖部分 が除去されたタンパク質か生成するため、分子量かは−っきりと低下する。この 分子量の低干は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ−（糖部分が除去されたタンパク質の移動度 が増加−４−るので観察することができる。エン１−グリコシダーセの処理ζこ より一ン、ノドの古リパーゼの分子量が５２．ＧＯＯから４１，０００に明らか に減少するということは、（Ｔｆｆｆｆｌで）酵素の約２０％は炭化水素より旧 及びＢｇＩｌ＋を用いて水解した後、バイオケル（Ｂｉｏｇｅｔ）　Ａ５０クロ マＩ・グラフィにより過剰のリンカ−から分とｉＩＩシた。それぞれの分画から のｃＤＮＡは、粘着性末端に結合させることにより（マニアナス外、−上記参照 ）、３つの読み枠全部にβ−ガラクトンダーゼ又は１．ｒ　ｐ　Ｅ融合ポリペプ チドが生成するような−ノ１１の発現ヘクターのＢａｍ　ｔｌＩ部位に挿入した 。β−ガラクトシダーゼ融融合ダクタ一ついては、ラザー（Ｒｕｔｈｅｒ）とミ ュラー　ヒル（１９８３）　ＥＭＢｏ　、１．　′Ｌ、川７９１−１．７９４に 記載されており、またｔ　ｒ　ｐ　Ｅ融合ヘクターについては同時係属中の国際 特許出願ＰＣＴ　／ＧＢ８３１００１７２　（１！１１８４年２月　２日にＷｏ 　８／１１００３８０とし７て公開）に説明されている。

結合しているＤＮＡは、ハナハン、　Ｄ、　（）ｌａｎａｂａｎ、　Ｄ、　）　 （，１，Ｍｏｌ。

Ｒｉｏｌ　↓リー１ｐ５５７−５８０　（１９８３）　）の方法により大腸菌（ Ｅ。

ｃｏｌｉ）のＤ旧細胞に入れて形質転換を行った。什成した絹換え体コロニーは ニドじ２セルロースフイルタートで複製し、改心こ］ζ記に示すように、ラット の舌すバーセ抗原決定基を持っているタンパク質を産生ずるものを探すためのス クリーニングを行った。コロこｍ−は、クロロホルムが飽和した雰囲気中で１０ ｍ■トリス１（ＣＩ　、　１ｍ門ＥＩＩＴ八へ　ｐＨ７，５ｉ液に叶尿素が入っ ているものを用いてフィルター上で／８解した。細胞断片は、１６０ｍＭ　Ｎ、 １ｌＣ１、１０ｍＭトリスＩＩｃＩを含むｐＨ７，５の緩衝液を用いて充分に洗 うことによりフィルターから除去した。５μｇ　／　ｍ　Ｉ！のＩＩＮアーセを ＤＮＡを取り除くために使用した。更に洗った後、フィルター上の非特異的な結 合部位は、０．５％カゼインを含む洗浄緩衝液を用いて培養することにより封鎖 した。

これらのフィルターは、コロニー（別を下向きにして、０１％１−リドンＸ　１ ００．０．１％ＳＯ５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び約２μｇ／ｍ７！のＩｇＧ　（ウ サギ抗うット舌すパーゼ血ｌｎから精製したもの、上記参照）を史に含む洗浄緩 衝液中で培斧ユし人−０このＩＬζｔｊ調製物（。１、大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１） 　１）ＩＩＩからの全タンバタ宵抽出物Ｃ１二対し、て）−め吸収させておいま たものである。改心、−８完谷−Ｑご洗浄をｉＩっ−（フィルターから結合して いないＩｇＧを１収り１徐き、引き続き１？−・Ｉてラヘルされ）こ１　ｐ　Ｃ ｉ／　ｍ　ｌのフ゛ＩＩラーインへ　（Ｐｒｏｌ、ｅｉｎ　Ａ　）を月１い−ζ フィルターを培養し２だ。最７１ａこ、これ（しのフィルタをに、、　］Ａｉの 緩衝液を含むＳＯ３と１−リ１ン×１００を用いて洗った後、」−ラジオグラフ ィにかけた。ラノ［−の−；リパーセ抗原決定基を自するタンパク質を産）１− 」る：ｌ　ｍｌニーは８．’？Ｉ＃　’４ｉ　ｉ巽）尺枝往ｆ（リチ了ルディ、 　Ｒ，Ｐ、　（Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ、　Ｒ，Ｐ、　）外（１９７９）　Ｐｒｏｃ 、Ｎａ１ｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（米国）７す、４９２７−４９３１．　）により、りじｌ−ン化され たラット舌リパーゼ配列が存５Ｆ　シー（いるかどっかを（］在かめるために更 に分析した。

候補ｊ０ニーからのプラスミド調製物についても、クローン化したＤＮＡ断片の 部分的ＤＮＡ配列を分））１するごとによりスクリーニングを行った。ＤＮＡ断 片は、Ｍ１３ヘクターｍ１」８とｍ　ｐ　９に入れて配列させるためにクローン 化したく４１．ノシンク　（，１，ｈｌｅｓｓｉｎＬ＋）とＪ、ベイラ（Ｊ、Ｖ ｉｅｉｒａ）　（１９８２）ジーン、川、２６９−２７６　）。配列は、クロー ン化された部分に対して−Ｊ度３′領域に交雑した合成の一本鎖の一般的プライ マーを用いて、ディデオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ　）配列法（サンガー、　Ｆ、Ｓ 、外（１９７７）　ＰＮＡＳ、　７４．５４６３　；八、Ｊ、Ｈ，スミス（１９ ８０）メリンス・イン・エンジモロシー、アカデミツク・プレス、亜、５００） により決定した。

ｐＬＬｌｏ　（第３図）と呼ばれるプラスミドが同定された。このプラスミドに は、約１３５０の塩基より成るＤＮＡ挿入物が含まれており、これによりラット の占リパーゼの全アミノ酸配列をコートすることができる。

プラスミドｐＬｌ、１０は、プラスミドｐＵＲ２９２（ラザーとミュラ−ヒル、 上記参照）に由来するものである。クローン化した前駆舌リパーゼ（破線）は、 ｐＵＩ？２９２のＢａｍ　旧部位に挿入する。

ｐＬＬｌｏの制限エンドメクレアーゼ地図を作成しく第４図ａ）　）、挿入物の 完全なりＮＡ配列を決定した（第５図）。

第４図ａ）に、ラットの舌リパーゼＤＮＡ配列における幾つかの制限エンドヌク レアーゼによる切断部位の位置を矢印で示す。

直線の下の数字は、第５図に示す塩基の番号と関連している。

第４図ｂ）は、ＤＮＡ配列を有するラットの舌すパーゼタンパク譬の直線的配列 を示す。直線の上の数字は、第５１８２１に示すアミノ酸の番号と関連している 。→−１の位置は、成熟した舌リパーゼのＮ′ｆ＋端残基である。３７７の位置 は、成〃）シたタンパク質のＣ末端アミノ酸である。−１から−１８までのアミ ノ酸は、−１８の位置にあるメチオニンで始まる、推定のラットの西リパーゼ信 号配列を表す。第４図Ｃ）は、β−ガラクトシダーゼと前駆舌リパーゼとの連結 配列を５くず。ブタスミｔ”ｐｌ凡１０中で前駆ラットの古゛リパーゼのコード 領域は、リンカ−をβ−ガラクトシダーゼの１ｔ１２１＋Ｊ基に二Ｉ−卜する４ アミノ酸により融合する。図面は、β−ガラクトシダーゼと連結しているＤＮＡ と誘導されたアミノ酸の配列及び占すパーゼ造伝子を示す。Ｉ）Ｎ　Ａ配列十の 文字は、この領域におりる誘導！アミノ酸配列をボす。アミノ酸コード文字の十 の数字は、β−ガラクトシダーゼ又は舌リパーゼ遺伝子中のアミノ酸番号を示す 。丁の線は、配列の起点を示１゜ 第５Ｎ６こ、前Ｔ！ｊＡ占リパーゼ遺伝子のコード鎖のＤＮＡ配列を示寸。ＤＮ Ａ配列の士の数字は、塩基番号を表す。塩基の１は、ｌｔ疋の読め始めｍｅｔ残 基であるＡＴＧコドンから６ヌクレアーゼ士流にイ１を、乙こイ律したものであ る。”　＊　”は、終］トニノ１−ンＴ八八を不の直く上の文字は、誘導ｌアミ ノ酸配列であり、これを従来の］、　１ｌｉｉｌの文字によるアミノ酸略号を使 用して表す（即ち、Ａ−アラニン、Ｒ−アルギニン、Ｎ−アスパラギン、Ｄ−ア スパラギン酸、Ｃ−システィン、Ｅ−グルタミン酸、Ｑ−グルタミン、Ｇ−グリ シン、Ｈ−ヒスチジン、Ｉ　−（ソロイシン、Ｉ−＝　［：フイシン、Ｋ−リジ ン、Ｍ−メチオニン、Ｆ−フェニルアラニン、Ｐ−プロリン、Ｓ−セリン、Ｔ　 −トレオニン、Ｗ−１，リブトファン、Ｙ−チロシン及び■−バリン）。６力導 アミノ酸配列の上の士線を引いた文字は、精製したラノ１の誌リパーゼがら的接 得られたＮ末端アミノ酸配列を表す。括弧に人ゲ（いるアミノ酸は、ＤＮＡ配列 により誘導されたアミノ酸配列と精製した一；リパーゼのアミノ酸配列決定より ＣＩられた配列との相違点を表す。

直接得られたアミノ酸配列中の隙間（−）（；ｌ、未決定めアミノ酸を表す。ア ミノ酸の−１８から一用までは、ＣＩ定の信号配列を表し、＋１から３７７まで は成熟したタンパク質のアミノ酸配列を表す。破線は、アスパラギン残基付近の 潜在的に糖タンパク質化（グリコンレーション）が可能な配列をン１り’Ｊ。

１１　＋１Δ配列から予想されるアミノ酸配列は、成４ノ）シた舌すバーセが（ 終ＩＬコドンで終わる）　３７７１１１．Ｉのアミノ酸タンパク油３Ｌり成るこ とを示している（第５図）。この成ρノ）シたタンパク質の予想分子量は４２． ５６４であり、これは糖部分を除去１−だ酵素についてｓｏｓ　ＰＡＧＥにより 決定した分子量と略一致している。０１１４配列から予想される、成〃）シた酵 素の全アミノ酸組成と分離しカニタンパク質から直接得られたものとの比較を表 １に示す。成シ）した古すパーセには、（一般式はＸ−Ａｓｎ　＼Ｔｈｒ又はＳ ｅｒである）潜在的にグリニ１シレーンヨンのｎＪ能な部イ）ンが５つある。ラ ットの舌リパーゼは、ブタの膵臓リバーセ゛と比べてアミノ酸が７２個短く、ま たこの酵素とは配列の相同性又はアミンｒθ絹成の類似性は殆どない。しかし、 ラットの舌リパーゼと、ブタの膵臓リパーゼの重要なセリン−１５２の領域にお けるブタの膵臓リパーゼとは近情した相同性が確かに存在する。このセリンは、 膵臓リパーゼの脂質への界面での固定に関与していると考えられており　（ギド ニ、へ、　（Ｇｕｉｄｏｎｉ、八、）外（１９８１）　、Ｂｉｏｃｈｉ＋ｎ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、八ｃｔａ、　６１ｚＱ＝、１４）１−１５０　）、ミセルのジ エチル−ｐ−ニトロフェニルツメスフエイトと反応する（ルワート、　Ｍ、　（ ＲｏｕａｒｄＭ、）　タト　（１！Ｊ７８）　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、八ｃｔａ、旦８】公−１２２７−２３５）　。

そして、次の主要なアミノ酸配列における略同し位置にも存−ゼにあるｌ（固の グリコシレージョン位：首（八ｓｎ　−１６６）であり、これはラットの舌リパ ーゼにＡｓｎ　−１６６として存在しζいることが明らかである。

１１、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質としＣのラットの前駆舌すバー セの大腸菌中での発現 を３７°Ｃでアンピシリンを加え、たし＝プロ人中で１晩生育さセた。

１ｍｅの試料をアンピシリンの入った１００１の１−−−ブロスに移した後、３ ７℃で５時間生育させζ０Ｄ６００で約１．０とした。培養物を氷で冷やした後 、４°Ｃで遠心分離により細胞を集めた。■から０．０１までの光学濃度単位（ ６００ナノメータ）に相当する細胞試料を５ＤＳ−メルカプトエタノール試＃１ 桜南？＆、中で煮た後、５％ポリアクリルアミドＳＯＳゲルに充填し、クマシブ ルーで染色した（第６図ａ）。レーン１は、ｐＵＩ？２９２を含む細胞からの１ ０１分子量大腸菌タンパク質を示す。レーン２ば、ｐＬＬＩＯを含む細胞からの 全クンバク質を示す。全大腸菌クンバク質の５−１量％より成る大きなハンドが 、レーン２巾に約１６０，０００の見掛けの分−７量を持って移動しているのが 観察できる（この値は、分子量約１６０，０００の大腸菌ＲＮＡポリメラーゼの β号ブユニットに近いものである）。このハントは２．ＵＲ２９２を含む細胞中 に観察することはできない。舌リパーゼとβ−ガラクトシダーゼの融合タンパク 質の分子量（古リパーゼのＤＮＡ配列とβ−ガラクトシダーゼの既知の分子量か ら予想されたもの）は、約１６０，０００である。

従って、ｐＬＬｌｏから発現されたタンパク質は、融合タンパク質について予想 された分子量と略同しである。

このことは、同様のポリアクリルアミドゲルを使用したウェスタン・プロット分 析法により確認したく第６図ｂ）。レーン１．２．３．４には、それぞれ大腸菌 ／ｐＬＬ］ｏの１．０．５．０．１及び０．０１　０量ｇｏｏ単位から抽出した 全タンパク質が含まれている。レーン５には、大腸菌／ｐＵＲ２９２の１０量ｅ ｏｏ単位からの全タンパク質が含まれている。レーンらと７には、約１μｇの精 製した真正のラットの舌リパーゼが含まれている。レーン１−４かられかるよう に、低い分子量の幾つかのタンパク質と一緒に、分子量約１６０，０００の主要 なタンパク質が検出されている。ｐＬＩＲ２９２から調製した抽出液中には、免 疫反応を起こすタンパク質ば検出されていない（レーン５）。ラットの舌から精 製したラットの舌リパーゼの試料も抗血清と反応する（レーン６．７）。この結 果、ラットの舌リパーゼは大腸菌中にβ−ガラクトシダーセと共に融合タンパク 質として曲しヘルで発現されたということが結論できる。

５、＋１）大腸菌、（２）酵母、（３）組織培養した動物細胞におけるラットの 舌リパーゼの発現 ５．１大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） 成熟したラットの舌すパーセを発現させるためのプラスミトヘクターは、ｐ　Ｃ Ｔ　５４に基ついて作成する（エムティン１．■。

Ｓ、　（Ｅｍｔａｇｅ、　Ｊ、Ｓ、）外、ＰＮＡＳ、米国（１９８３）　、靭、 ３６７１−３６７５　）これらのヘククーには、ｔｒｐプロモーター、即ち好ま しくは（Ｍｅｔ）舌すパーゼ造伝子と隅り合・う、最適化したシャインーデルガ ーノΔＴＧ塩基配列を含む。これらのヘククーを適当に作成することによっても 、前駆古リパーゼ又はｔｒｐＥ遺伝子産物の融合タンパク質及び舌リパーゼ又は ２蒲駆舌リパーセか発現する。リパーゼを発現さ弔る人口めに最適条件でろＬ育 ご−Ｕた場合、これらのプラスミドを含む大腸菌は、全細胞クンバク質の１０％ に及ふレヘルてメチオニン−西リパーゼ、前駆古リパーゼ又は融合タンパク質を 産生ずる。′ａＩ泡全体の粗製抽出液中にこの酵素が存ン１していることは、ケ ル走査と免疫沈降法により確認し、また定量する（エムティン、外（１９８３） Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（米国）、遺０．３６７１−３６７ ５　＞　。

粗製大腸菌抽出液からの可溶性タンパク質う１画は、上述の方法により検定を行 って脂肪分解酵素活性を調べた。大腸菌中に発現された酵素の一部又は全部は、 不溶性で不活性の形態となっていることがあり、このため上記検定では検出され ない。この、Ｌうな場合、検定と精製の前に、キモシンの生産と関係して本出願 人の同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ　／ＧＢ８３１００１５２　（曽０　８３ ／　０４４１８として公開）と公開された英国特許用ＩＷＪＩＧＢ　２１００７ ３７Ａに記載されているように、酵素を可溶化し−（活性化さゼ°ておく。上述 の技術により可溶性で活性かあり、多少精製された酵素を得た後、この酵素を上 述したように、又は他の標準的な精製技術を使用して更に精製する。

５．２酵母 成熟したラットの舌リパーゼを発現させるためのプラスミトヘクターば、同時係 属中の公開された欧州特許出願ＥＰ　Ａ２００７３６３５に記載されているヘク ターに基づいて作成ｊ′る。これらのヘクターには、酵母のＰＧＫプロモーター と、ＰＧＫとメチオニン−すリパーゼ又は前駆古リパーゼ間に（メチオニン）舌 リパーゼ、前駆古リパーゼ又は融合タンパク質を介在さ−ＵでいるＰＧＫ遺伝子 ３′末端と隣り合う配列が含まれている。

リパーゼを発現させるために最適条件で生育させた場合、これらのプラスミドを 含む酵母は、メヂオニン西リパーゼ、１１；ｊ駆古リパーゼ又は融合タンパク質 を全細胞タンパクｉの１０％に及ふレヘルで産生する。発現されたリパーゼは、 上述したように定量と検定と精製を行う。

５．３組織培養した動物細胞 ラットの前駆古リパーゼを発現させるためのプラスミトヘクターは、バブラキス 、　Ｇ、Ｎ、’（Ｐａｖｌａｋｉｓ、　Ｇ、Ｎ、）とへイマー。

Ｄ、Ｈ，（Ｉｌａｍｅｒ、　Ｄ、Ｈ，）　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、米国、８０．３９７−４０１に記載されているヘクターに基 づいて作成する。

これらのヘクターには、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎθ）遺 伝子ブロモ−クーと発現前駆舌すバーセが含まれている。

この方法で産生された酵素は、細胞膜を通って分泌される。

そして、この酵素を１達したように組織培養している培地で検定し、また組織培 養している培地から精製することかできる。

［ｉ、ヒトの舌リパーゼ ｌ二連した操作は、ラットの舌リパーゼについてのクローニング、発現及び精製 法を説明したものである。同様の操作は、ヒトから類似の酵素を得る際にも行う 。

ヒトの舌のｍＲＮＡから出発して、ヒトの舌リパーゼのｃＤＮ＾クローンが得ら れる。ＲＮＡは、ヒ１−の舌の試料からグアニジンイソチオシアナートを使用し た抽出により調製する（チャーブウィン、　Ｊ、Ｍ、　（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　 Ｊ、Ｍ、）外（１９７９）バイオケミストリー、トグラフィにより精製する（ア ビブ、Ｈ５（＾ｖｉｖ、　Ｈ，）とレイグー、　Ｐ、　（Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　 ）　（１９７２）　ＰＮＡＳ、　６９．１４０８）。

最初の鎖のｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）でプライムされた逆転二りにより行 い（レソッｌル（Ｒｅｔｚｅｌ）外（１９８０）バイオケミストリー、−１馬５ １３−５１８　）　、ＤＮ八とＲＮへの雑種を生成させる。グブラー、　Ｖ、　 （Ｇｕｈｌｅｒ、　Ｖ、）　七ポフマン　［（ｌＩＯｆｆＩＩＢｎｌＲ，３び大 腸菌リガーゼの作用により合成し、そして二本鎖ｃｌｌＮＡにはポリ　（ｄＣ） の尾部を付ける（ビラ（Ｖｉｌｌａ　）−コマロフ（Ｋｏｍａｒｏｆ　Ｉ’）れ てアニールした後、切断し、そしてＰｓｔ　［部位にポリ　（ｄＧ）の尾ｎ１； を付ける。これらの雑種は形質転換能力のある大腸菌のＤ開部分に入れて形質転 換した後、寒天培地上でテトラサイクリン耐性のあるものを選別する。形質転換 物は、ニトロセルロース系のフィルター上でコロニー交雑法によりスクリーニン グを行う（ハナハン、　Ｄ’、　（Ｉｌａｎａｈａｎ、　Ｄ、　）とメセルソン ２Ｍ（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、Ｍ、　）　（１９８０）ジーン、川、６３−６７　” ）　。交雑のプローブは、ニック（ｎｉｃｋ）翻訳によりラベルされたラットの 舌リパーゼのためのコード領域を含むＤＮＡ断片である（リグビー。

ＤＮＡの交雑による検出が可能である。

推定のヒトの舌リパーゼクローンの地図を制限エンドヌクレアーゼを使用して作 り、ラットの舌リパーゼについて説明したようにＤＮ＾配列を行う。ヒトの前駆 舌リパーゼ又はメチオニン舌リパーゼの完全な長さのｃｌｌＮＡクローンは、ラ ットのにリパーゼについて説明したように、大腸菌、酵母又は動物細胞中に発現 される。発現されたし１−の舌リパーゼは、ラットの古リパーゼについて説明し たように、組織培養している大腸菌、酵母又番１動物細胞に対して検出、検定、 特・１ｊ４−の解明及び精製を行・）。

本発明は、上述した通り、純粋に実施例によって説明されており、また本発明の 範囲と趣旨内で部分的な変更をなし得ることが当然理解されるであろう。

ＦＩＧ、　２ ＋ｙ　弓 Ｑ）　Ｈ，＞ 「ＩＧＧ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号 優先権主張　０１９８３年９月５日■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リパーゼ欠乏症の治療において使用するための舌リパーゼタンパク質。 ２、　舌のリパーゼタンパク質はヒトの舌リパーゼタンパク質である、請求の範 囲第１項記載の舌リパーゼタンパク質。 ３、　舌リパーゼタンパク質はラットの舌リパーゼタンパク質である、請求の範 囲第１項記載の舌リパーゼタンパク質。 ４、　メチオニン−舌リパーゼタンパク質のコードとなる遺伝子を含むヘクター で形質転換された宿主生物中でクンバク質を産生させることより成る、メチオニ ン−舌リパーゼクンバク質の生産方法。 ５、　前駆体タンパク質のコードとなる遺伝子を含むヘククーで形質転換された 宿二Ｆ住物中で舌リパーゼ前駆体クンバク質を産生さゼた後、該前駆体タンパク 質を切断して舌リパーゼタンパク質を生成させろことより成る、ゼ：リノマーセ クン・パり質の生産方法。 ６　舌リパーゼ前駆体タンパク質は前駆舌リパーゼタンパク質であり、宿主４ｉ 物は該前駆舌リパーゼタンパク質を切１υ〒して古リパーゼタンパク質を生成さ せることができるものである、請求の範囲第５項記載のＰ１リパーゼタンパク質 の生産方法。 ７、　宿主生物は組織培養している咄乳動物の細胞である、請求の範囲第６項記 載の西リパーゼタンパク質のクト産方法。 ８、　古リパーゼ前駆体タンパク質は異種のタンノマク質と舌１ノノマーゼタン パク質より成るものである、請求の範囲第５項記載の古リパーゼタンパク質の生 産方法。 ！］、ｉｉｊ駆西リバすセクンバク質。 １０　メチオニン−古リバーセタンバク質。 比后リパーゼタンパク質と異種クンバク質より成る融合タンノマク漢。 １２、少なくとも舌リパーゼタンパク質のアミノ酸配列より成るタンパク質のコ ートとなる遺伝子。 １３、請求の範囲第１，２，３．９．１０及び１１項のうちのいずれか１項に基 づくタンパク質のコートとなる、請求の範囲第１２項記載の遺伝子。 １４、請求の範囲第１２項又は第１３項に基づく遺伝子を含むヘクター。 １５、請求の範囲第１４項に基づくヘクターで形質転換した宿主生物９１６、占 リパーゼタンパク質の抗原決定基に幻して特異性を持っている抗体。 １７、舌リパーゼタンパク質と医薬基準に合った賦形剤より成る医薬構成物。 １８、舌リパーゼタンパク質は、請求の範囲第４項又は第５項に係る生産方法に より生産された請求の範囲第２項又は第３頃の古リバーセタンバク質である、請 求の範囲第１７項記載の医薬構成物。 １９　単位投薬剤となっている請求の範囲第１７項又は第１８項記載の医薬構成 物。 ２０、液状となっている請求の範囲第１７項又は第１８項記載の医薬＋１′４成 物。