JPH07188296A - 組換えインヒビン - Google Patents

組換えインヒビン

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JPH07188296A
JPH07188296A JP6054500A JP5450094A JPH07188296A JP H07188296 A JPH07188296 A JP H07188296A JP 6054500 A JP6054500 A JP 6054500A JP 5450094 A JP5450094 A JP 5450094A JP H07188296 A JPH07188296 A JP H07188296A
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Kretzer David Moritz De
デ・クレツツアー，デイヴイツト・モリツツ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒトおよびウシ等の組換えインヒビンおよびそ
の生合成方法、それを含む薬剤組成物、その合成ペプチ
ド、その他の有用な用途を提供すること。 【構成】インヒビン又は同様な免疫学的又は生物学的活
性を有するポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体
又は前駆体から成る、形質転換宿主の発現生成物、産生
したインヒビンの薬剤組成物、その他の用途に使用する
こと。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は特にホルモンインヒビン
の１部又は全部をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）配列を含有するクローニングベクターの構築、該ベ
クターを含有する細菌株の様な宿主細胞ならびにインヒ
ビンの１部又は全部又はその前駆体を産生する細菌株の
様な宿主細胞に関するものである。更に本発明は、天然
物も合成物も含めて、該ベクターおよび菌株の発現産物
の産生および用途ならびに該発現産物およびベクターの
断片の産生および用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】生殖腺が下垂体機能のフィードバック調
整に関与するインヒビンと呼ばれる非ステロイド系因子
を生産するものであることが１９３２年に報告された
（マツクラー，Ｄ．Ｒ．（１９３２）サイエンス，７
６，１９−２０（ＭｃＣｕｌｌａｇｈ，Ｄ．Ｒ．（１９
３２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６，１９−２０））。この時
以来、下垂体前葉部は、共に生殖腺の発育と機能を調節
する少くとも２種のゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン
すなわちフォリトロピン（ＦＳＨ）および黄体形成ホル
モンすなわちルトロピン（ＬＨ）を生成することが知ら
れている。高感度ラジオイムノアッセイによれば各ホル
モンを正確に個々にモニターすることが可能であり、又
これにより生殖腺によるこれらのホルモンのフィードバ
ック調整の様子を明らかにすることも出来る。ＬＨのフ
ィードバック調整は主としてステロイドを介するもので
あると見られ、又一方、ＦＳＨのそれはステロイドの他
にたん白質や糖たん白質因子およびインヒビンを介する
ものである。
【０００３】現在インヒビンは卵巣中の顆粒膜細胞や精
巣中のセルトリ細胞から分泌されるたん白質又は糖たん
白質として定義されている。これはＦＳＨに応答して心
泌され、そしてＦＳＨ合成および分泌のフィードバック
抑制剤として下垂体に作用するが、ＬＨの基底合成およ
び分泌にはほとんど関与しない。インヒビン、そのｍＲ
ＮＡ又は前駆体が他の細胞や組織中で生成されるかどう
かについては未だ不明である。
【０００４】１９７０年代初期以来、精巣および卵巣の
種々の生殖腺からインヒビンを精製する種々の試みが成
されて来たが、当時の種々の生物学的定量法では下垂体
細胞中の生体内および生体外におけるＦＳＨの抑制はイ
ンヒビンが原因であると推定されしかも被検体の非特異
性毒性作用について常にチェックが行なわれていたわけ
ではなく（Ｂａｋｅｒ，Ｈ．Ｗ．Ｇ等（１９８１年）
〔Ｉｎｔｒａｇｏｎａｄａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（Ｆｒａｎｃｈｉｍｏ
ｎｔ，ＰおよびＣｈａｎｎｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．編），Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９３〜２
２８頁；およびＢａｋｅｒ，Ｈ．Ｗ．Ｇ．等（１９８２
年），Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
３８３，３２９−３４２）。この様な方法を使用したこ
とがある程度原因となって矛盾する結果となっていた
（ｄｅ Ｊｏｎｇ，Ｆ．Ｈ．（１９７９年）Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１３，１−１０）。
【０００５】近年、ウシ卵胞液（ｂＦＦ）からのインヒ
ビンを精製して均質物とすることが行なわれた。（国際
特許出願、ＰＣＴ／ＡＵ８５／００１１９；およびＲｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．等（１９８５年）のＢｉｏｃ
ｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２
６，２２０−２２６。）この成功は、被検体の細胞毒作
用を測定する手段（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．等
（１９８２年）のＭｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
ｏｌ，２６，１１９−１２７）を組み入れた精密培養ラ
ット下垂体細胞分析法（Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｓ．等（１９
８０年）のＥｎｄｏｃｒｉｎｓｌ，１０７，１５３６−
１５４２）を使用したことによるものであり、これによ
り測定細胞中のＦＳＨ含有量を低下させる非特異性毒性
作用がインヒビンの作用とは異なるものであることが同
定された。使用した標準体は、１Ｕ／ｍｇの任意の活性
を与える前記ヒツジ精巣リンパ標準体に関して２０Ｕ／
ｍｌのインヒビン活性を有するウシ卵胞液製剤であった
（Ｓｃｏｔｔ，Ｒ．Ｓ．等（１９８０年）のＥｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ，１０７，１５３６−１５４２）。
【０００６】ｂＦＦからのインヒビンは薬３５００回精
製されて２００，０００単位／ｍｇ（たん白質）の特異
活性を有し、そしてこれはドデシルスルホン酸ナトリウ
ムの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）により明らかにされたところによると、そ
れぞれ約４３ｋＤおよび１５ｋＤの２個のジスルフィド
結合サブユニットＡおよびＢから成る５８ｋＤのたん白
質である。各サブユニットのＮＨ2 −末端のアミノ酸配
列は決定されている。この精製物質は先にインヒビンの
生理的性質として定義された、すなわち、ラット下垂体
細胞からの内在ＦＳＨの合成および放出を抑制するがＬ
Ｈ、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモンの合成およ
び放出には関与しないという、生体外生理的性質有して
いる。
【０００７】ＦＳＨは雌の排卵および雄の精子形成の発
生および率の決定に重要であるので、インヒビン、その
類縁体又は相同体あるいはインヒビンに対する抗体を投
与することは主として人間および家畜動物における生殖
腺を抑制又は刺激することになるであろうし、又生殖腺
機能分析用の診断器材としても使用できるであろう。イ
ンヒビンの生理作用を分析することを目的として、粗製
の又は部分分画した生殖腺抽出物又は分泌物を使用して
の多くの生体内実験が行なわれて来た。これらの実験に
おいて、インヒビン又はインヒビンに対する抗体による
作用として以下のものが明らかとなった。
【０００８】１．生殖腺機能の抑制。（Ｍｏｕｄｇａ
ｌ，Ｎ．Ｒ．等（１９８５年）のＧｏｎａｄａｌ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔ
ｔｒｅｉｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｅ
ａｎｃｅ（Ｓａｉｒａｍ，Ｍ．ＲおよびＡｔｋｉｎｓｏ
ｎ，Ｌ．Ｅ．，編）Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｒｉｆｌ
ｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｓｉｎｇａｐｏｒ
ｅ，２１−３７ページ）。
【０００９】２．排卵率の増加。（Ｏ′Ｓｈｅａ，Ｔ．
等（１９８２年）のＰｒｏｃ．Ａｕｓｔ，Ｓｏｃ，Ｒｅ
ｐ，Ｂｉｏｌ，１４，８５；Ｏ′Ｓｈｅａ，Ｔ．等（１
９８３年）のＰｒｏｃ．Ａｕｓｔ，Ｓｏｃ，Ｒｅｐ，Ｂ
ｉｏｌ，１５，２２；およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．
Ｍ．等（１９８４年）のＪ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１
０２，３０５−３０９）。
【００１０】３．思春期の始まりの促進。（Ａｌ−Ｏｂ
ａｉｄｉ，Ｆ．Ａ．Ｒ．等（１９８３年）のＰｒｏｃ．
Ａｕｓｔ，Ｓｏｃ，Ｒｅｐ，Ｂｉｏｌ，１５，８０）。
生体動物におけるこれらの性質やあるいはさらにその他
の生理学的研究を市場規模で開発するためには、天然物
又は合成物の大量の精製インヒビン又はその分画物ある
いはインヒビン作用薬および拮抗薬を必要とする。この
様な大量を得ることは、その物質源が限られている（例
えば、ヒト卵胞液から）ために現在の精製法だけでは不
可能であり、例えば、５０ｍｍのｂＦＦからの抽出では
わずか５−１０μｇの精製物が得られるにすぎない。
【００１１】本発明は、特に、インヒビンをコードする
遺伝子又は遺伝子の部分の分子クローンを例えば大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の様な宿主に導
入するためにインヒビンをコードする遺伝子を同定しそ
して特定することにより、そしてそのサブユニットを含
めこのインヒビン分子の全部又は１部又は前駆体を合成
することのできる宿主、例えば細菌株を創製するために
そのクローン化遺伝子又はその部分を操作することによ
り、前記した制限をとり除こうとするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の態様は、
インヒビンの全部、１部又は前駆体のアミノ酸配列のコ
ード配列として作用する第１のＤＮＡ配列、ならびに該
第１のＤＮＡ配列と交雑するＤＮＡ配列を提供すること
にあり、該配列は天然の又は合成の又は半合成の原料を
含めていかなる原料物質から得られるせのであっても良
く、又該配列は突然変異関連配列を含み、又単一の又は
複数の塩基置換、除去、導入および変換を含み、かつイ
ンヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫学
的生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部又は
前駆体あるいは相同体又は類縁体をその発現の際にコー
ドしているＤＮＡ配列を含むものである。
【００１３】本発明において好ましい配列は、以下本文
において詳述しそして本文添付の図７〜１１に示したウ
シおよびヒトインヒビンの４３ｋＤおよび１５ｋＤ（Ａ
およびＢ）のサブユニットに相当するポリペプチドをコ
ードする配列である。本発明のもう１つの好ましい態様
は、本文後記するインヒビンの２０ｋＤ（Ａｃ）サブユ
ニットをコードするＤＮＡである。
【００１４】本発明のＤＮＡ配列は、例えば脊椎動物の
細胞から常法によりその全ＤＮＡを抽出しそしてその配
列を単離することによって得ることができる。別法とし
てこのＤＮＡは又生体外化学合成又は生合成により例え
ばｍＲＮＡ鋳型を使用することによって得ることもでき
る。本発明は又、インヒビンのポリペプチド又はインヒ
ビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポリペ
プチドの全部又は１部又は前駆体をコードするＤＮＡ又
はＲＮＡ配列を選択する方法も包含するものであり、そ
して該方法は、１種又はそれ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ配
列を得て、そしてこれら上記した活性を有するポリペプ
チドの１部又は全部又は前駆体をコードすることが知ら
れている公知のＤＮＡ又はＲＮＡと交雑する配列を決定
するか、あるいは、インヒビンに対する抗血清又はその
１部を得てそしてインヒビンの１部又は全部と発現する
宿主−ベクター系を同定することから成る。
【００１５】前記配列は天然物源からのものでも良い
し、又、組換えＤＮＡ分子からのＲＮＡ配列、合成配列
又はＤＮＡ配列あるいはこれら配列の組合わせから成る
ものであっても良い。本発明の１つの好ましい態様とし
て、たん白質インヒビンの少くとも１部分をコードする
ＤＮＡを同定しそして特定するために使用する方法は、
インヒビン産生細胞からｍＲＮＡを抽出し、これを２本
鎖ＤＮＡ（相補性ＤＮＡ、すなわちｃＤＮＡ）に変換し
そしてこれらをプラスミドの様な自律複製因子中に挿入
することから成る。そして次に該因子で細菌株の様な宿
主細胞を形質転換し、そして他のたん白質をコードする
ことなくインヒビンだけをコードするＤＮＡを含有する
クローンを検出するために、インヒビン様ｍＲＮＡ又は
ＤＮＡに相補的な合成ＤＮＡプローブの産生するライブ
ラリーをスクリーニングする。
【００１６】従って本発明の態様は、インヒビン様ｍＲ
ＮＡ又はＤＮＡの同定用の合成ポリヌクレオチドプロー
ブを提供するものであり、該プローブはポリヌクレオチ
ドおよび標識物質から成り、そして該ポリヌクレオチド
は下記から選択した配列を有する。
【００１７】
【表１】
【００１８】好ましくは標識物質は５′末端に結合した
32ＰＯ4 群であるか、あるいは他の標識物質であっても
良い。本発明の更に別の態様は、インヒビンの全部又は
１部又は前駆体のアミノ酸配列をコードする第１のＤＮ
Ａ配列および該第１の配列と交雑するＤＮＡ配列とから
成るＤＮＡを挿入したことを特徴とする組換えＤＮＡ分
子を提供することであり、該配列は天然の、合成の、生
合成の又は半合成の物質を含むいかなる物質源に由来す
るものでも良く、又該配列は突然変異、単一の又は複数
の塩基置換、除去、挿入および変換による関連体を含有
し、そして更に、インヒビンのポリペプチド又はインヒ
ビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポリペ
プチドの全部又は１部あるいは前駆体、類縁体又は相同
体をコードする配列を含有するものである。
【００１９】本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子はその
挿入ＤＮＡに効果的に結合する発現抑制配列を含有す
る。本発明の１つの好ましい態様においては、該挿入Ｄ
ＮＡは大腸菌（Ｅ．コリ）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子と効果的に結合する。他の好ましい抑制系としては、
トリプトファン（ｔｒｐ）オペロン、バクテリオファー
ジλ（ＰL ）の左側プロモーターおよびｔａｃの様なハ
イブリッドプロモーターあるいは長鎖末端反復モロネイ
（ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ビールスのプロモーターの様
なビールスプロモーターから成るものが挙げられる。
【００２０】本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は前記
挿入ＤＮＡを含有するプラスミドである。本発明の好ま
しいプラスミドは本文後記において詳述するが、ｐＢＴ
Ａ２２，ｐＢＴＡ２３，ｐＢＴＡ２８，ｐＢＴＡ２９，
ｐＢＴＡ３０，ｐＢＴＡ２９０およびｐＢＴＡ２９２−
ｐＢＴＡ３０５，ｐＢＴＡ３０６−ｐＢＴＡ３１０，ｐ
ＢＴＡ４７２及びｐＢＴＡ４１５−ｐＢＴＡ４１８が挙
げられる。
【００２１】これとは別に該組換えＤＮＡ分子は、バク
テリオファージλの様な適当なバクテリオファージのＤ
ＮＡあるいは生体外であるいはあらゆる有機体内で真核
細胞中において複製可能なビールスのＤＮＡに結合した
前記挿入ＤＮＡから成るものであっても良い。本発明は
又、プロモーター、翻訳開始シグナルおよびインヒビン
のポリペプチドあるいはインヒビンと同様の免疫学的又
は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部又は
前駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこ
れをコードする第１のＤＮＡ配列、あるいは該第１の配
列と交雑するＤＮＡ配列又は突然変異、単一のあるいは
複数の塩基置換、除去、挿入又は該第１のＤＮＡ配列へ
の変換による関連体のＤＮＡ配列から成る融合遺伝子を
提供するものである。
【００２２】本発明の好ましい組換えＤＮＡ分子は、本
発明のＤＮＡから成るＤＮＡ配列を挿入したプラスミド
から成るものである。適当なプラスミドとしては、ｐＢ
Ｒ３２２，ｐＵＲ２９０，ｐＵＲ２９１又はｐＵＲ２９
２又はｐＢＴＡ２８６，ｐＵＣ７，ｐＵＣ８又はｐＵＣ
９又はｐＵＣ１３又はｐｔｒＰＬ１又はｐＷＴ１１１，
ｐＷＴ１２１又はｐＷＴ１３１およびそれらの誘導体が
挙げられる。又ビールスベクター、例えばｐＺＩＰ Ｎ
ｅＯ ＳＶ（Ｘ）１、ワクシニアビールス、バクロビー
ルスおよびそれらの誘導体も挙げることができる。
【００２３】又本発明は、インヒビンのポリペプチド又
はインヒビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有す
るポリペプチドの全部、１部又は類縁体、相同体又は前
駆体のアミノ酸配列に相当するかあるいは発現時にこれ
をコードする第１のＤＮＡ配列、該第１の配列と交雑す
るＤＮＡ配列あるいは突然変異、単一の又は複数の塩基
置換、除去、挿入ならびに該第１のＤＮＡ配列あるいは
交雑配列への変換による関連体の配列から成る挿入ＤＮ
Ａを作り、そしてこの挿入ＤＮＡをクローニングベクタ
ーに導入することから成る、組換えＤＮＡ分子の製造方
法も包含するものである。
【００２４】好ましくは該ＤＮＡ配列ハクローニングベ
クターの正しい位置に導入することであり、そして正し
い読み枠は発現抑制配列を有する。更に他の態様として
本発明は又、少なくとも１個の本発明の組換えＤＮＡ分
子で形質転換されそしてポリペプチドインヒビン又はイ
ンヒビンと同様の免疫学的又は生物学的活性を有するポ
リペプチドの全部、１部又は前駆体を発現可能な宿主を
提供するものである。
【００２５】適当な宿主としては、細菌細胞、バクテリ
オファージ、酵母、他の真菌類、脊椎動物細胞、昆虫細
胞、植物細胞ならびにヒト細胞ホ、ヒト組織およびあら
ゆる真核有機体が挙げられる。適当な細菌宿主はＥ．コ
リおよび他の腸管内微生物、シュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
である。好ましい宿主培養体としてはＥ．コリＢＴＡ５
４５，ＢＴＡ６３４，ＢＴＡ６３７，ＢＴＡ６４７およ
びＢＴＡ６５２として同定されており、又宿主−ベクタ
ー系としてはＡＴＣＣ６７０５４−ＡＴＣＣ６７０５９
およびＢＴＡ１３６１として同定されている。
【００２６】本発明は又、適当な宿主を作り、そして本
発明の組換えＤＮＡ分子を該宿主中の正しい読み枠中に
導入することから成る、宿主の形質転換方法をも包含す
る。更に又本発明は、インヒビンのポリペプチド又はイ
ンヒビンと同様の免疫学的又は生物学的性質を有するポ
リペプチドの全部、１部又は前駆体から成る、本発明の
形質転換宿主の発現生成物を提供する。
【００２７】本発明の好ましい態様においては、その発
現生成物は、宿主と相同の第１のポリペプチド配列と、
インヒビンのポリペプチド又はインヒビンと同様な免疫
学的又は生物学的性質を有するポリペプチドの全部、１
部又は前駆体、類縁体又は相同体をコードするアミノ酸
配列である第２のポリペプチド配列とから成る。本発明
の好ましい態様においては、該第１のアミノ酸配列はβ
−ガラクトシダーゼの１部又は全部であり、該宿主細胞
はＥ．コリである。本発明の更に好ましい態様において
は、該第１の配列は発現生成物のＮＨ2 −末端配列であ
る。
【００２８】更に又本発明は別の態様として本発明は、
適当な宿主を本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換して
インヒビンの全部、１部又は前駆体であるポリペプチド
又はインヒビンと同様の生物学的又は免疫学的活性を有
するポリペプチドを含有するたん白質生成物を発現可能
な宿主を作り、該宿主を培養して該発現生成物を得、そ
して該ポリペプチドを採取することから成る、インヒビ
ンの全部、１部又は前駆体から成るポリペプチド又はイ
ンヒビンと同様な免疫学的又は生物学的活性を有するポ
リペプチドを生合成する方法を提供する。
【００２９】好ましい態様として、該発現生成物は不活
性封入体として生成され、そし可溶性細胞たん白質から
の遠心分離によって細胞抽出物から精製される。好まし
い精製方法としては、プロテオリシス抑制剤および膜崩
壊剤を添加しそして密度勾配遠心分離に付することであ
る。必要に応じて、この精製封入体は可溶化されそして
放出されたたん白質は更に選択的分解および（または）
付加的精製等の処理に付することによって不用なたん白
質を除去しても良い。
【００３０】更に又本発明は、プラスミドｐＢＴＡ２
８，ｐＢＴＡ２９，ｐＢＴＡ２９２およびｐＢＴＡ２９
６−ｐＢＴＡ３１０，ｐＢＴＡ４７２及びｐＢＴＡ４１
５−ｐＢＴＡ４１８で形質転換された細菌によって発現
されたインヒビン様たん白質を提供しよう。更に又本発
明は、薬学的に許容される形態又はその等価合成体の形
の、１種又はそれ以上の本発明の発現生成物を含む薬剤
組成物を提供する。
【００３１】更に又本発明は、インヒビンの部分であ
り、そしてインヒビン作用薬又は拮抗薬となり得るかあ
るいは抗原性応答を誘発することができそしてＦＳＨ準
位又は生殖生理を左右するものとして使用することので
きる、合成ペプチドを包含する。組成物は経口投与ある
いは注射剤の形であるのが適当であり、そして好ましく
は薬学的に許容されるアジュバントを含有している。本
発明の薬剤組成物は又、徐放性の形態、特に移植に適当
でありそして脊椎動物中で徐放効果のあるものをも含有
する。この様な形態における組成物は脊椎動物中に移植
し生殖腺機能に作用させそして所望の効果が得られた後
にこれを除去することができる。
【００３２】本発明は又、薬学的に許容される形態にあ
る、１種又はそれ以上の発現たん白質を含有するワクチ
ンを提供する。本発明は又、本発明の薬剤組成物の有効
量を脊椎動物に投与することから成る、脊椎動物の生殖
腺機能を調整する方法を提供する。本発明は又、１種又
はそれ以上の本発明の発現生成物又は本発明の薬剤組成
物を脊椎動物に投与する免疫学的操作の結果得られる抗
体製剤を包含する。該抗体製剤としてはポリクローナル
およびモノクローナル抗体製剤を挙げることができる。
【００３３】本文および請求の範囲における語句の「イ
ンヒビン」とは非検特異性なものであり、従ってこれは
ウシ、ヒト、ヒツジ、ブタ、トリおよび魚等のインヒビ
ン関連種、特にヒトおよびウシインヒビンを包含するせ
のである。又該語句は非グリコシル化およびグリコシル
化インヒビン種も包含する。「脊椎動物」なる語句は魚
類、両生類、爬虫類、鳥類およびヒトを含む哺乳類の種
を包含する。 インヒビンのサブユニット構造 本文中に記載の様に、ろ胞液中に分泌されるインヒビン
は、２つのサブユニット、即ち４３ｋＤおよび５１ｋＤ
のサブユニット（それぞれＡおよびＢ）から成る５８ｋ
Ｄのたん白質である。Ａ、すなわち４３ｋＤ種は、ある
インヒビン種を他の種に投与した時に抗原として作用す
るであろう様に相違している種間における相同たん白質
である。この様に、異種インヒビンは後記する用途の抗
インヒビン抗体を生起せしめる様に使用することができ
ると考えられる。
【００３４】一方、Ｂサブユニットすなわち１５ｋＤサ
ブユニットは多くの種間において、例えばヒトおよびウ
シ種においてアミノ酸配列が実質的に同一である。ある
状況下においては、全たん白質は分子量２０ｋＤおよび
１５ｋＤの２つのサブユニット（それぞれＡｃおよび
Ｂ）から成る１３ｋＤ型に切断される場合がある。この
３１ｋＤ型はインヒビン活性を有しており、そして本発
明の範囲内に包含されるものである。５８ｋＤ型を３１
ｋＤ型に切断することによりＡN 断片と呼ばれるポリペ
プチド断片が生成するが、これ自身生殖腺機能に重要な
作用をするので、これも又本発明の範囲内に包含され
る。
【００３５】本文においては下記の略語を使用した。 ＡＴＰ ： アデノシントリフォスフェート ｂＦＦ ： ウシ卵胞液 ｂｐ ： 塩基材 ｃＤＮＡ ： 相補ＤＮＡ ＣＧ ： 絨毛ゴナドトロピン Ｃｉ ： キューリー Ｄ ： ダルトン ｄＡＴＰ ： ２′−デオキシアデノシントリフォスフ
ェート ｄＣＴＰ ： ２′−デオキシシチジントリフォスフェ
ート ｄＧＴＰ ： ２′−デオキシグアノシントリフォスフ
ェート ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＤＴＴ ： ジチオスレイトール ｄＴＴＰ ： ２′−デオキシチミジントリフォスフェ
ート ＥＤＴＡ ： エチレンジアミンテトラ酢酸 ＥＬＩＳＡ： エライサ（酵素結合免疫吸着分析） ＦＳＨ ： フォリトロピン又はろ泡刺激ホルモン ＸＧ ： 重さの〜倍の力 ｇ ： グラム ＨＰＬＣ ： 高速液体クロマトグラフィー ｋ ： （接頭語）キロ ｌ ： リットル Ｍ ： モル濃度 ｍ ： （接頭語）ミリ ｍｏｌ ： モル ｍＲＮＡ ： メッセンジャーＲＮＡ ｐ ： （接頭語）ピコ ｎ ： （接頭語）ナノ ＰＡＧＥ ： ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＣＭＢ ： パラクロルメルクリ安息香酸 ＰＭＳ ： ヒト閉経後血清 ＰＭＳＦ ： フェニルメチルスルホニルフルオライド ＰＭＳＧ ： 妊馬血清ゴナドトロピン ＲＩＡ ： ラジオイムノアッセイ ＲＮＡ ： リボ核酸 ＲＰ−ＨＰＬＣ ： 逆相 ＨＰＬＣ ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム ＳＳ ： 去勢ウシ血清 Ｔｒｉｅ ： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン μ ： （接頭語）ミクロ 尚本文においては起源又はグリコシル化の状態に関係な
く下記の通り用語を互換可能に定義しこれを使用した。
【００３６】Ａサブユニット＝４３ｋＤサブユニット＝
５８ｋＤインヒビンの大サブユニット＝アミノ酸Ｈｉｓ
１からＩｌｅ３００（図５及び図６）＝アミノ酸Ｈｉ
ｓ１からＩｌｅ３０６（図９及び図１０）。Ａｃサブユ
ニット＝２０ｋＤサブユニット−３１ｋＤインヒビンの
大サブユニット＝アミノ酸Ｓｅｒ１６７からＩｌｅ３０
０（図５及び図６）＝アミノ酸Ｓｅｒ１７２からＩｌｅ
３０６（図９及び図１０）。
【００３７】Ａｎ断片＝ＡサブユニットのＮＨ2 −末端
部＝アミノ酸Ｈｉｓ１からＡｒｇ１６６（図５）＝アミ
ノ酸Ｈｉｅ１からＡｒｇ１７１（図９）。Ｂサブユニッ
ト＝１５ｋＤサブユニット＝５８ｋＤおよび３１ｋＤイ
ンヒビンの小サブユニット＝アミノ酸Ｇｌｙ １からＳ
ｅｒ１１６（第６および８図）。「同様な免疫学的活性
を有する」とは、インヒビン又はその１部の充分に相同
性のあるたん白質であって、（１）その受容菌の免疫系
が生来のたん白質と同様な反応性を有するか、あるいは
（２） これを投与した場合に内在インヒビンを認識可
能な該たん白質に対する抗体を生成し得る様なたん白質
を含めて意味するものである。
【００３８】又、「インヒビンの部分」とはインヒビン
のサブユニットを含めて意味するものであると理解すべ
きである。本発明の方法および産生物を以下に実施例を
挙げて詳述するが、当業者においてはこれらを変更する
ことが可能であり、本発明は当然それらの変法等も良く
包含するものであることは言うまでもない。
【００３９】
【実施例】
実施例１ ウシ顆粒層細胞からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）の単離 全精巣および全卵巣または単離したセルトリ細胞および
顆粒層細胞をインヒビンｍＲＮＡ源として使用すること
ができる。本例の場合単離した顆粒層細胞を使用した。 （ａ）顆粒層細胞の採取 針および注射器を使用して、地方畜殺場において新鮮な
ウシ卵巣の表面の大卵胞から、顆粒層細胞を含むウシ卵
胞液（ｂＦＦ）を採取した。この液は採取後すぐに実験
室へ運ぶまでの間氷冷却保存した。７０〜１００ｍｌの
ｂＦＦからの細胞を５分間５００×Ｇで遠心分離して上
ずみ液を除去して生来インヒビンの精製をした。ＲＮＡ
を下記の様にして細胞から抽出した。 （ｂ） ＲＮＡの抽出と精製 採取後すぐに顆粒層細胞に２４ｍｌの４．２Ｍグアニジ
ウムイソチオシアネート／１２０ｍＭメルカプトエタノ
ール／５％（ｖ／ｖ）サクロシル／１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．等
（１９７９年）のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８；５
２９４−５２９９）を加えてこれを溶解した。この溶解
産物をソルバール オムニミックス（Ｓｏｒｖａｌｌ
Ｏｍｎｉｍｉｘ）中で速度４で３０秒間ホモジナイズ
し、次に１５分間２０，０００ｘＧで遠心分離して細胞
細片を除去した。上ずみ液に２．５ｍｌにつき１ｇのＣ
ｓＣｌを加えた。この混合物を９ｍｌの５．７Ｍ Ｃｓ
Ｃｌ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）のクッションの上に置きそして６５時間
１５℃で１２２，０００Ｇで遠心分離した。
【００４０】ＲＮＡペレットを５ｍｌの７０％エタノー
ル／３０％ＴＥ（１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭ トリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で数回洗浄してＣｓＣｌを除去
した。これを最後に０．３ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ７．５）と６ｍｌのエタノールを加えて３ｍｌの
ＴＥから析出させて次に−７０℃で凍結させそして１０
分間２０，０００ｘＧで遠心分離した。このＲＮＡペレ
ットを１ｍｌのＴＥ中に再溶解し次で使用するまでの間
−７０℃に保存した。 （ｃ） ｍＲＮＡの単離 オリゴｄＴ セルロースクロマトグラフィーにより全Ｒ
ＮＡからｍＲＮＡを抽出した。（Ａｖｉｖ，ＨおよびＬ
ｅｄｅｒ，Ｐ（１９７２年）によるＰｒｏｃ，Ｎａｔ
ｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ，６９；１４０８−１４
１２）。まずＲＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の溶液と
し、２分間７０℃に加熱し、氷水中に急冷しそしてオリ
ゴｄＴセルロース（ＢＲＬ）のカラム（乾燥床重量０．
５ｇ）に供給した。画分からの流体を加熱し、冷却しそ
してこの操作を２回くり返した。カラムを５ｍｌの負荷
緩衝液で次で０．５Ｍ ＮａＣｌを加えた同緩衝液５ｍ
ｌで順次洗浄した。ｍＲＮＡが６０℃でＴＥ中に溶出し
た。画分（０．２５ｍｌ）を集め、そのｍＲＮＡ含有分
を酢酸ナトリウムおよびエタノール（上記参照）を使用
して析出させ、そしてペレットを真空乾燥した。ｍＲＮ
Ａを０．１ｍｌのＴＥ中に再溶解して部分標本（アリク
ウォット（２５μｌ）を−７０℃に凍結した。
【００４１】これらの抽出および精製工程からのＲＮＡ
画分の全部をあわせ、その１〜２μｇ試料をアガロース
−尿素ゲル上の電気泳動により検査した。すなわち、５
Ｍ尿素と核０．０１％（ｗ／ｖ）のトラッキング色素ブ
ロモフェノールブルーとキシレンシアノールＦＦとを含
有する１０μｌのＴＥ中のＲＮＡ試料を２分間７０℃に
加熱し、そして５．６Ｍ尿素／１４ｍＭヨード酢酸塩／
１ｍＭ ＥＤＴＡ／３６ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ／４０ｍ
Ｍトリス−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）を含有する１．５％
アガロースゲルの電気泳動に付した。ブロモフェノール
ブルー色素がゲルの底部に到達した時点で電気泳動を完
了し、そして臭化エチジウムの溶液を加えて着色後ＲＮ
Ａを紫外線下に可視化した。
【００４２】ＲＮＡ濃度をその２６０ｎｍにおける吸光
度により測定し、４０μｇ／ｍｌのＲＮＡは１ｃｍの光
路長を使用してのＡ260 が１．０であった。具体的に
は、６０−１００ｍｌのｂＦＦからは１−３ｇ湿重量の
ペレット化顆粒層細胞が得られ、そしてこれから６００
−９００μｇの全ＲＮＡおよび２０−６０μｇのｍＲＮ
Ａが抽出された。
【００４３】このｍＲＮＡ画分はインヒビン、そのサブ
ユニット又はインヒビン様ポリペプチドに特異性のある
ｍＲＮＡを含有しているが、このｍＲＮＡ画分はその大
部分が不用である種々の非常に多くの異なるｍＲＮＡ種
から成る混合物であることを理解すべきである。次のｃ
ＤＮＡ合成および尾部形成の工程中にこれらの各々はイ
ンヒビン、そのサブユニット又はインヒビン様ポリペプ
チドに特異性のあるｍＲＮＡと同様に機能し、そしてこ
れらが存在する事が結局大量の不用クローンの生成の原
因となりために所望のクローン、すなわちインヒビンの
全部、１部又はサブユニットをコードするｃＤＮＡ配列
を含有するクローンを同定するためのスクリーニング工
程が必要となる。
【００４４】ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの生成工程および
これをベクターｐＢＲ３２２に導入する工程を図１に示
しそして実施例２および３に更に詳述したが、これは本
発明の１例の例示にすぎないものである。 実施例２ ｍＲＮＡからのコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成 （ａ） 第１ｃＤＮＡ鎖の合成 ｄＡＴＰの不足した反応混合物を用意し、その小部分を
とり出してα−32ＰｄＡＴＰを加えることによりｃＤＮ
Ａ合成の様子をモニターした。次に過剰のｄＡＴＰを主
反応混合物に添加し直して第１鎖の完全合成をした。即
ち、ｍＲＮＡ混合物の試料（２μｇ）を水を加えて２７
μｌとし２分間７０℃に加熱し、そして氷水中に急冷し
た。５００ｎｇのオリゴｄＴ１０−１７プライマー（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、各５０ｎｍｏｌのｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰおよびｄＧＴＰ、５ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、１００
ｎｍｏｌのＤＴＴ、２０単位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２μｍｏｌのＫＣｌ、４００
ｎｍｏｌのＭｇＣｌ2 および２．５ｍｏｌのトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．５）から成る混合物２３．５μｌを加え
て反応を開始した。
【００４５】混合後直ちに２μｌの試料を０．５μｌの
α−32Ｐ ｄＡＴＰ（１８００Ｃｉ／ｎｍｏｌ；５μＣ
ｉ／μｌ）を含有する別のチューブに入れて分析反応を
行い、そして０．５μｌの６０ｍＭ ｄＡＴＰを主反応
系に添加し直してこれを４２℃に６０分間保った。分析
反応系から０．５μｌをとり出しエタノール−ドライア
イス浴中で急激に冷凍しこれを０時間のコントロール試
料とした。
【００４６】反応系の残りを４２℃に６０分間保ち、更
にその０．５μｌを分析に供した。各放射性試料を０．
７５Ｍ ＫＨ2 ＰＯ4 緩衝液（ｐＨ３．５）中ポリエチ
レンイミン（ＰＥＩ）セルロース（Ｍｅｒｃｋ）の薄層
クロマトグラフィーに付した。オートラジオグラフィー
の結果を図２に示した。こうして非結合ヌクレオチドを
出発物中に残っている新たに合成した第１鎖（ＤＮＡ−
ＲＮＡハイブリッド）から除去した。オートラジオグラ
フィー後に各スポットを切り出しそしてその結合放射能
を測定して結合能を評価した。総数の１０％の結合（評
価 最大結合３３％）又はそれ以上がｃＤＮＡの第２鎖
合成に充分な量であった。放射性物の残りを２Ｍ酢酸ア
ンモニウム／６７％エタノールから２回析出させ、負荷
緩衝液（上記参照）中で２分間沸騰させた後にアガロー
ス−尿素ゲルの電気泳動に付してＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖を
分離した。このゲルを次にＸ−線フィルム（富士ＲＸ
型）のオートラジオグラフィーに付した。この工程によ
りｃＤＮＡ生成物のサイズが決定されるが、これによる
と代表的なものは１０００塩基以上から２００塩基以下
の範囲であった。
【００４７】第１鎖合成は等業者に公知の他の方法によ
っても行うことができる。本例においてはオリゴｄＴを
プライマーとして使用してポリ（Ａ）領域を有する全ｍ
ＲＮＡ種からの第１ｃＤＮＡ鎖を合成した。ｍＲＮＡ種
からｃＤＮＡを合成するために任意のプライマーを使用
することもできる。又別法として、インヒビンｍＲＮＡ
の部分に相補性のある配列を有するプライマーを使用し
てのインヒビンｃＤＮＡの特異的合成も可能である。オ
リゴｄＴ又はインヒビンｍＲＮＡの部分に相補性のある
配列を有する他のプライマーを第１鎖の合成用のプライ
マーとして使用することも出来る。 （ｂ） 第２鎖の合成 第１ｃＤＮＡ鎖合成と同様にして、ｄＡＴＰの不足した
出発反応混合物から主反応および分析反応を行った。
【００４８】すなわち、第１ストランド主反応系のｃＤ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子をこれに５０μｌの３Ｍ
酢酸アンモニウム（ｐＨ７．５）および２００μｌのエ
タノールを加えることによって析出させ、−７０℃に冷
却しそして１５，０００ｘＧで５分間遠心分離した。こ
のペレットを５０μｌのＴＥ中に再けん濁し、再析出さ
せ、これを乾燥しそして最後に５０μｌのＴＥ中に取っ
た。
【００４９】これに、各１６ｎｍｏｌのｄＣＴＰ，ｄＴ
ＴＰおよびｄＧＴＰ、１ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、３．５単
位のＲＮＡアーゼＨ（ＢＲＬ）、９２単位のＤＮＡポリ
メラーゼＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、４０μｇのＢＳ
Ａ、６ｎｍｏｌのβ−ＮＡＤ、４００ｎｍｏｌの（ＮＨ
4 ）ＳＯ4 、４μｍｏｌのＫＣｌ、２００ｎｍｏｌのＭ
ｇＣｌ2 および８００ｎｍｏｌのトリス−ＨＣｌから成
る溶液（ｐＨ７．５）（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｖ．およびＨｏ
ｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．（１９８３年）のＧｅｎｅ ２
５；２６３−２６９）の３５０μｌを加えた。
【００５０】混合後直ちに２μｌの試料を０．５μｌの
α32ＰｄＡＴＰ（１８００Ｃｉ／ｎｍｏｌ；５μＣｉ／
μｌ）を含有する別のチューブに入れて分析反応を行
い、そして２μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰを主反応系に添
加し直してこれを１５℃に６０分間次いで２２℃に６０
分間保った。０時間、１時間および２時間目に分析反応
系から０．５μｌの試料をとり出しエタノール−ドライ
アイス浴中で急冷凍しそして第１鎖合成の場合（図２）
と同様にして薄層クロマトグラフィーにより分析した。
この第２鎖合成の結果、総数の少くとも５％の結合（評
価最大結合８％）が得られた。
【００５１】第２鎖合成は当業者に公知の他の方法によ
って行うことができる。その例としては例えば次のよう
なものが挙げられる。本例の場合は、ＤＮＡ／ＲＮＡハ
イブリッド中のＲＮＡに特異性のあるＲＮＡアーゼ（例
えばＲＮＡアーゼＨ）をＤＮＡポリメラーゼと一緒に使
用した。別法として、第１鎖合成の際に生成したＤＮＡ
／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを化学的又は酵素的に
分解しあるいはＤＮＡから単離し、ＤＮＡを自己プライ
マーとしても良い。次にＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写
酵素を使用して第２鎖合成を行い、残存するヘヤーピン
ループを１本鎖特異性Ｒ因子例えばＳ１ヌクレアーゼに
よって消化する。
【００５２】第３の方法は、ｍＲＮＡの除去又は分解の
後にオリゴヌクレオチド（例えばオリゴｄＣ）尾部を第
１鎖ＤＮＡ生成物の３′末端に付加する方法である。相
補オリゴヌクレオチド（例えばオリゴｄＧ）を尾部にア
ニーリングしそしてこれをＤＮＡポリメラーゼ又は逆転
写酵素による第２鎖反応のプライマーとして使用する。
インヒビンｃＤＮＡに相補の又は同一の又は類似の配列
を有する一本鎖又は２本鎖ＤＮＡは又クローンの化学合
成によっても作ることができる。 実施例３ Ｅ．コリ中におけるウシ顆粒層細胞ｃＤＮＡライブラリ
ーの構築 （ａ） テイリングおよびアニーリングｃＤＮＡ ４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．５）および８
００μｌのエタノールを加えることによって第２鎖合成
で得られた２本鎖ｃＤＮＡを析出させ、これを−７０℃
に冷却しそして２０，０００ｘＧで５分間遠心分離し
た。このペレットを５０μｌのＴＥ中に再溶解し、等容
量のフェノール（ＴＥで予め平衡化しておいた）で２回
抽出し、１００μｌのジエチルエーテル（ＴＥで予め平
衡化しておいた）で３回抽出し次で５０μｌの４Ｍ酢酸
アンモニウムと２００μｌのエタノールを加えて析出さ
せそして−７０℃に冷却した。この析出操作とは別に、
冷混合物を室温に戻し、１５，０００ｘＧで５分間遠心
分離した。この操作は非結合ヌクレオチドを除去するた
めのものである。このペレットを５０μｌのＴＥ中に溶
かしそして酢酸アンモニウムとエタノールを使用して析
出させた。ペレットを真空乾燥し３０μｌのＴＥ中に再
けん濁させた。
【００５３】１５μｌのｃＤＮＡに３０ｎｍｏｌのＣｏ
Ｃｌ2 、３ｎｍｏｌのＤＴＴ、１．５μｍｏｌのカコジ
ル酸カリウム（ｐＨ７．２）、５μｇのウシ血清アルブ
ミン、３０ｎｍｏｌのｄＣＴＰおよび１７単位の末端ト
ランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を含有する緩衝液の等容量
を加えた。混合物を３７℃で３〜５分間培養し、エタノ
ール−ドライアイス浴中で凍結し次で６５℃で５分間加
熱した。この尾部形成ＤＮＡを次に使用するまで−２０
℃で保存した。ＰｓｔＩ制限酵素部位（ＢＲＬＣａｔ，
Ｎｏ．５３５５ ＳＡ）の３′突出末端上に約２４個の
ｄＧ残基を有する市販のｐＢＲ３２２プラスミド分子
（図１；表２）中へのアニーリングとして公知の方法に
よってｃＤＮＡ種を結合した。このアニーリング処理に
より、ｃＤＮＡのｄＣ尾部はプラスミドのｄＧ尾部と安
定なハイブリッドを形成する。ＰｓｔＩ部位はｐＢＲ３
２２Ｂ−ラクタマーゼ遺伝子中にあるので、生成したプ
ラスミドはアンピシリン感受性であるが、テトラサイク
リンには尚耐性がある。
【００５４】アニーリング操作において、２．５μｌの
ｄＣ尾部付ｃＤＮＡと約０．５μｇのｄＧ尾部付ｐＢＲ
３２２とを０．１Ｍ ＮａＣｌ含有ＴＥの５０μｌ中で
６５℃に５分間加熱し、次で５７℃に２時間培養した。
次に溶液を１時間以上かけて徐々に室温に冷却しこれを
次に使用するまでの間氷上に保存するか又は−２０℃で
冷凍保存した。
【００５５】ｃＤＮＡ種のベクター分子中への挿入は当
業者に公知の他の方法によっても行うことができる。例
えば、テイリングとして知られている末端トランスフェ
ラーゼ反応を使用してヌクレオチドをＤＮＡ分子の３′
末端に付加することができる。これらの分子を次に相補
配列でテイリングしたベクターＤＮＡ分子でアニーリン
グすることができる。これとは別にｃＤＮＡ分子は、制
限酵素で切断した時に、クローニングに好都合な配列を
生成するＤＮＡリガーゼによって付加された合成リンカ
ーを有していても良い。又別に、ｃＤＮＡは直接制限酵
素又はＤＮＡアーゼで切断して直接クローニングに供し
ても良い。又平滑末端ＤＮＡ分子はベクター中に直接ク
ローニングしても良く、この様なベクターとしてはプラ
スミド、コスミド、バクテリオファージおよび他のビー
ルス等が挙げられる。 （ｂ） 組換えプラスミドによるＥ．コリＥＤ８６５４
の形質転換 Ｅ．コリＥＤ８６５４（表２）をＤ．Ｈａｎａｈａｎの
方法（１９８３年、Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，１６０，５
５７−５８０）により処理して反応能を付与し、この反
応性細胞の０．２ｍｌを１０μｌのアニーリングしたｃ
ＤＮＡ−ｐＢＲ３２２ハイブリッドで形質転換した。形
質転換後、細胞を２ｍｌのＳＯＣ（５ｇ／ｌの酵素エキ
ス／２０ｇ／ｌのトリプトン／１０ｍＭのＮａＣｌ／
２．５ｍＭのＫＣｌ／２０ｍＭのＭｇＣｌ2 ／２０ｍＭ
のＭｇＳＯ4 ／２０ｍＭのグルコース）中で２時間生長
させ、次で２，０００ｘＧで５分間遠心分離し、０．５
ｍｌの０．８５％ ＮａＣｌ中に再けん濁し、そして全
けん濁液と、ｐＢＲ３２２組換えプラスミドで形質転換
した細胞を選択するために、１０μｇ／ｍｌのテトラサ
イクリン−ＨＣｌを含有する２８０ｍｍのＬＢ（１リッ
トルにつき５ｇの酵素エキス／１０ｇのトリプトン／５
ｇのＮａＣｌ）寒天（１リットルにつき１５ｇの寒天）
板上に載置した。こうして３７℃で４８時間培養した。
この方法により、代表的な例としてこの形質転換により
組換えプラスミドｐＢＲ３２２ １μｇにつき約５×１
０3 〜５×１０4 個のコロニー、あるいはｃＤＮＡ１μ
ｇにつき約１０4 〜１０5 個のコロニーが生成すること
になる。又１４個のテトラサイクリン耐性コロニーから
のプラスミドの任意のスクリーニングにより測定したと
ころ、形質転換体の７８％以上が組換えプラスミドを含
有していた。 （ｃ） 形質転換細胞の保存 各培養板からのコロニーを１０ｍｌのＬＢ中にかき落し
た。推定２０００の独立した形質転換の結果生成した細
胞を集め、１，５００ｘＧで５分間遠心分離し、０．５
ｍｌのＤＭＳＯを加えた５ｍｌのＬＢ（ｖ／ｖ）中へ再
けん濁した。この一部（０．４ｍｌ）を液体窒素中で凍
結し、次に使用するまで−７０℃で保存した。こうし
て、この様な５個のプールを作成した。
【００５６】各原形質転換体はｍＲＮＡ画分中にあるｍ
ＲＮＡ種の１個の完全又は部分コピー由来の１個の組換
えＤＮＡ種を含有しているので、これら形質転換体の集
合体すなわちプールはライブラリーと呼ばれる。本例の
場合、ウシ顆粒層細胞ｃＤＮＡのライブラリーがＥ．コ
リ中に形成されたことになる。真核細胞は約１×１０4
〜２×１０4 の別種のたん白質を生成することができる
ので、１０4 個の独立の形質転換体の集合体はそれ以上
の多数のｍＲＮＡ種の全部に由来したものを含むことに
なる。事実、これらのライブラリー中の極めて大量の細
胞の大部分は本発明には不用のｃＤＮＡを含有してお
り、その内のわずかのものがインヒビンｍＲＮＡ種の完
全又は部分コピーを含有しているので、これらのコロニ
ーを同定し単離するために次の工程を行う。 実施例４ インヒビンクローンライブラリーのスクリーニング （ａ） スクリーニング用ライブラリーの調製 冷凍細胞のチューブを解凍し５×１０5 倍に希釈しその
０．５ｍｌを１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン−ＨＣ
ｌを含有する２８０ｍｍのＬＢ寒天板の表面上に広げ、
１晩３７℃で培養した。こうして１培養板あたり約１０
4 個のコロニーが生成し、原ライブラリー中の各形質転
換体は１〜５倍に増加した。転写レプリカをニトロセル
ロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅ
ｌｌ）上に置き、墨につけた針をフィルターを通して寒
天中に突き刺すことによって定位マークをつけた。母培
養板を次に使用するまで４℃に保存し、一方レプリカフ
ィルターを１０μｇ／ｍｌのケトラサイクリン−ＨＣｌ
を含有する新しいＬＢ寒天板の上にかぶせて８時間培養
した。次でこれを５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー
ルを含有するＬＢ寒天板上に転写し、組換えプラスミド
の細胞１個あたりのコピー数を増加させるために１晩培
養した（Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｅ．（１９７２年）の
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１０；６６７−６７６；Ｈ
ａｎａｈａｎ，ＤおよびＭｅｓｅｌｓｏｎ，Ｍ（１９８
０年）のＧｅｎｅ １０，６３−６７）。このフィルタ
ーをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ，ＭおよびＨｏｇｎｅｓｓ，
Ｄ．Ｓ．らの方法（１９７５年、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，
Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ ７２，３９６１−３９６
５）の変法で処理した。
【００５７】細胞分解と一本鎖ＤＮＡの形成促進のため
に、このフィルターを、０．５ＭＮａＯＨ／１．５Ｍ
ＮａＣｌ中で飽和したワットマン３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａ
ｎ３ＭＭ）紙上に１５分間かぶせて置き、次いで１．５
Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
中で飽和した紙を２回交換して１５分間中和した。これ
らを空気乾燥し、ブワナーろう斗の上に置き、次いで２
０ｍｌのＣＨＣｌ3 で飽和して吸引した。次いでフィル
ターを８０℃で２時間真空オーブン中で焼いた。 （ｂ） 方法 インヒビンｃＤＮＡ遺伝子又はその１部を含有するクロ
ーンを同定するために、放射能標識したオリゴデオキシ
リボヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）プローブを使
用した。これらは、各４３ｋＤおよび１５ｋＤサブユニ
ットのＮ末端アミノ酸配列をコードするｍＲＮＡの部分
に相補性がある様にしたものである（プローブ１および
５、図３）。４３ｋＤおよび１５ｋＤサブユニットのＮ
Ｈ2 末端配列は、完全５８ｋＤインヒビンおよびその単
離サブユニットの配列のアミノ酸由来のものであり、そ
れぞれの最初の１６個のアミノ酸は国際特許出願ＰＣＴ
／ＡＵ ８５／００１１９に記載してある。次いで、完
全５８ｋＤインヒビンのミノ酸配列から４３ｋＤサブユ
ニットのアミノ酸配列（これはｐＢＴＡ２２およびｐＢ
ＴＡ２３中の配列のｃＤＮＡによって決定されたもので
ある一実施例６Ａ参照）を除去することにより、表２に
示した１５ｋＤサブユニット原分析を改良し拡大するこ
とが出来た。この改良によりオリゴヌクレオチドプロー
ブの作成に有用な別の区域、２０〜２４個を含めてのア
ミノ酸の区域が明らかとなった。図３は作成したオリゴ
ヌクレオチドプローブ（プローブ２）を示す。これは２
４倍変性の１４量体であり、ｐＢＴＡ２９３およびｐＢ
ＴＡ２９４の単離用に使用した。各アミノ酸（メチオニ
ンとトリプトファンを除く）はそれに特異性のある１個
より多くのＤＮＡコドンを有しているので、プローブ中
には可能なすべての組合わせのコドンを入っていること
が好ましい。こうして、インヒビンの大サブユニット用
に選択したアミノ酸配列の大部分をコードする６４個の
可能なＤＮＡ配列（プローブ１、図３）とインヒビンの
小サブユニット用選択したアミノ酸配列の大部分をコー
ドする２４個の可能なＤＮＡ配列（プローブ２、図３）
がある。これら配列の各々の代表的な分子を得る可能性
を最大とするために、５′末端から２および６位置にお
いて、ｄＧおよびｄＡ又はｄＴおよびｄＡ又はｄＧおよ
びｄＧ又はｄＴおよびｄＧのどちらかを有する４個の独
立の合成体から集めた。プローブ２は単一バッチ中で合
成した。 （ｃ） オリゴヌクレオチドの合成および精製 オリゴヌクレオチドプローブはＤＮＡ自動合成装置（モ
デル３８０Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｉｎｃ．製）を使用して合成した。この装置は、最初
にＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｌｈｅ
ｒｅ，Ｍ．Ｈ．により開発された方法（１９８１年、
Ｊ．Ａｍｅｒ，Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ，１０３，３１８５−
３１９１）に従って、Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルホスホ
ルアミジトデオキシリボヌクレオチド誘導体を派生制御
多孔性ガラス支持体に配列に従って結合する様に入力し
ておいた。
【００５８】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｉｎｃ．社処方の方法を使用した。ホスホルアミジトデ
オキシリボヌクレオチドを単一派生塩基で置き換えて、
変性オリゴヌクレオチドを生成した。２０％（ｗ／ｖ）
アクリルアミド／１．０％（ｗ／ｖ）Ｎ，Ｎ′−ビスア
クリルアミド／１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（固体ほう酸でｐＨ８．３に調整）を含有するゲル
（２０ｃｍ×２０ｃｍ×１．５ｍｍ）中の調製用電気泳
動により、早期に停止したオリゴヌクレオチドからこの
オリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動は５００Ｖで
１．５時間行い、次でＵＶ光で検出可能な様にこのゲル
をキーゼルゲルＦ２５４（Ｍｅｒｅｋ）薄層クロマトグ
ラフィー上に置いて可視化した。オリゴヌクレオチドは
暗バンドを示す。これらを切り取り、０．８ｍｌの無菌
水中で１晩ゲルから溶出した。溶出オリゴヌクレオチド
の濃度は２６０ｎｍの吸光度の測定により推定され、こ
れは１ｃｍの光路長を使用してのＡ260 が１．０である
ことから、３５μｇ／ｍｌ濃度の一本鎖ＤＮＡである。 （ｄ） ５′末端標識反応32 Ｐ−標識りん酸塩基をその５′末端に付加することに
より、精製オリゴヌクレオチドを放射能活性にした。
【００５９】すなわち、４０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオ
チドと４０ｐｍｏｌのγ−32Ｐ ＡＴＰ（２０００Ｃｉ
／ｍｍｏｌ；５μＣｉ／μｌ）を凍結乾燥し次で溶解し
そして４単位のＴ4 ポリヌクレオチドキナーゼ／１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ2 ／１０ｍＭのＤＴＴ／１ｍＭのスペルミ
ジン／５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有
する緩衝液の２０μｌ中で９０分間３７℃で培養した。
【００６０】放射性オリゴヌクレオチドを上記の様にし
て精製しそして富士ＲＸ型Ｘ−線フィルム上で５分間オ
ートラジオグラフィーにより可視化した。１．８ｍｌの
無菌水中で１晩溶出した。プローブ１も一緒に含む４個
のオリゴヌクレオチド集合体（実施例１ｂ参照）の各々
をこの段階では別々に処理し次いでこれらを一緒にし
た。
【００６１】
【表２】
【００６２】５８ＫＤインヒビンを還元し、アルキル化
しそして分離したサブユニットをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
からの電気溶出により単離した。５８ＫＤインヒビン
（８０ｐｍｏｌ）、Ａサブユニット（１７ｐｍｏｌ）お
よびＢサブユニット（６ｐｍｏｌ）をガス連続相中でエ
ドマン分解した。 （Ｘａａ）＝ｃＤＮＡ配列から決定したアミノ酸。
【００６３】Ｘａａ* ＝５８ＫＤインヒビンの２重配列
からＡサブユニット配列を除去することにより同定した
アミノ酸。 オリゴヌクレオチドプローブ型を作るのに使った領域に
下線を付した。 （ｅ） ライブラリーのスクリーニングのためのプロー
ブの使用 放射性プローブの各組を４０ｍｌの５×ＳＳＣ／１０×
デンハルト溶液中にとり、各ライブラリーの代表的な１
つのフィルターを、ゆっくり攪拌しながら１晩この溶液
中に浸した。（尚、２０×ＳＳＣは３ＭのＮａＣｌ／
０．３Ｍのクエン酸トリナトリウム（ｐＨ７．０）であ
り、５０×デンハルト溶液は１％（ｗ／ｖ）フイコール
／１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン／１％（ｗ／
ｖ）ウシ血清アルブミンである。）フィルターを１×Ｓ
ＳＣ／０．１％ＳＤＳ（トデシル硫酸ナトリウム）で数
回室温下に洗浄し富士ＲＸ型Ｘ線フィルムおよびデュポ
ンＣｒｏｎｅｘ Ｈｉ Ｐｌｕｓ強化スクリーンを使用
して−７０℃で３〜５時間オートラジオグラフィー処理
した。フィルムを現像し、フィルターを再度１×ＳＳＣ
／０．１％ＳＤＳで３７℃で洗浄し次いで１晩オートラ
ジオグラフィーに付した。
【００６４】室温における洗浄後に背景部よりも強度が
強いかあるいは３７℃における洗浄後に尚可視状態であ
り、かつ母培養板上のコロニーの位置に相当する区域が
潜在インヒビンクローンであるとみなされた。上記実施
例はインヒビン又はインヒビン様ＤＮＡ配列を含有する
細胞の製造手段および方法のいくつかを例示したもので
あって、その変法を除外するものではない。例えば、出
発ＤＮＡとしてゲノムＤＮＡを使用しｃＤＮＡ合成を必
要としない場合もある（実施例８参照）。又、クローン
化ＤＮＡ断片を発現させそして抗インヒビン抗血清を使
用し（実施例１０参照）あるいはインヒビン又はインヒ
ビン様生物学的活性を直接検出することによりスクリー
ニング操作を行う様なクローニングベクターであっても
良い。この様な方法は当業者に周知である。 実施例５ 推定クローンの特定 （ａ） 潜在インヒビンクローンの精製 オートラジオグラムによる暗色スポットに相当する区域
を拾い出し、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン−ＨＣ
ｌを含有するＬＢ板上で単一コロニーの筋をつけ３７℃
で１６時間培養した。これら培養板のレプリカは次に使
用するまで４℃に保存した。フィルターをテトラサイク
リン−ＨＣｌ含有ＬＢ寒天上に３〜６時間置き、５０μ
ｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天に１６時
間転写し、次でコロニーを上記の様にして分解し、再度
放射性オリゴヌクレオチドプローブを使用してスクリー
ニングした。これらのフィルターからオートダイアグラ
ム上の最暗色スポットに相当する単一コロニーを拾い出
しこれに筋付けをして分析した。 （ｂ） プラスミドＤＮＡの制限地図 各推定インヒビンの少くとも１個の単離体のプラスミド
ＤＮＡ含有量を、制限酵素ＰｓｔＩで抽出および消化す
ることにより分析した。この酵素はプラスミドから挿入
ｃＤＮＡを放出しそして更に内部ＰｓｔＩ部位において
該ｃＤＮＡを切断する。プラスミドＤＮＡ抽出はＢｉｒ
ｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法（１９７９年，Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７；１５１３−１５２３）に
従った。３ｍｌのＬＢ中で１晩培養した細胞を遠心分離
し０．２ｍｌの分解緩衝液（５０ｍＭ グルコース／１
０ｍＭ ＥＤＴＡ／０．２％リゾチーム／２５ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中に再けん濁しそして０℃で
１０分間培養した。これに０．４ｍｌのアルカリ性ＳＤ
Ｓ（０．２Ｍ ＮａＯＨ／１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を加
え、そして０℃で１０分間保持後に０．３ｍｌの３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を加えた。０℃で１５〜３
０分後に、生成した沈でん物を遠心分離により除去し
た。０．７ｍｌのイソプロパノールを加え、−７０℃に
冷却しそして１５，０００ｘＧで５分間遠心分離するこ
とにより０．８ｍｌの上ずみ液中のプラスミドを析出さ
せた。このペレットを０．４ｍｌのＴＥ中に再溶解し、
次いで４０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．５）と
０．８ｍｌのエタノールとを加えそして上記の様にして
冷却し遠心分離することにより沈でんを析出させた。最
終的に得られたペレットを真空乾燥して０．２ｍｌのＴ
Ｅ中に溶解した。１０μｇ／ｍｌのＲＮＡアーゼＡを含
有する４０μｌ（最終容量）のＴＡ緩衝液（６６ｍＭ酢
酸カリウム／１０ｍＭ酢酸マグネシウム／０．５ｍＭＤ
ＴＴ／０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ／３３ｍＭトリス・酢酸
塩（ｐＨ７．９）中、３７℃で６０分間試料（２０μ
ｌ）を２０単位のＰｓｔＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で
消化し、次いでＴＢＥ緩衝液（２．５ｍＭ ＥＤＴＡ／
１３３ｍＭトリス−ＨＣｌ／８９ｍＭほう酸）中でポリ
アクリルアミドゲル（１０％までのアクリルアミド／
０．２７％ビスアクリルアミド）上で電気泳動した。Ａ
ｌｕＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で消化したｐＢＲ３２
２の試料を標準体として使用した。最初に同定されたク
ローンを表３に示した。 （ｃ） 配列決定法 適当な制限酵素断片（１個又はそれ以上の酵素Ｐｓｔ
Ｉ、ＰｖｕＩＩ、Ｓｅｕ３ＡＩ又はＳｍａＩ由来のも
の）を０．５Ｍ酢酸アンモニウム／１０ｍＭ酢酸マグネ
シウム／０．１Ｍ ＥＤＴＡ／０．１％ ＳＤＳ中、３
７℃で１晩溶出することによりポリアクリルアミドゲル
から精製し、次いでエタノールで析出させ、ＴＥ中に再
溶解し、そしてこれをサブクローニングして、万能プラ
イマー（１７量体；＃１２１１又は＃１２１２；Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）又はｃＤＮＡ自
身に相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマーを使用
するＳａｎｇｅｒ Ｆ、等のジデオキシ鎖末端法（１９
７年、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ
７４，５４６３〜５４６７）により配列決定用のバク
テリオファーズＭ１３ｍｐ８およびＭ１３ｍｐ９の複製
型分子とした。前記オリゴヌクレオチドプライマーはと
りわけ重複ｃＤＮＡ種の単離や重複ｃＤＮＡ種からの公
知配列の抗張やあるいはｄＧ／ｄＣ尾部からｃＤＮＡの
中央部への配列決定に有用である。
【００６５】配列決定、サブクローニングおよび発現操
作（実施例１０参照）のすべてにわたって制限酵素はＴ
Ａ（実施例５Ｂ参照）中で使用し、Ｔ４リガーゼはその
メーカー処方に従って使用した。
【００６６】
【表３】
【００６７】（ａ） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ
ｕｅｔｒａｌｉｅ Ｐｔｙ，Ｌｔｄ．Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのコード名。 （ｂ） 「サイズ」（記載がある場合において）とは、
ＡｌｕＩで消化したｐＢＲ３２２標準体に対するポリア
クリルアミドゲル上における電気泳動から推定したｂｐ
値を表わす。この値はＤＮＡ配列から得られる実際の大
きさから少し違っている。 （ｃ） Ｍｕｒｒａｙ，Ｎ．Ｋ．等（１９７７年）、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１５０；５３−６１。 （ｄ） Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｆ等（１９７７年）のＧｅｎ
ｅ ２；９５−１１３。 （ｅ） ＢＴＡ６４７＝Ｅ，コリ Ｋ１２，ｈｅｄ Ｒ
K ，ｓｕｐ Ｅ４４，ｓｕｐＦ５８，ｌａｃＹ１，ｇａ
ｌＴ２２，ｇａｌＫ２，ｔｒｐＲ５５／Ｆ′ｌａｃ
ｌq ，Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５，ｌａｃＹ+ Ａ+ ，ｐｒｏ
Ａ+ Ｂ+ ，ｔｒａ+ 。 （ｆ） Ｒｕｔｈｅｒ，ＵおよびＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌ
ｌ，Ｂ，（１９８３年）のＥＭＢＯ Ｊ，２；１７９１
−１７９４。 （ｇ） ＢＴＡ６３４＝Ｅ，コリ Ｋ１２ Δ（ｌａ
ｃ，ｐｒｏ），ｓｕｐ Ｅ（ｇｌｎＶ），ｔｈｉ，ｌｏ
ｎ−１，ｚａｊ：：Ｔｎ５／Ｆ′ｐｒｏＡ+ Ｂ+ ，ｌａ
ｃＩq ，Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５，ｌａｃＹ+ Ａ+ ，ｔｒ
ａＤ３６。 （ｈ） ｐＢＴＡ２８６は、２３５５個の塩基対のＨｐ
ａＩ−ＡｖａＩ ＤＮＡ断片がｌａｃＺ遺伝子のコード
配列から除去されてそのコード配列が枠内に残るように
したｐＵＲ２９１の誘導体である。 （ｌ） ＢＴＡ６５２−Ｅ，コリＫ１２ Δ（（ｌａ
ｃ，ｐｒｏ），ｔｈｉ- ，ｓｕｐＥ（ｇｌｎＶ）４４，
ｈｓｄＰｋ１７ ｅｎｄＡｌ，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｌＡ
ｌ／Ｆ′，ｐｒｏＡ+ Ｂ+ ，ｌａｃＩq ，Δ（ｌａｃ
Ｚ）Ｍ１５，ｌａｃＹ+ Ａ+ ，ｔｒａＤ３６。 （ｊ） Ｖｉｅｒａ，Ｊ，およびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｊ，
（１９８９年）のＧｅｎｅ １９，２５９−２６８。 （ｋ） ＢＴＡ５４５＝Ｅ，コリＫ１２ ｔｒｉ- ，Δ
（ｌａｃ，ｅｒｇＦ），Ｕ１６９，Δ（ｌｏｎ）１０
０，ｈｆ１１５０，ｚｊｅ／ｚｊｆ：：Ｔｎ１０，ｒｐ
ｓＬ，ｈｓｄＰｋ／Ｆ′ｌａｃＩq ，Δ（ｌａｃＺ）Ｍ
１５，ｌａｃＹ+ Ａ+ ，ｐｒｏＡ+ Ｂ+ ，ｔｒａ+ 。 （ｌ） ＢＴＡ６３７＝ＢＴＡ６５２，ｌｏｎ−１，ｚ
ａｊ；；Ｔｎ５，Ｌ（ｍ）Ｃｅｐｋｏ ｅｔ ａｌ（１
９８４）Ｃｅｌｌ ３７，１０５３−１０６２。 実施例６ インヒビンクローン （ａ） Ａ（４３ｋＤ）サブユニットクローン ４３−ｋＤサブユニットの部分をコードする２個のプラ
スミドｐＢＴＡ２２およびｐＢＴＡ２３を、プローブ１
（図３） 使用して最初に作った。これらのｃＤＮＡの
配列分析の結果これらは充分な長さではなかったので、
ｐＢＴＡ２２（プローブ３）からの５′位およびｐＢＴ
Ａ２３（プローブ４）からの３′位に伸びるｃＤＮＡを
単離するために特異性オリゴヌクレオチドプローブを作
った。ｐＢＴＡ２９０はプローブ３を使用して単離し、
一方ｐＢＴＡ３０とｐＢＴＡ２９５はプローブ４を使用
して単離した。
【００６８】ＰｓｔＩ地図およびプラスミドから挿入ｃ
ＤＮＡの配列決定の方法を図４に示し、Ａサブユニット
をコードする複合ヌクレオチド配列を図５に示した。こ
の配列はプラスミドｐＢＴＡ２９０とｐＢＴＡ２９５か
らのｃＤＮＡ中に完全に含まれる。ｐＢＴＡ３０の４１
０ｂｐ断片は停止コドンと、その次の、ｄＧ／ｄＣ尾部
の前の３′−非翻訳区域の６塩基とを含む。Ａサブユニ
ットのＨｉｅｌをコードするＣＡＴはｐＢＴＡ２２，ｐ
ＢＴＡ２３およびｐＢＴＡ２９０の５′−ＰｓｔＩ，ｃ
ＤＮＡ断片中に存在するが、ｐＢＴＡ３０の２４０又は
３００塩基対ＰｓｔＩ ｃＤＮＡ断片のどちらかの中に
は存在しない。これら２つの断片は他のクローンと同様
に開放読み枠又は配列を含有しないので、スプライシン
グしていないイントロンの部分中に存在していても良
い。
【００６９】ｃＤＮＡ配列は１〜１１４０番目の塩基の
開放読み枠を含有している。この読み枠においては、第
１のＡＴＧは６１番目塩基（Ｍｅｔ−６０）にありそし
てＭｅｔ−６０に続くアミノ酸配列がシグナルペプチド
を表わすものであるが、多くのシグナルペプチドと異な
って、疎水性ロイシンのストリングの前にはアルギニン
又はリジンはない（Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｅ．（１９
８４年）のＮｕｃｌ，Ａｃ．Ｒｅｓ．１２，５１４５−
５１６４）。このシグナルペプチドは、Ｈｉｓ−１の前
の約４０個ほどのアミノ酸のプロペプチドを残してＧｌ
ｙ−４４とＧｌｙ−４１の間で終るものと思われる。こ
うして、インヒビンのＡサブユニットは最初に、Ｍｅｔ
−６０からＩｌｅ−３００に伸びる３８，８１０ダルト
ンのプレプロたん白質として合成される。
【００７０】Ａサブユニットは、たん白質前駆体のたん
白質分解用の共通シグナルである、アルギニン残基対
（−２，−１）における切断によってその前駆体から得
られる（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｆ等（１９８０年）のＡ
ｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３４３，１−１
６）。このＡサブユニットプロたん白質は、−６、−
５、８、９および１６５、１６６位に３個の別のアルギ
ニン残基対を含有している。Ａサブユニットの１６５お
よび１６６残基における切断により、本文中ＡN および
ＡC として示す同サイズの２個の切断が生成するであろ
う。ＡC 断片は３１−ｋＤａウシインヒビンの２０−ｋ
Ｄａサブユニットから成る（実施例９参照）。Ａサブユ
ニットは１１個のシステイン残基を含有するものと思わ
れ、その内の４個はＨｉｓｌからＡｒｇ１６６までのＡ
N 断片中にある。これら４個の残基は内部結合してお
り、ＡC サブユニットからＡN 断片を除去することを可
能にしていると思われる。ＡC サブユニットは７個のシ
ステインを含有しており、その内の少くとも１個はＢサ
ブユニットとジスルフイド結合を形成するものと思われ
る。サブユニットＡはその認識配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
／Ｔｈｒに基づきＡｓｎ８０およびＡｓｎ２０２に２個
の潜在Ｎ−グリコシル化部位を有しており（Ｗｏｇｈ，
Ｐ．Ｖ．およびＢａｈｌ，Ｏ．Ｐ．（１９８１年）のＣ
ＲＣ Ｃｒｉｔ，Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０，３０
７−３７７）、そしてＡｓｎ２０２がＡC サブユニット
中に含まれる。サブユニットＡおよびＡC のたん白質鎖
の予想分子量は３２，２９８および１４，６２４であ
り、これは天然インヒビンのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより推
定されるもの（それぞれ４３−ｋＤおよび２０−ｋＤ）
よりも約２５％少ない。これは幾分、その分子重量およ
び分子容量が両方とも変化可能であるものと分子中の炭
水化物含有量に起因するものであると思われる。これら
の違いから、ＡN およびＡC の両部分とも、たぶんＡｓ
ｎ８０およびＡｓｎ２０２においてグリコシル化されて
いると思われるが、セリンおよびスレオニン残基のＯ−
結合グルコシル化があるかどうかについては不明であ
る。糖たん白質ホルモンのウシＬＨ、ヒトＣＧおよびＰ
ＭＳＧの炭水化物含量はそれぞれ１６，２９−３１およ
び４５重量％であるとされている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｊ．
ＧおよびＰｏｒｓｏｎ，Ｔ．Ｆ．（１９８１年）のＡｎ
ｎ，Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，５０；４６５−４９５）
ので、本発明においてはこれが見かけ分子重量の約２５
％であることからその範囲の下限になることになる。
【００７１】ｃＤＮＡ配列から４２塩基のｍＲＮＡ中の
３′−非翻訳領域が予測出来る。これはポリ（Ａ）尾部
の前の典型的なポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡ
Ａ）１６塩基を含む（Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９８
３年）のＡｎｎ，Ｒｅｖ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，５２，４４
１−４６６）。その３′−非翻訳領域は、コード配列
（６６．３％Ｇ＋Ｃ）および５′−非翻訳領域（７１．
６％Ｇ＋Ｃ）と異なり、Ａ＋Ｔが多い（４０．４％Ｇ＋
Ｃ）。 （ｂ） Ｂ（１５ｋＤ）サブユニットクローン ５個の異なるクローンをプローブ２で検出し、その代表
的な２つ（ｐＢＴＡ２９３およびｐＢＴＡ２９４）から
成熟ＢサブユニットをコードするｃＤＮＡを図４に示し
た。他の３つのクローンは、ｐＢＴＡ２９３と同様の制
限型を有しているが、但しその５′−ＰｓｔＩ断片がよ
り短いものであるｃＤＮＡを含有していた。
【００７２】ＢサブユニットｃＤＮＡ（図７〜８）のヌ
クレオチド配列はｐＢＴＡ２９３およびｐＢＴＡ２９４
配列に原初的に由来するものであり、また、プローブ６
（図３Ｂ）を用いてｐＢＴＡ３０６ｐＢＴＡ３０７（図
２４）のそれに重ね合うｃＤＮＡが得られた。Ｂサブユ
ニットは、４２５アミノ酸（図２５）からなるプレ−プ
ロ蛋白質として合成されるが、Ａｃサブユニットと同様
に、その各プロ蛋白質のＣ末端である。これは５個の連
続するアルキニン残基だけその前節から分離される。こ
れはＢ、１４および１０２、１０３位に２対のリジン残
基を含有しているが、反応部位はありそうにもない（Ｓ
ｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．等（１９８０年）の上記文
献）。９個のシステイン残基があり、そして奇数はその
少なくとも１つがＡｃサブユニットと架橋可能であるこ
とを示している。このｃＤＮＡ配列から、Ｂサブユニッ
トのたん白質鎖は１２，９７７ダルトンの分子量を有す
ることが予想され、これは生素のＢサブユニットのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥから予測される見かけ分子量１４，９００
に近い。成熟Ｂサブユニット中にははっきりしたＮ−グ
リコシル化配列はないが、そのプレプロ蛋白質中のＡｓ
ｎ−１４５はグリコシル化可能である。
【００７３】シグナルペプチドの長さは確実には分から
ないが、Ｇｌｙ−２８２がシグナルペプチドの最後のア
ミノ酸であると考えられる。これらペプチドの生理活性
能力を示すプロー蛋白質には、可能な蛋白質加水分解開
裂部位が幾つかある。Ｂサブユニットの３′−非翻訳領
域は９４ヌクレオチドの長さであり、Ａサブユニットを
コードするｃＤＮＡの様なＡＡＴＡＡＡポリアデニル化
シグナルはない。ポリ（Ａ）尾部の前の３′−非翻訳領
域の最後の１２塩基は、同様にＡＡＴＡＡＡ配列を有し
ていないエリスロポイエチン３′−非翻訳ｃＤＮＡ（Ａ
ＣＴＧＡＡＡＣＣＡＣＣ）の最後の１２塩基と良く調和
する（Ｊａｃｏｂｓ，Ｋ．等（１９８５年）のＮａｔｕ
ｒｅ，３１３，８０６−８１０）。Ｂサブユニットの
５′−非翻訳領のＧ＋Ｃ含有量は５０％であるが、プレ
プロＢサブユニットコード領域のＧ＋Ｃ含有量は５６．
８％でありそして３′−非翻訳領域のそれと同じ位（５
５．３％）であり、これはＡサブユニットコード配列お
よび３′−非翻訳領域においてみられた違いとは異なっ
ている。 実施例７ ゲノムＤＮＡ中のウシインヒビン様配列の同定 ウシインヒビンの大（４３ｋＤ）および小（１５ｋＤ）
サブユニットをコードする遺伝子と同様か又は相同の配
列を、ヒト、ヒツジ、ブタ、魚およびトリゲノムＤＮＡ
中で同定した。
【００７４】これは主としてＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏ
ｔ標準交雑法（ＭａｎｉａｔｉｓＴ．等（１９８２年）
のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ）に従って行った。なわ
ち、ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、得られた断片を
アガロースゲルの電気泳動によりその大きさ別に分け
る。ＤＮＡをニトロセルロース（又は他のものでも良
い）膜上に転写し、次いでこれを、４３ｋＤ又は１５ｋ
Ｄウシインヒビンサブユニットの実質的な部分をコード
する〔32Ｐ〕−標識 ｃＤＮＡで調べる。この結果、ヌ
クレオチド配列と類似か又は同一のゲノムＤＮＡ段片が
検出される。
【００７５】具体的には次の様である。ゲノムＤＮＡを
ヒトマイクロファージ細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １５３９）からか、又はヒト血液、ブタ血液および
トリ血液からか、又はウシおよびヒツジ軟組織から作成
した。軟組織およびヒト細胞系からの作成にはｍａｎｉ
ａｔｉｓ，Ｔ．等の前記文献等に記載の方法を使用し
た。血液からはＤＮＡは次の様にして作成した。１０〜
１５ｍｌの血液（０．６２５％のクエン酸塩添加）を１
０ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）（ＴＥ１０−１０）の冷溶液で４０ｍｌに希釈し、
氷上に５分間置いて血液細胞を分解した。４０００ｘＧ
で５分間遠心分離した後に、ペレットを１０ｍｌの冷Ｔ
Ｅ１０−１０液中に再けん濁し、ＴＥ１０−１０で４０
ｍｌに希釈しそして３０００×Ｇで５分間遠心分離し
た。このペレットを１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）／５ｍＭ ＥＤＴＡ（出発血液と同容量）中で解こ
うした。１０％ＳＤＳを加えて０．５％にし、プロティ
ナーゼＫを加えて５０μｇ／ｍｌにし、次いでこの混合
物をゆっくり振とうしながら１晩３７℃で培養した。
０．１％８−ヒドロキシキノリンを含有する０．１ｍＭ
トリス−ＨＣｌで飽和したフェノールの１０ｍｌを加え
て室温で５〜１０分間ゆっくりと混合した。ＣＨＣ
ｌ3 ：イソアシルアルコール（２４：１）の１０ｍｌを
加えて５〜１０分間混合し、次いで室温で１０分間８０
００×Ｇで遠心分離した。水相を１５ｍｌのＣＨＣ
Ｈ3 ：イソアシルアルコールで更に２回再抽出した。１
／２０倍量の５Ｍ ＮａＣｌと２倍量のエタノールとを
室温で加えて混合した。ＤＮＡをパスツールピベットで
取り出し、３０−６０秒間空気乾燥し、そして３時間３
７℃でゆっくり攪拌することによって４ｍｌのＴＥ中に
溶解した。このＤＮＡを上記の様にして再析出させそし
て３ｍｌのＴＥ中に再溶解した。
【００７６】このＤＮＡの試料（普通１０μｇ）を、５
００単位／ｍｌまでの酵素を使用し１６時間培養して、
４０〜５０μｇ／ｍｌの濃度でそのメーカー指示の処方
に従って、種々の制限酵素で切断した。生成物を、等量
のフェノールで抽出し次いでクロロホルムで３回抽出し
て２．５倍量のエタノール含有０．２Ｍ ＮａＣｌ中で
析出することによってたん白質の除去を行った。ＤＮＡ
ペレットを水中に溶解しそしてＴＡＥ緩衝液中１１×１
４ｃｍの１％アガロースゲル上の電気泳動（７５ボルト
／４時間）によりサイズ分画した。このゲルを１．５Ｍ
ＮａＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨの溶液中に４５分間浸
漬し次いで３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍトリス・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７）中で２×４５分間中和することによってＤ
ＮＡを変性した。このＤＮＡを毛管作用によりニトロセ
ルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ）
に転写し、真空中８０℃で２時間加熱して固定した。フ
ィルターを５０％ホルムアミドと５倍のＳＳＰＥ（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ等の前記文献）と５倍のデンハルト（Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ）と２５μｇ／ｍｌの音波処理したにしん
精子ＤＮＡとから成る溶液で２−４時間前交雑した。
【００７７】交雑プローブは次の通りである。 （ａ） ｐＢＴＡ２３のＡサブユニットｃＤＮＡ遺伝子
からの７９０ｂｐ Ｓｐｈ Ｉ・Ｓｍａ Ｉ断片（図５
〜６）。 （ｂ） ウシＢサブユニットクローンｐＢＴＡ２９３か
ら得た１１０９ｂｐのＳｐｈ Ｉ・ＥｃｏＲＩ断片（図
４）。これは３６１〜７１８位の塩基のＢサブユニット
ｃＤＮＡ（図７〜８）ならびにｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ
からＥｃｏＲＩ部位の７５１ｂｐの断片を含有してい
る。
【００７８】これらの断片を、電気泳動後に、低ゲル化
温度のアガロースゲルから単離し次いでＦｅｉｎｂｅｒ
ｇ，Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂの方法
（１９８４年、Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３７，２
６６−２６７）によってα−32ＰｄＡＴＰで標識した。
約３０ｎｇのＤＮＡを、ＤＮＡ１μｇにつき２×１０8
〜１０9 カウント／分（ＣＰＭ）の特異活性を有する様
に標識し、そして１００℃に加熱後、３〜４×１０6 Ｃ
ＰＭのプローブを１倍のデンハルト／５０％のホルムア
ミド／５倍のＳＳＰＥ／１倍のデンハルト／１０％の硫
酸デキストラン／２５μｇ／ｍｌの音波処理したにしん
精製ＤＮＡから成る溶液と混合した。フィルターの交雑
は４２℃で２０時間行った。フィルターを室温で２倍の
ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳですすぎ、次いで各２倍
のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ次に１倍のＳＳＣ／０．１
％のＳＤＳ次に０．２倍のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳで
順に３０分間５０℃で洗浄した。交雑は、その交雑配列
の少なくとも７０〜７５％が全体としてウシｃＤＮＡ配
列と相同体となる様な条件下で行った。少なくとも２４
時間富士ＲＸ型Ｘ−線フィルムに露光後、交雑断片のサ
イズを、そのサイズがわかっているマーカーＤＮＡ断片
を基にして決定することができた。
【００７９】Ａ又はＢサブユニット遺伝子プローブと強
力に交雑した、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタおよびトリゲ
ノムＤＮＡの断片の大体のサイズ（塩基対における）は
次のとおりである。
【００８０】
【表４】
【００８１】実験した各種の動物種からのＤＮＡは、大
または小ウシインヒビンサブユニットｃＤＮＡプローブ
と交雑する限られた数（通常は１個であって、ＰｓｔＩ
での消化により例外的に３個まで）の断片を有してい
る。大サブユニットｃＤＮＡで調べた全部の種に共通の
約４８０ｂｐのＰｓｔＩ断片が特徴的なものであった。
これらの交雑断片は、ウシインヒビン遺伝子と類似した
又は相同的であるウシ以外の種の遺伝子中に存在するこ
とがわかる。本例において選択使用したプローブ中に含
まれないインヒビンｃＤＮＡ配列も又、表４に示した断
片中のもの以外のゲノムｃＤＮＡと交雑可能であること
を除外するものではない。
【００８２】別の実験において、ウシサブユニットｃＤ
ＮＡをプローブとして使用して、ラット卵巣からのＲＮ
Ａ中のＡおよびＢサブユニット前駆体ｍＲＮＡ種を調べ
た。これらｍＲＮＡ種は、ＰＭＳＧで処理したラットの
卵巣中に大量にあることがわかり、この結果、インヒビ
ンＤＮＡが診断用プローブとして有用であることがわか
った。
【００８３】従って、ウシＡおよびＢインヒビンサブユ
ニットをコードするｃＤＮＡは、他の種のゲノムおよび
器官中のインヒビン分子をコードするＤＮＡおよびＲＮ
Ａを同定するために使用することができる。この理由か
ら、それらのコードするインヒビン分子はウシインヒビ
ンと相当的なものであり、同様に使用することができ
る。 実施例８ ゲノムＤＮＡからヒトインヒビン様配列の単離 ウシインヒビンのＡおよびＢサブユニットをコードする
ｃＤＮＡと類似の又は相同性のあるヒトＤＮＡ配列を単
離した。これは、クローン化ＤＮＡのヒトゲノムライブ
ラリーをバクテリオファージλ中に構築し、次いでウシ
インヒビンのＡ又はＢサブユニットのどちらかをコード
するｃＤＮＡから作った〔32Ｐ〕−標識ＤＮＡ断片でそ
のバクテリオファージプラークを調べることによって行
った。陽性プラークのファージＤＮＡを単離し、制限酵
素で切断し、次にインヒビン様ＤＮＡ含有断片（これは
実施例７のプローブと方法を使用して、Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎＢｌｏｔ交雑法により決定した）をＭ１３中でサブク
ローシングしてヌクレオチド配列を決定した。
【００８４】具体的には次の通りである。ヒトゲノムラ
イブラリーを、Ｍａｎｉａｔｉｓ等の方法（前記文献）
によりバクテリオファージλＥＭＢＬ3 中で構築する
か、あるいは同様なヒトゲノムライブラリーをλし、４
７中で構築した（ Ｌｏｅｎｅｎ，Ｗ．Ａ．Ｍ．および
Ｂｒａｍｍａｒ，Ｗ．Ｊ．（１９８０年）のＧｅｎｅ，
２０，２４９−２５９）。ヒトゲノムＤＮＡ（実施例７
の様にして作った）をＳａｕ３Ａ Ｉｔｏで部分消化し
て約５〜３０ｋｂｐの長さのサイズの範囲にあるＤＮＡ
を作った。これは、ＴＥおよび１ＭのＮａＣｌの傾斜液
（Ｃｍｉｘ＝１５％、Ｃｒ＝３１．５，Ｖｍ＝３４．４
５，ａＫ＝２．１４７）を使用して、ＢｅｃｋｍａｎＳ
Ｗ５０．１型回転装置中で１２．５μｇのＤＮＡを５
０，０００ＲＰＭで２時間遠心分離する、しょ糖傾斜遠
心分離（ＭｃＣａｒｔｙ，Ｋ．Ｓ．等（１９７４年）の
Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，６１，１６５−１８３）に
よって分画したサイズである。
【００８５】この傾斜分離によって約１５〜２５ｋｂｐ
のＤＮＡを集め、エタノールを担体としてのｔＲＮＡ
０．５μｇで析出させそしてＥＭＢＬ３λａｒｍｓにラ
イゲートした。ＥＭＢＬ3 ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂ
ｉｏｔｅｃ，ＭａｄｉｓｏｎＷＩ，ＵＳＡ）を酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノールとクロロ
ホルムで脱たん白質し、そして０．３Ｍ酢酸ナトリウム
の存在下に０〜４℃で０．６倍量のイソプロパノールで
析出させた。その２．４μｇを、１０ｍＭトリス・ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ Ａ
ＴＰ、２０ｍＭジチオスレイトールおよび２単位のＴ4
ＤＮＡリガーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）から成り全量４０μｌの溶液中で１５−２５ｋｂｐ
のヒトＤＮＡの約１μｇと混合しそして１５℃で２０時
間培養した。９５μｌのパッカジーン（Ｐａｃｋａｇｅ
ｎｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、２２℃
で２時間培養した。この混合物を特別の宿主ＮＭ５３９
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ社の処方参照）に与
え、平板直径１４ｃｍにつきほぼ５０，０００個のプラ
ークの濃度とした。この反応混合物から８板の平板を作
った。
【００８６】バクテリオファージＬ４７中のヒトライブ
ラリーも同様にＮＭ５３９に与えて、同様のプラーク濃
度を得た。インヒビンｃＤＮＡプローブで調べるため
に、このプラークをＭａｎｉａｔｉｓ等の方法（１９８
２年、前出文献）によりニトロセルロースフィルター
（１枚の平板につき２つのレプリカ）に転写した。標識
プローブは次の通りである。ウシインヒビンのＡサブユ
ニットに相当する配列には、７９０ｂｐのＳｐｈＩ−Ｓ
ｍａＩ断片をλＬ４７ライブラリー用に使用し、Ａサブ
ユニットｃＤＮＡ（表３参照）を含有するｐＢＴＡ２９
７からのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＥＭＢＬ3
ライブラリー用に使用した。小サブユニット用のプロー
ブは実施例７に記載のＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片とし
た。調製、標識および交雑の条件は実施例７に記載した
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ交雑方法と同じである。第
１のプラークのスクリーニングには、１つの交雑溶液中
に両方のプローブを使用した。潜在陽性プラークを溶出
し、再度平板上に載置し、そして純粋クローンが得られ
るまでプローブで調べた。２つのクローンが特に重要で
あり、その１つはＬ４７ライブラリーから得られた大
（Ａ）サブユニットと交雑するλＡ2 であり、もう１つ
はＥＭＢＬ3 ライブラリーから得られた小（Ｂ）サブユ
ニットと交雑するλＢ1 である。このλＡ2 は約１１〜
１２ｋｂｐのヒトＤＮＡが挿入してあった。ＰｓｔＩで
消化するとたくさんの断片が生成し、その内、ウシＡ遺
伝子の〔32Ｐ〕−標識ＳｐｈＩ−ＳｍａＩ断片（前記し
たもの）と交雑した３個がみられた。ＰｖｕＩＩで消化
すると同じプローブと交雑するさらに２つの断片が生成
する（表５）。
【００８７】
【表５】
【００８８】１１６０および４８０ｂｐ断片（ＰｓｔＩ
消化による）と８００ｂｐ断片（ＰｖｕＩＩ消化によ
る）とはそのサイズにおいて、実施例７に示したヒトゲ
ノムＤＮＡのＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析において
同じプローブと交雑するＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩ断片
にそれぞれ類似している。同じλＡ2 サザンブロット
（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）と、ｐＢＴＡ２９５か
らの〔32Ｐ〕−標識した５００ｂｐのＰｓｔＩ断片との
交雑によると、λＡ2 のＰｓｔＩによる消化の結果の１
１６０ｂｐ断片のみが同定された。この様な交雑パター
ンは、クローン化ヒトＤＮＡ断片がウシインヒビンＤＮ
Ａと類似か又は相同的である配列を有するという仮説に
一致するものである。λＡ2 をＰｓｔＩで消化し、次い
で低ゲル化温度のアガロースゲルから４８０，１１６０
および２５００ｂｐ断片を切り取り、Ｍ１３中でサブク
ローニングしそしてそのヌクレオチド配列を決定（実施
例５ｃ参照）した結果の配列を図９〜１０に示した。２
７５と２７６番目の塩基の間の１．４−１．５ｋｂｐの
イントロンのＤＮＡ配列は省略してある。誘導アミノ酸
配列とウシインヒビンプレ−プロＡサブユニットの配列
が類似していることから、相同たん白質であることがわ
かり、又これはヒトインヒビンＡおよびＡｃサブユニッ
トの前駆体である。ヒトインヒビンのＡN断片はＨｉｓ
ｌからＡｒｇ１７１のアミノ酸であり、Ａｃサブユニッ
トはＳｅｒ１７２からＩｌｅ３０６のアミノ酸である。
【００８９】λＢ1 クローンは約２１〜２６ｋｂｐの挿
入ＤＮＡを有している。このＤＮＡを同様に制限酵素Ｐ
ｓｔＩで切断し、１％アガロースゲル上の電気泳動でサ
イズ分画しそしてニトロセルロースフィルターに転写し
た。ｐＢＴＡ２９３から精製した１３６ｂｐ又は５１０
ｂｐのインヒビンＰｓｔＩ断片（〔32Ｐ〕−標識した）
での交雑（図４）によると、小さい方のプローブは長さ
が約１３００ｂｐ（１１００−１３５０ｂｐの範囲）の
ＤＮＡの断片に結合し、大きい方のプローブは長さが約
８００ｂｐ（７４０−８４０ｂｐの範囲）の断片に結合
した。８００ｂｐの断片の部分のヌクレオチド配列は、
λＢ1 をＰｓｔＩで消化し、約８００ｂｐのＰｓｔＩ断
片を低ゲル化温度のアガロースゲル上で精製しＭ１３ｍ
ｐ９のＰｓｔＩ部位中にクローニングし、次いでヌクレ
オチド配列を決定することによって決定された。配列決
定のために８００ｂｐ断片（ＰｓｔＩ−Ｓａｕ３ＡＩ；
Ｓａｕ３ＡＩ−Ｓａｕ３ＡＩ）の小さい方の断片とＭ１
３中にサブクローニングした結果得られたヌクレオチド
配列を図１１に示した。ＤＮＡ配列の翻訳により決定さ
れたアミノ酸配列によれば、このＤＮＡはインヒビンの
Ｂ鎖の全部をコードしそしてＧｌｙからＳｅｒ１１６の
ヒトＢ鎖はウシＢ鎖と同一である。これらλクローンか
ら決定されたヒトプレプロＢサブユニットの活性なコー
デング配列を図２６に示す。このコーディング配列は３
８８塩基間のイントロによって妨害される。
【００９０】ヒトインヒビンＤＮＡ配列を有するこれら
のλクローンの断片ならびに類似の合成断片は、真核生
物又は原核生物発現系に挿入してヒトインヒビン又はそ
の構造がインヒビンに関連したポリペプチドを生成し得
ることがわかる（実施例１０参照）。又、λクローン自
体も適当な真核細胞系にトランスフェクトして発現させ
ることが可能である。
【００９１】ウシｃＤＮＡをプローブとして使用して種
々の脊椎動物種中のインヒビンサブユニット遺伝子を検
出し（実施例７）、次いでアミノ酸配列中の広大な類似
点を明らかにするためにヒトインヒビンサブユニット遺
伝子のクローニングと配列決定を行うことにより、他の
脊椎動物インヒビンが国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５／
００１１９および図５〜８中に示したウシインヒビンた
ん白質と相同的であるかまたはそうでなければ同一であ
ることが明らかとなる。
【００９２】本発明者らは多くの脊椎動物種（例えば表
６参照）からの卵胞液や卵巣抽出物中のインヒビン活性
を検出し、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５／００１９お
よび実施例９の方法によりヒトＦＦおよびヒツジＦＦか
らの生来のインヒビンを精製し、そして両種ともにウシ
インヒビンと機能的に類似しておりかつウシ型と類似し
たサブユニット構造の５８ｋＤおよび３１ｋＤ型を有し
ている事を発見した。
【００９３】又、ウサギ、ウシおよびヒトインヒビン
は、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５／００１１９に記載
の、精製５８ｋＤウシインヒビンに対するウサギ抗血清
により中和され、かつＲＩＡ中で交差反応して再度緊密
な構造相同性を示す（表６）。しかしながら、生来のウ
シインヒビンはウサギ中での免疫応答誘発が可能である
という事実は、ウサギ免疫系によって異質物として認識
されるような、ウサギおよびウシインヒビンとの間の相
違点がある事を意味するものであり、従って、ある種か
らのインヒビンは他の種においては抗原として使用する
ことが可能でありそして内因性インヒビンを認識する抗
体が生成される。
【００９４】表６に示した全ての種が、下垂体細胞受容
体と相互作用をする構造相同性を示すラット下垂体細胞
培養物中で活性であるとしても、ウサギの生成した抗体
は、特殊なエピトープ用の抗血清の特異性を示すヒツジ
やラットインヒビンと顕著な交差反応はしいな。Ｂサブ
ユニットはほとんどの種の中に充分に存在していてかつ
多分同一のものであろうので、内因性インヒビンＢサブ
ユニットと交差反応する抗体を誘発するために突然変異
体Ｂサブユニットたん白質を抗原として使用することは
多くの種において広く可能でありかつ効果的であろうこ
とは、すでに先に述べた記載からも明らかである。この
様な抗体は、ＤＮＡの生体外突然変異形成、実施例１０
に記載の様な新しい遺伝子の発現又はＢサブユニットた
ん白質の化学変性又は図７〜８および図１１記載のもの
とは同一ではないが類似しているＢサブユニットを有す
る種からのＢサブユニット遺伝子の単離、および実施例
１０の様にしてのこの遺伝子の発現から成る様な手段に
より生成可能である。
【００９５】
【表６】
【００９６】実施例９ インヒビンの５８ｋＤ型と３１ｋＤ型との関係 インヒビンは顆粒層細胞により作られそして卵胞液中に
分泌される。すでに報告されている様に（国際特許出願
ＰＣＴ／ＡＵ／８５／００１１９）、これは最初は５８
ｋＤ型として存在する。
【００９７】ウシ卵胞液からインヒビンを精製する効率
を改良することを目的とした研究から、小さいインヒビ
ンの別の型があることが明らかにされた。Ｒｏｂｅｒｔ
ｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．等（１９８５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ，１２
６，２２０−２２６；国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８５／
００１１９）の精製方法を使用して、ｐＨ４．７５での
沈殿工程を最初の中性および酸性緩衝液ゲルろ過クロマ
トグラフィー工程の間に行った。この結果、酸性ゲルろ
過工程による最初の生成物から単離された、第２の生物
活性種が生成している事が明らかとなった。この第２の
種を逆相ＨＰＬＣおよび予備ポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付した後、見かけ分子量が２０，０００と１
５，０００の２つのサブユニットから成る、見かけ分子
量が３１，０００であってかつもとの５８ｋＤ型と同様
な生物学的活性を有するたん白質が生成していることが
わかった。これら２つのインヒビン種の小さい方のサブ
ユニットの見かけの分子量は非常に似ている（約１５ｋ
Ｄ）ことから、この２つのインヒビン種の見かけの分子
量の違いは、４３ｋＤサブユニットが約２０ｋＤに小さ
くなった事に主として起因すると思われる。
【００９８】又、純粋５８ｋＤインヒビンは、去勢ウシ
血清（ＳＳ）又はヒト閉経後血清（ＰＭＳ）中での培養
中に３１ｋＤ型に変化する。この分解はｂＦＦでの同様
の培養中には起こらない（図１２）。従って、インヒビ
ンの小さい方の（３１ｋＤ）型、特にその大きい方の
（２０ｋＤ）サブユニットは、国際特許出願ＰＣＴ／Ａ
Ｕ８５／００１１９およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄ．
Ｍ．等（１９８５年）の“Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ，Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｍ，１２６，２２０−２２
６”に記載のインヒビンの５８ｋＤ型の直接誘導体であ
り、かつ本明細書に記載のサブユニット遺伝子から誘導
可能であると考えられる。
【００９９】又、天然インヒビンを含有しない血清（Ｓ
ＳおよびＰＭＳ）は組換えインヒビン又はそのサブユニ
ットを処理するのに使用することができ、かつ確実な酵
素を血清又はこうの反応を行う細胞型から精製しそして
同様な目的に使用することができるのは明らかである。
この酵素反応はプロテアーゼ抑制剤に関して特徴的であ
る。ＳＳ又はＰＭＳの存在下に３０℃で１７時間血清を
よう素化５８ｋＤインヒビンで培養した後で、３ｍＭの
パラクロルメルクリ安息香酸塩又は１０ｍＭのＥＤＴＡ
を加えることによって５８ｋＤから３１ｋＤインヒビン
への変化は２４％から４．５％へ減少した。バシトラシ
ンおよびペプスタチンＡ（各０．３ｍＭ）は効果がなか
った。このプロテアーゼ抑制のパターンは作用酵素の特
徴であり（Ｌａｚｕｒｅ，Ｃ．等（１９８３年）のＣａ
ｕ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，６１，
５０１−５１５）であり、本反応で使用されるＡサブユ
ニット（図５〜６）中にＳｅｒ１６７の前の標準的な反
応部位（Ａｒｇ−Ａｒｇ）があるという発見とも合致す
るものである。
【０１００】血清中への放出の際のインヒビン分解によ
り２分子、すなわちインヒビンの３１ｋＤ型およびＡN
断片（大サブユニットのアオノ酸１−１６６）が生成す
る。この３１ｋＤ型は下垂体細胞によるＦＳＨの合成お
よび放出を抑制することが知られているが、又一方、１
方の又は両方の分子は生殖腺にもどりそして直接生殖腺
機能を調節することもでき、あるいはインヒビン自体又
はインヒビンの断片やその前駆体分子、例えばＡN がＦ
ＳＨの下垂体調製以外の別の生物学的機能を有している
ことでも良い。これらはウサギ６９９をペプチド１で免
疫することによりＦＳＨ力価が突然０に落ちたという事
実からもうかがえる（実施例１５参照）。
【０１０１】インヒビンの両サブユニットはプレプロ分
子として生成し、そして各サブユニットからのプロペプ
チドは細胞生長および抑制を含めてそれら自身の生物活
性を持つことができる。インヒビン自身の３１ｋＤ型は
形質転換生長因子−β（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．等（１９
８５年）のＮａｔｕｒｅ ３１６，７０１−７０５）と
高い相同性を示し、下垂体細胞によるＦＳＨ合成におけ
るすでに知られた作用に加えて、細胞調整における生来
の分子の作用を有することもうかがえる。 例１０ インヒビンｃＤＮＡの発現 （ａ） ４３ｋＤおよび２０ｋＤサブユニット クローンＢＴＡ４０５（表３）はインヒビンの大サブユ
ニットの部分をコードするｃＤＮＡを含有しているが、
これがインヒビンの部分を生成する事は期待できない。
なぜならば、そのｃＤＮＡはｄＣ尾部を有し（実施例３
ａ参照）、かつその配列中にリボース結合部位や開始Ａ
ＴＧ（ｆ．Ｍｅｔ）コドンがないからである。インヒビ
ン遺伝子の部分を発現させるためには、ｐＢＴＡ２３中
のｃＤＮＡの最大（約４８０ｂｐ）ＰｓｔＩ断片をｐＵ
Ｒ２９２のＰｓｔＩ部位中にクローニングすることによ
って融合ペプチドを作った。これを定位におくことによ
って、Ｅ．コリたん白質β−ガラクトシダーゼの大部分
とそれに続くインヒビンの４３ｋＤサブユニットの２７
〜１８３アオノ酸とから成るたん白質が生成する。プラ
スミド構成はＥ．コリＢＴＡ６４７（表３）中に形質転
換した。
【０１０２】これらクローンを同定するために、免疫学
的スクリーニング法を使用した。形質転換後、形質転換
体を選択するために、細胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンナトリウム含有ＬＢ寒天板上に３７℃で１６時間置
いた。コロニーをニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に転写し、そして墨にひた
した針を寒天から膜中に突き刺すことによって定位印を
つけた。母培養板は次にこれを使用するまで４℃で保存
し、一方Ｌプリカフィルターは、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンナトリウム含有の新しいＬＢ寒天板の上にのせ
て３時間培養した。０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）含有ＬＢ寒天上に３７℃
で２時間で融合たん白質が誘発された。フィルターを
０．２ＭＮａＯＨ／１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで飽和したワ
ットマン３ＭＭ（Ｗｈａｔｍａｎ３ＭＭ）紙のシート上
に５分間おき、次いで０．５Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）で飽和した紙の上で中和した。コロニーから放
出されたたん白質はその場でニトロセルロースに結合す
る。フィルターを、更に０．５％（ｖ／ｖ）のトウィー
ン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０，Ｓｉｇｎａ社）を含有する
ＴＳＴ（１５０ｍＭＮａＣｌ／０．０５％（ｖ／ｖ）ト
ウィーン２０／１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
中に１時間ゆっくり攪拌しながら浸漬することによっ
て、ニトロセルロース上に残っているたん白質結合部位
をブロックした。このフィルターを、ウサギ抗−ウシ５
８ｋＤインヒビン抗血清（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８
５／０００１９）を含有し、ＴＳＴで１：５０に希釈し
た溶液で室温で１晩処理し、次いで残った抗体を除去す
るためにＴＳＴ中で数回洗浄した。フィルターを、ブタ
抗ウサギ免疫グロブリン−西洋ワサビペルオキシダーゼ
共役化合物（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）をＴＳＴ中で１：２
００に希釈した溶液で室温で１時間処理し、次いでＴＳ
Ｔ中で洗浄した。最後に、これらを２０ｍＭのトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で洗浄しそして０．５ｍｇ／ｍ
ｌの４−クロルナフトール／０．０３％（ｖ／ｖ）のＨ
2 Ｏ2 ／２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含
有する溶液で着色した。
【０１０３】融合ペプチド含有コロニーは、フィルター
上において、コントロール菌株ＢＴＡ６４７（ｐＵＲ２
９２）が生長した区域よりもより強く着色した区域から
同定された。その上で誘発Ｅ．コリＢＴＡ６４７（ｐＵ
Ｒ２９２）のローンが生長しそして分解したフィルター
で、ウサギ抗インヒビン抗血清の希釈体を前培養するこ
とによって該抗血清の抗Ｅ．コリ抗体力価を減少させよ
うとする試みをしたにもかかわらず、別のコロニーが着
色した背景がいくつか見られた。
【０１０４】この様なコロニーを３つ精製し、そのプラ
スミド内容物を分析した。全部が定位にある予想された
ｃＤＮＡ断片を有するｐＵＲ２９２を含んでおり、これ
ら菌株の１つをＢＴＡ４１０としそしてそのプラスミド
をｐＢＴＡ２８とした（表３）。融合ペプチドの同定
は、たん白質をドデシル硫酸ナトリウムで変性し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によりサイズごとに分け、
次いで横向きにニトロセルロースシート上に転写すると
いう、Ｗｅｅｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法（Ｔｏｗｂｉｎ，
Ｈ．等（１９７９年）のＰｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａ
ｄ，Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．７６，４３５０−４３５４）
によって行った。ニトロセルロースは次いで、どのたん
白質バンドがインヒビン抗原決定群を含有しているか決
定するために、前記の様にして処理する。たん白質試料
は次のようにして作った。
【０１０５】ＬＢ中で３７℃に１晩培養したＢＴＡ６４
７（ｐＵＲ２９２）およびＢＴＡ４１０の培養物を新た
な培地中に１：１００に希釈し、濁度がＡ600 ＝０．４
になるまで培養し、次いでＩＰＴＧ中で０．５ｍＭにし
そして更に２時間培養してから採取した。この細胞ペレ
ットを０．１倍量の負荷緩衝液（３０％（ｗ／ｖ）しょ
糖／１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ／０．１Ｍβ−メルカプトエ
タノール／０．０１％ブロモフェノールブルー含有電気
泳動緩衝液）中に直ちに再けん濁し、次いで５分間沸と
う水浴中で加熱した。試料（１０−３０μｌ）をポリア
クリルアミドゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７
０年）のＮａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５；Ｍａ
ｔｔｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．等（１９８０）年のＥｕｒ，Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１４，６４３−６５１）に供給し、
電気泳動を、ブロモフェノールブルー色素がゲルの底部
に到達するまで行った。Ｈｏｅｆｆｅｒ Ｔｒａｎｓｂ
ｌｏｔ装置を使用して、１５６ｍＭのトリス−塩基／１
２０ｍＭのグリシン中で１時間、１アンペアで側面転写
を行った。フィルターの抗血清でのブロッキングおよび
処理は前記した通りである。ポリアクリルアミドゲルの
中のたん白質を直接可視化するために、ゲルを脱色液
（１０％（ｖ／ｖ）メタノール／５％（ｖ／ｖ）氷酢
酸）中に３０分間漬け、次いで同溶液に仕上げた０．５
％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０
で１時間着色した。ゲルを、数回脱色溶液をとり換えな
がらゆっくり攪拌して脱色し、そしてたん白質バンドを
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔおよび免疫検出により検出し
たものと比較した。株ＢＴＡ４１０は少なくとも２個の
たん白質を含有しており、これらは全細胞たん白質の約
５−１０％に当り、これらはＩＰＴＧにより誘発され、
そして抗インヒビン抗血清（図１７、トラック１０）に
より検出され、かつこれらは株ＢＴＡ６４７（ｐＵＲ２
９２）（図１７、トラック１１）中には存在しないこと
が明らかとなった。これらは生来のβ−ガラクトシダー
ゼ（１１６ｋＤ）よりも大きく（約１３０および１１７
ｋＤ）、従って、β−ガラクトシダーゼ−インヒビン融
合たん白質である。この融合たん白質の大きい方はＤＮ
Ａ分析から予想されたもの（約１３２ｋＤ）に匹敵する
ものである。
【０１０６】同様の方法で、ｐＢＴＡ３０の４１０ｂｐ
ＰｓｔＩ断片がｐＵＲ２９１中に発現した。得られたプ
ラスミドをｐＢＴＡ２９２（表３）とし、再度、融合た
ん白質が抗インヒビン抗血清（図１７、トラック９）を
使用して検出可能であった。完全サブユニットを発現さ
せるために、ｐＢＴＡ２９０とｐＢＴＡ３０からのｃＤ
ＮＡをスプライシングし、その方法を図１３に示した。
これを簡単に説明すると、まず各クローンからＳａｕ３
ＡＩ断片を精製し、これらを特異のＲｓａＩ部位で切断
しそしてライゲートしたものである。ライゲートした生
成物の混合物をＳａｕ３ＡＩで切断し、その生成物をｐ
ＵＲ２９０中にライゲートした。次いでｐＢＴＡ２９０
の５′−Ｓａｕ３ＡＩ−ＲｓａＩ断片とｐＢＴＡ３０の
３′−ＲｓａＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片の両方を含むクロー
ンを同定するために、クローンとプローブ３と４（図
３）でスクリーニングした。ｐＵＲ２９０がＡｓｐ−１
０からＩｌｅ−３００の正しい読み枠を与えるので、そ
の挿入が定位である場合にβ−ガラクトシダーゼ−イン
ヒビン融合たん白質の生産が確実となる。４８０および
４１０ｂｐ ＰｓｔＩ部位における正しい発現を、ｐＢ
ＴＡ２８とｐＢＴＡ２９２の融合生成物（実施例９参
照）を含有するカラムから単離した特異性抗体を使用す
ることによって別々にチェックすることができる。得ら
れたプラスミドをｐＢＴＡ２９６（表３）と命名した。
この完全Ａサブユニット遺伝子を又、Ｓａｕ３ＡＩ・Ｓ
ａｕ３ＡＩ断片としてｐＵＣ７のＢａｍＨＩ部位中でク
ローニングし、得られたプラスミド（ｐＢＴＡ３０２；
図１６）をＢＴＡ６５２中へ導入してＢＴＡ４２６（Ａ
ＴＣＣ６７０５７）を得た。Ｓａｕ３ＡＩ部位の配列Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏは、これがぎ酸中で可変的であるので、融
合たん白質の上流からそのインヒビン部分を切断するの
に使用することができる（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ，等（１
９８５年）のＮｕｃｌ，Ａｃ．Ｒｅｓ，１３，１１５１
−１１６２）。株ＢＴＡ４１９からのβ−ガラクトシダ
ーゼに融合した４３ｋＤサブユニットの全長（アミノ酸
Ａｓｐ−１０からＩｌｅ−３００）の発現を図１７、ト
ラック８に示した。全長β−ガラクトシダーゼ・インヒ
ビンたん白質に加えて更に、生来のβ−ガラクトシダー
ゼの分子量とほぼ同じ分子量であるより小さいサイズの
少くとも３本の別のバンドがあり、これはおそらくその
全長生成物のたん白質分解か又は転写又は翻訳の成熟前
停止によるものであろう。融合たん白質のかたまりは可
溶性である。ｐＢＴＡ２９６からインヒビンＤＮＡと側
面のβ−ガラクトシダーゼＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断断片
として切り出し、ｐＢＴＡ２８６（表３；図１７、トラ
ック４）中に挿入してｐＢＴＡ２９７（表３）を生成
し、ｐＢＴＡ２８６から短縮したβ−ガラクトシダーゼ
たん白質のＣ−末端においてインヒビンＤＮＡを発現す
るクローンを、前記したコロニー免疫交雑法により選択
した。この様なクローンを位相差顕微鏡によって調べて
みると（例えば、ＢＴＡ４２０；表３）、これらが封入
体と呼ばれる不溶性生成物としての融合たん白質を生成
しているのがわかった。この封入体は細胞中のたん白質
分解を防ぐ様な機能を有しかつ抗原生成のための精製を
非常に簡素化するものである（実施例１２および１
３）。株ＢＴＡ４２０をＡＴＣＣ６７０５４と命名し、
ＢＴＡ４２０の精製封入体からのたん白質を図１７のト
ラック３に示した。ＢＴＡ４２６中のＡサブユニットの
発現を図１７に示し、そしてこのたん白質は特に封入体
として生成される。ＢＴＡ４２０中の融合たん白質と異
なり、ＢＴＡ４２６中の最長融合たん白質は、Ｗｅｓｔ
ｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析において最も顕著でありかつ最も
反応性が高く、従ってこれはインヒビン様たん白質の産
生用の特にすぐれた宿主−ベクター系であることがわか
る。
【０１０７】前記したところから、他の制限酵素部位も
又Ａサブユニットの発現に有用であることは明らかであ
る。その第１はコドンをＨｉｓ１につなぐ特異Ｓｐｈ１
部位であり、そして、オリゴヌクレオチド リンカー
を、種々の宿主やベクター中のＡサブユニット又はＡN
断片を融合生成物として、あるいは新たなｆ−Ｍｅｔコ
ドンをＨｉｓ１をコードするＣＡＧの直前に導入するか
又はシグナルペプチドをＨｉｓ１の前に与えた様な構造
の非融合たん白質として発現させ得るように作ることも
できる。この様な構造は当業者には周知であり、その１
例を図１４〜１５に示した。
【０１０８】この発現リンカーは、Ｃｌａ１部位を使用
して、ｔｒｐプロモータープラスミド例えばｐｔｒｐＬ
Ｉ（Ｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｃ．等（１９８１年）のＮａｔｕ
ｒｅ２９１，５０３−５０６）中への挿入後に新しいＮ
−末端メチオニンを介して４３ｋＤ蛋白質またはＡN 断
片を発現させるか、あるいは、ＢａｍＨＩを使用してｐ
ＵＣ７、ｐＵＣ１３又はｐＵＲ２９０中への挿入により
β−ガラクトシダーゼ−インヒビン融合たん白質とし
て、又は、ｐＷＴ１２１（Ｔａｌｃｏｎ，Ｗ．等（１９
８０年）のＭｏｌｅｃ，Ｇｅｍ，Ｇｅｎｅｔ，１７７，
４２７−４３８）中への挿入後のｔｒｐＥ−インヒビン
融合たん白質として発現が可能であるように作られるも
のである。
【０１０９】ＡN 断片を発現するクローンの構築方法は
図２２に示した。概略的に説明すれば、ＢａｍＨＩおよ
びＳｐｈＩでｐＢＴＡ２９７を消化し、次いで図１４Ａ
の１．に記載のリンカーを挿入した。図２１に示したよ
うに、完全長Ａサブユニット遺伝子をＳａｕ３ＡＩ断片
として単離し、ＨａｅＩＩ部分消化をした。双頭のナン
センスコドンを含むストップリンカーをＨｄｅＩＩ部位
に付加した反応生成物をＢａｍＨＩで切断し、得られた
断片をｐＵＣ１３に挿入した。
【０１１０】組換えプラスミドは、アミノ酸１２８×１
３０をコード化するＨａｅＩＩ部位に及ぶオリゴヌクレ
オチドプローブＴＣＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣを用い
てスクリーニングし、小ＨａｅＩＩ断片が正しい方向に
存在することを確認する。陽性クローンを取り、これを
精製する。次いで、それら挿入部を固定するため配列決
定した。２種の各々のクローンから、一つは正しい挿入
部を含み、他の一つは異なる起源のものを含んでいた。
この正しい挿入部を精製し、ｐＵＣ１３にリクローニン
グし、次いでＥ．コリに導入され、原初的発現のための
ＢＴＡ１３６５を提供する。該分子の両端の３つの制限
部位によって、上記した他のベクターにサブクローニン
グすることができる。
【０１１１】ＢＴＡ１３６５によって製造される組換え
蛋白質は封入体として排出され、明らかにＭＷ２３．５
ｋダルトンを有し、ＢＴＡ４２６およびＢＴＡ４２７
（図１７）からの融合蛋白質と類似し、予見されるよう
に血清４７４によるウエスタンブロットで検出される。
全長プレプロＡサブユニット遺伝子の構築法を図１８〜
１９に示した。この方法は基本的には、ｐＢＴＡ２９５
からＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を単離し次いで図１４
（Ａｉｉ）に示したリンカー（りん酸化されていない）
を付加することから成り、これによりシグナルペプチド
の５′−位の最初の４つのアミノ酸（Ｍｅｔ−６０から
Ｇｌｎ−５７）を最初のＰｖｕＩＩ部位に再構築して
５′−末端にＢａｍＨＩ部位を与えることになる。リン
カー結合分子をＳｐｈＩで切断しＢａｍＨＩとＳｐｈＩ
とで切断したｐＢＴＡ２９７中へライゲートしてｐＢＴ
Ａ３０５を得る。この中間体は融合たん白質としてプレ
プロＡサブユニットを発現する。インヒビンＤＮＡ断片
をＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として又はＥｃ
ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、次の工程で使
用する。特に、このＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片はｐＵ
Ｃ９中でサブクローニングする。そのインヒビンｃＤＮ
Ａ配列は、ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片として切り出さ
れ、ベクターｐＺＩＰ ＮｅｏＳＶ（Ｘ）１（Ｃｏｐｋ
ｏ，Ｃ．Ｌ．等（１９８４年）のＣｅｌｌ，３７，１０
５３−１０６２）にリクローニングし、ｐＢＴＡ４１７
を提供する。
【０１１２】この様に５′ＰｖｕＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩお
よびＳｐｈＩ部位はすべて４３ｋＤたん白質の発現に都
合の良いリンカー部位である。７３４番塩基から出発す
るＨａｅＩＩ部位は、アルギニン１６５から出発するＡ
サブユニットのＡｃ部分の発現に好都合な部位である。
図１４（Ａｉｉｉ）に記載のＨａｅＩＩ部位リンカーの
使用により、ｐＵＲ２９０、ｐＢＴＡ２８６およびｐＵ
Ｃ１３中にβ−ガラクトシダーゼが融合生成物が発現し
ていた。これを達成するためにｐＢＴＡ３０からの所望
のＨａｅＩＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片を精製し、リンカーを
付加した。得られた構築物をＳａｕ３ＡＩで切断し、次
いでＤＮＡを、大ＤＮＡ断片を効率的に析出するが、リ
ンカーの様な小ＤＮＡ断片を充分に析出しない、イソプ
ロパノールで２回析出させた。析出したＤＮＡをＴＥ中
に再溶解し、ｐＵＲ２９０中にライゲートした。このプ
ラスミドをＢＴＡ６３４に形質転換した。得られたクロ
ーンと複写フィルター上に複写し、次いで各対の一方の
フィルターを、〔32Ｐ〕−標識ＨａｅＩＩリンカー（図
１４（Ａｉｉｉ）に示したＤＮＡ対の先端鎖）を使っ
て、又他方をプローブ４（図３を使って、実施例４のよ
うにしてスクリーニングした。両プローブから検出され
たクローンをとり出しＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析に
より発現用の試験をした。この１方のクローンを図１
７、トラック７に示し、これをＢＴＡ４２１（表３）と
命名した。インヒビンＡｃサブユニットとその側鎖のβ
−ガラクトシダーゼＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ断片
も又ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、融合たん白質とし
ての発現用のｐＢＴＡ２８６中にライゲートした。この
融合たん白質は再度不溶性であり、従って精製および分
解防止に都合が良い。この株をＢＴＡ４２２と命名した
（ＡＴＣＣ６７０５９、表３；図１７、トラック２）。
【０１１３】Ａｃサブユニットをコードする新しいＢａ
ｍＨＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片も又ｐＢＴＡ２１８から切り
出され、短鎖融合たん白質生成のためにｐＵＣ１３中に
サブクローニングされる。株ＢＴＡ４２７（ＡＴＣＣ６
７０５６；表３）はこのたん白質を封入体として生成
し、これをゲル分析（図１７、トラック１５）すると、
再度ＢＴＡ４２６と一緒になって、その最長融合たん白
質がＷｅｅｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析において再び最も顕
著でありそして最もはっきりと見られることがわかる。
これはＢＴＡ４２７がインヒビン様たん白質の産生のた
めのすぐれた宿主・ベクター結合系であることを示して
いる。ｐＵＣ１３におけるヒトＡｃサブユニット遺伝子
の発現は、ヒトゲノムＤＮＡの４３６ｂｐのＰｖｕＩＩ
−ＢａｍＨＩ断片を単離することによりなされるが、こ
の断片はλＡ２（セクション８）から誘導されるが、λ
Ａｃサブユニットのコーディング領域を含有するもので
ある。
【０１１４】ＨｇａＩ消化後、
【０１１５】
【表７】
【０１１６】を付加し、生成物をＢａｍＨＩで開裂し、
その後、ｐＵＣ１３のＢａｍＨＩ部位にライゲーション
する。プラスミド調製物はＥ．コリＢＴＡ６５２を形質
転換し、融合生成物としてｈＡｃサブユニットを発現す
るクローンを単離した。このクローンはＢＴＡ１３６７
（＝ＢＴＡ６５２＜ｐＢＴＡ４７２＞）であり、融合ベ
クターの配列を図２７に示す。この融合蛋白質と同等で
あるようなものは、ウエスタンブロットで抗血清４７４
により検出されるが、最大バンドは最も顕著である。
【０１１７】第１４〜１５および上記のリンカー１に示
した各リンカーの顕著な特徴は、ＤＮＡがＢａｍＨＩ部
位から正しく発現された時には、そのアミノ酸配列Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏが融合たん白質中に導入されている。前記し
た様に、この配列はギ酸中で易変性であり、Ａサブユニ
ットたん白質中にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列を持たないたん白
質の上流（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．等（１９８５年）のＮ
ｕｃｌ，Ａｃ．Ｒｅｅ，１３；１１５１〜１１６２）か
らインヒビンたん白質を切断するために使うことができ
る。融合たん白質から所望の配列を切断するその他の方
法も組合わせて使用することができる。例としては、プ
ロテアーゼ認識配列、例えばＸａ−因子認識配列（Ｎａ
ｇａｉ，ＫおよびＴｈｏｇｅｒｓｏｎ，Ｈ．Ｃ．（１９
８４年）のＮａｔｕｒｅ ３０９，８１０−８１２）又
はコラゲナーゼ認識配列（Ｓｅｒｍｉｎｏ，Ｊ．および
Ｂａｓｔｉａ，Ｄ（１９８４年）のＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，４６９２−４６
９６）を導入する方法である。アルギニン対残基を認識
する酵素の使用可能性については先に述べた（実施例
９）。インヒビン配列の前にその上にメチオニンを導入
することにより、臭化シアンで融合生成物を切断してβ
−ガラクトシダーゼを含有しないインヒビン断片を得る
ことができる。インヒビン配列中のメチオニン残基は、
ｃＤＮＡの生体外突然変異によって別のアミノ酸に変え
ることができ、従って、全長インヒビン様たん白質は融
合たん白質前駆体を含有しないものであろうから、これ
によりこの臭化シアン切断法の利用法が増大する。内部
メチオニン残基を変えることにより、更には、より好ま
しい抗原性又はインヒビン様作動性又は拮抗性を有する
分子とすることもできる。 （ｂ） １５ｋＤサブユニットの発現 ｐＢＴＡ２９３（図４）の５１０ｂｐ ＰｓｔＩ ｃＤ
ＮＡ断片をＰｓｔＩ部位にライゲートし、次いでこのプ
ラスミドをＥ．コリＢＴＡ６３４中に形質転換した。得
られたクローンを、最初にｐＢＴＡ２９３およびｐＢＴ
Ａ２９４（プローブ２、図３）の単離に使用した。２４
回変性した１４−量体オリゴヌクレオチドを使用してス
クリーニングして形質転換プラスミドの存在を確認し
た。次いで数個のプラスミドを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩ
を使用して地図を作り、そして定位に挿入図を有する２
つのプラスミドをポリアクリルアミドゲル上での発現用
に分析した。この１個の株をＢＴＡ４２３（表３）と命
名した。
【０１１８】ｐＢＴＡ２１３の５１０ｂｐ ＰｓｔＩ
ｃＤＮＡ断片を直接ｐＢＴＡ２８６のＰｓｔＩ部位中に
クローニングし、融合たん白質発現のためにＢＴＡ６３
４中へ形質転換した。ｐＢＴＡ２８６はｐＵＲ２９１由
来であり、従ってそのＰｓｔＩ部位を横切る読み枠の故
にこの直接クローニングが可能である。得られた株をＢ
ＴＡ４２４（ＡＴＣＣ６７０５８；表３）と命名、これ
は封入体として融合たん白質を生成する。
【０１１９】ｐＢＴＡ２９３の５１０ｂｐ ＰｓｔＩ
ｃＤＮＡ断片を同様にｐＵＣ８のＰｓｔＩ票位中にクロ
ーニングし、そして不溶性短鎖融合たん白質の発現用に
ＢＴＡ６３７中に形質転換して株ＢＴＡ１３６０（ＡＴ
ＣＣ６７０５５；表３）を作った。ＡおよびＡｃサブユ
ニットがそれぞれあるにもかかわらず、ＢＴＡ４２３、
ＢＴＡ４２４およびＢＴＡ１３６０からの融合たん白質
はいずれもウサギ抗インヒビン抗血清によっては検出さ
れなかった（図１７、トラック１、６および１６）。こ
れにより、１５ｋＤたん白質に対する抗体の準位が非常
に低いか又は０であることがわかり、従ってインヒビン
に対する免疫性に関連した生物学的作用はＡ又はＡｃサ
ブユニットの使用によってのみ達成可能であろうと思わ
れる（実施例１７〜２１も参照のこと）。
【０１２０】又、１５ｋＤ配列の発現は、１５ｋＤ配列
の全部およびアルギニン−５から−１に及びＨａｅＩＩ
断片と単離することにより、そして図１４（Ａｉｉｉ）
に示したＨａｅＩＩ部位リンカーを付加することにより
達成される。得られた融合コードは、第１１（Ｂｉ）に
示しそして上記した様に、ＢａｍＨＩ部位を使用したｐ
ＵＲ２９０／ｐＵＣ７／ｐＵＣ１３中のβ−ガラクトシ
ダーゼ融合の発現に有用であり、かつＡｓｐ−Ｐｒｏ配
列における融合をぎ酸で切断し得る機能も有している。
尚、ＣｌａＩ部位は、ＡＴＧが新しい翻訳開始部位とし
て機能しているｐｔｒｐＬ１（Ｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｃ．等
（１９８１年）の上記文献）中における発現用にも使用
可能である。
【０１２１】発現のために可能な第３の手段は、特異Ｈ
ｉｎｄＩＩ部位を使用し、そして、図１５（Ｂｉｉ）に
示すように、所望のリンカーとＭｅｔ−１配列とを有す
るアミノ酸１〜８をコードするＤＮＡ配列を合成するこ
とである。こうして、ＰｓｒＩ、ＨａｅＩＩおよびＨｉ
ｎｄＩＩ部位は全て発現リンカー付加用に好都合な部位
である。又、５１０ｂｐＰｓｔＩ断片のＨａｅＩＩＩに
よる部分消化の後で、アミノ酸１および２をつなぐＨａ
ｅＩＩＩ部位（ＧＧＣＣ）を使用することもできる。
尚、発現系を種々変えることは当業者に周知の技術であ
り、ＡおよびＡｃサブユニットに関して前記した可能性
はいずれもＢサブユニットに適用される。
【０１２２】プレプロＡサブユニットおよびプロＢサブ
ユニットｃＤＮＡに基ずくプレプロＢサブユニットの構
成を図２２に示す。インヒビンの該Ｂサブユニットを５
１０ｂｐＰｓｔＩ断片（図４）としてｐＢＴＡ２９３か
ら単離した。ＨａｅＩＩで該ＰｓｔＩ断片を消化した
後、分離した３６５ｂｐＨａｅＩＩ断片をＨｅａＩＩ部
位リンカー（図１５Ｂ１）に結合させることによりＢａ
ｍＨＩ断片に転換する。得られたＢａｍＨＩ断片をｐＺ
ｉｐＺｅｏ ＳＶ（Ｘ）１のＢａｍＨＩ部位に結合さ
せ、次いで、Ｅ．コリを形質転換してＢＴＡ１４１９
（＝ＥＤ８６５４ ｐＢＴＡ４１６）を得た。ｐＺｉｐ
Ｎｅｏの合成プレプロ遺伝子を構築するため、Ａサブユ
ニットのシグナル配列をｐＢＴＡから１６０ｂｐＢａｍ
ＨＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断片として単離した。これを下流Ｂ
ａｍＨＩ部位が削除されたｐＢＴＡ４１６誘導体のＢａ
ｍＨＩ部位に結合して、ｐＢＴＡ４１８である合成プレ
プロＢベクターを得た。この構築を図２３に示す。アミ
ノ酸−６１〜−１の配列はシグナルペプチドにたった１
個のシステイン残基を含有する。従って、真核細胞中で
の発現の間、正しいジスルフィドの形成によって、Ｂサ
ブユニットの折りたたみが起こることが予想され、かつ
その合成前駆体からのＢサブユニットのプロセッシング
は、Ｇｌｙ１前の５個のアルギニン残基に起こることが
なお予想される。
【０１２３】確実かつ完全なプレプロＢサブユニット遺
伝子は、真核細胞による発現のためにｐＢＴＡ３０６、
ｐＢＴＡ２９４およびｐＢＴＡ３０８からのセグメント
をスプライシングすることにより再構成され、かつサブ
ユニット前駆体の部分はそれら各々の機能を研究するた
めインビビンＡＣおよびＢサブユニット配列を独立に前
核細胞又は真核細胞に発現されることは明白である。
【０１２４】牛とヒトのＢサブユニットのアミノ酸配列
は同一であるので、ウシＢサブユニットをコードするｃ
ＤＮＡを発現させた場合、その生成物はヒトＤＮＡ配列
を使って同様に発現させて得た生成物と同一である。従
って、株ＢＴＡ４２３、ＢＴＡ４２４およびＢＴＡ１３
６０も又ヒトインヒビンのＢサブユニットを生成すると
考えるべきである。完全長プレプロＢサブユニットｍＲ
ＮＡをコードするＤＮＡは特別なＳａｃＩ部位（７６７
〜７７０塩基、図２５）のプラスミドｐＢＴＡ２９４お
よびｐＢＴＡ３０６からのｃＤＮＡをスプライシングす
ることにより作られる。 ｃ．真核細胞における発現 ベクターｐＢＴＡ４１７およびｐＢＴＡ４１８をＮＩＨ
３Ｔ３細胞に導入することにより真核細胞におけるイン
ヒビンサブユニットの発現を下記の操作によって独立
に、又は同時に行なった。
【０１２５】トランスフェクションの前日、約２×１０
5 個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を培地５ｍｌのＴ２５フラスコ
にまいた。ＤＮＡ（レトロウイルスまたはバクテリオフ
ァージラムダＤＮＡ）１００ｎｇ−１μｇをＰａｒｋｅ
ｒ，Ｂ．Ａ．とＳｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．（１９７９，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ，３１，３６０−３６９）によって改変され
たＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．とＶａｎｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．
Ｊ．（１９７３，Ｖｉｒｏｌ，５２，４５６−４６７）
のリン酸カルシウム法によるトラスフェクションに用い
た。４時間後、グリセロールで刺激し、その後７２時間
たって、該細胞をＴ７５フラスコに１／３分取するが、
このフラスコには、１ｍｌ当たりＧ４１８を２００μｇ
含有する完全培地を入れておく。培地を含むＧ４１８で
細胞を３〜４日ごとに洗浄し、集密的生長が完成するま
で１４〜２１日間分裂させる。
【０１２６】ＮＩＨ３Ｔ３細胞は牛胎児血清１０％（ｖ
／ｖ）、グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイ
シンで補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ培地 （完全培地）に維持された。形質転
換された細胞および上清は、細胞が集密的生長に達した
時、即ち分取後約３日後インヒビンの発現を同定した。
細胞溶解物は、約２×１０7 細胞をトリプシン処理し、
ＰＢＳ１０ｍｌの洗浄し、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液１ｍｌで再懸濁し、−２０℃で凍結したものから調製
される。
【０１２７】ＲＮＡを調製するため、細胞（２×１
０7 ）を遠心分離により集め、９５℃下で２ｍｌの２×
ＮＥＴＳ／フェノール（２×ＮＥＴＳ＝２００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．５，１．０％ＳＤＳ）にただちに再懸濁し
た。激しく攪拌した後、混合物は相が遠心分離により分
離する前に室温まで冷却された。
【０１２８】水相はフェノールにより再抽出され、ＲＮ
Ａは最終水相から沈殿されるが、この時１／１０容量の
３Ｍ酢酸ナトリウムと２容量のエタノールを添加した。
ドライアイス上で１０分後、ＲＮＡを１１，０００ｇ、
１０分、４℃で遠心分離しペレット化した。ＲＮＡを水
に溶解し、ＤＮＡとｔＲＮＡを全核酸からＬｉＣｌを
２．５Ｍまで添加することによって分離した。該水溶液
を４℃一晩静置し、ＬｉＣｌ−沈殿ＲＮＡｓは、１０分
間１１，０００ｇ、４℃下、等容量３ＭＬｉＣｌクッシ
ョンを通して遠心することにより分離した。最終ＲＮＡ
ペレットを水から再沈殿し、７０％エタノールで洗浄
し、乾燥し、滅菌蒸留水に溶解した。２６０ｎｍの吸光
度で濃度を測定後、ＲＮＡを使用に供するまで−８０℃
に貯蔵した。
【０１２９】ノザーンブロット及びドットブロット分析
をベクターに起因するｍＲＮＡ転写物の量とサイズを見
積るために用いた。ＲＮＡ（５μｇ）をＴｈｏｍａｓ，
Ｐ．Ｓ．，１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７，５２０１−５２０５に記載され
ているようなグリオキシレーション後、１％アガロース
ゲルで分離した。ＲＮＡを直接、２０×ＳＳＣ存在下ニ
トロセルロースに移し、室温で１晩置いた。次いで、減
圧下８０℃で２時間加熱した。フィルターを４２℃で４
時間、５０％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、１０ｍＭ酢
酸ナトリウムｐＨ６．５，２５０μｇｍｌ-1ＤＮＡ０．
０２％ＰＶＰ２５，０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ ４００中
でプレハイグリダイズし、次いで、ハイブリダイゼイシ
ョンを４２℃で１晩行なったが、この時、プレハイブリ
ダイゼーション緩衝液に硫酸デキストラン１０％まで、
および１μｇＤＮＡプローブ当たり２×１０9 ｃｐｍを
１０6 〜１０7 ｃｐｍ含む緩衝液中で行なった。Ａｃサ
ブユニットのプローブは７８８〜１１４９塩基（図５〜
６）を含む３６５ｂｐ ｃＤＮＡ断片であり、Ｂサブユ
ニットのプローブは５０４〜８７２塩基（図７〜８）を
含む３６９ｂｐ ｃＤＮＡ断片である。フィルターを６
５℃、０．１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄し、次い
で−８０℃でオートラジオグラフィーを実施した。
【０１３０】ゲノムＤＮＡの調製のため、集めた細胞
（２×１０7 ）をＴＮＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ，４００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．２）および最終濃度０．５％まで添加され
たＳＤＳに再懸濁された。混合後、プロティナーゼＫを
２０μｇｍｌ-1添加し、３７℃、１晩インキューベート
した。ＤＮＡを等容量のフェノールで２度各々１５分間
抽出し、次いで１度クロロフォルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１）で抽出した。
【０１３１】ＤＮＡを最終水相からエタノール沈殿によ
り回収、巻き取り、次いでＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）に再溶解し
た。熱処理されたＲＮａｓｅを４００μｇｍｌ-1添加
し、３７℃、３０分間インキュベートした後、ＳＤＳを
０．５％まで添加した。プロティナーゼＫを２０μｇｍ
ｌ-1まで添加し、インキュベーションを更に２時間続行
した。ＤＮＡを２度のフェノール処理と１度のクロロフ
ォルム：イソアミルアルコール処理の後、エタノール沈
殿により分離した。巻き取ったＤＮＡを利用に供するま
でＴＥに溶解し、４℃に保存した。
【０１３２】サザーンブロット分析はベクターをゲノム
内への組込みを検知するため用いられたが、それは、組
込まれたコピーの数を見積る能力もある。ＤＮＡ（１０
μｇ）をＤＮＡ１μｇ当たり８〜１０単位の酵素で消化
するが、この時、通常、提供者の推奨する条件下で３７
℃、１晩実施される。試料をフェノール抽出し、エタノ
ールで沈殿さ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ アセテート、１ｍ
ＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．２を含有する０．７％アガロース
ゲルで電気泳動される。ＵＶ下、可視化の後、変成およ
び中和し、ＤＮＡはサザーン（１９７５）によって述べ
られているように通常２０×ＳＳＣ存在下のニトロセル
ロースへゲルから移される。一晩移行の後、フィルター
を５×ＳＳＣで軽く洗浄し、８０℃、２時間、減圧下加
熱する。
【０１３３】プレハイブリダイゼーションを最低４時
間、５０％フォルムアミド、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ，
２５μｇｍｌ-1，ＤＮＡ，５×ＳＳＰＥ（ＳＳＰＥ：１
８０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）中で実施し、ハイブリダイゼーションを
４２℃、１晩、１０％硫酸デキストリンおよび１０6 〜
１０7 ｃｐｍプローブ（１μｇ ＤＮＡ当たりの比活性
２×１０9 ｃｐｍ）を含有するプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファ中で実施する。プローブは上述したもので
ある。フィルターを６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳで洗浄し、−８０℃でオートラジオグラフィーを
行なった。
【０１３４】ＲＩＡはほとんどＭｃＬａｃｈｌａｎ，
Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ（１９８６；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，４６，１７５−１８５）に記載さ
れているが、トレーサーとしてＩ125 −ラベル化３１Ｋ
Ｄ牛インヒビンを使用するものである。この検定法は、
変成サブユニットよりむしろ形態的に正確なインヒビン
あるいはサブユニットを検知する。使用される標準は、
ＨＰＬＣ精製３１ＫＤインヒビンで、０．４のＢ／Ｉ比
を有し、１．０のＢ／Ｉ比を有するｂＦＦと対比され
る。
【０１３５】分取されたラットの脳下垂体細胞培養は、
国際特許公開ＷＯ８６／０００７８に記載されているよ
うに、羊の網状組織液がスタンダードに用いられた。全
ての場合、正しいＤＮＡがゲノム中に観察され、形質転
換させるベクターの組込みを示していた。またｍＲＮＡ
はこれらの細胞中で生成されていた。しかしながら、組
込みコピー数、ｍＲＮＡレベルおよび発現蛋白質間の明
確な関係はなかった。
【０１３６】一方、新しい細胞培養培地はバイオアッセ
イおよびＲＩＡにおいてインヒビンを検知するのは不可
能であった、ベクターｐＢＴＡ４１９により形質転換さ
れた細胞からの経過培地はバイオアッセイにおいて、Ｆ
ＳＨ抑制を低レベルに与えるが、これは、非特異的抑制
効果（図７〜８）と思われる。対照的に、ｐＢＴＡ４１
７のＡサブユニット遺伝子は、発現し、バイオアッセイ
およびＲＩＡ両者に検知可能な物質を与えるように分泌
される。この事はプレプロＡサブユニット遺伝子単独か
らの１種又は複数の蛋白質はインヒビン様生物活性を有
していると思われるが、以前は単にＡＢまたはＡｃＢの
サブユニットの組合せをインヒビンとして分類していた
のもである。
【０１３７】生産された免疫活性物質の量は、培養培地
の細胞数に比例する〔Ｂサブユニットブロット〕。しか
しながら、宿主細胞自体が低レベルのＢサブユニットを
作っているということを今だ除外することはできない。
トランスフェクション３からの試料のＢ／Ｉ比は天然の
インヒビンと接近しているので、この組換え物質は生物
活性が要請されているところ、例えば避妊剤の開発な
ど、どこへでも、天然のインヒビンと代替可能であるこ
とを示している。生物活性物質はまた、ｐＢＴＡ４１７
と４１８によるコトランスフェクションされた細胞から
の上清または各々のベクターを別々にトランスフェクシ
ョンした後混合された集合体からの上清に見られるがイ
ンヒビンの再構成を表わしている。
【０１３８】
【表８】
【０１３９】データはバイオアッセイ（Ｂ）またはＲＩ
Ａ（Ｉ）において決定されたが、単位／ｍｌ（培養上
清）として与えている。 ＮＤ：検知以下のレベルをふす。 ＊ ：純化細胞コロニーから得られたデータを示す。残
りのものは、細胞を混合した集合体を含有する形質転換
上清から得られたものである。
【０１４０】＋ ：各々のベクターを独立に形質転換
し、その後それらを混合した培養細胞を示す。 ／ ：各々のベクターを同時にコトランスフェクション
した細胞を示す。 ヒト、牛および他の動物種（実施例７）間の類似性か
ら、上述と類似の構成はヒトを含む任意の種から生物活
性のある分子を発現するために用いられることができ
る。しかしながら、インヒビン蛋白質またはインヒビン
様蛋白質またはペプチドの発現は上述の実施例に限定さ
れない。
【０１４１】本発明における配列の発現は、従来公知の
前核細胞および真核細胞に用いられている多くの異なる
発現に対しても適用できるものである。 実施例１１ 抗インヒビン抗体の単離 ＢＴＡ４１０およびＢＴＡ４１５からのβ−ガラクトシ
ダーゼ−インヒビン融合たん白質を含有するたん白質画
分を、カルボニルジイミダゾール法（Ｂｅｔｈｅｌｌ，
Ｇ．Ｓ．等（１９７９）年のＪ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ，
２５４；２５７２−２５７４）を使用してセファロース
ＣＬ−６Ｂに結合し、各融合たん白質に対する抗体をア
フイニテイ精製により１ｍｌのウサギ抗インヒビン抗血
清から単離した。吸着した抗体を３ＭのＭｇＣｌ2 でカ
ラムから溶出し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ／１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した。
【０１４２】溶出された抗体を各融合たん白質のＷｅｓ
ｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ分析に使用したところ、これらは、
それが単離された融合たん白質をのみ結合することが明
らかとなった。すなわち、交差結合性はなく、かつ抗イ
ンヒビン抗体に比べて抗β−ガラクトシダーゼ抗体の量
は無視し得る程度であった。株ＢＴＡ４２５，４２０，
４２２および４２４からの融合たん白質についても同様
の実験を行った。
【０１４３】これらの実験の結果、組換えインヒビン又
はインヒビン様たん白質は、抗インヒビン抗体の精製や
抗インヒビン抗体用のモノクローナル又はポリクローナ
ル抗体製剤のスクリーニングならびにインヒビン分析
系、例えばＥＬＩＳＡやＲＩＡ等における標準体として
使用することができる。 実施例１２ 合成ペプチドの合成 真核細胞および原核細胞中でのインヒビン様たん白質の
産生の代替法は、インヒビンの１部又は全部を化学的に
合成することである。この様な合成ペプチドは、インヒ
ビンの類縁体、作用剤および拮抗剤として使用すること
ができ、実施例１０および１１に記載の様な用途を有し
ている。
【０１４４】合成ペプチドの合成、精製および特性決定
は次の様な方法で行った。４３０Ａ型ペプチド合成装置
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｅｔｅｍｅ Ｉｎｃ．）
を使用した。１．００版ソフトウエアを変更することな
くメーカーの処方通りに使用した。すべての使用薬剤
は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｅｔｅｍｅ社供給のも
のを使用した。ＰＡＭ樹脂と共有結合して供給されたＣ
末端アミノ酸（０．５ｍｍｏｌ）を反応容器に装填し
た。合成の様子は、各樹脂のカップリング後のニンヒド
リン反応でモニターした。ペプチドに結合した樹脂の総
収量は約７５％であった。
【０１４５】ペプチド結合樹脂を、スカベンジャークレ
ゾール（０．５ｍｌ）とチオクレゾール（０．５ｍｌ）
の存在下に０℃で１時間ふっ化水素酸（１０ｍｌ）で処
理することによって樹脂からのペプチドの切断と脱保護
を行った。この切断と脱保護は、テフロンＨＦ−型反応
装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ，大阪）中で行った。反応生成物をエーテル
（３×５０ｍｌ）中ですりつぶし、ろ過し、次いで、こ
のペプチドを酢酸（１０％）中に溶解し、ろ過し、そし
てろ液を凍結乾燥した。
【０１４６】残留物をアセトニトリル（１０％）を含有
するトリフルオル酢酸（０．１％）中に溶解した。ペプ
チドを逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し
て均質物とした。トリフルオル酢酸（０．１％）と１０
〜８０％に直線的に増加するアセトニトリルとを使用し
て傾斜溶出した。アルテックス（Ａｌｔｅｘ）Ｃ８カラ
ムを分析クロマトグラフィーに使い、溶出液を連続的に
１ｍｌ／分の流速で２２０ｎｍでモニターした。予備Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣを、Ｖｙｄａｃ ＰｒｏｔｅｉｎおよびＰ
ｅｐｔｉｄｅｓ Ｃ18カラム（Ｃａｔ，Ｎｏ．２１８Ｔ
Ｐ１０１０）を使って２〜４ｍｌ／分で操作して行っ
た。溶離液傾斜は各ペプチドの最適精製となる様に調節
した。アセトニトリルを蒸発させて精製ペプチドを回収
し次いで水相を凍結乾燥した。
【０１４７】Ｗａｔｅｒｓ Ｐｉｃｏ−ｔａｇ Ｓｙｓ
ｔｅｍを使用して合成ペプチドのアミノ酸分析をした。
メーカー処方に従って行い、系をＰＴＣアミノ酸で目盛
った。各ペプチドのアミノ酸組成は各アミノ酸の予想割
合と一致した。ｃＤＮＡ配列由来のＡサブユニットアミ
ノ酸配列の２つの領域を最初に合成ペプチドの生成に使
用した。第１はＨｉｓＩからＡｌａ２６までであり、第
２はＳｅｒ１６７からＡｓｐ１９５までであり、これは
インヒビンの４３ｋＤ（Ａ）および２０ｋＤ（Ａｃ）サ
ブユニットのＮ末端を含むものである。ペプチド１の全
配列を以下に示した。ここで各数字は図５〜６のアミノ
酸配列に従って表示した。ペプチド１
【０１４８】
【表９】
【０１４９】この配列は最後の１個のアミノ酸コードを
使用して（Ｈ1 −Ａ26）Ｋと省略することができ、ここ
にかつこ中のアミノ酸は図５〜６に挙げたインヒビン配
列を示す。ペプチド２はＹ（Ｈ1 −Ａ26）Ｋである。こ
れはペプチド１にＮＨ2 末端チロシンを付加して得られ
る。合成法としてはリジンから出発して行った。樹脂の
部分（７５％）を除去し（ペプチド１）、次いでペプチ
ド２を生成するために、チロシン残基を残りの２５％の
ペプチドに加えた。リジン残基はハブテンの製造を容易
にするために加えたものであり、チロシンは放射性よう
素化の部位を作るために加えたものである。実施例１３ 封入体の製造と精製 株ＢＴＡ４２０とＢＴＡ４２２とＢＴＡ４２４は融合生
成物としてインヒビン様たん白質を生成する。これら３
種の株からたん白質はいずれも封入体と呼ばれる不溶性
塊状物として生体内に見られ、これは次の工程により生
成しそして精製される。
【０１５０】１晩培養した培養物を２リットルのじやま
板付フラスコ中で２×１リットルの新鮮なＬＢ（１０ｇ
のトリプトン／５ｇの酵母エキス／５ｇのＮａＣｌ；１
リットルにつき）中に１：５０に希釈し、これを、培養
物濃度がＯＤ＝０．３−０．４になるまで３７℃で振と
うした。イソプロヒル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシダーゼ
（ＩＰＴＧ：最終濃度０．１ｍＭ）を加えて２〜７時間
培養を続けた。封入体は最初２時間後に明相顆粒状に可
視となり次いで７時間後に実験的に最大のサイズおよび
量になった。
【０１５１】細胞を集め、便利のためにこのペレットを
１晩−８０℃に冷凍した。細胞をもとの培養物１リット
ルにつき２０ｍｌのＨ2 Ｏ中に再けん濁し、フレンチプ
レス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）を使用して破砕し
た。けん濁液を臭化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳ
Ｆ）と５％のトリトンＸ−１００中で０．１ｍＭにし、
次いで１，２００×Ｇで１０分間遠心分離した。
【０１５２】上ずみ液を捨て、ペレットを超音波処理に
より、５０ｍｌの１Ｍ ＮａＣｌ／５％トリトンＸ−１
００中に再けん濁し次いで遠心分離した。この洗浄工程
をくり返し、ペレットを最終的に超音波処理により、も
との培養物１リットルにつき２．５ｍｌの１Ｍ ＮａＣ
ｌ／５％トリトンλ−１００中に再けん濁した。このけ
ん濁液をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ２８回転器
中、６０％（ｗ／ｖ）のしょ糖密度勾配上に層を作り、
３２，０００×Ｇで６０分間遠心分離した。封入体はし
ょ糖クッションを通してペレットとなり、細胞枠片から
単離した。これらをＨ2 Ｏで洗い、少なくとも３か月
間、ポリアクリルアミドゲル上に見られるたん白質物質
として何の変化もなく−８０℃で冷凍保存できる。 実施例１４ 抗原の製造 精製した封入体を２ｍｇ／ｍｌの濃度に８Ｍ尿素／０．
１Ｍ ＤＴＴ／０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
中に、Ｎ2 雰囲気下３７℃で２時間溶解した。溶液を１
２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上ずみ液を１
晩４℃で少くとも２×５リットル交換して５０ｍＭ Ｎ
ａＨ2 ＰＯ4 ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
（ＰＢＳ）に対して透析した。透析バッグ中のたん白質
は白色のフロックとなり、これは更に精製することなく
使用した。その１ｍｇをマウスに腹腔内注射したとこ
ろ，この物質は発熱物質やリポ多糖類を含まないことが
わかった。このフロックけん濁液を、同量の油性アジュ
バント、すなわちＭａｒｃｏｌ５２；Ｍｏｎｔａｎｉｄ
ｅ８８８（９：１）で乳化し、最終的に１ｍｌにつき抗
原１００−２５０μｇの濃度にした。２種又はそれ以上
の出発物からの抗原がある場合には、各抗原の濃度を１
００−２５０μｇ／ｍｌとした。
【０１５３】合成ペプチドをグルタルアルデヒド法に従
ってキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌ
ｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ，ＫＬ
Ｈ）と結合させ（Ｂｒｉａｄ，Ｊ．Ｐ．等（１９８５
年）のＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，７８，５
６−５９）、そしてこの共役物を前記した様に乳化し
た。抗原を製造するのにたくさんの他の手段があり、又
免疫性付与についても他のたくさんの方法ややり方があ
ることに留意すべきである。抗原製造の別法としては、
例えば、フロイントの完全又は不完全アジュバント中へ
の乳化、アンヒドロゲル又はサポニン中への乳化又は抗
原含有ポリアクリルアミドゲル切片の温浸等がある。又
これとは別に、抗原はアジバントを使用することなく投
与しても良い。投与形態としては、経口投与、粘膜を通
しての投与、筋肉内投与、腹腔内投与あるいは皮下投与
等がある。又、ペプチド又はたん白質の抗原性増強にも
たくさんの方法があり、例えば自分自身との架橋、他の
たん白質との架橋あるいは残基の変性や配列の変更等が
挙げられる。 実施例１５ 免疫付与方法 下記の動物についてまず図１の注射をし（０週目）、次
に４週間後に促進剤を注射した。各フロック抗原の投与
量は下記の通りである。
【０１５４】 ウサギ １００ μｇ／回 ヒツジ ２５０ 〃 ブ タ ２００−２５０ 〃 ラット １００ 〃 尚、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結
合した合成ペプチド（ペプチド１，実施例１０）は、１
回につき１００μｇの接合体をウサギに投与して使っ
た。 実施例１６ 抗血清の分析 血液試料を規則的に採取する。代表的な放血法は次の通
りである。第１回目の注射の前に１回放血し、ブースタ
ー投与前に１回またはそれ以上放血し、更にブースター
投与時および投与後に毎週放血する。この血液を一晩４
℃で凝血させ、そして遠心分離後に血清を除く。血清を
整除数個に分けて、抗体およびＦＳＨ力価の分析中に−
２０℃に冷凍して保存した。
【０１５５】血清は３種の違った実験条件下で試験し
た。 （ａ） トレーサー結合 よう素化した５８ｋＤおよび３１ｋＤインヒビンとの抗
体結合性を測定し、これにより抗体が在来のウシインヒ
ビンを認識可能かどうかを調べた。トレーサー抗体錯化
合物を第２抗体を使用して沈でんさせ、ペレット中の放
射性を、反応系中の全カウント数のパーセントで表わし
た。
【０１５６】よう素化工程は次の通りである。精製した
５８ｋＤ又は３１ｋＤインヒビン（２５μｌの電気溶出
緩衝液中に１〜２μｇ）（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８
５／００１１９）を２５μｌの０．５Ｍりん酸緩衝液
（ｐＨ７．２）に加えた。Ｎａ125 Ｉ（０．５ｍＣｉ，
５μｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）を加え
た。クロラミンＴ（４０μｌ）をクロラミンＴ：ホルモ
ン＝８：１の割合で加えた。反応を攪拌下に室温で６０
秒間行い、２０μｌのメタ重亜硫酸ナトリウム（３ｍｇ
／ｍｌ）を加えて反応を停止した。反応混合物を２０ｍ
Ｍりん酸緩衝液／０．１％ＢＳＡ又は０．５％Ｐｏｌｙ
ｐｅｐ（ｐＨ６．０）で５００μｌとし、セファデック
スＧ２５カラム（ＰＤ１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐ
ｐｅａｌａｐＳｗｅｄｅｎ）上でゲルろ過して遊離の
125Ｉを除いた。不活性画分を集め２０ｍｌにし、２０
０μｌのＭａｔｒｅｘ Ｒｅｄ Ａ（Ａｍｉｃｏｎ，Ｄ
ｅｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓ．，ＵＳＡ）に供給し、次いで
４００ｍＭ ＫＣｌを含有するりん酸緩衝液で洗浄し、
溶出物を除去した。 125Ｉ−インヒビンをりん酸緩衝液
中の１Ｍ ＫＣｌ／４Ｍ尿素で溶出した。このよう素化
インヒビンを更に適当なＲＩＡ緩衝液（下記参照）を有
するセファデックスＧ２５カラム上でゲルろ過し、ＫＣ
ｌ／尿素を除去した。
【０１５７】５８ｋＤおよび３１ｋＤインヒビンのよう
素化に続き、セファデックスＧ２５上でのゲルクロマト
グラフィー後の不活性体積画分中のそれぞれ６０μＣｉ
および２５μＣｉを回収した。約３０％が１Ｍ ＫＣｌ
／４Ｍ尿素緩衝液で溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
ける分子量から決定した 125Ｉ−インヒビンはこの画分
中に見出された。
【０１５８】よう素化製剤の特異活性は、基準体のよう
素化に使ったホルモンを使用する自己置換法（Ｍａｒａ
ｎａ等（１９７９年）のＡｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ（Ｋｂｈ．）９２，５８５−５９８）によるラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）により決定された。 125Ｉ−５
８ｋＤインヒビンの特異活性は５０−６０μＣｉ／μｇ
で、 125Ｉ−３１ｋＤインヒビンのそれは２４μＣｉ／
μｇであり、それぞれの回収率は５−２５％であった。
【０１５９】在来５８ｋＤインヒビンで免疫したウサギ
４７４からの抗インヒビン抗血清は生来のインヒビンの
生物活性を失っており、よう素化５８および３１ｋＤイ
ンヒビンと強力に結合するが、各インヒビンの分離した
サブユニットとはほとんど結合しない。この事は、よう
素化はその分子にそれほど重大変化を与えていないこと
がわかる。従って被検抗血清のよう素化インヒビンとの
結合能は、該抗血清の在来インヒビンを認識する能力で
あるとみなされる。 （ｂ） 生体外生物学的定量（バイオアッセイ） 前記したバイオアッセイ（国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ８
５／００１１９）において、抗血清は在来インヒビンの
生物活性を抑制する能力を有するのであるから、中和抗
体が存在するものと認められる。 （ｃ） ＦＳＨ。
【０１６０】ヒツジＦＳＨの血清準位を、ウサギ抗ヒツ
ジＦＳＨ血清とトレーサーとしてのよう素化ヒツジＦＳ
Ｈとを使用するラジオイムノアッセイ法により決定し
た。又ウサギＦＳＨの血清準位をモルモット抗ウサギＦ
ＳＨ血清とトレーサーとしてのよう素化ウサギＦＳＨと
を使用するラジオイムノアッセイ法により決定した。Ｆ
ＳＨ力価における増加は、組換え体に対して生起した抗
体循環からの内因性インヒビンの除去の際に認められる
と思われる。 実施例１７ ヒツジ実験 ９匹の動物のグループ（白めん羊、実験中発情期にない
ものを選んだ）を、表５に示した１つの又は１対のフロ
ック抗体で免疫し、その血清を実施例１６の様にして分
析した。 （ａ） トレーサー結合実験。
【０１６１】１９匹から顕著なトレーサー結合能（表１
０）を有する血清（ブースター投与後２週間目）が採取
された。これらの動物はすべて、プラシーボコントロー
ル群（Ａ群）およびｐＢＴＡ３０１からの１５ｋＤサブ
ユニット融合たん白質で免疫した群（Ｃ群）以外の群の
ものであった。最高の応答は６７３番の動物（Ｄ群）に
みられ、これは１、１０００の希釈条件下で３１ｋＤト
レーサーとの１０％結合能および５８ｋＤトレーサーと
の３．１％結合能を示した。
【０１６２】
【表１０】
【０１６３】表中に記載のない動物はすべて１％より少
ない結合度であった。この様に、組換えインヒビンサブ
ユニットは、これを抗原として使用した時に、生来のイ
ンヒビンを認識し得る抗血清をヒツジ中に生起せしめる
能力を有する。尚、（ｉ）これらの実験により血清中の
遊離の抗体が検出され、かつヒツジインヒビンに対して
最高の親和性を有する抗体は実際にヒツジインヒビンと
結合しておりこの実験の分析では検出されなく、そして
（ｉｉ）スクリーニングは、弱陽性血清の希釈力価を多
分超えた１：１０００の希釈度で行った点に留意すべき
である。 （ｂ） 生体外バイオアッセイによるデータ 本実験条件（２Ｖインヒビンにつき１μｌの抗血清）下
においては、いずれの血清も、下垂体細胞培養バイオア
ッセイでの生体外インヒビン活性中和を示さなかった。 （ｃ） ＦＳＨ力価 各動物群の血清ＦＳＨ準位を表１１に示した。コントロ
ール群（Ａ）とは顕著な違いが見られなかったが、１時
的ではあっても顕著な増加が被検群全部（１群を除き）
に見られた。
【０１６４】この様に、組換えインヒビンは家畜動物に
おけるＦＳＨ力価を増加する抗原として使用することが
できる。ＦＳＨは排卵率を増加することが知られている
ので、従って組換えインヒビンに対する免疫は排卵率を
増加するものであると期待出来、かつこれは生殖改善の
ための生殖能増強剤としての使用が期待される。更に
又、ＦＳＨは雄における精子生成および雌における卵子
生成を調節する作用を有しているので、生物化成組換え
インヒビンの投与によってＦＳＨ準位を低下させ、従っ
て雄および雌の両方用の避妊薬としてこれを使用するこ
とも出来る。
【０１６５】
【表１１】
【０１６６】上記データは、群平均±標準偏差である。
被検群は表５と同じである。第４週目のデータとその後
の週のデータとの間の統計的な比較を、同じ群の動物間
の１対のｔ−試験において行った。 （＊） Ｐ＜０．０５ （＊＊） Ｐ＜０．０１実施例１８ ウサギ実験 在来５８ｋＤ又は３１ｋＤインヒビンで、又はプラスミ
ドｐＢＴＡ２９７，２９９又は３０１を有する細胞から
の融合たん白質で、又は合成ペプチド１（実施例１０）
を含有する接合たん白質で免疫した、去勢していない雄
ウサギからの抗血清を、トレーサー結合系で分析した。
結果を表１２に示した。
【０１６７】
【表１２】
【０１６８】動物番号４７４の血清は１：２０００に希
釈したものを使用し、他は全部１：１０００に希釈して
使用した。これらのデータから又、組換えインヒビンサ
ブユニットおよび合成ペプチドは、在来インヒビンを認
識しかつこれを結合し得る抗体を含めての抗体応答を誘
発し得ることがわかる。応答は動物によって変るが、組
変え１５ｋＤ抗原（ＢＴＡ４２４由来）はすべての被検
ウサギにおいて顕著な応答を誘発しない事から、４７４
番ウサギからの血清中のすべての抗体（これは在来５８
ｋＤインヒビンに対して生起されたものである）は本実
験に関する限り４３ｋＤインヒビンに対する抗体である
と思われ、従って１５ｋＤサブユニットはウサギにおい
てはほとんど抗原性を有しないと認められる。しかしこ
の事実は、このサブユニットが他の種において有用でな
いだろう事を意味するものではない。これらの結果から
又、１５ｋＤサブユニットに対する充分な抗原性応答を
達成するためには、その構造、配列又は構成に何らかの
変更を与える事が必要であろうと思われる。又同様に、
２０ｋＤサブユニットもウサギにおいては貧抗原であ
る。
【０１６９】６９９番ウサギの毛清準位は、ペプチド１
・ＫＬＨ接合抗原（図２０）での強化免疫後に突然減少
して０になり、又６９８番ウサギでは徐々に減少するこ
とがわかる。各動物の応答は、５８ｋＤトレーサーに対
するその抗血清力価と相互関係がある。又、合成ペプチ
ド自体又はそれに対する抗血清は生体外ラット下垂体細
胞バイオアッセイにおいて作用せず、これらはインヒビ
ン受容体に対して直接作用をしない。従って、ＦＳＨは
精子形成および卵子形成に関与する（実施例１９参照）
ので、このペプチドおよびその誘導体は、雄および雌の
両方に対して避妊薬として使用可能なものである。更に
又、これはＡN 断片のＮＨ2 −末端部であるので、ＡN
断片自身又はウシ、ヒト又はその他の脊椎動物種のＡN
断片由来のその他の合成ペプチドも又、ここに観察され
た応答が抗体を介するものであるとするならば、同様な
用達を有するものと認められる。又、生物活性ＡN 断片
又はその部分を抗原としてではなく投与する場合にはＦ
ＳＨ準位が増加することが予想され、従って、これらは
生殖能改善のための生殖増強剤として作用することが予
想される（実施例１９も参照）。 実施例１９ ブタ実験 本実験の方法は前記の例の場合とは異なる。
【０１７０】末経産の雌ブタ（２２−２３週令）を、Ｂ
ＴＡ４２５由来β−ガラクトシダーゼフロック抗原７５
０μｇで（１６匹、コントロール群）、又はＢＴＡ４２
２、ＢＴＡ４２４およびＢＴＡ４２６由来の各サブユニ
ットフロック抗原の各２５０μｇを含有する混合物で
（１６匹、テスト群）それぞれ免疫した。初回免疫後２
５日目と更に４７日目に同様のブースターを投与した。
初回免疫後６０日目に血清を採取し、トレーサー結合法
により抗インヒビン抗体を分析した。これらの雌ブタは
発情を示し、６０日後の第１回発情期に交尾させた。
【０１７１】１５匹の被検動物からの血清を、１：１０
０の希釈条件下にトレーサー結合能を分析したところ、
これらの内の１０匹の血清は１．７〜９．０％（Ｘ＝
４．９±２．５）の範囲の 125Ｉ−５８ｋＤインヒビン
との結合能を示した。更に、125Ｉ−５８ｋＤインヒビ
ンに対して２．０％の結合能を有する１例は 125Ｉ−３
１ｋＤインヒビンに対しても６．４％の結合能を示し
た。コントロール血清の６例はいずれも両トレーサーに
対してはっきりした結合性を示さず、これより組換えイ
ンヒビンサブユニットはブタの抗原性応答誘発が可能で
あり、従って在来インヒビンを認識する抗体となり得る
ことが明らかとなった。
【０１７２】ブタの発情期は、６０日目の採血の後に２
１〜２７日周期であり、本実験の被検動物は全て発性を
示し従って交尾するものと予測された。表１３はコント
ロール群およびテスト群の交尾データを示す。しかし、
下記分析の結果から、この実験処理により多くのテスト
群の動物は交尾しなかったことがわかる。
【０１７３】
【表１３】
【０１７４】抗５８ｋＤインヒビン抗体を有する１０例
の血清の内９例は１：１００の希釈条件下において３１
ｋＤインヒビンを検出しなかったので、上記のデータは
５８ｋＤインヒビンのＡN 断片に対する抗体作用を示す
ものであり、この抗体の大部分はＡN 特異性であると考
えられる。この仮説はウサギ実験において、すなわち、
ペプチド１を抗原として投与した場合に、ＦＳＨ準位が
低下し（実施例１８）そしてその１つの結果として、雌
の脊椎動物において発情期周期と卵胞形成が停止するこ
とになることによって裏付けられている。５８ｋＤイン
ヒビンよりも３１ｋＤインヒビンに対してより高い抗体
力価を持つ血清を生成した１例は本実験の期間中に正常
に交尾した。又次の様に説明することもできる。例え
ば、４３ｋＤ抗原はプレプロＡサブユニットのアミノ酸
−１０から−１を持っており、この配列が前記作用をも
たらすものである。しかしこの逆説的な結果が生体内で
達成されたといういかなる作用機能によっても、そのデ
ータはＦＳＨと従って生殖機能およびその過程の調整剤
としてのインヒビンの作用を強調するものであり、かつ
これは雄および雌の避妊薬としてそして雌の発情期を抑
制する分子としての組換えインヒビンの作用を実証する
ものである。 実施例２０ ラット実験 ラットの被検群をヒツジの場合と同様にして免疫した。
その血清をよう素化トレーサー結合分析により１：５０
０の希釈条件下に分析し、各群の結合データ（％）を平
均値±標準偏差の値で表１４に示した。群（Ａ−Ｆ）で
使用した抗原は表１０と同じものである。
【０１７５】
【表１４】
【０１７６】これらのデータにおいて、（Ａ）群と
（Ｂ）および（Ｅ）又は（Ｄ）群のトレーサー結合能を
比較すると、Ａ（４３ｋＤ）サブユニットの方がＡｃ
（２０ｋＤ）サブユニットよりもすぐれた抗原であるこ
とがわかる。トレーサー結合試験の結果からみると、Ｂ
サブユニットは抗原としての作用は有していなかった。
これらの結果は、５８ｋＤ在来インヒビンは４７４番ウ
サギにおいてすぐれた抗体応答性と中和抗体を生成し、
一方４６１番ウサギと３１ｋＤ在来インヒビンで免疫し
た他の２匹においては中和抗体は生成されず又抗原応答
性もほとんどなかったという観察結果をうら付け強調す
るものである。
【０１７７】他の種（ヒツジ、ウサギ、ブタ）に関して
は、組み換えインヒビンサブユニットで免疫した動物の
どれにも中和抗体は検出されなかった。又、ほとんどの
種において、抗原のβ−ガラクトシダーゼ部分に対する
顕著な免疫応答が見られた。これらの観察結果から、立
体配座エピトープが重要であり、かつＢＴＡ４２６，Ｂ
ＴＡ４２７およびＢＴＡ１３６０由来の又はｔｒｐベク
ター（実施例１０）由来の抗原の様な抗原が高価値であ
ることがうかがわれる。なぜならば、融合部のβ−ガラ
クトシダーゼ部分は実質的に減少している（図１６）か
あるいは欠失しており、そして実験は立体配座エピトー
プを生成するためにかつ抗原生成を改善するために行う
ことができるからである。
【０１７８】しかしながら、本発明における動物実験に
よれば、組換えインヒビン、サブユニット、断片および
その合成類似体又は相同体は次のように使用することが
できることが明らかにされた。 （ａ） 在来インヒビンを認識する抗体の産生。 （ｂ） ＦＳＨ準位の変更。 （ｃ） 生殖増強剤又は避妊薬としての用途。 実施例２１ 免疫原としてのｐＵＣ−由来融合蛋白質の生産と利用 ｐＢＴＡ３０３，ｐＢＴＡ３０８，ｐＢＴＡ３０９およ
びｐＢＴＡ４７２からのｐＵＣ−由来短鎖融合蛋白質の
優れた免疫原性がＢＴＡ４２７様由来の封入体からの牛
Ａｃ生成物で免疫された羊の抗体を中和することにより
得られるものによって例示される。
【０１７９】この蛋白質は封入体をTris−ＨＣｌ ｐＨ
８．０（８Ｍ尿素および０．１ＭＤＴＴ含有）、３７
℃、２時間溶解することにより調製される。この溶液は
氷酢酸を添加してｐＨ３にし、次いで、遠心し、その後
濃縮し、０．１Ｍ酢酸でセファデックス×Ｇ５０または
Ｇ７５カラムでクロマトグラフィーを実施した。組換え
蛋白を含む画分はＳＤＳ−ｐＡＧＥにより固定され、プ
ールされ、逆相クロマトグラフィーカラム（Ｖｙｄａｃ
Ｃ４またはＤＹ ｎａｍｅ×Ｃ１８）で実施した。各
々の場合、蛋白質は０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル
勾配を用いてカラムから溶出した。溶出された蛋白質
は、再びＳＤＳ−ｐＡＧＥで固定され、必要な画分をプ
ール、濃縮し、１〜１０ｍｇ／ｍｌとし、ＰＢＳで透析
した。蛋白質の固定はＮＨ2 −末端配列決定法により確
認された。
【０１８０】４頭の羊は３００μｇＫＬＨで免疫され、
等数の羊はＡｃ融合蛋白質３０μｇ、および３００μｇ
ＫＬＨ結合Ａｃを含む混成体（１０７：１モル比）をグ
ルタルアルデヒド法（Ｂｒｉａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１
９８５ ｉｄｉｄ）により各々免疫された。第１次免疫
感体は０日ではフロインドの完全アジュバントで、ブー
スターは２１日と５０日にマルコール（Ｍａｒｃｏｌ）
５２：モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）８８８（９：
１）で実施した。２６日の血清は、ＲＩＡにより天然の
牛３１ＫＤトレーサーを認識する能力をテストし、その
結果を％（カウント）で表１５に示した。
【０１８１】
【表１５】
【０１８２】天然３１ＫＤインヒビンへの意味ある結合
は、形態的に正しいインヒビンを認識する抗体が作られ
たことを示している。更に、羊６，７，８および１０か
らの抗体を主体内バイオアッセイでテストしたが、それ
らはインヒビン生物活性を中和した。羊５〜１２は混成
されない免疫原（モンタニド８８８：マルコール５２中
に１００μｇ）で９３日に再免疫し、次いで排卵応答を
調べるため、プロゲストーゲン発情周期同時施療を実施
した。組換えインヒビンを受容しているこれらのグルー
プはＫＬＨ−免疫コントロールまたは非処理コントロー
ル（Ｃ１〜Ｃ５：表１６）より顕著に高い排卵率を有
し、単独で、またはキャリア分子との混成されたものを
使いる時、免疫原としての短鎖融合蛋白質の優れた特性
が確認され、インヒビンの単独サブユニットに対する抗
体が生体内および生体外でインヒビンの生物活性を中和
することが可能なことが証明された。１頭（９）は腹腔
鏡で、オバレクトマイズド（ｏｖａｒｅｃｔｍｉｓｔ
ｄ）していることが分かった。
【０１８３】
【表１６】
【０１８４】これらの方法がヒトおよび家畜、例えば、
ブタ、犬、馬、牛、羊やヤギなどに、ｐＢＴＡ３０３，
ｐＢＴＡ３０８，ｐＢＴＡ３０９およびｐＢＴＡ４７２
からの蛋白質を単独あるいは混合して用いることができ
ることは明白である。 実施例２２ インヒビンの製造方法 インヒビン産生の遺伝情報を有する組み換えプラスミド
を持つ宿主細胞を産生培養集合体中で凍結乾燥したバイ
アルとして保存する。保存バイアルからの細胞を再生
し、特定の培地上に植え、そしてこの培地からの細胞を
使用して発酵様接種材料を調整する。この接種材料は適
当な成長培地を含有する発酵材料を作るのに使用し、発
酵はインヒビンたん白質産生に適当な条件下で行う。発
酵終了後に、細胞を採取し、産生物を細胞から単離しそ
して精製する。生成物を分析し品質調整し、そしてその
安定性のために充分な保存条件下に保存する。きびしい
衛生条件下で生成物を他の成分と組合わせて用途に応じ
て組成する。
【０１８５】
【発明の効果】
インヒビンの用途 本発明により生成されるインヒビン又はその部分は抗原
としてあるいは生理活性物質として使用することができ
る。ある１つの使用法による効果は他の使用方法による
効果と逆である場合がある。
【０１８６】１つの形態として、本発明により生成さ
れ、そして（または）ひきつづき変性処理されたインヒ
ビン又はその部分は抗原として使用することができ、従
って生殖能力を調節するために使用することができる。
ヒトを含めての脊椎動物における排卵率の上昇は生殖能
力を改善し従って繁殖性を増大し、すなわち生殖効率を
改善する。本発明の生成物は、排卵率の増加のために使
用することができ、従って例えば家畜ろヒト用の生体内
での受精のプログラミングに利用することができる。
又、家畜以外の動物にも、例えば動物園において交配を
容易にするためにも使用することができる。又本発明の
生成物は、生殖可能期を長くするために性的成熟および
思春期の到来を早めたり、および（または）交尾と分べ
んの間の期間を短かくするために畜産動物における発情
期を長くしたり、および（または）季節的な又は分べん
後の非発情期を短かくするために使用することができ
る。雄の場合には、本発明の化合物は精子形成刺激のた
めに使用することができる。
【０１８７】従って畜産業種例えばウシ、ヒツジ、ブ
タ、ヤギ、シカ、ウマ、サカナおよびトリ等の飼育にお
いて、インヒビンの投与は益のあるものである。又イン
ヒビンは活性物質として雌における排卵を抑制し又は雄
における精子形成能を低下させる手段として使用するこ
とができ、従って避妊薬としてや排卵の同時性を持たせ
るための手段として使用することができる。
【０１８８】インヒビンの部分、例えば合成ペプチド又
はＡN 断片はＦＳＨ準位を下げるための抗原として使用
することができ、そして避妊薬として又は発情期を抑制
するための薬剤として作用する。本発明の生成物は抗体
産生用に使用することができ、この抗体も又本発明の一
部に包含されるものである。又抗インヒビン抗体は診断
剤として使用することが出来る。例えばこの様な用途と
しては、ヒトを含めての脊椎動物における生殖周期の状
態をモニターする手段等がある。この様にして、排卵の
時期や排卵した卵の数を予測することが可能であり、従
って生殖周期の調整に使う治療法を決定することも出来
る。
【０１８９】この抗体は雌の顆粒層細胞機能を検知し、
あるいは雄のセルトリ細胞機能のマーカーとして、ある
いはおそらく繁殖能の高い家畜の遺伝的選択用のマーカ
ーとして使用することができる。この様に、先に記載し
た組み換えたん白質やその誘導体、相同体および類似体
は多くの種々の例えば次の様な用途を有している。 （ａ）生体内において、在来インヒビン又はその前駆体
に起因する生理的作用の１部又は全部を抑制しあるいは
禁止するための抗原又はインヒビン拮抗薬としての用
途。 （ｂ）モノクローナル又はポリクローナル抗体生成用の
抗原としての用途。 （ｃ）生体内又は生体外における生理的活性組換えイン
ヒビンの生成のための前駆体としての用途。 （ｄ）インヒビンラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およ
び酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）や
あるいは他の検出系例えば化学発光体や蛍光発光体を使
用する分析法における標準体としての用途。 （ｅ）モノクローナル又はポリクローナル抗体製剤のス
クリーニングにおける用途。 （ｆ）インヒビン又はインヒビン様アミノ酸配列（実施
例９参照）を認識する抗体の精製における用途。 （ｇ）生成内における在来インヒビン又はその前駆体に
起因する生理的作用の１部又は全部を可能にするための
インヒビン作用薬としての用途。生物活性組換えインヒ
ビンは同一細胞内で両サブユニット又はその前駆体を同
時に発現させるか、又は個々のサブユニット又はその前
駆体、類似体、相同体又は誘導体を生体外で正しく再構
築することにより生成することができる。
【０１９０】インヒビンｃＤＮＡ配列は種々の用途を有
しているが、その例を次に挙げる。 （１）原核又は真核細胞中でのたん白質合成のｃＤＮＡ
鋳型としての用途（実施例８参照）。 （２）放射性標識インヒビンｃＤＮＡプローブの製造用
のＤＮＡ鋳型としての用途。これらのプローブは色々な
種のゲノムＤＮＡ中やあるいはインヒビン又はインヒビ
ン様ペプチドを作る細胞のｍＲＮＡ中のインヒビン又は
インヒビン様配列を検出し単離するために使用すること
ができる（実施例７および８参照）。従ってこれらは、
ヒトおよび家畜動物におけるインヒビン合成および調節
を診断的に検出する能力、あるいはインヒビン遺伝子の
クローニングおよび処理における使用可能性を有してい
る。 （３）前記（２）と同様な用途の放射性標識ＲＮＡプロ
ーブの製造のためのＤＮＡ鋳型としての用途。 （４）放射性標識インヒビンの製造のためのＤＮＡ鋳型
としての用途。
【図面の簡単な説明】
【図１】ウシ顆粒層細胞ｃＤＮＡを含有する組換えプラ
スミドの合成法を示す。
【図２】ウシ顆粒層細胞のメンセンジャーＲＮＡからの
合成ｃＤＮＡの産物のポリエチレンイミンセルロース上
の薄層クロマトグラムである。
【図３】４３ｋＤ（Ａ）サブユニットおよび１５ｋＤ
（Ｂ）サブユニットプローブの配列を示す。
【図４】制限酵素（ＰｓｔＩ）地図および７個のインヒ
ビンｃＤＮＡの配列方法を示す。
【図５】ウシインヒビンＡサブユニットｃＤＮＡのヌク
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。これに選択した制限酵素部位はそのＤＮＡ配列の上
に示した。ず
【図６】図５の続きである。
【図７】ウシインヒビンＢサブユニットｃＤＮＡのヌク
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
【図８】図６の続きである。
【図９】ヒトインヒビンＡサブユニットＤＮＡのヌクレ
オチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
【図１０】図９の続きである。
【図１１】ヒトインヒビンＢサブユニットＤＮＡのヌク
レオチド配列ならびにその予想されるアミノ酸配列を示
す。
【図１２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の分子量標準（Ｓは
ｋＤで示した大きさ）としての５８ｋＤインヒビン
（Ｉ）と３１ｋＤインヒビン（ＩＩ）の構造（Ａ）；お
よび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの切片中での放射
能測定により測定した、去勢ウシ血清（ＳＳ）およびヒ
ト閉経後血清（ＰＭＳ）中で１晩培養した後の５８ｋＤ
の在来ウシインヒビンの３１ｋＤ型への変換の結果
（Ｂ）を示す。尚、ＰＢＳは、ウシ血清アルブミンを、
ＣＡは炭酸デヒドラターゼを示す。
【図１３】全長ＡサブユニットｃＤＮＡを得る方法を示
す。
【図１４】ＡおよびＢサブユニットｃＤＮＡの発現のた
めに使用するリンカーを示す。
【図１５】図１４の続きである。
【図１６】プラスミドｐＢＴＡ３０２，ｐＢＴＡ３０３
およびｐＢＴＡ３０４の地図を示す。
【図１７】Ｅ．コリ株中におけるインヒビンサブユニッ
ト融合たん白質およびβ−ガラクトシダーゼの発現を示
す。
【図１８】全長プレプロＡサブユニットｃＤＮＡの構築
法を示す。
【図１９】図１８の続きである。
【図２０】合成ペプチドで免疫化したウサギの血清ＦＳ
Ｈ位を示す。矢印はワクチン注射の時期を示す。
【図２１】牛ＡＮ断片発現のためのベクターの構成を示
す。
【図２２】プレプロＢサブユニット遺伝子の構成を示
す。
【図２３】ｐＢＴＡ４１８のプレプロＢサブユニット遺
伝子の構造を示す。
【図２４】ｐＢＴＡ３０６およびｐＢＴＡ３０７の制限
酵素（ＰｓｔＩ）地図および塩基配列法を示す。
【図２５】完全長牛イニヒビンプレプロＢサブユニット
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列とその予見されるアミノ酸
配列を示す。
【図２６】完全長ヒトインヒビンプレプロＢサブユニッ
トコーディングＤＮＡ配列とその予見されるアミノ酸配
列を示す。
【図２７】プラスミドｐＢＴＡ３０３、ｐＢＴＡ３０
８、ｐＢＴＡ３０９およびｐＢＴＡ４７２によってコー
ドされるインヒビン融合蛋白質の配列を示す。合成リン
カーにより製造された塩基は各配列の小文字で示されて
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/395 ＡＥＦ Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｋ 1/06 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ (31)優先権主張番号 ＰＨ３９６０ (32)優先日 1985年12月19日 (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＨ３９６１ (32)優先日 1985年12月20日 (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (71)出願人 594051585 モナッシュ・メディカル・センター オーストラリア国 ヴイクトリア 3004、 メルボルン、セント・キルダ・ロード（番 地なし) (71)出願人 594051596 セント・ヴインセンツ・インステイチユー ト・オブ・メデイカル・リサーチ オーストラリア国 ヴイクトリア 3065、 フイツツロイ、ヴイクトリア・パーク 41 (72)発明者 フオレイジ，ロバート・グレゴリー オーストラリア国 ニユー・サウス・ウエ ールズ 2088、モスマン、アワバ・ストリ ート 80 (72)発明者 スチワート，アンドリユー・ジヨージ オーストラリア国 ニユー・サウス・ウエ ールズ 2073、ピンブル、ロビン・ヘッ ド・ロード 26 (72)発明者 ロバートソン，デイヴイツト・マーク オーストラリア国 ヴイクトリア 3150、 グレン・ウエイヴアーリー、フロリート・ コート ６ (72)発明者 デ・クレツツアー，デイヴイツト・モリツ ツ オーストラリア国 ヴイクトリア 3127、 サリー・ヒリズ、リユーラ・ストリート １ (72)発明者 フィンドレイ，ジョン・ケール オーストラリア国 ヴイクトリア 3127、 マウント・アルバート、バロア・ロード ３

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 インヒビン又は同様な免疫学的又は生物
    学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、類縁体、
    相同体又は前駆体から成る、形質転換宿主の発現生成
    物。
  2. 【請求項２】 実質的に純粋な形の請求項１に記載の発
    現生成物。
  3. 【請求項３】 宿主と相同的な第一のポリペプチド配列
    と、インヒビン又は同様な免疫学的又は生物学的活性を
    有するポリペプチドの全部、１部、類縁体、相同体又は
    前駆体のアミノ酸配列である第２のポリペプチド配列と
    から成る、請求項２または３の発現生成物。
  4. 【請求項４】 該第１のアミノ酸配列がβ−ガラクトシ
    ダーゼの１部又は全部でありそして宿主細胞がた、コリ
    である請求項３の発現生成物。
  5. 【請求項５】 インヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１
    ５ＫＤサブユニット、インヒビンの４３ｋＤおよび１５
    ｋＤサブユニットの組合わせ、インヒビンの２０ｋＤお
    よび１５ｋＤサブユニットの組合わせあるいはその生物
    学的等価体を含有する、請求項２，３又は４の発現生成
    物。
  6. 【請求項６】 該インヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は
    １５ｋＤサブユニットが配列においてウシ又はヒトイン
    ヒビンのそれに相当するものである、請求項５の発現生
    成物。
  7. 【請求項７】 第５図の−６０から１６６のアミノ酸配
    列、第５図の−１０から１６６のアミノ酸配列、第５図
    の１から１６６のアミノ酸配列、図９及び図１０の−６
    １から１７１のアミノ酸配列、図９及び図１０の−１０
    から１７１のアミノ酸配列、図９及び図１０の１から１
    ７１のアミノ酸配列又はその生物学的等価体を含有す
    る、請求項１の発現生成物。
  8. 【請求項８】 インヒビン又は同様の免疫学的又は生物
    学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、類似体、
    相同体又は前駆体から成るポリペプチドを生合成する方
    法であって、 インヒビンの全部、１部、類似体、相同体又は前駆体の
    アミノ酸配列に相当するかあるいは発現の際にこれとコ
    ードする第１のＤＮＡ配列、該第１の配列と交雑するＤ
    ＮＡ配列、単一の又は複数の塩基置換、転換、除去およ
    び挿入を含めての前記第１の配列又は交雑配列への変異
    関連のＤＮＡ配列、又はインヒビン又は同様の免疫学的
    又は生物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、
    類似体、相同体又は前駆体を発現の際にコードするＤＮ
    Ａ配列から成る挿入ＤＮＡを有することを特徴とする組
    換えＤＮＡ分子を用意し、 該組換えＤＮＡ分子で宿主を形質転換して、該宿主がイ
    ンヒビン又はインヒビンに類似の生物学的又は免疫学的
    活性を有するポリペプチドの全部、１部又は前駆体から
    成るポリペプチドを含有するたん白質生成物を発現可能
    である様にし、 該宿主を培養して発現生成物を生成させ、そして該たん
    白質生成物を採取することからなる、該方法。
  9. 【請求項９】 該たん白質生成物が封入体として生成さ
    れる、請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】 該たん白質生成物がウシ又はヒトイン
    ヒビンの４３ｋＤ，２０ｋＤ又は１５ｋＤサブユニット
    又はその実質的な部分から成るものである、請求項８又
    は９の方法。
  11. 【請求項１１】 該たん白質生成物が第５図の−６０か
    ら１６６ノアミノ酸配列、第５図の−１０から１６６の
    アミノ酸配列、図９の１から１６６のアミノ酸配列、図
    ９及び図１０の−１０から１７１のアミノ酸配列、図９
    及び図１０の１から１７１のアミノ酸配列又はその生物
    学的等価体から成るものである、請求項８又は９の方
    法。
  12. 【請求項１２】 インヒビンの全部、１部、類縁体、相
    同体間は前駆体から成るポリペプチド又は同様の免疫学
    的又は生物学的活性を有するポリペプチドである、請求
    項８〜１１項のいずれかの方法による生成物。
  13. 【請求項１３】 インヒビン又は同様の免疫学的又は生
    物学的活性を有するポリペプチドの全部、１部、類縁
    体、相同体又は前駆体から成るポリペプチドである、組
    換えＤＮＡ技術により生成されたポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 ウシ又はヒトインヒビンの４３ｋＤ，
    ２０ｋＤ又は１５ｋＤサブユニット又はその実質的な部
    分から成る、請求項１３のポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜７のいずれかの発現生成物
    又は請求項１３〜１４のいずれかのポリペプチドを、薬
    学的に許容される希釈剤又は担体との混合物の形で含有
    してなる、薬剤組成物。
  16. 【請求項１６】 経口投与型、注射剤型又は徐放性製剤
    型である、請求項１５の薬剤組成物。
  17. 【請求項１７】 インヒビンの少なくとも１部のミノ酸
    配列を有しかつインヒビン分子又はその一部に帰する免
    疫学的又は生物学的活性を有するポリペプチドから成る
    合成ペプチド。
  18. 【請求項１８】 実質的に純粋な形の、請求項１７の合
    成ペプチド。
  19. 【請求項１９】 下記の式の配列および所望によっては
    これにカルボキシル−又はアミノ−末端チロシン残基を
    付加して成る、請求１７又は１８の合成ペプチド。 Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ− １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ− １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ− １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６
  20. 【請求項２０】 本文添付の第５，６，７又は８図に記
    載の配列の全部又は１部に相当するアミノ酸配列を有す
    る、請求項１７又は１８の合成ペプチド。
  21. 【請求項２１】 インヒビン作用薬又は拮抗薬としての
    用途又は生殖腺機能又は生殖生理機能を調節する抗原応
    答を誘発すまための用途に使用する、請求項１７〜２０
    のいずれかの合成ペプチド。
  22. 【請求項２２】 請求項１７のいずれかに記載の発現生
    成物又は請求項１３〜１４のいずれかに記載のポリペプ
    チド、又は請求項１７〜２０のいずれかに記載の合成ペ
    プチドを、脊椎動物に投与することから成る、生殖腺機
    能又は生殖生理機能を調節する方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１〜７のいずれかの発現生成
    物、又は請求項１３〜１４のいずれかのポリペプチド、
    又は請求項１７〜２０のいずれかの合成ペプチドの用途
    であって、該生成物、ポリペプチド又は合成ペプチドに
    対する抗体を生起させるように脊椎動物を免疫学的に挑
    発することから成る前記用途。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に従った脊椎動物の免疫学
    的挑発の結果として生成された抗体調製物。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜７又は１３〜１４のいずれ
    かの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又
    は前駆体、あるいは請求項１７〜２０のいずれかの合成
    ペプチドの、診断剤又は医薬としての用途。
  26. 【請求項２６】 請求項１〜７又は１３〜１４のいずれ
    かの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又
    は前駆体、あるいは請求項１７〜２０のいずれかの合成
    ペプチドの、脊椎動物における避妊薬としての用途。
  27. 【請求項２７】 請求項２４の抗体調製物を脊椎動物に
    投与することによって脊椎動物における生殖能力を増強
    せしめることである、該抗体調製物の用途。
  28. 【請求項２８】 脊椎動物をその内因性インヒビンに対
    して免疫してその生殖能力を増強させることである、請
    求項１〜７又は１３および１４項のいずれかの組換えイ
    ンヒビン又はその部分、類似体、相同体又は前駆体又は
    請求項１３および２０のいずれかの合成ペプチドの用
    途。
  29. 【請求項２９】 脊椎動物において、その性的成熟まで
    の期間を短縮しあるいは非発情期の時期を短縮するか又
    は全くなくするためのものである、請求項１〜７又は１
    ３および１４のいずれかの組換えインヒビン又はその部
    分、類縁体、相同体又は前駆体、又は請求項１３および
    ２０のいずれかの合成ペプチドの用途。
  30. 【請求項３０】 脊椎動物において、その繁殖能抑制が
    望ましい場合にその非発情期を誘発させるためのもので
    ある、請求項１〜７又は１３および１４のいずれかの組
    換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆
    体、又は請求項１３および２０のいずれかの合成ペプチ
    ドの用途。
  31. 【請求項３１】 脊椎動物において、ＦＳＨ準位を低下
    させ又は完全に０にして繁殖能抑制、ヒトの避妊又は有
    害生物の撲滅の手段としての避妊効果を達成するための
    ものである、請求項１〜７又は１３および１４のいずれ
    かの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又
    は前駆体、又は請求項１３および２０項のいずれかの合
    成ペプチドの用途。
  32. 【請求項３２】 ヒト特に男性における避妊薬とてし
    の、請求項１〜７又は１３および１４のいずれかの組換
    えインヒビン又はその部分、類縁体、相同体又は前駆
    体、又は請求項１３および２０のいずれかの合成ペプチ
    ドの用途。
  33. 【請求項３３】 脊椎動物におけるインヒビン又はその
    誘導体の準位の診断的測定においてそしてその様な診断
    的測定系用の標準体として有用である、モノクローナル
    およびポリクローナルの両抗体を生成するための反応剤
    としてのものである、請求項１〜７又は１３および１４
    のいずれかの組換えインヒビン又はその部分、類縁体、
    相同体又は前駆体、又は請求項１３および２０のいずれ
    かの合同ペプチドの用途。
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