KR100293025B1 - 고나도트로핀방출호르몬에대한면역원성캐리어시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GnRH에 대하여 포유류를 백신 접종하는 것에 관한 것이다. 이 백신은 이.콜리 팜브리알-필라멘트에 컨쥬게이트된 GnRH 펩타이드를 포함하며 GnRH에 대한 면역반응을 유도한다.
Description
제1도는 플라스미드 pPIL291-1510과 pPIL291-1519에 삽입된 올리고 뉴클레오티드로서, 암호된 GnRH 아미노산 서열은 밑줄로 표시한다.
제2도는 플라스미드 pAI 410, 430, 440 및 450 내의 재조합 HR4 부위의 DNA 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 암호된 GnRH 아미노산 서열은 밑줄로 표시하였다.
제3도는 GnRH의 아미노산 서열을 보유하는 변이 핌브리아로 처리하거나 또는 처리하지 않은 암컷 래트의 혈청중의 항-EnRH 항체 역가를 나타낸 것으로서, 5600x 혈청 희석액에서의 상대적인 결합율로 표시한다.
제4도는 보조제 만으로 처리한 래트의 발정주기를 나타낸 것으로서, 스코어 1 = 발정간기, 2 = 발정전기 또는 후기, 3 = 발정기를 의미한다.
제5도는 pAI 10410으로 처리한 래트의 발정주기를 나타낸 것으로서, 스코어 1 = 발정간기, 2 = 발정전기 또는 후기, 3 = 발정기를 의미한다.
제6도는 GnRH의 아미노산 서열을 보유하는 변이 핌브리아로 처리하거나 또는 처리하지 않은 암컷 래트의 평균 체중을 나타낸 것이다.
제7도는 GnRH의 아미노산 서열을 보유하는 변이 핌브리아로 처리하거나 또는 처리하지 않은 래트의 난소 중량을 나타낸 것이다.
제8도는 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)의 아미노산 서열을 보유하는 변이 핌브리아로 처리하거나 또는 처리하지 않은 송아지의 혈장중, 항-GnRH 항체 역가를 나타낸 것이다(5600x 혈장 희석액에서의 상대적인 결합율).
제9도는 GnRH의 아미노산을 서열을 보유하는 변이 핌브리아로 처리하거나 또는 처리하지 않은 송아지의 음낭 둘레의 증가를 나타낸 것이다.
본 발명은 "고나도트로핀 방출 호르몬(이하, GnRH)"에 대한 면역 응답을 유도해 낼 수 있는 면역원성 캐리어 시스템(immunogenic carrier system), 이 캐리어 시스템을 암호하는 재조합 DNA 서열 및 GnRH에 대해 포유류를 면역화하기 위한 캐리어 시스템의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명은 면역학 분야에 속하며, 더 구체적으로 말하자면, 본 발명은 "GnRH(또는 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)으로 칭하기도 함)"또는 이의 유사체나 유도체에 대해 면역 응답을 유도해 낼 수 있는 면역원성 캐리어 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 상기 캐리어 시스템을 암호하는 재조합 DNA 서열, 이 캐리어 시스템을 포함하는 조성물 및 GnRH에 대하여 포유류를 면역화하기 위한 캐리어 시스템의 사용 방법을 포함한다. 이 캐리어 시스템은 예를 들어 백신이나 의약 제제에 포함될 수 있다.
GnRH는 하기의 아미노산 구조를 지니며 호르몬 작용을 갖는 데카펩티드이다: pGlu - His - Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly - NH2. 이 서열에서는 통상적인 3 글자 암호를 사용하며, pGlu는 피로글루탐산이고 Gly - NH2는 글리신 아미드이다. GnRH의 mRNA는 GnRH 서열과 시그날 서열을 포함하며, 이 시그날 서열은 해독이후 절단되고 N-말단의 Gln 잔기가 고리화되어 피로-Glu을 형성한다.
캐리어 단백질에 결합된 GnRH는 포유류에 백신을 접종하는데 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 백신 접종은 GnRH의 본래 작용과 관련되 각종 원인에 대해 실시할 수 있다. 시상하부에서 형성되는 GnRH는 뇌하수체에서의 성호르몬 LH(즉, "황체 형성 호르몬") 및 FSH("난포 자극 호르몬")의 생성과 방출을 조절한다. 혈액내의 고나도트로핀 호르몬 양의 감소는 생식선의 자극 감소로 인한 것이며, 그 결과 혈액중의 스테로이드 농도가 낮아진다. 생식선 절제술 이후 얻은 스테로이드 농도와 비견할 만한 농도로 혈액내 스테로이드 농도가 감소했다는 사실로 GnRH에 대해 동물이 효과적으로 면역되었다는 것을 알 수 있다.
환자 또는 동물에게 항원으로서, 즉 면역원으로서 GnRH 또는 이의 유사체를 투여하면, GnRH 또는 이의 유사체는 백신으로서 작용하여 숙주세포는 GnRH 또는 그 유사체에 대한 항체를 산출하고 또한 숙주세포 자체의 GnRH에 대응하여 작용한다. 따라서, 상기 유사체 자체가 대사되고 배출된 이후에 상기 유사체의 효과가 유지될 것이다. 여러 가지 GnRH 유사체 또는 GnRH 자체에 대한 치료법이 이하 문헌에 기재되어 있다 : A. 아리무라 외, Endocrinology 93:1092-1103(1973) ; H.M. 프레져 외, Journal of Endocrinology 63:399-406(1974) ; S.L.제프코트 외, Immunochemistry vol 11, p 75-77(1974) ; I.J. 클라크 외, Journal of Endocrinology 78:39-47(1978) ; L.피크 외, Immunchemistry vol 15, P55-60(1978) ; V.C. 스티븐스 외, American Journal of Reproductive Immunology 1:307-314(1981) ; 및 미합중국 특허 제3,963,691호.
유럽 특허 제0,181,236호에서는 성 호르몬에 의해 자극되는 암 치료 및 기타 증상을 치료하기 위한 효과적인 피임제, 성 호르몬 활동 항진상태 치료제로 유용한 면역원성 백신을 제시하고 있다. 상기 백신은 캐리어 단백질과 GnRH로부터 유도된 하나이상의 노나펩티드 및 데카펩티드 사이의 접합체를 포함한다. 상기 면역법은 가역적이며 수술과정중에 유리하다.
국제 특허 출원 WO 88/05308호는 5 아미노산, 6 아미노산 또는 7 아미노산 길이를 갖는 GnRH의 부분 펩티드를 접합시킨, 소 혈청 알부민과 같은 면역원성 단백질을 포함하는 조성물로 포유류를 면역중화시키는 방법을 제시하고 있다.
박스트레이트(Vaxstrate ; 세계 최초로 시판된 소의 피임용 백신)는 항-GnRH 2-투여 백신으로 개시되어 있는데, 이 백신은 소의 임신을 약 80% 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 이 백신은 오일계의 백신을 보조하는 난알부민에 접합된 합성 GnRH를 사용하는 것을 포함하며, 상기 백신은 GnRH에 대한 면역을 자극한다. 이 백신은 더 높은 바디 스코어와 생성 효율을 나타낸다.
WO 90/11298호에 따라, 전술한 백신 보다 더 효능있는 백신을 수득할 수 있으며 즉, 수돼지 고기 냄새를 방지하는데 적당하다. 이 백신은 바람직하게 KLH와 같은 단백질에 접합된 GnRH 일렬 구조를 지닌 펩티드를 주성분으로 한다. 이 펩티드를 초기에 완전 프로인트 보조제(CFA)와 병용하여 사용한 후 8주후 추가 항원 투여한다.
WO 88/00056호에서는 GnRH에 대한 면역 응답을 유도하는데 충분한 양으로 GnRH 또는 그 유사체에 각각 커플링되는 2종 이상의 상이한 캐리어를 포함하는 조성물을 개시하고 있다. 일반적으로 단백질 캐리어와 보조제를 사용하며 하나이상의 추가항원 자극을 요한다.
단백질 캐리어에 접합시킨 이후 GnRH 또는 그 유사체를 사용하는, 공지된 백신은 항-GnRH 항체를 산출하는 면역시스템을 자극하는 것으로 예상되며, 상기 항체는 GnRH와 반응하여 체내의 GnRH 농도를 효과적으로 감소시킨다. 그러나 이러한 방법은 주입이후 초기 가변 기간동안 임신을 방지하는 효과는 없다.
WO 90/03182호에서, 이 문제를 해결하기 위해서 (1) 유리 GnRH 또는 이의 유사체 및 (2) GnRH 또는 이의 유사체와 캐리어 단백질 간의 면역원성 접합체를 포함하는 조성물을 사용한 용액을 제공한다. 유리 GnRH 또는 이의 유사체는 투여시부터 약 6주 동안 포유류의 임신을 방지하는 작용을 하며, 상기 접합체에 대한 반응으로 형성된 GnRH 항체가 대사될 때까지 일반적으로 약 6개월 - 2년후까지 유효하다. 그러나, 폴리펩티드 접합체 자체는 여전히 만족스러울 정도로 면역을 유발하지 못했다.
폴리펩티드 캐리어(예, 소 혈청 알부민이나 인간 혈청 알부민 또는 파상풍 독소나 타이로글로블린)와 GnRH를 접합시키는 방법은 일반적으로 커플링 방법을 포함하며, 이 방법으로 생체내에서 GnRH의 블록킹 작용을 할 수 있는 항-GnRH 항체를 수득한다는 관점에서 바람직하다고 생각되는 용액중 유리 GnRH의 구조적 특징을 모두 보유하지 못하는 약한 면역원을 산출한다. 또한, 상기 펩티드는 면역학적 인지에 중요한 부위를 거쳐 캐리어에 결합될 위험이 있다.
내인성 GnRH의 생물학적 효능을 현저하게 경감시킬 수 있는 항-GnRH 항체를 고역가로 제공하기 위해 접합체를 사용하여 포유류를 효과적으로 면역시키는 것은 바람직하지 않은 부작용을 일으키기 쉬운 보조제(일반적으로, 프로인트 완전 보조제 또는 프로인트 불완전 보조제)의 존재하에만 얻어질 수 있다. 프로인트 완전 보조제는 가축(소)에서 투베르쿨린 시험을 저해한다. 또한 프로인트 완전 보조제 뿐만 아니라 불완전 보조제도 주사부위에 다양한 정도로 만성 염증 반응을 일으킨다.
GB 2,196,969호에서 자연 아미노산 서열의 C-말단에 짧은 펩티드로 연장된 GnRH 유사체를 포함하는 백신을 제시하고 있으며, 상기 유사체는 포텐셜 에너지 계산에 의해 용액중에서 자연 GnRH와 거의 동일한 구조를 지닐 것으로 예상되며, C-말단에 제공되는 시스테인 잔기 또는 티로신 잔기의 측쇄를 거쳐 폴리펩티드 캐리어로 쉽게 연결될 수 있다.
일반적으로 전술한 백신은 임의의 항체 응답을 얻기 위해 까다로운 보조제를 수반한 다량의 백신이 요구된다. 이 백신은 GnRH와 관련된 생물학적 활성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 기재된 대부분의 백신은 면역 응답을 유도할 수 있으며, 상기 면역 응답은 GnRH에 대한 항체 형성만을 포함하며, 백신 접종된 포유류의 GnRH의 생물학적 활성에 거의 영향을 미치지 않는다. 생물학적 효과를 유출하는 이러한 백신은 100% 면역화를 제공하지 못한다.
본 발명은 GnRH 또는 GnRH의 유사체 또는 유도체에 대한 면역 응답을 크게 향상시킬 수 있는 면역원성 캐리어 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 캐리어 시스템을 사용하여 얻을 수 있는 면역 응답은 면역된 포유류에 있어서 GnRH의 생물학적 활성에 충분한 큰 영향을 미친다. 특히, 캐리어 시스템은 동물의 발정주기, 정자형성 및/또는 성적 행동을 효과적으로 억제하기 위한 용도로 적당하다. 본 발명의 캐리어 시스템은 백신에 사용될 수 있으며, 이 백신은 면역 응답을 일으키기 위해서 프로인트 완전 보조제 또는 불완전 보조제와 같은 바람직하지 못한 보조제가 더 이상 필요치 않다. 따라서, 영향을 덜 끼치는 보조제를 사용할 수 있다.
본 발명은 GnRH 또는 그것의 유사체 또는 유도체에 대한 면역 응답을 유발할 수 있는 면역원성 캐리어 시스템에 관한 것으로서, 이 캐리어시스템은 삽입물이 있는 주 서브유닛의 적어도 일부분을 포함하는 이.콜리 P-핌브리아(fimbria) 필라멘트를 적어도 일부 포함하며, 상기 삽입물은 GnRH 또는 그것의 유사체 또는 유도체에 대한 항원결정기를 하나 이상 지니는 펩티드를 포함하며, 야생형 주 서브유닛의 초가변부(hypervariable region) 4의 위치에 해당하는 위치로 상기 주요 서브 유닛에 배치된다. 이 경우 야생형은 삽입물 없는 주 서브유닛 형태를 의미한다.
핌브리아로 공지된 핌브리아 필라멘트는 긴 필라멘트형 부속지로서, 여러 박테리아 균주에서 다량으로 발견되기도 한다. 각 필라멘트는 α-이중나선 형태로 중합된 약 1000개의 서브유닛으로 구성된다(코오넨, T.K. 및 렌, M. Am. Clin. Res. 1982, 14, 272-277; 길스, C.L. 및 마아스, W.K. Prog. Vet. Microbiol. Immuno 1987, 3, 139-158). 핌브리아 구조는 매우 상세히 연구되었으며, 하이브리드 핌브리아로 공지된 재조합 핌브리아 필라멘트는 합성 펩티드를 포함하는 것으로 종래 문헌에 기재되어 있다. 핌브리아의 구조와 공지된 하이브리드 핌브리아의 설명은 이하에서 제공한다.
뇨 병원성 이.콜리와 주로 결합되어 있고 상피조직에 박테리아 부착과 관련이 있는 P-핌브리아는 한 종류의 주요 서브유닛과 몇가지 다른 소수 서브유닛을 포함한다. 소수 핌브리아 성분의 위치 및 생합성(biogenesis)은 린드버그 등에 의해 연구되어 왔다(Nature (런던) 1987 328:84-87 및 리그만 외, 1988 Mol. Microbiol. 2;73-80).
이.콜리 P-핌브리아 또는 P-핌브릴린의 주 서브유닛이 대부분을 차지하며, 항원 특징을 결정한다. 혈청형 F7-F13은 P-핌브리아에 해당하며 상기 혈청형은 주 서브유닛에 의해 특징화되는 것으로 알려져 있다. 주 서브유닛 단백질의 아미노산 서열과 다른 혈청형을 비교한 결과 상동성이 높은 서열중에 5개의 초가변부(HRs)가 나타났다. 상기 초가변부는 상기 P-핌브리아의 천연 에피토프를 포함한다(반 디 외, (1987) Microbiol. Pathogen 3:149-154 ; 반 디 외, (1988) FEMS Microbiol. Let. 49:95-100)
반 디 등은 Mol. Gen. Genet(1990) 222 : 297-303에서 혈청형 F11를 지닌 P-핌브리아의 주 서브유닛의 초가변부 1 및 4(HR1-HR4)가 이종 에피토프의 삽입에 있어서 이용되는 방법을 기술하고 있다. 다른 병원체로부터 유도되는 항원 결정기를 암호하는 몇 개의 올리고뉴클레오티드를 클론시키고 생성된 재조합 주 서브유닛을 핌브리아에 결합시키기도 했다. 이러한 핌브리아의 결합은 삽입된 펩티드의 길이가 14 아미노산을 초과하지 않을 때에만 발생한다.
도입부에 개시한 바와 같이, GnRH에 대한 면역 응답을 유발하기에 적당한 각종 시스템에서 연구를 실시하였다. 그러나, 이제까지 GnRH에 대한 면역 응답을 유발하기에 적당한 에피토프를 포함하는 하이브리드 핌브리아에 대한 실험은 개시되지 않았다.
GnRH 자체는 면역원성이 아니므로 면역원성 캐리어를 필요로 한다. 중합체 구조 때문에, 핌브리아는 높은 면역원성이 있으며 GnRH 또는 그것의 유사체나 유도체에 대한 면역원성 캐리어로서 작용할 수 있다. 또한, 본원 발명자들은 주 서브유닛에 삽입물을 지닌 P-핌브리아 필라멘트를 포함하는 이종의 합성 펩티드에 대한 면역원성 캐리어 시스템이 합성 펩티드에 대한 면역 응답을 향상시킬 수 있으며, 상기 삽입물은 GnRH에 대한 항원 결정기, 즉 일반적으로 약한 면역원성을 지니는 것으로 공지된 펩티드라고 추정하였다. 또한, 핌브리아화된 박테리아는 저 비용으로 배양할 수 있고 이 박테리아로부터 핌브리아를 쉽게 분리 및 정제할 수 있기 때문에 GnRH에 대한 면역시 사용하기 위한 면역원성 캐리어 시스템은 더 싸고 효과적이다.
그러나, 핌브리아 서브유닛의 에피토프 중 하나는, 상기 서브유닛의 형성을 저해하지 않고, 바람직하게는 이후 다수의 중합화된 서브유닛을 포함하는 핌브리아 필라멘트 형성을 저해하지 않고 대체될 수 있다. 또한, 이종 에피토프는 핌브리아 서브유닛 구조에 존재하는데, 이중 항원결정기는 면역 응답을 유발하기 위해 적당히 노출되며 서브유닛의 중합화를 방해하지 않는다.
본 발명자들은 핌브리아 구성 성분을 암호하는 주 서브유닛 유전자의 HR1에 GnRH를 암호하는 DNA 서열을 결합시키는 연구를 계속적으로 수행하였다. HR1 중에 GnRH 이외의 펩티드의 효과적인 결합을 증명하는 Van Die 등(1990, Mol. Gen. Genet. 222 : 297-303)의 연구 결과와는 대조적으로, P-핌브리아 필라멘트의 주 서브유닛의 HR1에 GnRH가 삽입된 P-핌브리아 필라멘트를 암호하는 DNA를 포함하는 미생물은 실제적으로 핌브리아들을 형성하지 못하는 것으로 판명되었다.
그러나, 놀랍게도, 본 발명자들은 핌브리아 필라멘트의 주 서브유닛의 HR4중에 GnRH에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 이종 펩티드가 삽입되어 있는 이.콜리 (E. Coli) P-핌브리아 필라멘트를 암호하는 DNA를 포함하는 미생물이 우수한 핌브리아를 형성한다는 사실을 연구 결과 밝혀냈다. 더욱 중요한 점은, 결과로서 형성된 필라멘트들이 GnRH에 대한 하나 이상의 항원결정기를 분명히 포함하며, 이러한 항원결정기가 양호하게 노출되도록 하는 배열로 되어있다는 것이다. 더욱이, 이러한 필라멘트들을 포함하는 조성물을 주사한 동물은 예상외의 높은 GnRH에 대한 항체 역가를 산출한다. 사실상, 결과의 면역 응답은 GnRH 관련 방법에서 생물학적 효과를 얻을 수 있을 정도로 높다.
따라서, 본 발명은 GnRH 또는 GnRH 유사체 또는 유도체에 대한 면역 응답을 일으킬 수 있는 면역원성 캐리어 시스템에 관한 것이며, 상기의 캐리어 시스템은 삽입물을 갖고 있는 주 서브유닛을 하나 이상 포함하는 이.콜리 (E. Coli) P-핌브리아 필라멘트의 적어도 일부를 포함하고, 상기의 삽입물은 GnRH 또는 GnRH의 유사체 또는 유도체에 대한 적어도 하나의 항원 결정기를 갖는 펩티드를 포함하며, 상기 삽입물은 야생형 주 서브유닛의 초가변부 4 (HR4) 중의 한 위치에 상응하는 주 서브유닛중의 한 위치에 배치된다.
본 발명에 따른 캐리어 시스템중에 포함되는 GnRH에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 갖는 펩티드는 서열 gln-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly (서열 번호 : 19)를 가진 GnRH를 암호화하는 데카펩티드 또는 GnRH에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 상기 서열의 유도체일 수 있다(아미노산 서열은 아미노산에 대한 통상적인 3문자 코드로 표시한다).
노나펩티드 kwsyglrpg는, 그 부분적인 펩티드(하기의 단일 문자 아미노산 서열을 갖는) # ehwsy, # ehwsyg, # ehwsygl, hwsyglr, wsyglr, syglrpg@ 및 yglrpg@(WO 88/05308 국제 특허 출원)에서와 같이, GnRH에 대한 면역 응답을 일으키는 것으로 알려져있다(미국 특허 제4,608,251호). 따라서, 상기의 유도체들은 또한 본 발명에 따른 GnRH에 대한 면역 응답을 일으키게 하기 위한 캐리어 시스템의 재조합 핌브리아 필라멘트의 일부를 포함하기에 적합한 펩티드이다.
본 발명에 따른 캐리어 시스템의 구성요소를 형성할 수 있는 기타 적당한 펩티드는 GnRH에 대한 면역 응답을 일으킬 수 있는 GnRH의 유도체 또는 유사체이다. 미국 특허 3,963,691호 및 4,608,251호에서는, 항 GnRH 항체들을 자극시키는데 유용한 GnRH 유사체들을 개시(開示)하고 있다. 따라서, 상기 특허들에 기재된 유사체 또는, P-핌브리아 필라멘트의 주 서브유닛의 일부에 포함된 펩티드로서 GnRH에 대한 면역 응답을 일으킬 수 있는 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 GnRH의 일부 다른 유사체 또는 유도체를 포함하는 캐리어 시스템은 본 발명에 따른 캐리어 시스템의 일양태이다.
본 명세서 중에서 이미 언급한 바와 같이, 혈청형 F7∼F13은 P-핌브리아로 구별되어졌다(Orskov, I., and F. Orskov. 1985. 장외 감염에 있어서의 대장균(Escherichia coli in extraintestinal infections). J. Hyg. 95 : 551-575). 다른 혈청형을 갖는 몇몇 P-핌브릴린의 아미노산 서열은 Van Die 등의 문헌에 의해 개시되어 있다(Microbiol. Pathogen. 3, 149-154, 1987). 본 발명에 따른 캐리어 시스템은 P-핌브리아들의 임의의 혈청형으로부터 유도될 수 있는 재조합 주 서브유닛을 포함할 수 있다. 실시예들에 있어서, 혈청형 F11은 본 발명에 따른 캐리어 시스템의 적당한 일양태를 예시하기 위하여 사용되어졌다.
P-핌브리아 필라멘트 부분으로서 중합된 재조합 주 서브유닛을 포함하는 캐리어 시스템 뿐만 아니라, P-핌브리아 필라멘트 부분으로서 단일 재조합 주 서브유닛을 포함하는 전술한 캐리어 시스템은 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 캐리어 시스템은 하나 이상의 주 서브유닛을 포함하는 완전한 P-핌브리아 필라멘트 또는 P-핌브리아 필라멘트의 일부분을 포함할 것이다. 완전한 재조합 P-핌브리아 필라멘트는 1000개 정도의 재조합 주 서브유닛을 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 캐리어 시스템중 중합된 재조합 주 서브유닛중의 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 면역 응답을 일으킬 수 있는 펩티드의 다수 복사체로 존재하는 것이 선호되는 것은 핌브리아 필라멘트에 대한 에피토프가 다수복사체로 존재하게 되면 이러한 에피토프에 대한 극히 높은 면역원성 활성을 유도할 수 있다는 사실 때문이다.
본 발명에 따른 캐리어 시스템은 삽입물을 갖는 주 서브유닛을 적어도 포함하는 P-핌브리아 필라멘트의 적어도 일부를 암호하는 재조합 DNA 서열의 형질발현을 통해서 얻어질 수 있으며, 상기의 삽입물은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 갖는 펩티드를 포함하며, 상기의 삽입물은 야생형 주 서브유닛의 초가변부 4(HR4) 중의 한 위치에 상응하는 주 서브유닛 중에 한 위치에 존재한다. 야생형은 본 명세서 중에서 이미 언급한 바와같이 정의된다. 따라서, 이러한 재조합 DNA 서열은 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 갖는 펩티드를 적어도 암호화하는 DNA 서열 L을 적어도 포함하며, 상기의 DNA 서열 L은 P-핌브리아 필라멘트의 야생형 주 서브유닛의 초가변부 HR4 중의 한 위치에 상응하는 한 위치에서 DNA 서열 S중에 삽입되고, 상기의 서열 S는 야생형 주 서브유닛의 적어도 일부를 암호한다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열에 있어서 DNA 서열 L에 대한 특히 바람직한 예는, 하기의 아미노산 서열들을 암호하는 DNA를 포함하는 DNA 서열 L이다 :
1) Leu-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Arg-Thr;
2) Leu-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Thr;
3) Leu-Thr-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Asp-Pro-Thr;
4) Leu-Gly-Ser-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Cly-Gly-Pro-Thr.
전술한 아미노산 서열들을 암호하는 적합한 DNA 서열들을 그 각각의 순서대로 나타낸다 :
1) TTG-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGC-CTG-CGT-CCA-GGA-TCC-CGA-ACC;
2) TTG-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGC-CTG-AGG-CCT-GGA-ACC;
3) TTG-ACT-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGC-CTG-CGT-CCA-GGG-GAT-CCA-ACC;
4) TTG-GGA-TCC-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGC-CTG-CGT-CCA-GGC-GGT-CCA-ACC.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열에 대한 적절한 예로는 주 서브유닛의 초가변부 4(HR4) 중에 삽입된 DNA 서열 L을 갖는 F11의 유전자 집단을 들 수 있다. 요병원성 이.콜리 (E. Coli), 즉, F71, F72, F8, F9, F11, 및 F13으로부터의 혈청학적으로 상이한 다양한 P-핌브리아의 합성을 담당하는 유전자들을 클로닝하였다 :
De Ree, J.M., P. Schwillens, L. Promes, I. van Die, H. Bergmans, and H. van den Bosch, 1985. 뇨병원성 이.콜리로부터의 F9 핌브리아에 대한 분자 클로닝 및 특성 규명(Molecular cloning and characterization of F9 fimbriae from a uropathogenic Escherichia coli). FEMS Microbiol. Lett. 25:163-169;
De Ree, J.M., P. Schwillens, and J.F. van den Bosch, 1985, 뇨병원성 이.콜리로부터의 F11 핌브리아의 분자 클로닝 및 단일클론 항체를 사용한 핌브리아의 특성 규명(Molecular cloning F11 fimbriae from a uropathogenic Escherichia coli and charaterization of fimbriae with monoclonal antibodies). FEMS Microbiol. Lett. 29:91-97;
Hacker, J., M. Ott, G. Schmidt, R. Hull, and W. Goebel, 1986, 이.콜리로부터의 F8 핌브리아 항원의 분자 클로닝(Molecular cloning of the F8 fimbrial antigen from Escherichia coli), GEMS,(Microbiol). Lett. 36:139-144;
Hull, R.A., R.E. Gill, P. Hsu, B.H. Minshew, and S. Falkow, 1981. 요도 감염 이.콜리 분리주로부터의 타입 1 또는 D-만노오스-저항성 필리를 암호하는 재조합 플라스미드의 구성 및 형질발현(Construction and expression of recombinant plasmids encoding type 1 or D-mannose-resistant pili from a urinary tract infection Escherichia coli isolate). Infect. Immun. 33:933-938;
Rhen, M., J. Knowles, M.E. Pentilla, M. Sarvas, and T.K. Korhonen, 1983. 이.콜리의 P-핌브리아 : 구조 유전자를 포함하는 DNA 단편의 분자 클로닝(P-fimbriae of Escherichia coli:molecular choning of DNA fragments containing the structural genes). FEMS Microbiol. Lett. 19: 119-123;
Van Die, I., G. Spierings, I. van Megen, E. Zuidweg, W.Hoekstra, and H. Bergmans, 1985. 뇨병원성 이.콜리의 F71핌브리아를 암호하는 유전자 집단의 클로닝 및 유전적 구성, 그리고 F72유전자 집단과의 비교(Cloning and genetic organization of the gene cluster encoding F7, fimbriae of a uropathogenic Escherichia coli and comparison with the F72gene cluster). FEMS Microbiol. Lett. 28: 329-334;
Van Die, I., C. van den Hondel, H.-J. Hamstra, W. Hoekstra, and H. Bergmans, 1983. 이.콜리 06:K2:H1:F7 균주의 핌브리아에 관한 연구 ; 인체 적혈구의 만노오스-저항성 적혈구 응집 반응을 야기하는 핌브리아 항원을 암호하는 DNA 단편의 분자 클로닝(Studies of the fimbriae of an Escherichia coli 06:K2:H1:F7 strain: molecular cloning of a DNA fragment encoding a fimbrial antigen responsible for mannose-resistant hemagglutination of human erythrocytes), FEMS. Microbiol. Lett. 19: 77-82.
그리고, 임의의 이들 DNA 서열 또는 그 일부분은 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열에 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열의 삽입물인 DNA 서열 L이 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 펩티드를 암호화할 뿐만 아니라 상기 펩티드를 암호하는 DNA 측면에 있는 그 이상의 아미노산들을 암호하는 DNA도 또한 포함하는 것이 바람직하다. DNA 서열 L은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 펩티드의 한 말단 또는 양 말단에 존재하는 측면 아미노산(flanking amino acid)들을 암호할 수 있다. 이러한 측면 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산들을 포함할 수 있다. DNA 서열 L이 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 펩티드의 양 말단에 측면 아미노산 서열들을 포함하는 경우, 이 측면 아미노산 서열들은 동일 길이 및/또는 동일 조성이 다를 수도 있으나, 길이 및/또는 조성이 또한 상이할 수도 있다. GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 펩티드의 한 말단 또는 양 말단에 측면 아미노산 서열 존재를 암호하는 DNA 서열 L을 포함하는 재조합 DNA 서열이 선호되며, 그 이유는 상기의 재조합 DNA 서열이 형질 발현될 때, GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기가 측면 아미노산 서열이 존재하지 않는 캐리어 시스템보다 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대해 더 양호한 면역 응답을 일으킬 수 있는 개선된 배열을 명백히 갖고 있는 본 발명에 따른 캐리어 시스템이 얻어질 수 있기 때문이다.
본 발명에 따른 바람직한 재조합 DNA 서열의 적절한 예로는 15 아미노산을 암호하는 DNA 서열 L이 있으며, 여기서, GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 항원 결정기를 하나 이상 포함하는 펩티드를 암호하는 DNA는 펩티드의 N-말단쪽의 2개의 추가적인 아미노산 및 펩티드의 C-말단쪽의 3개의 아미노산의 측면에 위치한 데카펩티드이다. 본 발명에 따른 바람직한 재조합 DNA 서열의 다른 예로는, 하나의 아미노산을 암호하는 서열에 의해서 양쪽에 이웃한, GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 암호하는 데카펩티드를 암호하는 DNA 서열 L이 있다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열은, 16 이상의 아미노산을 암호하는 삽입물을 갖는 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열을 포함하는 재조합 미생물이 재조합 핌브리아를 형성하는 능력에 있어서 극도로 제한되므로, 최대 길이가 16 아미노산인 펩티드를 암호하는 DNA 서열 L을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열에 있어서, 이 DNA 서열 L은 야생형 초가변부 4(HR4)를 전체적 또는 부분적으로 대체하는 방식으로 DNA 서열 S중에 삽입될 수 있다.
주 서브유닛의 초가변부 HR4에 상응하는 한 위치에 삽입된 GnRH 또는 GnRH의 유사체 또는 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 펩티드를 적어도 암호하는 DNA 서열 L을 갖는 DNA 서열 S를 포함하며, 상기의 DNA 서열 S는 주 서브유닛을 암호하는 DNA 서열의 인접한 상동영역 및 초가변부1(HR1)중 변이를 더 포함하는 재조합 DNA 서열은 본 발명에 따른 바람직한 재조합 DNA 서열이다. 이는 재조합 DNA 서열의 형질발현이, HR1에서의 변이가 존재하지 않는 본 발명의 동등한 캐리어 시스템 보다도 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 더욱 양호한 면역 응답을 일으킬 수 있는 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체의 하나 이상의 항원 결정기를 포함하는 본 발명의 캐리어 시스템을 유도하기 때문에 선호된다.
이러한 바람직한 재조합 DNA 서열의 적절한 예는 주 서브유닛의 적어도 일부를 암호하는 DNA 서열 S의 인접한 상동 DNA 및 초가변부 1 에서의 StuI 부위를 포함한다. 인접한 상동영역 및 초가변부 1에서의 돌연변이된 DNA 서열은 아미노산 서열 Gly-Leu-Gly을 암호한다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열을 사용하여 우수한 결과를 얻었으며, 여기서, HR4을 대체하는 DNA 서열 L은 14 아미노산을 암호화하고, Gly-Leu-Gly를 암호하는 DNA 서열은 HR1의 최종 아미노산과 인접한 상동 영역의 2개의 연속되는 아미노산을 암호하는 DNA 서열의 9개의 뉴클레오티드들을 대체한다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열은 미생물에 의한 핌브리아 필라멘트의 생합성 과정에 있어서의 각종 단계들에 필요한 DNA와 같은 추가의 DNA를 또한 포함할 수 있다. 핌브리아의 생합성은 미생물의 내막을 통한 핌브리아 서브유닛의 전위 단계, 외질 공간에서의 서브유닛의 수송 단계 및, 핌브리아내로 서브유닛의 외막으로서 서브유닛의 분출과 이에 따른 핌브리아내로의 서브 유닛의 중합 단계를 포함한다.
P-핌브리아 필라멘트의 적어도 일부를 암호하는 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열의 경우, 앞절에서 언급한 바와 같은 추가의 DNA는, 핌브리아를 생합성할 수 있는 미생물에 의해서 수행될 때, 서브유닛의 수송 및 서브유닛의 핌브리아 필라멘트내로의 중합을 위해서 형질발현되는 하나 이상의 보조 유전자들을 포함할 수 있다. 이 보조 유전자는, 서브유닛을 암호하는 DNA 서열 S가 유도될 수 있는 미생물과 동일한 혈청형을 갖는 미생물로부터 얻은 DNA에 의해서 암호될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열에서 보조 유전자를 암호하는 추가 DNA는 또한 재조합 주 서브유닛을 암호하는 DNA 서열이 유도된 미생물보다는 P-필라멘트의 상이한 혈청형을 가지는 미생물로부터 유도될 수 있으며, 이는 P-핌브리아의 상이한 혈청형을 암호하는 DNA로부터 유도된 보조 유전자가 핌브리아의 생합성에 해로운 영향을 끼치지 않고 미생물에서 상호교환될 수 있기 때문이다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열의 추가 DNA 서열은 미생물이 재조합 주 서브유닛을 분비할 수 있도록 하는 임의의 DNA 서열을 포함한다. 예를들면, 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열은 시그날 펩티드를 암호하는 추가 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 이 시그날 펩티드는 재조합 주 서브유닛이 본 발명에 따른 재조합 DNA를 형질발현시킬 수 있는 미생물의 막을 통과할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 캐리어 시스템은 형질발현 벡터로부터 전술한 재조합 DNA 서열을 형질발현시켜 얻을 수 있다. 그러므로, GnRH 또는 GnRH의 유사체 또는 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 가진 펩티드를 적어도 암호하는 하나 이상의 DNA 서열 L을 포함한 하나 이상의 재조합 DNA 서열을 함유하는 형질발현 벡터와 본 명세서에서 언급된 임의의 여러 구체적인 재조합 DNA 서열을 포함하는 형질발현 벡터가 또한 본 발명의 일부를 형성하는데, 상기 하나 이상의 서열 L은 P-핌브리아 필라멘트의 주 서브유닛의 초가변부 HR4의 한 위치에 해당하는 DNA 서열 S에 삽입되며 상기 서열 S는 하나 이상의 주 서브유닛을 암호한다. 본 발명에 따른 형질발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 방법으로(예: 미생물의 형질 전환에 의해) 상기 재조합 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 숙주 세포내로 도입될 수 있다.
GnRH 또는 GnRH의 유사체 또는 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 가진 펩티드를 적어도 암호하는 하나 이상의 DNA 서열 L을 포함한 하나 이상의 재조합 DNA 서열을 함유하는 숙주 세포와 본 명세서에서 주어진 임의의 구체적인 재조합 DNA 서열을 함유하는 숙주 세포 또한 본 발명의 범위에 속하는데, 상기 DNA 서열은 P-핌브리아 필라멘트의 주 서브유닛의 초가변부 HR4의 한 위치에 해당하는 DNA 서열 S에 삽입되며 상기 서열 S는 하나 이상의 주 서브유닛을 암호한다. 숙주 세포는 형질발현 벡터상의 재조합 DNA 서열 또는 숙주 세포의 염색체에 삽입되어 있는 상기 재조합 DNA 서열을 포함할 수 있다. 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 미생물이 바람직하다.
재조합 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포는 핌브리아를 생합성할 수 있는 것이 바람직하다. 핌브리아의 생합성은 숙주 세포의 내막을 통한 핌브리아의 서브유닛의 전위 단계, 외질 공간에 서브유닛의 수송 단계 및 외막으로의 서브유닛의 분출과 이에 따른 서브유닛의 중합 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포는 본 발명의 범위내에 있으며, 재조합 숙주 세포는 재조합 핌브리아의 생합성이 불가능하다. 이 핌브리아-재조합 미생물은 그 미생물이 재조합 주 서브유닛 또는 이것의 부분을 상기 재조합 미생물의 배양 배지속으로 분비할 수 있게 하는 DNA를 포함할 수 있다. 그러한 재조합 미생물에서, 재조합 P-핌브리아 필라멘트의 재조합 주 서브유닛은 후속하는 중합단계 또는 외막을 지나 이동하여 중합된 주 서브유닛을 포함하는 재조합 P-핌브리아 필라멘트를 형성하는 단계없이 주변 세포질 간격으로 수송될 수 있다. 이 경우에, GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 항원 결정기를 가진 펩티드를 포함하는 단일 재조합 주 서브유닛이 당분야의 전문가에게 널리 공지된 방법으로 미생물로부터 얻을 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 캐리어 시스템은 중합된 재조합 서브유닛을 포함한다. 중합된 서브유닛을 포함하는 본 발명에 따른 캐리어 시스템을 얻기 위한 간단한 방법은 미생물로 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열을 형질발현시키는 것이며, 상기 미생물은 재조합 DNA를 형질발현시킬 수 있고 그 생성 재조합 서브유닛들을 중합시킬 수 있다. 상기 중합단계는 핌브리아의 생합성 중 하나의 단계로서 외막을 통해 서브유닛이 이동하는 동안 일어날 수 있다.
생성된 재조합 핌브리아는 상기의 재조합 미생물로부터 쉽게 분리할 수 있다. 재조합 핌브리아 필라멘트의 구조를 유지하기 위하여 비변성 환경에서 분리시키는 것이 바람직하다. 리이그먼, N등은 J. Bacteriol.(1990. 172 : 1114-1120)에서 정제된 핌브리아를 수득하는 방법을 기술하였다.
재조합 미생물은 비-재조합 미생물과 쉽게 식별되는 것이 바람직하다. 이는 핌브리아의 생합성이 불가능한 미생물을 사용하거나 또는 재조합 핌브리아의 독특한 특성을 가진 핌브리아를 생산할 수 없는 미생물을 사용하여 수행될 수 있다. 임의의 핌브리아-미생물을 본 발명에 따른 재조합 DNA의 형질발현 비히클로서 사용할 수 있다.
P-핌브리아(요병원성 이.콜리에서 통상 발견됨)를 보유한 박테리아를 P-혈액 군 항원의 α-D-gal (1→4) β-D-gal 부위에 결합시킨다. 따라서, 핌브리아가 적혈구의 응집으로 쉽게 육안 관찰될 수 있는 만노즈의 존재하에 인간 적혈구에 부착될 수 있기 때문에, P-핌브리아를 운반하는 박테리아를 확인하는 것은 간단하다. 본 발명에 따른 재조합 DNA의 도입시키기 전 인간 적혈구에 부착될 수 없는 미생물을 P-형의 재조합 핌브리아 필라멘트의 형질발현 비히클로서 사용할 수 있다. 그 생성 재조합 미생물은 본래 미생물과 대조적으로 인간 적혈구에 부착할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 DNA의 형질발현 비히클의 적합한 예로는 이.콜리 K12 균주 HB101(보이어 H.W. 룰랑-듀소스 D(1969) J. Mol. Biol. 41 : 459-472)이 있다. 최근까지 HB101은 제1형 핌브리아 생산력이 결핍된 것으로 여겨졌으나, Microbial Pathogenesis(1991) 10권 481-486면에서 엘리엇, S.J. 등은 HB101의 정치 배양(standing culture)은 제1형 핌브리아를 발육시킬 수 있음을 기술하고 있다. 발육하는 핌브리아는 사실 재조합 DNA의 형질발현에서 유도된 재조합 핌브리아라는 것을 확인하기 위해서는, HB101 세포를 교반하면서 고체 배지 또는 육즙 배지에서 증식시켜야 한다.
제1형 핌브리아를 생산하지 않는 이.콜리 K12 균주의 또다른 예는 JE2571의 recA 유도체인 AM1727(반 다이 등(1983) FEMS Microbiol. Let. 19. 77-82) 이다. 본 발명에 따른 캐리어 시스템을 위한 재조합 핌브리아의 제조에 유용한 미생물의 또 다른 예로는 JA221(클라크 L ; 및 카아본 J.(1978) J.Mol.Biol. 120: 517-532)이 있다.
재조합 핌브리아 필라멘트의 생합성을 가능하게 하기 위하여 형질발현되어야 하는 DNA는 형질전환되지 않은 미생물에서 부분적으로 이용될 수 있거나 또는 상기 미생물로 도입된 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열에 완전히 포함될 수도 있다. 상기 생합성을 가능하게 하는 DNA는 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열의 일부로서 도입될 수 있으나, 또한 분리된 형질발현 벡터 상에 포함될 수도 있다.
본 발명에 따른 여러 재조합 DNA 서열을 제조하고, 형질전환에 의한 재조합체 핌브리아 필라멘트를 분리하고 정제할 수 있는 핌브리아-결핍성 미생물로 상기 서열을 형질전환시켜, 본 발명의 캐리어 시스템을 수득하는 방법이 실시예에 기재되어 있다. 실시예들에서 기술되는 재조합 DNA, 그 재조합 DNA를 포함하는 미생물 및 캐리어 시스템을 포함하는 조성물 등이 또한 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명은 또한 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대응하는 면역 응답을 유도하기에 적합한 조성물에 관한 것으로서, 이 조성물은 본 명세서에서 개시된 캐리어 시스템을 포함한다. 이 조성물은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대응하는 면역 응답을 유도하는 데 적합하며, 본 발명에 따른 재조합 DNA 서열, 예를 들어 상기한 미생물로부터 얻을 수 있는 형질발현 산물을 포함하는 조성물이 또한 본 발명의 범위에 속한다.
게다가, 본 발명은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대응하는 면역 응답을 생성시키는 상기 조성물의 사용방법에 관한 것이다. 특히, 동물에서 GnRH의 생물학적 활성에 영향을 끼치기에 충분한 양 및 방법으로 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 임신을 예방하기에 충분하도록, 동물의 발정기, 정자형성 및/또는 성적 행동을 억압하는 용도로 특히 적합하다. P-핌브리아를 생합성할 수 있는 미생물에서 유도된 캐리어 시스템을 포함하는 조성물을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대응하는 면역 응답을 유도하는데 적합한 백신 또는 임의의 의학적 제제에 사용될 수 있다.
사실 본 발명에 따른 조성물은 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대한 항원 결정기를 포함하는 여러 공지된 조성물, 백신 및 의약 제제를 위한 임의의 용도로 당분야에서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 명세서의 도입부에서 제시된 여러 가능한 용도의 예들은 본 발명에 따른 조성물의 다양한 용도의 예가 될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 프로인트 보조제 및 불완전 프로인트 보조제와 같은 강력한 보조제를 사용하지 않고, 본 발명에 따른 상기 조성물을 이용하여 상기 보조제의 부정적 효과를 수반하지 않으면서 포유류를 포함한 동물을 면역화시키는 데 사용할 수 있다. 적합한 보조제로는 예를 들어 알루미늄 염(예 : Al(OH)3, AlPO4, Al2(SO4)3), 수중유 에멀션(Bayol F(R), Marcol F(R)), 비타민-E 아세테이트 가용화질 또는 사포닌 등이 있으며, 필요에 따라 Tween(R), Span(R)과 같은 하나 이상의 유화제를 또한 백신내로 혼입시킬 수 있다.
포유류를 비롯하여 동물의 면역화에 본 발명에 따른 상기 조성물을 사용하면 무엇보다도 GnRH 또는 GnRH의 유사체나 유도체에 대응하는 항체의 형성을 유도할 뿐만 아니라, 사실 상기 조성물의 사용으로 유도된 항체에 의한 GnRH 중화로 인해 생물학적 활성의 변화를 유도한다. 특히 본 발명에 따른 조성물을 동물에게 사용하면 그 동물의 생식 활성이 억제된다.
본 발명에 따른 조성물을 백신의 형태로 투여할 수 있다. 백신은 당업자들에게 널리 공지된 방법으로 면역화시킬 포유류에 피하적으로 또는 근육내로 투여할 수 있다. 1회 이상의 추가-항원 주사가 바람직하다. 각 주사액은 0.01㎎ 내지 1㎎의 GnRH-항원 또는 GnRH-유사체-항원 또는 GnRH-유도체-항원을 포함할 수 있다.
실시예 3 및 4에서 동물을 면역화시키기 위한 본 발명에 따른 조성물의 사용방법을 자세히 설명한다.
[실시예 1]
본 실시예에서는 혈청형 F11을 가진 P-핌브리아의 주 서브유닛을 암호하는 유전자에서 GnRH를 암호하는 유전정보의 삽입에 관하여 설명한다.
A) 재조합 DNA의 제조
파스퇴르 연구소의 CNCM에 번호 I-709로 기탁된 플라스미드 pPIL291-15를 사용하여 플라스미드 pPIL291-1510 및 pPIL291-1519를 제조하였다. 플라스미드 pPIL291-15는 F11 유전자 집합체의 유전적 조직체를 포함한다. pPIL291-15의 BamHI-Cla1 단편은 F11 즉 서브유닛을 암호하는 유전자, 즉 FelA 유전자를 포함한다.
반 다이 등의 Mol. Gen. Genet(1990) 222:297-303 및 반 다이 등의 J. Bacteriol.(1988) 170:5870-5876에 기술된 대로 플라스미드 pPIL291-1510 및 pPIL291-1519를 제조하였다.
pPIL291-151의 0.7kb Hind Ⅲ - EcoRI 단편(pPIL291-15의 3kb ClaI-BamHI 단편을 클로닝하여 수득함)을 세균성 파지 벡터 m13mp8 속으로 클로닝하였다. 이 클론을 부위 특이적 돌연변이를 위한 주형으로 사용하였다. 전술한(반 다이, I. 등(1988)의 J. Bacteriol. 170 : 5870-5876) 방법과 거의 같은 이중 나선의 겔화 방법(gapped duplex method)(Nucl. Acid Res. 12 : 9441-9456)에 의해 특정 부위의 돌연변이 유발을 수행하였다.
얻어진 2본쇄 DNA 분자를 균주 HB2154로에 형질전환시키고, 백색 플라크를 선별하고 제한 단편 DNA를 분리하고 점검하였다.
HR1에 대한 돌연변이 유발 프라이머는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열 CAGCTTTTAAAGGCCTTGGAGCAGCTAAAA(서열 번호: 20)을 갖는다. 돌연변이 유발 실험에서 야생형 F11 서열의 염기 355-362를 상이한 염기로 대체함으로써, 이 부위의 3개 아미노산의 변형을 초래하여 생성 DNA 분자에 StuI 제한부위(AGGCCT)의 도입을 유도하였다.
HR4에 대한 돌연변이 유발 프라이머는 다음과 같은 뉴클레오티드 서열 TTCTTTCGATGGGTTAACCCTGAAAGATGG(서열 번호 : 21)을 갖는다. 돌연변이 유발 실험에서 야생형 F11 서열의 염기 502-520를 4개의 새로운 염기로 대체하므로써 생성 DNA 분자에 HpaI 제한 부위(GTTAAC)의 출현 및 15개 염기의 결실을 초래하였다.
이어서 HindⅢ - EcoRI 단편을 분리하고, 플라스미드 pPIL291-151의 EcoRI - HindⅢ 단편을 대체하여 관련 플라스미드 pPIL291-1510(초가변부 1, 즉 HR1에 StuI 제한 부위를 포함) 및 pPIL291-1519(초가변부 4, 즉 HR4에 HpaI 제한 부위를 포함)를 생산하는데 사용하였다. 두 클로닝 부위는 동일한 해독틀내에서 작제하였다.
다양한 길이의 여러 올리고뉴클레오티드를 pPIL291-1510 및/또는 pPIL291-1519 내로 삽입하였다. 삽입된 올리고뉴클레오티드는 모두 아미노산 서열 gln his trp ser tyr gly leu arg pro gly을 같는 데카펩티드를 암호한다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 상기 데카펩티드 측면의 아미노산 서열의 조성 및 길이가 다르다.
제1도 및 서열 번호 : 1-8은 플라스미드 pPIL291-1510 및 pPIL291-1519 내로 삽입된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 상응하는 아미노산 내로 해독된 GnRH의 암호가닥은 밑줄을 그었다.
플라스미드를 포함하는 형질전환된 세포를 분리한 후, 링커 1(서열 번호 : 1,2), 링커 4(서열 번호 : 5,6) 및 링커 5(서열 번호: 7,8)와의 삽입체를 함유하는 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 부위의 존재를 측정하여 선별하였다.
삽입체로서 링커 3(서열 번호 : 3,4)을 포함하는 플라스미드를 확인하기 위해서는, 올리고뉴클레오티드의 StuI 인지 부위는 사용될 수 없는데, 그 이유는 StuI 인지 부위 바로 다음에 2개의 구아니딘 뉴클레오티드가 있어서 이.콜리 메틸라제에 의해 인지되며 메틸화된 시티딘 잔기 때문에 제한 효소로부터 보호되는 부위가 형성되기 때문이다. 링커 3의 혼입을 선별하기 위해서는, HR1에의 삽입을 확인하기 위해 플라스미드를 StuI으로 분해하고, HR4에의 삽입을 확인하기 위해 플라스미드를 HpaI으로 분해하였다. 각각 초가변부 HR1 및 HR4에 올리고뉴클레오티드의 혼입이 성공하면 상응하는 제한효소 부위를 제거할 수 있다.
이어서 정확한 방향의 링커의 존재를 측정하기 위하여, 선별된 플라스미드를 서열 결정하였다. 원하는 방향으로 링커를 이용하여, 기술한 바와 같이 수득한 플라스미드는 pAI X.Y.O으로 명명하였는데, 여기서 X는 초가변부의 존재를 나타내며, Y는 삽입된 링커의 존재를 나타내며, O은 보조 유전자의 존재를 나타낸다.
그러므로 pPIL291-1510에서 유도된 플라스미드는 pAI 110, pAI 130, pAI 140, pAI 150으로 나타내었다. 재조합 초가변부 1(HR1)에서, 즉 플라스미드 pPIL291-1550내로 삽입한 후의 초가변부 1에서, 올리고뉴클레오티드는 글리신 잔기의 코돈뒤에 있다.
서열 번호 : 1-8 에서 입증된 링커를 포함하는 pPIL291-1519에서 수득한 플라스미드는 각각 pAI 410(서열 번호 :9,10), pAI 430(서열 번호 : 11,12), pAI 440(서열 번호 : 13,14) 및 pAI 450(서열 번호 : 15,16)으로 나타내었다. 플라스미드 pPIL291-1519의 초가변부 4(HR4)으로 삽입된 올리고뉴클레오티드는 재조합 초가변부 HR4에서 루이신 잔기뒤에 있다. 재조합 초가변부 4의 최종 아미노산은 트레오닌이다.
제2도 및 서열 번호 : 9-16에서, 플라스미드 pAI 410(서열 번호 :9,10), pAI 430(서열 번호 : 11,12), pAI 440(서열 번호 : 13,14) 및 pAI 450(서열 번호 : 15,16)의 재조합 초가변부 4(HR4)의 DNA 서열 및 그에 상응하는 아미노산 서열을 F11(서열 번호 : 17)의 아생형의 DNA 서열 및 아미노산 서열과 함께 나타내었다. 상응하는 아미노산에서 해독되는 GnRH의 암호 영역은 서열 목록(ⅸ) 특징 (B)서열의 위치 관련 정보 장에 나타내었다.
표 Ⅰ은 GnRH에 대한 하나 이상의 항원결정기를 암호하는 데카펩티드 GnRH의 측면 서열들의 비교와 재조합 초가변부 4(HR4) 및 야생형 초가변부 4(HR4)의 길이들의 비교를 나타내었다.
B) 재조합 DNA의 형질발현으로부터 얻은 핌브리아의 분석
pPIL291-15의 ClaI/BamHI 제한효소 단편은 FelA 유전자를 포함하고 있는데, 링커 1,3,4 및 5를 각각 함유하는 pAI-플라스미드의 돌연변이된 ClaI-BamHI 단편에 의해 대체시켰으며, 생성된 4개 플라스미드를 HB101의 감응세포(competent cell)로 형질전환시켰다.
혈구응집 반응 양성 클론을 DNA 제한효소 단편 분석에 의해 선별하고 검사하였다. 형질전환된 HB101 세포에 의한 하이브리드 핌브리아의 형질발현을 또한 전자 현미경으로 검사하였다. 그 결과를 표 2에 요약하였다.
이들 테스트로부터 HB101/pAI 440은 정상 F11-유전자 집합체를 보유하는 HB101/pPIL291-15와 거의 동일한 효율로 핌브리아를 형질발현시킨다는 것이 제안되었다. 핌브리아 생성은 플라스미드 pAI 410과 pAI 430을 포함하는 HB101 세포내에서 약간 감소하였다. 초가변부 1에 링커의 삽입은 세포당 단지 몇 개의 핌브리아만이 확인될 만큼 핌브리아의 생합성을 심각하게 방해하는 것으로 보였다.
재조합 핌브리아의 형질발현은 또한 야생형 F11 핌브리아를 포함하는 완전한 박테리아에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 ELISA 분석을 통해 검사하였다. 이는 새로운 연결을 통한 F11 특이성 에피토프의 변형(반 다이등의 MGG222(1990) blz. 297-303에 기술되어 있는 현상) 때문에 모노클로날 항체 사용이 불가능할 때 수행하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[재료 및 방법]
a) 박테리아
하이브리드 핌브리아를 형태유전학적으로 형질발현시키기 위해 제1형 핌브리아(fimbriae) 형성기능이 결여된 이.콜리 균주 HB101을 숙주 균주로 사용하였다(Boyer, H.W., 와 D. Roullard-Dussoix(1969) ; J. Mol. Biol. 41:459-472). 형질전환 되지 않은 세포들이 핌브리아임을 확인하기 위해 회전진탕기 상에서 HB101을 배양하였다.
DNA 서열 결정을 위해, 균주 JM101을 M13MP8 유도체용 숙주로서 사용하였다(Messing, J., 와 J. Vieria(1982) ; Gene 19 : 269-276).
부위 특이적 돌연변이 유발 실험에서는, M13mp18 유도체용 숙주 균주로서 HB 2154를 사용하였다(Carter, P., H. Bedouelle 와 G. Winter(1985) ; Nucl. Acids. Res. 13:4431-43).
박테리아는 암피실린(50㎍/㎖)을 함유하고 있는 브레인 하트 침출 육즙(Brain Heart infusion broth) 상에서 증식시켰다.
b) 효소
제조자의 지시에 따라 제한 엔도뉴클레아제들을 사용하였다.
결찰(ligation) 반응을 위해서, T4 DNA 리가아제를 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
c) DNA 분석
0.6% 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 실시하여, DNA 단편들을 분석하였다.
DNA 서열결정 반응으로는, 생거등에 의한 디데옥시사슬 종료 반응을 이용하였다(Sanger, F., S. Nicklen, A.R. Coulson(1977) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67).
d) 형질전환
Kushner에 의한 방법으로 형질전환 반응을 실시하였다(Kushner, S.R.(1978) ; p.17-23 In : H.W. Boyer 와 S.Nicosia(ed) Genetic Engeneering. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam).
e) 국소 돌연변이 유발반응
이중나선의 갭화 방법(gapped duplex method)에 의해 국소돌연변이 유발반응을 실시했다. 프라이머를 M13mp18과 함께 65℃에서 1시간 동안 주형 DNA와 하이브리드 시켰다. 이와같이 갭을 지닌 이중나선 분자를 연장시키고 결찰시키는 반응은 필요한 dNTP들, 10유니트의 T4 리가아제 및 DNA 폴리머라제Ⅰ 중 클레노우 단편 3유니트를 첨가한 후 16℃에서 4시간동안 항온처리함으로써 실시하였다.
f) 링커 합성
Applied Biosystems의 DNA 합성기 모델 381A를 사용자 매뉴얼에 제시된 방법에 따라 사용하여 GnRH 올리고뉴클레오티드들을 합성했다.
g) 링커의 삽입
플라스미드 pPIL291-1519를 이하의 방법에 따라 HpaI으로 분해했다 : 1㎍ DNA, 5유니트의 제한 효소 HpaI, 1.5μ1의 제한 완충액(10x)을 혼합하고 여기에 TE 완충액(10mH 트리스 1mM EDTA)을 가해 15μ1로 만든 혼합물을 준배하고, 이 혼합물을 37℃에서 1½ 시간동안 항온처리하였다. 그후 상기 효소는 65℃에서 10분간 가열함으로써 불활성화 시켰다. 이 혼합물을 페놀 추출한 후 알코올로 침전시켰다.
이렇게 선형화된 플라스미드는 이하의 방법에 따라 GnRH 링커를 사용해 결찰시켰다 :
5유니트의 리가아제, 1μl의 리가아제 완충액(10x), 벡터 DNA와 링커 DNA를 혼합해 10μl 부피로 만든 혼합물을 준비했다. 결찰 반응은 16℃에서 밤새 실시하였다.
형질전환 반응은 HB101의 감응 세포(Kushner, S.R.(1978) ; P. 17-23 In : H.W Boyer 와 S. Nicosia(ed) Genetic Engineering. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam) 100μl를 상기 결찰된 플라스미드와 30분간 얼음상에서 혼합시킴으로써 실시했다. 그후 혼합물은 37℃에서 5분간 열쇼크 처리했다. LB-배지를 첨가시키고 1½ 시간후에 Amp 플레이트 상에 평판시켰다. 얻어진 콜로니들을 분리하여, 배양하고, 플라스미드 DNA를 이들 콜로니로부터 분리하여 서열결정 하였다.
GnRH를 HR1 내에 삽입하기 위해 상기와 동일한 과정을 반복하되, 단 HpaI 대신 StuI을 사용해 분해를 실시했다.
h) 완전 박테리아 ELISA.
사용된 항혈청은 F11 핌프리에에 대해 산출되는 흡착된 고도면역 토끼의 항혈청이었다.
매 분석시마다, 양성 대조용 균주와 음성대조용 균주를 사용했다.
세정후 편평한 바닥을 지닌 폴리스티렌 마이크로역가 플레이트에 박테리아를 접종시켰다. 이 박테리아 현탁액을 건조시키고, 세정한 후 PBS/Tween-80/ 신생송아지 혈청으로 차단시켰다. 이후 흡착된 혈청의 일련의 희석액을 가하고, 1시간동안 37℃에서 항온처리한 후, 플레이트를 세정하고, 퍼옥시다아제- 접합된 염소- 항-토끼 IgG (H+L)을 첨가했다. 세정하고, 우레움-퍼옥사이드와 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 함유하는 TMB-기질 완충액을 가한후, H2SO4를 첨가해 반응을 종료시키고, 마이크로엘라이사 판독기를 사용해 착색정도를 측정했다. 역가는 대조군 A450의 적어도 2배에 해당하는 A450을 제공하는 항혈청의 최고 희석배수로 측정했다.
i) 하이브리드 GnRH-F11 핌브리아의 생산, 분리 및 정제.
플라스미드 pAI 410, pAI 440, pAI 10410과 pAI 10440으로 형질전환시켜 30% 글리세롤 중의 -70℃에서 유지시킨 이.콜리 K-12 균주를 2회 사전-배양시켰다 (혈액 아가 베이스 제2호(Oxoid) + 100㎍/ml 암피실린이 있는 플레이트상에서 밤새 37℃ 하에 유지시키고, 100ml의 브레인 하트 침출 배지(BHI, oxoid) + 암피실린(100㎍/ml)중의 37℃에서 7시간 동안 교반함).
주 배양을 위해, 발효조를 121 BHI, 암피실린(100㎍/ml)와 5ml의 10% PPG(소포제)로 충진시킨후, 사전 배양물을 접종하고, 17시간 동안 증식시켰다(37℃ ; 50% O2포화도, 공기로 조절함 ; 100-1000rpm 교반).
배양시킨 박테리아를 65℃로 가열(15분), pH10에서 처리(1시간, 실온, 교반) 및 원심분리(15분, 13000rpm Sorvall RC-5B, 로타 GSA)하여 핌브리아를 제거하였다.
그 상청액을 200-600ml로 농축(XM300 필터, Minitan System, Millipore)시키고, 트리스/글리신 완충액(pH10)으로 세정한 후, pH를 8.5로 조절하고, 얻어진 침전물을 4℃에서 1일이상 정치시켰다.
침전물을 수거한 후(4℃, 48,000g에서 20분간 원심분리) 펠릿을 2M 우레아와 함께 100ml의 트리스/글리신 완충액(pH 8.5) 중에 용해시켰다. 이 제조물을 농축(YM100 필터, Amicon ultrafiltration cell) 시키고, 세정(2 x 200ml 트리스/글리신 완충액 pH 8.5)하여 백신 제조를 위해 사용할때까지 -20℃에서 보관하였다.
[실시예 2]
초가변부 1에서의 돌연변이와 초가변부 4에서의 삽입을 조사하였다. StuI인지 부위를 실시예 1에 제시된 바와 같은 국소 돌연변이 유발반응에 의해 상기 플라스미드들내에 형성시켰다. 이후 핌브리아 형성 및 이 작제물의 항원성 측정을 실시예 1의 작제물과 관련해 제시한 방법으로 실시하였다.
놀라웁게도 초가변부 1에 돌연변이가 존재하면, 즉, StuI 인지 부위가 존재하면, 플라스미드 pAI 410, pAI 430 및 pAI 440처럼 형질전환 세포에 의해 동량의 핌브리아를 형성하는 재조합 DNA가 제공된다는 것을 발견하였다. 이 결과는 표 2에 제시하였다.
초가변부 1에 StuI 부위가 작제됨으로써 초가변부 4에 혼입된 링커 노출현상이 개선되는 것으로 보인다. 초가변부 1에 StuI 부위를 포함하고 있는 돌연변이체들은 면역 금(gold) 표지 실험에서 양성반응을 나타내며, 이때 플라스미드 pAI 410을 함유한 세포상에서는 동일한 실험을 실시할 때 표지를 검출할 수 없었다. 이와 같은 발견으로부터 상기 2개의 초가변부가 조사단계에서 밀착상태였다는 것을 알 수 있다.
[실시예 3]
실시예 1 및 2에 제시한 작제물로 형질 전환시킨 미생물로부터 얻은 재조합 핌브리아 필라멘트들을 함유한 핌브리아 제제로 실험을 실시하였다.
면역화 시험은 GnRH에 대한 중화 효과를 측정하기 위해 실시하였다. 이 면역화 시험은 면역시킨 포유동물의 발정주기를 파괴 또는 억제시킨다.
이 실시예에서는 GnRH의 아미노산 서열을 보유하고 있는 돌연변이 핌브리아를 암컷 래트의 예방 접종용으로 사용하였다. 이 시험들은 유일한 GnRH- 유사펩티드가 초가변부 4, HR4 내에 작제된 핌브리아와 부가적으로 다른 변화, 그러나 매우 사소한 변화가 가해진(HR1 내에 StuI 부위가 삽입된 것과 같은) 핌브리아 사이의 활성 차이를 규명하기 위해 사용하였다.
초기 위스타(Wister) 주에서 개량한 정상적인 발정주기를 지닌 성체의 암컷 래트를 선별한 후, 6주간격으로 2회에 거쳐 오일/물 혼합물(70:30, V/V ; 여기에서 오일층은 액체 파라핀(Marcol52)중에 폴리솔베이트 80과 숄비탄 모노-올리에이트를 포함하고 있으며, 수층은 증류수중에 Al(OH)3를 포함하고 있음)중에 핌브리아(50㎍) 에멀젼 0.5ml를 사용해 처리하였다. 상기 돌연 변이 핌브리아는 pAI 10410, pAI 440과 pAI 10440 이었다. 이 핌브리아 제제는 실시예 1 및 2에 제시한 대로 제조하였다. 주사전, 주사사이 및 주사이후에 매일 질의 표본(vaginal smears)을 취하고, 소정의 시간마다 후방안와 신경총(retro-orbital plexus)에서 혈액을 수거하고 혈청은 분석시까지 -20℃에서 혈청을 보관하였다. 실험말기에 동물들을 치사시켜 난소를 평량하였다.
[질(Vaginal) 표본]
매일 질 표본들을 현미경 슬라이드상에 준비했다. 건조시켜 메탄올로 고정한 후, 증류수를 사용해 1:10으로 희석한 지엠사 용액(Merck, 서독, 다름스타트 소재)으로 20분간 염색하고, 수돗물로 철저히 세척하여 건조시켰다. 각각의 표본은, 각화 및 핵화된 상피세포의 백분율과 백혈구의 백분율을 평가함으로써 현미경(100X) 상에서 평가했다.
4일의 발정주기를 갖고 있는 정상래트의 질의 상태는 발정간기- 발정전기- 발정기의 순서이다. 첨부된 도면에서 이들 발정기들을 스코어로 표시했다 ; 1=발정간기, 2=발정전기, 3=발정기.
[분석]
혈청 샘플에서 항-GnRH 항체에 의한125I-GnRH의 결합력을 방사능 면역분석법(RIA)으로 측정했다.
항온처리 이전에, 해동시킨 혈청 샘플을 분석용 완충액(Na2HPO4·2H2O, 0.01 몰/1 NaCl, 0.15몰/1 0.1% 젤라틴과 0.1% 나트륨 아지드, pH 8.0)으로 희석시켰다.
RIA는 0.1㎖ 희석혈청 샘플, 0.2㎖ 분석용 완충액과 0.05㎖의125I-GnRH로 구성된 시료 2개를 4℃에서 16시간동안 항온처리하여 실시했다. 분리전에 캐리어 단백질로서 인체 혈청 0.05㎖를 상기 튜브들에 첨가하였다.
유리된 것과 결합된 것을 분리하는 과정은 모든 튜브들에 0.5㎖의 Peg 용액(젤라틴은 함유하고 있지 않은 분석용 완충액중에 40%의 Peg-4000)을 첨가하여 실시하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고, 침전을 감마-분광계로 계수하였다.
역가는 비특이적 결합 대 첨가된 방사능 활성의 총량에 대해 보정함으로써 방사능의 상대적 백분율로 계산하였다.
[결과]
[항-GnRH 항체와 발정주기에서의 영향]
(제3-5도)
- 보조제만으로 처리한 동물의 혈청은 항-GnRH 항체를 나타내지 않았다. 이들 동물에서 발정주기가 억제되는 현상은 관찰되지 않았다.
- 돌연변이 핌브리아로 처리한 모든 동물들은 발정주기의 파괴 및 억제 현상을 초래하는 항체 혈청 결합현상을 나타내었다.
[체중]
특히 pAI 10410 또는 pAI 10440으로 처리된 래트에서 위약으로 처리한 동물에 비해 추가항원 주사후 3∼5주 경에 더 높은 체중을 나타내었다(제6도).
[난소 중량]
모든 돌연변이 핌브리아는 난소 중량을 감소시킨다(제7도).
[실시예 4]
래트에서 실험을 실시한 것외에, 동일한 제제를 숫송아지에서 시험했다. 4개월령의 교잡시킨 숫 송아지들을 오일/물 혼합물(70:30, V/V; 이중 오일층은 액상 파라핀(Morcal 52) 중에 폴리솔베이트 80과 솔비탄 모노-올레이트를 함유하고 있고, 물층은 증류수 중에 Al(OH)3을 함유하고 있음) 중의 핌브리아(200㎍) 유화액 2ml를 8주 간격으로 2회 피하주사하였다. 돌연변이 핌브리아는 pAI 410, pAI 10410, pAI 440과 pAI 10440이었다. 이 핌브리아 제제는 실시예 1 및 2에 제시한 대로 얻었다. 상기 주사처리전, 사이, 및 이후에 매주 음낭둘레를 측정하고, 소정의 시간째에 경정맥에서 혈액을 수거하고 혈장을 분석때까지 -20℃에서 보관하였다.
[분석]
혈장샘플들내에서의 항-GnRH 항체들에 의한125I-GnRH의 결합력은 실시예 3에 제시한 바와 같은 방사능 면역분석법(RIA)으로 측정하였다.
[결과] (제8 및 9도)
- 보조제로만 처리한 동물의 혈장은 항-GnRH 항체들을 함유하고 있지 않았다. 상기 4마리의 숫송아지의 경우 실험기간 동안 음낭둘레가 정상적으로 증가되었다.
- 항체 결합은 pAI 410으로 처리한 숫송아지의 혈장에서 관찰되었고, 여기에서 그들의 음낭둘레는 대조용 동물에 비해 감소되는 결과를 나타내었다.
- 항체 결합현상이 pAI 440으로 처리한 숫송아지의 혈장에서 관찰되었으며, 한 동물에서는 매우 높게 나타났다. 이결과 대조용 동물에 비해 음낭둘레가 감소되었다.
- pAI 10410으로 처리한 숫컷들은 높은 혈장 항체 결합력을 나타내었으며, 특히 추가항원주사 직후 대조용 동물에 비해 음낭 성장이 상당히 억제되었다.
- pAI 10440으로 처리한 숫컷들은 혈장 항-GnRH 항체 결합현상을 나타내었고, 대조용 동물에 비해 음낭 성장도 상당히 감소했다.
- HR1 내에 Stu1 부위가 첨가되면, 링커 1 또는 4중 어느것이 사용되었는지와는 무관하게 항-GnRH 항체의 유도현상과 그의 활성이 상당히 개선되었다.
aa = 아미노산
wt = 원미생물의 HR4, 삽입체 없음.
돌연변이 핌브릴링(fimbrillins)을 암호하는 플라스미드를 보유하는 HB101 세포에 의한 핌브린아의 형질발현.
[서열 목록]
(1) 일반정보
(ⅰ) 출원인:
(A) 명칭 : 악조 엔. 브이.
(B) 거리명 : 벨페르베그 76
(C) 도시명 : 아르넴
(E) 국가명 : 네덜란드왕국
(F) 우편번호(ZIP) : 6824 비엠
(G) 전화번호 : 04120-66223
(H) fax번호 : 04120-50592
(I) Telex : 37503 akpha nl
(ⅱ) 발명의 명칭 : GnRH에 대한 캐리어시스템
(ⅲ) 서열수 : 21
(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 상용성
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(2) 서열 번호 1에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 36 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA(게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 2..31
(xi) 서열 : 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 31 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2 본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 2..31
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : misc_difference
(B) 서열의 위치 : 치환(31, ˝˝)
(xi) 서열 : 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 39 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 5..34
(xi) 서열 : 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 42 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 8..37
(xi) 서열 : 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 8:
(2) 서열 번호 9에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 48 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 7..36
(xi) 서열 : 서열 번호 9:
(2) 서열 번호 10에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 10:
(2) 서열 번호 11에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 42 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 7..36
(xi) 서열 : 서열 번호 11:
(2) 서열 번호 12에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 12:
(2) 서열 번호 13에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 51 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 10..39
(xi) 서열 : 서열 번호 13:
(2) 서열 번호 14에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 14:
(2) 서열 번호 15에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 54 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 13..42
(xi) 서열 : 서열 번호 15:
(2) 서열 번호 16에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 16:
(2) 서열 번호 17에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 27 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(ⅸ) 서열의 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 서열의 위치 : 1..27
(xi) 서열 : 서열 번호 17:
(2) 서열확인번호 18에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 9 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(xi) 서열 : 서열 번호 18:
(2) 서열 번호 19에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 10 아미노산
(B) 서열형 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅴ) 단편형 : 중간
(xi) 서열 : 서열 번호 19:
(2) 서열 번호 20에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(xi) 서열 : 서열 번호 20:
CAGCTTTTAA AGGCCTTGGA GCAGCTAAAA
(2) 서열 번호 21에 대한 정보
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 서열형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 2본쇄
(D) 형태 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA (게놈성)
(ⅲ) 추정 서열 : 아니오
(ⅲ) 안티-센스 : 아니오
(xi) 서열 : 서열 번호 21:
TTCTTTCGAT GGGTTAACCC TGAAAGATGG
Claims (10)
- 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)에 대한 면역 응답을 유도하는 면역원성 캐리어 시스템(immunogenic carrier system)으로서, 상기 캐리어 시스템은 삽입물을 지닌 주 서브유닛의 적어도 일부분을 포함하고 있는 이.콜리 P-핌브리아 필라멘트의 적어도 일부를 포함하며, 상기 삽입물은 GnRH, GnRH의 유사체 또는 GnRH의 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 보유하는 펩티드를 포함하고 야생형(wild type) 주 서브유닛의 초가변부 4의 한 부위에 해당하는 부위에서 상기 주 서브유닛에 위치하며, 상기 주 서브유닛은 야생형 주 서브유닛의 초가변부 1 및 인접한 상동부의 아미노산 서열에서 StuI 인지 부위를 형성하는 돌연변이를 더 포함하는 면역원성 캐리어 시스템.
- 제1항에 있어서, GnRH에 대한 항원 결정기를 보유하는 펩티드가 아미노산 서열 Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(서열 번호 1)로부터 유도되는 면역원성 캐리어 시스템.
- 제1항에 있어서, 주 서브유닛이 혈청형 F-11를 갖는 P-필라멘트로부터 유도되는 면역원성 캐리어 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 삽입물의 최대 길이가 16 아미노산인 면역원성 캐리어 시스템.
- 제1항에 있어서, 상기 삽입물이 GnRH, GnRH의 유사체 또는 GnRH의 유도체에 대한 항원 결정기를 보유하는 펩티드의 측면에 있는 하나 이상의 아미노산을 더 포함하는 면역원성 캐리어 시스템.
- 삽입물을 갖는 이.콜리 P-핌브리아 필라멘트 주 서브유닛의 적어도 일부를 암호하는 재조합 DNA 서열로서, 상기 삽입물은 GnRH, GnRH의 유사체 또는 GnRH의 유도체에 대한 하나 이상의 항원 결정기를 보유한 펩티드를 포함하고 야생형 주 서브유닛의 초가변부 4의 한 부위에 해당하는 부위에서 주 서브유닛에 위치하며, 상기 주 서브유닛은 야생형 주 서브유닛의 초가변부 1 및 인접한 상동부의 아미노산 서열에서 StuI 인지 부위를 형성하는 돌연변이를 더 포함하는 재조합 DNA 서열.
- 제6항에 기재된 재조합 DNA 벡터 서열을 포함하는 형질발현 벡터.
- 제6항에 기재된 재조합 DNA 서열을 포함하며, 상기 재조합 DNA 서열을 형질발현할 수 있는 미생물.
- 제8항에 있어서, 핌브리아의 생합성(biogenesis)이 가능한 미생물.
- 동물에서 GnRH에 대한 면역 응답을 유도할 수 있는 백신으로서, 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 기재된 면역원성 캐리어 시스템 또는 제7항에 의한 형질발현 벡터, 또는 제8항 또는 제9항에 기재된 미생물을 유효량 포함하고, 임의로 백신에 일반적으로 사용되는 하나 이상의 보조제 또는 기타 화합물을 포함하는 백신.
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