HU217096B - GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas immunogén hordozórendszer, ezt hordozó rekombináns DNS-szekvencia és ennek alkalmazása - Google Patents
GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas immunogén hordozórendszer, ezt hordozó rekombináns DNS-szekvencia és ennek alkalmazása Download PDFInfo
- Publication number
- HU217096B HU217096B HU9301764A HU9301764A HU217096B HU 217096 B HU217096 B HU 217096B HU 9301764 A HU9301764 A HU 9301764A HU 9301764 A HU9301764 A HU 9301764A HU 217096 B HU217096 B HU 217096B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gnrh
- subunit
- dna sequence
- recombinant dna
- analogue
- Prior art date
Links
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 62
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 28
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims description 27
- 101150108262 gnrh1 gene Proteins 0.000 title 1
- NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N GnRH Chemical group C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 NMJREATYWWNIKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 114
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 41
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 20
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- YBDOQKVAGTWZMI-XIRDDKMYSA-N His-Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N YBDOQKVAGTWZMI-XIRDDKMYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N Leu-Arg-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 claims description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 3
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 48
- 238000003287 bathing Methods 0.000 abstract 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N Arg-Pro-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HGKHPCFTRQDHCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000004706 scrotum Anatomy 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 5
- NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NSTUFLGQJCOCDL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N His-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 FBTYOQIYBULKEH-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 A1 (OH) 3 Chemical class 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 101150047844 F1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 2
- MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N O.O.O.[Al] Chemical compound O.O.O.[Al] MXRIRQGCELJRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N Ser-Tyr-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FHXGMDRKJHKLKW-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BIWVVOHTKDLRMP-ULQDDVLXSA-N Tyr-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BIWVVOHTKDLRMP-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000009329 sexual behaviour Effects 0.000 description 2
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001621104 Escherichia coli O6 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical group NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VGPCJSXPPOQPBK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010058823 Ovarian mass Diseases 0.000 description 1
- 241001516577 Phylloxera Species 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 MYVYPSWUSKCCHG-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- ABRICLFKFRFDKS-IHPCNDPISA-N Trp-Ser-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ABRICLFKFRFDKS-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 108010003786 Vaxstrate Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-UHFFFAOYSA-N alpha-D-galactose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N alpha-D-glucopyranose Natural products OCC1OC(O)C(O)C(O)C1O WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940124462 contraceptive vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 1
- BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N glycinamide Chemical compound NCC(N)=O BEBCJVAWIBVWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Gyroscopes (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
Abstract
A találmány szerinti imműnőgénhőrdőzó rendszer jellemző vőnása, hőgylegalább egy E. cőli P-fimbrilla-szálat tartalmaz, amely legalább egy,inszertet hőrdőzó főalegységet tartalmaz, ahől az inszert a GnRH,ennek analógja vagy származéka, legalább egy antigén determinánsáthőrdőzó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típűsú főalegység4 hipervariábilis szakaszának megfelelő pőzícióban helyezkedik el, ésahől a főalegység műtációt tartalmaz a vad típűsú főalegység 1hipervariábilis szakaszának vagy az ezzel szőmszédős hőmőlógszakasznak megfelelő aminősavszekven- ciában. A találmány kiterjed azE. cőli P-fimbrilla-szál főalegységet kódőló DNS-szekvenciára, ezttartalmazó expressziós vektőrra és mikrőőrganizműsra, valamint azimműnőgénhőrdőzó rendszert tartalmazó vakcinára. ŕ
Description
A találmány egy olyan immunogénhordozó rendszerre vonatkozik, amely a gonadotropinfelszabadító hormon, az angol név (Gonadotropin Releasing Hormoné) szerint rövidítve a továbbiakban GnRH, vagy más néven a luteinizálóhormont felszabadító hormon (LHRH), ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas. A találmány kiterjed a fenti immunogénhordozó rendszert kódoló rekombináns DNSszekvenciára, valamint emlősök GnRH elleni immunizálására.
A találmány kiterjed a fenti hordozórendszert kódoló rekombináns DNS-szekvenciára, a hordozórendszert tartalmazó készítményre, valamint ennek alkalmazására emlősök GnRH elleni immunizálásához. A hordozórendszer alkalmazható például vakcina vagy gyógyszerkészítmény formájában.
A GnRH egy hormonális aktivitással rendelkező dekapeptid, amelynek aminosavszekvenciája:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, ahol a szokásos hárombetűs kódot használjuk, és pGlu jelentése piroglutaminsav, illetve Gly-NH2 jelentése glicinamid. A GnRH-nak megfelelő mRNS tartalmazza a GnRH-szekvenciát, és azt a szignálszekvenciát, amely a transzláció után lehasad, amit az N-terminális Gin ciklizálása követ, amikor is pGlu keletkezik.
Ismert, hogy a GnRH egy hordozófehérjéhez csatlakozik, és így emlősök vakcinálására felhasználható. Az ilyen vakcinálás különböző okokból válhat szükségessé, amelyek mindegyike összefüggésben van a GnRH természetes funkcióival. A hipotalamuszban képződött GnRH a hipofízisben szabályozza az LH (luteinizálóhormon) és FSH (tüszőstimuláló hormon) szexuális hormonok termelését és felszabadulását. A gonadotrof hormonok vérszintjének csökkenése csökkenti az ivarmirigyek stimulálását, amelynek eredménye a vér szteroidszintjének csökkenése. Az ivarmirigyek eltávolításával kapott alacsony szinttel összehasonlítható szteroidszint elérhető az állatnak GnRH elleni hatékony immunizálásával.
Ha egy betegnek vagy állatnak antigénként, vagyis immunogénként GnRH-t vagy ennek analógját adagoljuk, akkor ez vakcinaként működik, és a gazdaszervezet antitesteket termel a GnRH vagy ennek analógja ellen, amely a szervezet saját GnRH-ja ellen is fellép. Ez azt jelenti, hogy az analóg által kiváltott hatás akkor is változatlanul fennmarad, amikor az analóg maga már lebomlott vagy kiválasztódott. Ez a kezelés megvalósítható GnRH-val vagy különböző GnRH-analógokkal [A. Arimura és munkatársai: Endocrinology, 93, 1092-1103. (1973); Η. M. Fraser és munkatársai: Journal of Endocrinology, 63, 399-406. (1974); S. L. Jeffcoate és munkatársai: Immunochemistry, 11, 75-77. (1974); I. J. Clarké és munkatársai: Journal of Endocrinology, 78,39-47. (1978); L. Pique és munkatársai: Immunochemistry, 75, 55-60. (1978); V. C. Stevens és munkatársai: American Journal of Reproductive Immunology 1, 307-314. (1981); valamint a 3 963 691 számú USA-beli szabadalmi leírás].
A 181 236 számú európai szabadalmi leírás olyan immunogén vakcinát ismertet, amely hatékony fogamzásgátló szerként, szexuális hiperaktivitás kezelésére alkalmas anyagként, rák és más szexuális hormonok által stimulált állapotok kezelésére alkalmas anyagként használható. A vakcina egy hordozófehérjéből és egy vagy több, GnRH-ból származó nona- és dekapeptidből álló konjugátumot tartalmaz. Az immunizálás reverzibilis, ami sebészeti beavatkozás esetén előnyös.
A WO 88/05308 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés emlősök immunsemlegesítésére alkalmas eljárást ismertet, amelyhez immunogén fehérjét, így boíjúszérum-albumint és ezzel konjugált 5, 6 vagy 7 aminosav hosszúságú, részleges GnRH-peptidet tartalmazó készítményt alkalmaznak.
Az első, kereskedelmi forgalomban kapható szarvasmarhafogamzás-gátló vakcina, a Vaxstrate egy antiGnRH kétdózisú vakcina, amely a kiválasztott állatok mintegy 80%-ánál megakadályozza a terhességet. A vakcina ovalbuminnal konjugált szintetikus GnRH-t tartalmaz olajalapú vakcinában, amely stimulálja a GnRH elleni immunitást. A vakcina nagyobb testtömeget és gyorsabb növekedést eredményez.
A WO 90/11298 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint a fentinél kedvezőbb vakcina állítható elő, amely különösen alkalmas a hús hímszagának csökkentésére. A vakcina a GnRH tandem szerkezetével rendelkező peptidhez konjugált fehérjén, így KLH-n alapszik. A peptidet elsősorban komplett Freund-adjuvánssal (CFA) kombinálva használják, amit 8 hét után egy emlékeztetővakcínálás követ.
A WO 88/00056 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés olyan készítményt ismertet, amely egyedileg GnRH-hoz vagy ennek analógjához kötött, két vagy több különböző hordozóanyagot tartalmaz a GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas mennyiségben. Általában egy fehérjehordozót és egy segédanyagot alkalmaznak, és egy vagy több emlékeztető vaké inálásra van szükség.
A GnRH-hoz vagy ennek analógjához konjugált fehérjehordozókat tartalmazó ismert készítményekről feltételezik, hogy anti-GnRH-antitestek termelésére stimulálják az immunrendszert, ami a GnRH-val reagálva hatékonyan csökkenti annak koncentrációját. Ez a technika azonban a fogamzás megelőzésére nem alkalmazható a befecskendezést követő első, és különböző hosszúságú periódusra.
A WO 90/03182 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés a probléma megoldására olyan készítményt javasol, amely egyrészt szabad GnRH-t vagy ennek analógját, másrészt GnRH-ból vagy ennek analógjából és hordozófehérjéből álló immunogén konjugátumot tartalmaz. A szabad GnRH vagy ennek analógja emlősökben megakadályozza a fogamzást az adagolást követő mintegy 6 héten keresztül, míg a konjugátum válaszaként képződött GnRH-antitestek általában mintegy 0,5-2 éven belül bomlanak le. Az alkalmazott polipeptidkonjugátum azonban immunológiai szempontból eddig nem volt kielégítő.
A GnRH polipeptid hordozóhoz, például borjú- vagy humán szérumalbuminhoz, tetanusztoxoidhoz vagy tiroglobulinhoz történő hozzákötése során általában össze2
HU 217 096 Β kapcsolást végeznek, amikor is a kapott, nehezen definiálható immunogén anyag nem mindig őrzi meg a szabad GnRH összes szerkezeti jellemzőjét, ami szükséges lenne a GnRH-fiuikciók in vivő blokkolására alkalmas antiGnRH-antitestek termelése szempontjából. Fennáll továbbá az a veszély, hogy a peptid a hordozóhoz olyan szakaszon keresztül kapcsolódik, ami az immunológiai felismerés szempontjából fontos lenne.
Az ilyen konjugátumokkal emlősök hatékony immunizálása, amikor az endogén GnRH biológiai hatékonyságának jelentős csökkentésére alkalmas, nagy mennyiségű anti-GnRH-antitest keletkezik, csak olyan segédanyag jelenlétében biztosítható, amely nemkívánatos mellékhatásokat okozna. A leggyakrabban a Freund-féle komplett vagy nem komplett adjuvánst használják. A Freund-féle komplett adjuváns szarvasmarháknál közreműködik a tuberkulintesztben. Emellett ez az adjuváns a Freund-féle nem komplett adjuvánssal együtt különböző krónikus, gyulladásos reakciókat vált ki az injekció helyén.
A 2196969 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás olyan vakcinát ismertet, amely a természetes aminosavszekvencia C-terminális végén rövid peptidszakasszal kiterjesztett GnRH-analógot tartalmaz, és amelyről a potenciális energiaszámítások alapján feltételezik, hogy oldatban a természetes GnRH-val lényegében azonos konformációt vesz fel, és a C-terminális végen található cisztein- vagy tirozinmaradék oldalláncán keresztül könnyen hozzákapcsolható a polipeptidhordozóhoz.
Az ismert vakcinákban az antitestválasz kiváltásához kísérőanyagként általában nagy mennyiségben kell különböző segédanyagokat alkalmazni. Ezek az anyagok a GnRH által kiváltott biológiai aktivitást általában nem, vagy legfeljebb csak kismértékben befolyásolják. A legtöbb ismert vakcina alkalmas immunválasz kiváltására, de az immunválasz csak a GnRH elleni antitest képződését jelenti, és ritkán befolyásolja a GnRH biológiai aktivitását a vakcináit emlősben. A biológiai hatáshoz vezető ismert vakcinák tehát 100%-os immunizálást nem eredményeznek.
A találmány olyan immunogénhordozó rendszerre vonatkozik, amely GnRH, ennek analógja vagy származéka ellen lényegesen jobb immunválasz kiváltására képes. A találmány szerinti hordozórendszerrel kapott immunválasz megfelelően erős a GnRH biológiai aktivitásának befolyásolására az immunizált emlősben. A hordozórendszer különösen előnyös az ivari ciklus, a spermaképzés és/vagy az állat szexuális viselkedésének hatékony elnyomására. A találmány szerinti hordozórendszer vakcinában alkalmazható, ahol a vakcina az immunválasz kiváltásához már nem igényel olyan agresszív segédanyagokat, mint a Freund-féle komplett vagy nem komplett adjuváns, hanem kevésbé agresszív segédanyagok is felhasználhatók.
A találmány tárgya tehát GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas immunogénhordozó rendszer, amely legalább egy E. coli P-fimbrilla-szálat tartalmaz, amely legalább egy, inszertet hordozó főalegységet tartalmaz, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység 4 hipervariábilis szakaszának megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol a főalegység mutációt tartalmaz a vad típusú főalegység 1 hipervariábilis szakaszának vagy az ezzel szomszédos homológ szakasznak megfelelő aminosavszekvenciában.
A vad típus alatt jelen esetben az inszert nélküli főalegységet értjük.
A fimbrillaszálak vagy más néven rojtok olyan, hosszú szálú nyúlványok, amelyek különböző baktériumtörzsekben gyakran nagy mennyiségben megtalálhatók. Minden szál mintegy 1000 alegységből van felépítve, amelyek α-hélix formájában vannak polimerizálva [Korhonen T. K. és Rhen M.: Am. Clin. Rés. 14, 272-277. (1982); Giles C. L. és Maas W. K.: Prog. Vet. Microbiol. Immuno 3,139-158. (1987)]. A rojtok szerkezetét részletesen tanulmányozták, és ismertek szintetikus peptidekből kialakított rekombináns fimbrillaszálak is, más néven hibrid rojtok. A rojtok szerkezetét és az ismert hibrid rojtokat az alábbiakban ismertetjük.
A P-fimbrilla főleg uropatogén Esherichia coliban található meg, és részt vesz a baktériumnak az epitéliális szövethez történő kötődésében, továbbá egyfajta főalegységből, és többfajta, különböző, kis alegységből áll. A kisebb fimbrillakomponensek elhelyezkedését és biogenezisét korábban tanulmányozták [Lindberg és munkatársai: Natúré, 328, 84-87. (1987); Riegman és munkatársai: Mól. Microbiol. 2, 73-80. (1988)].
Az E. coli P-fimbrilla főalegysége predomináns, és meghatározza az antigéntulajdonságokat. A P-fimbrillához az F7-F13 szerotípusok rendelhetők hozzá, ahol az említett szerotípusok a főalegység szerint különböztethetők meg. A különböző főalegység fehéréinek aminosavszekvencia-összehasonlítása alapján öt hipervariábilis szakasz (HR) különböztethető meg az egyébként homológ szekvenciák között. Az említett hipervariábilis szakaszok a P-fimbrilla természetes epitópjait tartalmazzák [Van Die és munkatársai: Microbiol. Pathogen, 3, 149-154. (1987); Van Die és munkatársai: FEMS Microbiol. Let. 49, 95-100. (1988)].
Az FII szerotípusú P-fimbrilla-főalegység 1 és 4 hipervariábilis szakaszát (HR1 és HR4) idegen epitópok beépítésére használják [Van Die és munkatársai: Mól. Gén. Génét 222, 297-303. (1990)]. Különböző patogénekből származó antigéndeterminánsokat kódoló oligonukleotidokat klónoztak, és a kapowtt rekombináns főalegységet több esetben beépítették a fimbrillába. A fimbrillába történő beépítés csak akkor eredményes, ha a bevitt peptid hossza nem lépi túl a 14 aminosavat.
Mint a bevezető részben említettük, egy sor kísérletet végeztek GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas különböző rendszerek kidolgozására. Eddig azonban még nem végeztek kísérletet a GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas epitópot tartalmazó hibrid fimbrillával.
A GnRH önmagában nem immunogén, és ezért immunogén hordozót igényel. Polimer szerkezetük
HU 217 096 Β miatt a fimbrillák erősen immunogén jelleggel bírnak, és lehetséges immunogén hordozóként szolgálhatnak GnRH, ennek analógja vagy származéka esetében. Emellett feltételeztük, hogy a főalegységében egy inszertet hordozó P-fímbrilla-szálat tartalmazó, idegen szintetikus peptidből álló immunogénhordozó rendszer esetében, ahol az inszert GnRH elleni antigéndeterminánst tartalmaz, az általában gyengén immunogén peptid fokozott immunogén választ válthat ki az adott szintetikus peptid ellen. Az a tény továbbá, hogy a rojtos baktériumok kis költséggel tenyészthetők, és a rojt könnyen eltávolítható és tisztítható, a GnRH elleni immunizálásra alkalmas olcsó és hatékony immunogénhordozó rendszerhez vezethet.
Ez azonban csak akkor valósítható meg, ha a fimbrillaalegység epitópjai közül egy helyettesíthető anélkül, hogy befolyásolnánk az alegység képződését, és előnyösen a nagyszámú polimerizált alegységet tartalmazó fimbrillaszál ezt követő kialakítását. További feltétel, hogy az idegen epitóp a fimbrillaalegységben olyan konfigurációban legyen, amely azonos az antigéndetermináns immunválasz kiváltására alkalmas feltételezett konfigurációjával, és nem befolyásolja az alegységek polimerizálását.
A GnRH-t kódoló DNS-szekvenciának a fimbrillakomponenst kódoló főalegységén HR1 szakaszába történő beépítése során azt tapasztaltuk, hogy az ismert eredményekkel [Van Die és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 222, 297-303. (1990)] ellentétben a GnRH-tól eltérő peptidnek a HR1 szakaszba történő hatékony beépülését demonstrálva a P-fimbrilla-szál főalegységének HR1 szakaszában GnRH-inszerciót hordozó Pfimbrilla-szálat kódoló DNS-t tartalmazó olyan mikroorganizmus állítható elő, amely gyakorlatilag képtelen a rojt előállítására.
A további kísérletek során azonban meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a fimbrillaszál főalegységének HR4 szakaszában a GnRH legalább egy antigéndeterminánsát tartalmazó idegen peptidinszertet hordozó E. coli P-fimbrilla-szálat kódoló DNS-t tartalmazó mikroorganizmus képes a rojt megfelelő előállítására. Sőt, a kapott szálak a GnRH legalább egy antigéndeterminánsát tartalmazzák a hatékony kifejezéshez szükséges konfigurációban. Emellett az ilyen szálat tartalmazó készítménnyel kezelt állat meglepően nagy mennyiségben termeli a GnRH elleni antitesteket. A kapott immunválasz a gyakorlatban olyan erős, hogy biológiai hatást gyakorol a GnRH-val összefüggő folyamatra.
A találmány szerinti immunogénhordozó rendszer jellemző vonása, hogy egy inszertet hordozó főalegység legalább egy részét tartalmazó E. coli P-fimbrillaszál legalább egy részét tartalmazza, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység 4 hipervariábilis szakaszának (HR4) megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol az inszertet hordozó főalegység mutációt tartalmaz a vad típusú főalegység 1 hipervariábilis szakaszának vagy az ezzel szomszédos homológ szakasznak megfelelő aminosavszekvenciában.
A találmány szerinti hordozórendszer a GnRH legalább egy antigéndeterminánsát hordozó pepiidként előnyösen GnRH-t kódoló dekapeptidet tartalmaz, amelynek szekvenciája gln-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly (19. számú szekvencia), vagy ennek a szekvenciának a származékát tartalmazza, amely a GnRH legalább egy antigéndeterminánsát hordozza. Az aminosavszekvenciát a szokásos hárombetűs kód alapján adjuk meg.
GnRH elleni immunválasz kiváltására képes a kwsyglrpg nonapeptid (4 608 251 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint ennek részpeptidjei: ehwsy, ehwsyg, ehwsygl, hwsyglr, wsyglr, syglrpg és yglrpg (WO 88/05308 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés), ahol az aminosavak egybetűs kódját alkalmazzuk. Ezek a származékok is felhasználhatók a GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas, találmány szerinti hordozórendszerben a rekombináns fimbrillaszál részét képező pepiidként.
Peptidként alkalmazhatók továbbá a GnRH-immunválasz kiváltására alkalmas analógjai vagy származékai is. Anti-GnRH-antitesteket stimuláló GnRH-analógokat ismertet például a 3963691 és 4608251 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A találmány szerinti hordozórendszer megvalósítási formáját jelenti minden olyan hordozórendszer, amely valamely fent említett analógot vagy a GnRH bármely egyéb olyan analógját vagy származékát tartalmazza, amely a Pfimbrilla-szál főalegységébe beépült peptidként a GnRH ellen immunválasz kiváltására alkalmas, legalább egy antigéndeterminánst hordoz.
Mint említettük, az F7-F13 szerotípusokat a P-fimbrilla alapján különböztetik meg [Orskov I. és Orskov F: „Escherichia coli in extraintestinal infections” J. Hyg. 95, 551-575. (1985)]. Több, különböző szerotípushoz tartozó P-fimbrilla aminosavszekvenciája ismert [Van Die és munkatársai: Microbiol. Pathogen, 3, 149-154. (1987)]. A találmány szerinti hordozórendszer bármely F-fimbrilla-szerotípusból származó rekombináns főalegységet tartalmazhat. A találmány szerinti hordozórendszer egyik lehetséges megvalósítási módjaként a példákban FII szerotípustalkalmazunk.
A találmány oltalmi körébe tartoznak a P-fimbrillaszál részeként egyetlen rekombináns főalegységet tartalmazó hordozórendszerek, valamint a P-fimbrilla-szál részeként polimerizált rekombináns főalegységet tartalmazó hordozórendszerek.
A találmány szerinti hordozórendszer előnyösen a P-fimbrilla-szál egyes részeit vagy a több főalegységből álló teljes P-fimbrilla-szálat tartalmazza. Egy teljes rekombináns P-fimbrilla-szál összesen 1000 rekombináns főalegységet tartalmazhat. A találmány szerinti hordozórendszer polimerizált rekombináns főalegységeiben a GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas peptid több másolatban történő előfordulásának előnye azon a tapasztalaton alapszik, hogy egy fimbrillaszálban több másolatban megtalálható epitóp különösen erős immunogén aktivitást képes kiváltani az adott epitóp ellen.
HU 217 096 Β
A találmány szerinti hordozórendszer előállítható például egy olyan rekombináns DNS-szekvencia kifejezésével, amely egy inszertet hordozó főalegység legalább egy részét tartalmazó P-fimbrilla-szál legalább egy részét kódolja, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység négy hipervariábilis szakaszának (HR4) megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol az inszertet hordozó főalegység mutációt tartalmaz a vad típusú főalegység 1 hipervariábilis szakaszának (HR1) vagy az ezzel szomszédos homológ szakasznak megfelelő aminosavszekvenciában. A vad típus definíciója azonos a fent megadott értelmezéssel. Az ilyen rekombináns DNS-szekvencia a találmány oltalmi köréhez tartozik.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia legalább egy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely legalább egy olyan peptidet kódol, amely a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozza (a továbbiakban L DNS-szekvencia). Az L DNS-szekvencia a P-fimbrilla-szál vad típusú főalegysége 4 hipervariábilis szakaszának (HR4) megfelelő pozícióban egy olyan DNS-szekvenciába van beépülve, amely a vad típusú főalegység legalább egy részét kódolja (a továbbiakban S DNS-szekvencia).
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában előforduló L DNS-szekvenciára előnyös példaként említhetők az alábbi aminosavszekvenciákat kódoló DNS-t tartalmazó L DNS-szekvenciák:
1) Leu-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlySer-Arg-Thr;
2) Leu-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyThr;
3) Leu-Thr-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-ProGly-Asp-Pro-Thr;
4) Leu-Gly-Ser-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-ArgPro-Gly-Gly-Pro-Thr.
A fenti aminosavszekvenciákat kódoló megfelelő DNS-szekvenciák azonos sorrendben a következők:
1) TTG-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGC-CTGCGT-CCA-GGA-TCC-CGA-ACC;
2) TTG-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGC-CTGAGG-CCT-GGA-ACC;
3) TTG-ACT-CAG-CAC-TGG-AGC-TAC-GGCCTG-CGT-CCA-GGG-GAT-CCA-ACC;
4) TTG-GGA-TCC-CAG-CAC-TGG-AGC-TACGGC-CTG-CGT-CCA-GGC-GGT-CCA-ACC.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia egyik előnyös példája az Fl 1 gén kötege mellett a főalegység 4 hipervariábilis szakaszába (HR4) beépülve L DNS-szekvenciát tartalmaz. Az uropatogén E. coliból, vagyis az F7b F72, F8, F9, Fll és F13 szerotípusnak megfelelő, szerológiailag különböző P-fimbrillák szintéziséért felelős géneket már klónozták:
- De Ree, J. Μ., P. Schwillens, L. Promes, I. van Die, H. Bergmans és H. van den Bosch: Molecular Cloning and Characterization of F9 Fimbríae írom a Uropathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 25, 163-169. (1985);
- De Ree J. Μ., P. Schwillens és J. F. van den Bosch: Molecular Cloning of Fll Fimbríae from a Uropathogenic Escherichia coli and Characterization of Fimbríae with Monoclonal Antibodies. FEMS Microbiol. Lett. 29,91-97. (1985);
- Hacker J., M. Ott, G. Schmidt, R. Hull és W. Goebel: Molecular Cloning of the F8 Fimbrial Antigén from Escherichia coli. GEMS Microbiol. Lett. 36,139-144. (1986);
- Hull R. A., R. E. Gill, P. Hsu, Β. H. Minshew és S. Falkow: Construction and Expression of Recombinant Plasmids Encoding Type 1 or D-mannose-resistant Pili from a Urinary Tract Infection Escherichia coli Isolate. Infect. Immun. 33, 933-938. (1981);
- Rhen M., J. Knowles, Μ. E. Pentilla, M. Sarvas és T. K. Korhonen: P-fimbriae of Escherichia coli; Molecular Cloning of DNA Fragments Containing the Structural Genes. FEMS Microbiol. Lett. 19, 119-123. (1983);
- Van Die I., G. Spierings, I. van Megen, E. Zuidweg, W. Hoekstra és H. Bergmans: Cloning and Genetic Organization of the Gene Cluster Encoding F7, Fimbríae of a Uropathogenic Escherichia coli and Comparison with the F72 Gene Cluster. FEMS Microbiol. Lett. 28,329-334. (1985);
- Van Die I., C. van den Hondel, H.-J. Hamstra, W. Hoekstra és H. Bergmans: Studies on the Fimbríae of an Escherichia coli O6:K2:H1 :F7 Strain: Molecular Cloning of a DNA Fragment Encoding a Fimbrial Antigén Responsible fór Mannose-resistant Hemagglutination of Humán Erythrocytes. FEMS Microbiol. Lett. 19, 77-82. (1983), ahol az ismertetett DNS-szekvenciák közül bármelyik részben vagy egészben felhasználható a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában.
Bizonyos esetekben előnyös lehet, ha a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában található inszert, vagyis az L DNS-szekvencia nemcsak a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó peptidet kódolja, hanem a peptidet kódoló DNS-szekvenciához kapcsolódva további aminosavakat kódoló DNS-t is tartalmaz. Az L DNSszekvencia által kódolt farkazó aminosavszekvenciák előfordulhatnak a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó peptid egyik vagy mindkét végén. Az ilyen farkazó aminosavszekvencia egy vagy több aminosavból állhat. Ha az L DNS-szekvencia a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó peptid mindkét végéhez kapcsolódó farkazó aminosavszekvenciát kódol, akkor a farkazó aminosavszekvenciák hossza és/vagy összetétele lehet azonos vagy különböző. A GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó peptid egyik vagy mindkét végéhez kapcsolódó farkazó aminosavszekvenciát kódoló L DNS-szekvenciát tartalmazó találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia előnye azon a tapasztalaton alapszik, hogy az ilyen rekombináns DNS-szekvencia kifejezésével kapott találmány szerinti hordozórendszer a GnRH, ennek analóg5
HU 217 096 Β ja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát jobb konfigurációban, és így a GnRH, ennek analógja vagy származéka ellen jobb immunválasz kiváltására alkalmas állapotban tartalmazza, mint az olyan hordozórendszer, amelyben ilyen farkazó aminosavszekvencia nem fordul elő.
A találmány szerinti előnyös rekombináns DNSszekvenciára példaként említhető az olyan DNS-szekvencia, amelyben az L DNS-szekvencia 15 aminosavat kódol, ahol a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptidet kódoló DNS egy olyan dekapeptidet kódol, ahol az említett peptid N-terminális végéhez két további aminosav, és C-terminális végéhez három további aminosav kapcsolódik. Az előnyös találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia egy másik példája olyan L DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy dekapeptidet kódol, ahol a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptid mindkét végéhez egy további aminosav kapcsolódik.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia előnyösen olyan L DNS-szekvenciát tartalmaz, amely legfeljebb 16 aminosav hosszúságú peptidet kódol, mivel az olyan, találmány szerinti rekombináns DNSszekvenciát tartalmazó rekombináns mikroorganizmus, ahol az inszert több mint 16 aminosavból áll, kevésbé képes rekombináns fimbrilla előállítására.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában az L DNS-szekvencia egy S DNS-szekvenciába épülhet be oly módon, hogy teljesen vagy részlegesen helyettesíti a vad típusú négy hipervariábilis szakaszt (HR4).
A találmány szempontjából előnyös az olyan rekombináns DNS-szekvencia, amely egy S DNS-szekvenciából és egy L DNS-szekvenciából áll, ahol az L DNS-szekvencia legalább egy olyan peptidet kódol, amely a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozza, és a főalegység 4 hipervariábilis szakaszába (HR4) van beépülve, és az S DNS-szekvencia mutációt hordoz az 1 hipervariábilis szakaszban (HR1) és a szomszédos homológ szakaszban. Az ilyen előnyös rekombináns DNS-szekvencia olyan találmány szerinti hordozórendszert fejez ki, ahol a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsa jobb immunválaszt vált ki a GnRH, ennek analógja vagy származéka ellen, mint az olyan ekvivalens hordozórendszer, amely a HR1 szakaszban mutációt nem hordoz.
Az ilyen előnyös rekombináns DNS-szekvencia egyik példája Stul helyet tartalmaz a főalegység legalább egy részét kódoló S DNS-szekvencia 1 hipervariábilis szakaszában, és az ezzel szomszédos homológ DNS-szakaszban. Az 1 hipervariábilis szakaszban és a szomszédos homológ szakaszban található mutált DNS-szekvencia Gly-Leu-Gly aminosavszekvenciát kódol. Különösen jó eredmények érhetők el az olyan találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciával, ahol a HR4 szakaszt helyettesítő L DNS-szekvencia 14 aminosavat kódol, és ahol a Gly-Leu-Gly szekvenciát kódoló DNS-szekvencia a DNS-szekvenciának azt a 9 nukleotidját helyettesíti, amely a HR1 utolsó aminosavát és a szomszédos homológ szakasz ezt követő két aminosavát kódolja.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia további DNS-szakaszokat is tartalmazhat, amelyre példaként említhetők a fimbrillaszálak mikroorganizmusban történő biológiai előállításának különböző lépéseihez szükséges DNS-szakaszok. A fimbrilla biológiai előállítása olyan lépéseket is tartalmaz, mint a fimbrilla alegységeinek transzlokációja a mikroorganizmus belső membránján keresztül, az alegységek transzportja a periplazmatikus térbe, és az alegységek kiválása a külső membránhoz, és ezt követően az alegységek polimerizálódása.
A P-fimbrilla-szál legalább egy részét kódoló találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia esetében az ilyen további DNS-szakasz egy vagy több olyan kiegészítő gént tartalmazhat, amelyek kifejeződése szükséges az alegységek szállításához és polimerizálásához, amit a fimbrilla biológiai előállítására alkalmas mikroorganizmus végez. A kiegészítő géneket kódoló DNSszakaszok általában ugyanolyan szerotípushoz tartozó mikroorganizmusból származnak, mint az alegységet kódoló S DNS-szekvencia.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában található, és a kiegészítő géneket kódoló további DNS-szakaszok származhatnak olyan mikroorganizmusból is, amelynél a P-fimbrilla eltérő szerotípushoz tartozik, mint az a mikroorganizmus, amelyből a rekombináns főalegységet kódoló DNS-szekvencia származik. Ennek oka, hogy az eltérő szerotípusú P-fimbrillát kódoló DNS-ből származó kiegészítő gének a mikroorganizmusban a fimbrilla biológiai előállítási folyamatának károsodása nélkül kicserélhető.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában található további DNS-szekvencia bármely olyan DNS-szekvenciát tartalmazhat, amely a mikroorganizmust képessé teszi a rekombináns főalegység kiválasztására. így például a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia tartalmazhat egy olyan további DNSszekvenciát, amely egy szignálpeptidet kódol, ahol a szignálpeptid a rekombináns főalegységet képessé teszi arra, hogy áthaladjon a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia kifejezésére alkalmas mikroorganizmus membránján.
A találmány szerinti hordozórendszer előállítható a fent említett rekombináns DNS-szekvencia kifejezővektorból történő kifejezésével. Ezért a találmány tárgyát képezi az olyan expressziós vektor, amely legalább egy rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a rekombináns DNS-szekvencia a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó legalább egy peptidet kódoló legalább egy L DNS-szekvenciából áll, amely L DNSszekvencia a P-fimbrilla-szál főalegysége 4 hipervariábilis szakaszának (HR4) megfelelő pozícióban egy S DNS-szekvenciába van beépülve, ahol az S DNSszekvencia legalább egy főalegységet és a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia bármely megvalósítási formáját tartalmazó expressziós vektort kódol.
HU 217 096 Β
Az ilyen, találmány szerinti expressziós vektor az említett rekombináns DNS-szekvencia kifejezésére alkalmas gazdasejtbe vihető bármely ismert módszerrel, például a mikroorganizmus transzformálásával.
A találmány tárgyát képezi ezért az olyan gazdasejt, amely legalább egy olyan rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, amely legalább egy olyan L DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigéndeterminánsát hordozó legalább egy peptidet kódol, és amely a P-fimbrillaszál főalegységének 4 hipervariábilis szakaszának (HR4) megfelelő pozícióban egy S DNS-szekvenciába van beépítve, ahol az S DNS-szakasz legalább egy főalegységet kódol; valamint az olyan gazdasejt, amely a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia bármely megvalósítási formáját tartalmazza. A gazdasejt a rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazhatja egy expressziós vektorban vagy saját kromoszómájába beépülve. A gazdasejt előnyösen valamely mikroorganizmus, így baktériumsejt.
A rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazó gazdasejt előnyösen fimbrilla biológiai előállítására alkalmazható. A fimbrilla biológiai előállítása magában foglal olyan lépéseket, mint a fimbrilla alegységeinek a gazdasejt belső membránjain keresztül történő transzlokációja, az alegységek periplazmatikus térbe történő transzportja, és az alegységek külső membránon keresztül történő kiválása, majd polimerizálása.
Az oltalmi körhöz tartozik továbbá az olyan, találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazó gazdasejt, vagyis rekombináns gazdasejt, amely rekombináns fimbrilla biológiai előállítására alkalmatlan. Az ilyen fimbrillarekombináns mikroorganizmus olyan DNS-t tartalmazhat, amely a mikroorganizmust képessé teszi arra, hogy a tenyészközegbe rekombináns főalegységeket vagy ennek részeit válassza ki. Az ilyen rekombináns mikroorganizmusban a rekombináns Pfimbrilla-szál rekombináns főalegysége a periplazmatikus térbe kerülhet anélkül, hogy ezt követően polimerizálódna vagy áthaladna a külső membránon, és így polimerizált főalegységekből álló rekombináns P-fimbrilla-szálat képezne. Az ilyen esetekben a mikroorganizmusból önmagában ismert módon kinyerhetők a GnRH, ennek analógja vagy származéka antigéndeterminánsát hordozó, peptidet tartalmazó önálló, rekombináns főalegységek.
Mint korábban említettük, a találmány szempontjából előnyös a polimerizált rekombináns alegységeket tartalmazó hordozórendszer. A polimerizált alegységeket tartalmazó, találmány szerinti hordozórendszer előállítására alkalmas egyszerű eljárás során a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciát az adott rekombináns DNS kifejezésére, valamint a kapott rekombináns alegységek polimerizálására alkalmas mikroorganizmusban kifejezzük. A polimerizálás megvalósítható például a fimbrilla biológiai előállításának részét képező azon lépésben, amikor az alegységek áthaladnak a külső membránon.
A kapott rekombináns fimbrilla az ilyen rekombináns mikroorganizmusból könnyen izolálható. Az izolálást előnyösen nem denaturáló körülmények között végezzük, amelynek során megtartjuk a rekombináns fimbrillaszál szerkezetét. A tisztított fimbrilla kinyerésére alkalmas eljárást ismertet Riegman N. és munkatársai: J. Bacteriol. 172,1114-1120. (1990).
A rekombináns mikroorganizmus általában könnyen megkülönböztethető a nem rekombináns mikroorganizmustól. Ez megvalósítható például olyan mikroorganizmus segítségével, amely nem képes a fimbrilla biológiai előállítására, vagy nem képes a rekombináns fimbrilla megkülönböztető jellemzőjét hordozó fimbrilla előállítására. A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia kifejezőrendszereként bármely fimbrillamikroorganizmus felhasználható.
A P-fimbrillát hordozó baktériumok (általában uropatogén Escherichia coli) a P-vércsoport antigén a-D-gal (1-4) β-D-gal egységéhez kötődnek. Ezért a P-fimbrillát hordozó baktériumok könnyen kimutathatók, mivel a fimbrilla a humán eritrocitákhoz kötődik mannóz jelenlétében, amely az eritrociták rögösítésével könnyen láthatóvá tehető. A P-típusú rekombináns fimbrillaszálak kifejezőrendszereként alkalmazható az olyan mikroorganizmus, amely a találmány szerinti rekombináns DNS bevitele előtt nem tapad a humán eritrocitákhoz. A kapott rekombináns mikroorganizmus az eredeti mikroorganizmussal ellentétben képes a humán eritrocitákon történő megtapadásra.
A találmány szerinti rekombináns DNS kifejezőrendszereként alkalmazható például a HB101 E. coli K12 törzs [Boyer H. W. és Roulland-Dussoix D.: J. Mól. Bioi. 41, 459-472. (1969)]. A legutóbbi időig azt feltételezték, hogy a HB101 nem képes 1-típusú fimbrilla termelésére, de Elliott S. J. és munkatársai: Microbial Pathogenesis 10, 481-486. (1991) szerint a HB101 állókultúrája képes 1-típusú fimbrilla előállítására. Annak biztosítása érdekében, hogy az előállított fimbrilla azonos legyen a rekombináns DNS kifejezéséből származó rekombináns fimbrillával, a HB101 sejteket szilárd közegben vagy kevert tápközegben tenyésztjük.
Az 1-típusú fimbrilla előállítására képtelen E. coli K12 törzsek egy másik példájaként említhető az AMI727, amely a JE2571 recA származéka [Van Die és munkatársai: FEMS Microbiol. Let. 19, 77-82. (1983)]. A találmány szerinti hordozórendszerhez alkalmazható rekombináns fimbrilla előállítására alkalmas másik mikroorganizmusként említhető a JA221 [Clark L. és Carbon J.: J. Mól. Bioi. 720,517-532. (1978)].
A rekombináns fimbrillaszál biológiai előállításához kifejezendő DNS részlegesen előfordulhat a nem transzformált mikroorganizmusban, vagy teljes egészében jelen van a mikroorganizmusba bevitt, találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciában. A biológiai előállításhoz szükséges DNS bevihető a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvencia részeként vagy külön expressziós vektor részeként.
A példákban különböző, találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciák előállításával, a szekvenciák fimbrillahiányos mikroorganizmusba történő transzformálásával, a rekombináns fimbrillaszálak előállításá7
HU 217 096 Β val, izolálásával és tisztításával különböző, találmány szerinti hordozórendszereket mutatunk be. A példákban szereplő rekombináns DNS-szekvenciák, a rekombináns DNS-t tartalmazó mikroorganizmusok és a hordozórendszert tartalmazó készítmények az oltalmi kör részét képezik.
A találmány kiteljed továbbá a GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas készítményre, amely találmány szerinti hordozórendszert tartalmaz. A GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas készítmény, amely a találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciából, például a fenti mikroorganizmusból kapott expressziós terméket tartalmazza, szintén az oltalmi körhöz tartozik.
A találmány kiterjed továbbá a GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas fenti készítmény alkalmazására. Közelebbről, a készítmény olyan alkalmazására, amikor is az alkalmazott mennyiség és az alkalmazás módja biztosítja az állatban a GnRH biológiai aktivitásának befolyásolását. A találmány szerinti készítmény különösen előnyös az ivari ciklus, a spermaképzés és/vagy az állat szexuális viselkedésének befolyásolására, elsősorban a fogamzás megelőzésére. Előnyösen a P-fimbrilla biológiai előállítására alkalmas mikroorganizmusból származó hordozórendszert tartalmazó készítményt használunk. A találmány szerinti készítmény alkalmazható a GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas vakcinában vagy bármely gyógyszerkészítményben.
A gyakorlatban a találmány szerinti készítmény a vakcináknál és gyógyszerkészítményeknél szokásos, bármely ismert módon felhasználható. Ezekre példaként említhetők a leírás bevezetőrészében felsorolt alkalmazási módok.
A találmány szerinti készítmény erős segédanyag, így Freund-féle komplett vagy nem komplett adjuváns nélkül felhasználható, és így a találmány szerinti készítmény állatok, így emlősök immunizálását az említett segédanyagok káros mellékhatása nélkül biztosítja. Segédanyagként alkalmazhatók például alumíniumsók, így A1(OH)3, A1PO4 vagy A12(SO4)3, „olaj a vízben” típusú emulziók, például Bayol F vagy Marcol F emulziók, E-vitamin-acetát-szolubilizátum vagy -szaponon, kívánt esetben egy vagy több emulgeálószer, így Tween vagy Span.
A találmány szerinti készítmény állatok, így emlősök immunizálásához történő alkalmazása nemcsak GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni antitestek kifejlesztését biztosítja, hanem a GnRH-nak a kialakított antitestekkel történő semlegesítése következtében megváltozott biológiai aktivitást okoz. A találmány szerinti készítmény alkalmazása ezért csökkenti az állat szaporodási aktivitását.
A találmány szerinti készítmény alkalmazható például vakcina formájában. A vakcina adagolható szubkután vagy intramuszkulárisan az immunizálandó állatnak. Előnyösen egy vagy több emlékeztetőinjekciót is alkalmazunk. Minden injekció általában 0,01-1 mg
GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni antigént tartalmaz.
A találmány szerinti készítmény állatok immunizálásához történő alkalmazását közelebbről a 3. és 4. példában mutatjuk be.
1. példa
A példában a GnRH-t kódoló genetikai információnak az FI 1 szerotípusú P-fimbrilla főalegységét kódoló génbe történő bevitelét ismertetjük.
A) Rekombináns DNS előállítása
A CNCM Institut Pasteur-gyűjteményben 1-709 számon letétbe helyezett pPIL291-15 plazmidból [De Ree és munkatársai: FEMS Microbiol. Lett. 29, 91-97. (1985)] pPIL291-1510 és pPIL291 -1519 plazmidot állítunk elő. A pPIL291 -15 plazmid az FI 1 génköteg genetikai szerkezetét tartalmazza. A pPIL291-15 plazmid BamHI-Clal ffagmense tartalmazza az FI 1 főalegységet kódoló FelA gént.
A pPIL291 -1510 és a pPIL291-1519 plazmidok előállítását Van Die és munkatársai: Mól. Gén. Génét 222, 297-303. (1990), valamint Van Die és munkatársai: J. Bacteriol. 170,5870-5876. (1988) szerint végezzük.
A pPIL291-1510,7 kb méretű HindlII-EcoRI fragmensét (előállítható a pPIL291-15 3 kb méretű ClalBamHI fragmensének klónozásával) ml3mp8 bakteriális fág vektorba klónozzuk. Ezt a kiónt használjuk templátként a helyspecifikus mutációhoz.
A helyspecifikus mutációt a kivágásos duplex módszerrel [Kramer V. és munkatársai: Nucl. Acid Rés. 12, 9441-9456. (1984)] lényegében a fent leírt módon [Van Die és munkatársai: J. Bacteriol. 170, 5870-5876. (1988)] végezzük.
A kapott kétszálú DNS-molekulát HB2154 törzsbe [Carter P., Bedouelle H. és Winter G.: Nucl. Acids Rés. 73, 4431-4443. (1985)] transzformáljuk, a fehér plakkokat kiválogatjuk, és a restrikciós DNS-fragmenst izoláljuk és vizsgáljuk.
A HR1 mutációs primer nukleotidszekvenciája a következő:
CAGCTTTTAAAGGCCTTGGAGCAGCTAAAA (20. számú szekvencia). A mutációs kísérletben a vad típusú FI 1 szekvencia 355-362. bázisait különböző bázisokkal helyettesítjük, amelynek eredményeként ebben a szakaszban három aminosav megváltozik, és így a kapott DNS-molekulában egy Stul restrikciós hely (AGGCCT) alakul ki.
A HR4 mutációs primer nukleotidszekvenciája a következő:
TTCTTTCGATGGGTTAACCCTGAAAGATGG (21. számú szekvencia). A mutációs kísérletben a vad típusú FI 1 szekvencia 502-520. bázisait négy új bázissal helyettesítjük, amelynek eredményeként 15 bázist kiiktatunk, és a kapott DNS-molekulában egy Hpal restrikciós helyet (GTTAAC) alakítunk ki.
Ezután izoláljuk a HindlII-EcoRI fragmenseket, majd a pPIL291-151 plazmid EcoRI-HindlII fragmensének helyére beiktatva a HR1 szakaszban Stul restrikciós helyet tartalmazó pPIL291-1510 és a HR4 szakaszban Hpal restrikciós helyet tartalmazó pPIL291-1519 plaz8
HU 217 096 Β midot kapunk. Mindkét klónozási hely ugyanabban a leolvasókeretben található. A pPIL291-1510 és/vagy pPIL291 —1519 plazmidokba különböző hosszúságú oligonukleotidokat inszertálunk. Az inszertált oligonukleotidok a gin his trp ser tyr gly leu arg pro gly aminosavszekvenciájú GnRH-dekapeptidet kódolják. Az oligonukleotidok eltérést mutatnak a lánc hosszúságában és a dekapeptidhez kapcsolódó aminosavszekvencia összetételében.
Az 1. ábra és az 1-8. számú szekvenciák a pPIL291-1510 és pPIL291-1519 plazmidokba bevitt oligonukleotidokat mutatják. Aláhúzással jelöljük a GnRH megfelelő aminosavakra lefordított kódolószálát.
A plazmidokat tartalmazó transzformált sejtek izolálása után a BamHI restrikciós endonukleázhely jelenlétében meghatározása alapján szelektáljuk az 1 linkért tartalmazó inszerteket (1. és 2. számú szekvencia), a 4 linkért tartalmazó inszerteket (5. és 6. számú szekvencia) és az 5 linkért tartalmazó inszerteket (7. és 8. számú szekvencia).
Az inszertként 3 linkért tartalmazó plazmid (3. és 4. számú szekvencia) kimutatásához az oligonukleotidban található Stul restrikciós hely nem használható, mivel az Stul felismerő helyet közvetlenül két guanidinnukleotid követi, amely az E. coli metiláz által felismert helyet képez, és így a metilezett citidinmaradékok miatt védve van a hasításból. A 3 linker beépülésére történő szelektáláshoz a plazmidokat ezért Stul enzimmel emésztjük, amely kimutatja a HR1 szakaszba történő beépülést, és Hpal enzimmel emésztjük, amely kimutatja a HR4 szakaszba történő beépülést. Az oligonukleotidnak a HR1 és HR4 hipervariábilis szakaszba történő sikeres beépülése következtében a megfelelő hasítóhelyek megszűnnek.
Ezután a kiválasztott plazmidokat szekvenáljuk a megfelelő orientációban lévő linker jelenlétének igazolása érdekében. A kapott plazmidokat a kívánt orientációban lévő linker megjelölésével pAI X.Y.O névvel jelöljük, ahol X a hipervariábilis szakasz jelenlétére, Y a beépített linker jelenlétére és 0 a kiegészítő gének jelenlétére utal.
A pPIL291 — 1510 plazmidból előállított plazmidok jele ezért pAI 110, pAI 130, pAI 140 és pAI 150. A rekombináns 1 hipervariábilis szakaszban, vagyis a pPIL291-1510 plazmidba történő inszertálás után az oligonukleotidokat egy glicinmaradékra vonatkozó kodon előzi meg.
A pPIL291-1519 plazmidból származó plazmidok közül az 1-8. számú szekvenciáknak megfelelő linkereket tartalmazó plazmidok jele rendre a következő: pAI 410 (9. és 10. számú szekvencia), pAI 430(11-12. számú szekvencia), pAI 440 (13. és 14. számú szekvencia) és pAI 450 (15. és 16. számú szekvencia). A pPIL291 — 1519 plazmid 4 hipervariábilis szakaszába inszertált oligonukleotidokat a rekombináns HR4 szakaszban egy leucinmaradék előzi meg. A rekombináns 4 hipervariábilis szakasz utolsó aminosava egy treonin.
A 2. ábrán és a 9-16. számú szekvenciákban a pAI 410 (9. és 10. számú szekvencia), pAI 430 (11. és 12.
számú szekvencia), pAI 440 (13. és 14. számú szekvencia) és pAI 450 (15. és 16. számú szekvencia) plazmidok rekombináns HR4 szakaszának DNS-szekvenciáját és megfelelő aminosavszekvenciáját adjuk meg. Szerepel továbbá az Fl 1 vad típusú HR4 szakaszának DNS-szekvenciája és aminosavszekvenciája (17. számú szekvencia). A GnRH kódolószakaszait a megfelelő aminosavakra lefordítva a szekvenciák listájában az ix/B (jelleg/lokáció) jellemzőben adjuk meg.
Az 1. táblázatban összehasonlítjuk a GnRH legalább egy antigéndeterminánsát kódoló GnRH dekapeptid farkazószekvenciáit, valamint a rekombináns HR4 és a vad típusú HR4 hosszát.
B) A rekombináns DNS kifejezésével kapott fimbrilla analízise
A pPIL291 —15 plazmidból az FelA gént hordozó Clal-BamHI restrikciós fragmenst a pAI plazmidokból származó és az 1, 3, 4 és 5 linkereket tartalmazó ClalBamHI mutált fragmensekkel helyettesítjük, és a kapott négy plazmidot a megfelelő HB101 sejtekbe [Boyer H. W. és Roullard-Dussoix D.: J. Mól. Bioi. 41,459-472. (1969)] transzformáljuk.
A hemagglutináció szempontjából pozitív kiónokat szelektáljuk, és DNS-restrikciós ffagmentanalízissel ellenőrizzük. A hibrid fimbrilla transzformált HB101 sejtekből történő kifejeződését elektronmikroszkopikusan vizsgáljuk. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
A vizsgálati eredményekből látható, hogy a HB101/pAI 440 rendszer a fímbrillát közel olyan hatékonyan kifejezi, mint a normál Fl 1 génköteget hordozó HB101/pPIL291-15 rendszer. A fímbrillatermelés csak kismértékben csökken a pAI 410 és pAI 430 plazmidokat hordozó HB101 sejtekben. A linkemek az 1 hipervariábilis szakaszba történő beépítése látható módon súlyosan befolyásolja a fimbrilla biológiai előállítását, mivel sejtenként csak néhány fimbrilla mutatható ki.
A rekombináns fimbrilla kifejeződését ELISA-vizsgálattal ellenőrizzük, amelyhez poliklonális antitesteket alkalmazunk a vad típusú FII fimbrillát tartalmazó komplett baktériummal szemben. Ennek magyarázata, hogy monoklonális antitestek alkalmazása lehetetlen az FII specifikus epitópoknak az új ligálásokkal történt eltorzítása miatt [a jelenséget ismerteti Van Die és munkatársai: Mól. Gén Génét. 222, 297-303. (1990)]. Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.
Anyagok és módszerek
a) Baktérium
A hibrid fimbrilla morfogén kifejezéséhez gazdatörzsként az 1 típusú fimbrilla képzésére alkalmatlan Escherichia coli HB101 törzset használjuk [Boyer H. W. és Roullard-Dussoix D.: J. Mól. Bioi. 41,459-472. (1969)]. A HB101 törzset forgó edényekben tenyésztjük annak biztosítása érdekében, hogy a nem transzformáit sejtek fimbrillamentesek legyenek.
A DNS-szekvenáláshoz JM101 törzset használunk az M13MP8 származékok gazdájaként [Messing J. és Vieira J.: Gene 19, 269-276. (1982)].
A helyspecifikus mutáció során HB2154 törzset használunk az M13mpl8-származékok gazdájaként
HU 217 096 Β [Carter P., Bedouelle H. és Winter G.: Nucl. Acids Rés. 73,4431-4443.(1985)].
A baktériumokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó agy-szív infúziós közegben tenyésztjük.
b) Enzimek
A restrikciós endonukleázokat a gyártó előírásai szerint használjuk.
A ligáláshoz T4 DNS-ligázt használunk a gyártó előírásai szerint.
c) DNS-analízis
A DNS-fragmensek analízisét 0,6% agarózgélen végzett elektroforetikus vizsgálattal végezzük.
A DNS-szekvenálás során a didezoxi-láncterminációs módszert használjuk [Sanger F., Nicklen S. és Coulson A. R.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.(1977)].
d) Transzformáció
A transzformálást Kushner módszerével végezzük [Kushner S. R.: Genetic Engineering, H. W. Boyer és S. Nicosia, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 17-23. (1978)].
e) Lokalizált mutáció
A lokalizált mutációt kimetszett duplex módszerrel végezzük. A prímért a templát DNS-sel és M13mpl8-cal hibridizáljuk 65 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül. A kimetszett duplex molekula meghosszabbítását és ligálását a kívánt dNTP, 10 egység T4 ligáz és 3 egység Klenowffagmens DNS-polimerizáz I hozzáadása után végezzük, amit 16 °C hőmérsékleten 4 órás inkubálás követ.
f) Linkerszintézis
A GnRH oligonukleotidokat az Applied Biosystems 381A modellszámú DNS-szintetizáló berendezésével a gyártó előírásai szerint állítjuk elő.
g) A linkerek inszertálása
A pPIL291 -1519 plazmidot Hpal enzimmel emésztjük a következő módon: 1 μg DNS, 5 egység Hpal restrikciós enzim és 1,5 μΐ restrikciós puffer (10χ) elegyét TE pufferrel (10 mmol/1 trisz, 1 mmol/1 EDTA) 15 μΐ térfogatra töltjük, és 1,5 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az enzimet ezután 10 percen keresztül 65 °C hőmérsékleten végzett melegítéssel inaktiváljuk, és az elegyet fenollal extraháljuk, majd alkohollal kicsapatjuk.
A linearizált plazmidot GnRH-linkerrel ligáljuk a következő módon:
egység ligáz, 1 μΐ ligázpuffer (10χ), vektor- DNS és linker- DNS elegyét 10 μΐ térfogatra töltjük. A ligálást 16 °C hőmérsékleten végezzük.
A transzformáláshoz 100 μΐ megfelelő HB101 sejtet [Kushner S. R.: Genetic Engineering, H. W. Boyer és S. Nicosia, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 17-23. (1978)] a ligáit plazmiddal keverünk 30 percen keresztül jéghűtés közben. Az elegyet eztán 5 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten melegítjük, majd LBközeget adunk hozzá, és 1,5 óra elteltével Amp lemezekre szélesztjük. A kapott telepeket izoláljuk, tenyésztjük, és a plazmid-DNS-t ezekből a telepekből izoláljuk és szekvenáljuk.
Ugyanezt az eljárást végezzük a GnRH-nak a HR1 szakaszba történő beviteléhez azzal a különbséggel, hogy Hpal enzim helyett Stul enzimet használunk az emésztéshez.
h) Teljes baktérium-ELISA
Antiszérumként FII fimbrilla elleni abszorbeált hiperimmun nyúlantiszérumot használunk.
Minden vizsgálatban pozitív és negatív kontrolitörzseket használunk.
Mosás után a baktériumokat lapos fenekű polisztirol mikrotitrálólemezekre visszük. A baktériumszuszpenziót hagyjuk megszáradni, majd mosás után PBS/Tween 80/magzati borjúszérum eleggyel blokkoljuk. Ezután hozzáadjuk az abszorbeált szérum megfelelő hígítási sorát, és 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Mosás után peroxidáz konjugált kecske-anti-nyúl IgG(H+L)-t adunk hozzá. Mosás után TMB szubsztrátum puffért adunk hozzá, amely ureum-peroxidot és 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidint tartalmaz. A reakciót kénsawal megállítjuk, és az elszíneződést mikro-ELISA-leolvasóval mérjük. A kapott titert a háttér A450-értéknél legalább kétszer nagyobb A450-értéket adó legnagyobb antiszérumhígításhoz viszonyítjuk.
i) Hibrid GnRH-Fll fimbrilla előállítása, izolálása és tisztítása
A pAI 410, pAI 440, pAI 10410 és pAI 10440 plazmidokkal transzformált E. coli K12 törzseket -70 °C hőmérsékleten 30% glicerinben tároljuk, majd két tenyészetben előtenyésztjük (egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten lemezeken véragaralapú, 2. számú közegben (oxoid), amely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz, majd 7 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 100 ml agy-szív infúziós közegben (BHI, oxoid), amely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz, kevertetés közben).
A főtenyészethez egy fermentort 100 pg/ml ampicillint tartalmazó 12 1 BHI-közeggel és 5 ml 10% PPG habzásgátlóval töltünk meg, majd az előtenyészettel inokuláljuk, és 17 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 50% oxigéntelítettség mellett levegőellátás és 100-1000 fordulat/perc közötti kevertetés mellett tenyésztjük.
A fímbrillát a tenyésztett baktériumról 15 percen keresztül, 65 °C hőmérsékleten végzett hőkezeléssel eltávolítjuk, majd pH = 10 értéken 1 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük, végül 15 percen keresztül 13000 fordulat/perc értéken centrifugáljuk (Sorvall RC-5B, GSA rotor).
A felülúszót 200-600 ml térfogatra koncentráljuk (XM 300 szűrő, Minitan rendszer, Millipore), trisz/glicin pufferrel (pH= 10) mossuk, pH=8,5 értékre állítjuk, és a kapott csapadékot legalább 1 napon keresztül 4 °C hőmérsékleten ülepítjük.
A csapadékot összegyűjtjük (20 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten 48,000 g értéken centrifugáljuk), majd a pelletet 100 ml trisz/glicin pufferben (pH=8,5) 2 mol/1 karbamid jelenlétében oldjuk. A készítményt koncentráljuk (YM 100 szűrő, Amicon ultraszűrő sejt), 2 x200 ml trisz/glicin pufferben (pH=8,5) mossuk, és a vakcina előállításáig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
2. példa
Ebben a példában mutációt végzünk az 1 hipervariábilis szakaszban, és inszertálást végzünk a 4 hiperva10
HU 217 096 Β riábilis szakaszban. A plazmidokban az Stul felismerőhelyet az 1. példa szerinti lokalizált mutációval alakítjuk ki. Ezután a fimbrilla előállítását és a szerkezet antigéntulajdonságát az 1. példában leírt módon vizsgáljuk.
Meglepő módon azt találtuk, hogy az 1 hipervariábilis szakaszban kialakított mutáció, vagyis az Stul felismerőhely jelenléte olyan rekombináns DNS-t eredményez, amely a transzformált sejtekben ugyanolyan mértékű fimbriilatermelést vált ki, mint a pAI 410, pAI 430 és pAI 440 plazmidok. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja.
Úgy tűnik, hogy az Stul hely az 1 hipervariábilis szakaszban javítja a 4 hipervariábilis szakaszba beépített linkerek működését. Az 1 hipervariábilis szakaszban Stul helyet tartalmazó mutánsok pozitív reakciót adnak az immungold-jelölési kísérletben, míg ugyanebben a kísérletben jelölés nem detektálható a pAI 410 plazmidot hordozó sejteknél. Ez arra utal, hogy a két, vizsgált hipervariábilis szakasz szoros együttműködésben van.
3. példa
A példában az 1. és 2. példa szerinti szerkezetekkel transzformált mikroorganizmusokban kapott rekombináns fimbrillaszálakat tartalmazó készítményeket vizsgáljuk.
Immunizációs tesztet végzünk a GnRH semlegesítő hatásának meghatározásához. Az immunizációs teszt hatására az immunizált állat ivari ciklusa megzavarodik vagy elnyomódik.
A vizsgálatban a GnRH aminosavszekvenciáját hordozó mutáns fimbrillával nőstény patkányokat vakcinálunk. A vizsgálatok célja annak meghatározása, hogy van-e különbség a 4 hipervariábilis szakaszban GnRHszerű peptidet tartalmazó fimbrilla és a további kis változtatást (Stul hely a HR1 szakaszban) hordozó fimbrilla aktivitása között.
Wistar típusú, felnőtt nőstény patkányok közül kiválogatjuk a szabályos ivari ciklussal rendelkező állatokat, majd szubkután kétszer (6 hetes intervallumban) 0,5 ml fimbrillaemulzióval kezelünk. Az emulzió 50 pg fimbrillát tartalmaz „olaj a vízben” típusú, 70:30 térfogatarányú elegyben, ahol az olajos fázis poliszorbát 80 és szorbitán-monooleát adalékanyagokat tartalmaz folyékony paraffinban (Marcol 52), és a vizes fázis alumínium-trihidroxidot tartalmaz desztillált vízben. A vizsgálat során a pAI 10410, pAI 440 és pAI 10440 mutáns fimbrillákat használjuk. A fimbrillakészítményt az 1. és 2. példában leírt módon állítjuk elő. Az injekciók előtt, között és után naponta hüvelykenetet veszünk, és előre meghatározott időpontokban vérmintát veszünk a retroorbitális plexusból, és a szérumot a vizsgálatig -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A kísérlet végén az állatokat megöljük, és a petefészket lemérjük.
A napi hüvelykenetet mikroszkóplemezre vesszük. Szárítás után metanollal fixáljuk, majd 20 percen keresztül desztillált vízzel 1:10 arányban hígított Giemsaoldattal (Merck, Darmstadt, Németország) színezzük, majd vezetéki vízzel lemossuk, és szárítjuk. A kenetet mikroszkopikusan (100x) vizsgálva meghatározzuk az elszarusodott és magvas hámsejtek és a leukociták százalékos mennyiségét.
A 4 napos ivari ciklussal rendelkező normál patkányok hüvelyszekvenciája a következő:
di-oestrus - pro-oestrus - oestrus.
Az ábrákon ezeket az ivari fázisokat az alábbi számokkal jelöljük:
1= di-oestrus
2=pro-oestrus
3=oestrus.
A vizsgálat
A 1251-GnRH anti-GnRH-antitestekhez történő kötődését a szérummintákban radioimmunoassay-vizsgálattal határozzuk meg.
Az inkubálás előtt a felolvasztott szérummintákat vizsgálati pufferben hígítjuk [0,01 mol/1 Na2HPO4x 2H2O, 0,15 mol/1 NaCl, 0,1% zselatin és 0,1% nátriumazid (pH=8,0)].
A radioimmunoassay-vizsgálathoz 0,1 ml hígított szérummintát, 0,2 ml vizsgálati puffért és 0,05 ml 125IGnRH-t 16 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubálunk két párhuzamosban. Az elválasztás előtt 0,05 ml humán szérumot adunk a vizsgálati csövekhez hordozófehérjeként.
A szabad és a kötött minta elválasztását 0,5 ml Peg oldattal (40% Peg-4000 zselatin nélküli vizsgálati pufferben) végezzük. Az elegyet centrifugáljuk, és a csapadékot gamma-spektrométerben számláljuk.
A titert a nem specifikus kötődés alapján korrigált radioaktív kötődésnek a hozzáadott össz-radioaktivitáshoz viszonyított százalékos arányában számoljuk.
Eredmények
Az anti-GnRH-antitestekre és az ivari ciklusra gyakorolt hatás (3—5. ábra)
- A csak segédanyaggal kezelt állatok széruma antiGnRH-antitesteket nem tartalmaz. Ezeknél az állatoknál az ivari ciklus változása nem mutatható ki.
- A mutáns fimbrillával kezelt állatok szérumantitestet tartalmaznak, amelynek következtében az ivari ciklus megváltozik, és elnyomódik.
Testtömeg
A pAI 10410 vagy pAI 10440 plazmiddal kezelt patkányok az ismétlőkezelést követő 3-5 hét elteltével nagyobb testtömeget mutatnak, mint a placebóval kezelt állatok (6. ábra).
Petefészek tömege
Az összes mutáns fimbrilla csökkenti a petefészek tömegét (7. ábra).
4. példa
A patkányokon végzett kísérlet mellett ugyanezekkel a készítményekkel bikaboijúkat is kezelünk. Négy hónapos, keresztbe tenyésztett bikaboijúkat 2 ml fimbrillaemulzióval szubkután kezelünk kétszer 8 hetes periódusban, ahol az emulzió 200 pg fimbrillát tartalmaz „olaj a vízben” 70:30 térfogatarányú elegyben, ahol az olajos fázis poliszorbát 80-at és szorbitán-monooleátot tartalmaz folyékony paraffinban (Marcol 52), és a vizes fázis alumínium-trihidroxidot tartalmaz desztillált víz11
HU 217 096 Β ben. Mutáns fimbrillaként pAI 410, pAI 10410, pAI 440 és pAI 10440 mintát használunk. A fimbrillakészítményeket az 1. és 2. példában leírt módon állítjuk elő. Az injekciók előtt, között és után hetenként meghatározzuk a herezacskó átmérőjét, és meghatározott időközökben vérmintát veszünk a nyaki vénából, és a plazmát a vizsgálatig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
Vizsgálat
A l25I-GnRH anti-GnRH-antitestekhez történő kötődését a plazmamintákban radioimmunoassay-vizsgálattal mérjük a 3. példában leírt módon.
Eredmények (8. és 9. ábra)
- A csak segédanyaggal kezelt állatok plazmája antiGnRH-antitestet nem tartalmaz. A herezacskó átmérője a kísérleti periódusban mind a négy állatnál szabályosan növekszik.
- A pAI 410 mintával kezelt állatok plazmájában antitestkötődés mutatható ki, amelynek hatására csökken a herezacskó átmérője a kontrolihoz viszonyítva.
- A pAI 440 mintával kezelt állat plazmájában antitestkötődés mutatható ki, amely egy állatnál különösen magas értéket mutat. A herezacskó átmérője a kontrollállathoz viszonyítva csökken.
- A pAI 10410 mintával kezelt állatoknál a plazmában erős antitestkötődés mutatható ki, különösen röviddel az ismétlőinjekció után. Ezzel egyidejűleg jelentős mértékben csökken a herezacskó növekedése a kontrollállathoz viszonyítva.
- A pAI 10440 mintával kezelt állatok plazmájában anti-GnRH-antitest-kötődés mutatható ki, és a herezacskó növekedése a kontrollállathoz viszonyítva jelentősen csökken.
- A HR1 szakaszban kialakított Stul hely jelentős mértékben fokozza az anti-GnRH-antitestek termelődését és aktivitását, függetlenül attól, hogy az 1 vagy 4 linkért használjuk-e.
1. táblázat
| Linker | HR | Rekombináns HR4 hossza | 5’ farkazószakasz |
| 1 | HR4 | 14 as | 1 as |
| 3 | HR4 | 12 as | 1 as |
| 4 | HR4 | 15 as | 2 as |
| 5 | HR4 | 16 as | 3 as |
| Vad | - | 7 as | - |
(1. táblázat folytatása)
| Linker | 5’ farkazószakasz | 3’ farkazószakasz hossza | HR4 hosszának növekedése |
| 1 | leu | 3 as | 7 as |
| 3 | leu | 1 as | 5 as |
| 4 | leu-thr | 3 as | 8 as |
| 5 | leu-gly-ser | 3 as | 9 as |
| Vad | - | - | - |
2. táblázat
| Plazmid | Fimbrilla- képzés | Inszert helye | |
| 110 | +/- | HR1 | |
| HR1 | 130 | + + | HR1 |
| 140 | +/- | HR1 | |
| 150 | + | HR1 | |
| 410 | + + + | HR4 | |
| 430 | + + + | HR4 | |
| 440 | + + + + | HR4 | |
| HR4 | 450 | +/- | HR4 |
| 10410 | + + + | HR4 | |
| 10430 | + + + | HR4 | |
| 10440 | + + + | HR4 | |
| Vad típusú F11 | 291-15 | + + + + + | - |
3. táblázat
| Minta | Titer |
| pAI 440 | 1:64,000 |
| pAI 440 | 1:32,000 |
| pAI 10410 | 1: 8,000 |
| pAI 10430 | 1:16,000 |
| pAI 10440 | 1:32,000 |
| pPIL291-15 | 1:32,000 |
Az ábrák rövid ismertetése:
Az 1. ábra apPIL291-1510 és apPIL291-1519plazmidokba bevitt oligonukleotid-inszertet mutatja. A GnRH-aminosavszekvenciát kódoló részt aláhúzással jelöljük.
A 2. ábra a pAI 410, pAI 430, pAI 440 és pAI 450 plazmidok rekombináns HR4 szakaszának DNSszekvenciáját és a megfelelő aminosavszekvenciát mutatja. A GnRH-aminosavszekvenciát kódoló szakaszt aláhúzással jelöljük.
A 3. ábra az anti-GnRH-antitest-titert mutatja kezeletlen és a GnRH aminosavszekvenciáját hordozó mutáns fimbrillával kezelt nőstény patkányok szérumában. Az ábrán az 5600-szoros hígítású szérum relatív kötődését adjuk meg.
A 4. ábra a csak segédanyaggal kezelt patkányok ivari ciklusát mutatja.
Az 5. ábra a pAI 10410 mintával kezelt patkányok ivari ciklusát mutatja.
A 6. ábra a kezeletlen vagy a GnRH-aminosavszekvenciáját hordozó mutáns fimbrillával kezelt nőstény patkányok átlagos testtömegét mutatja.
A 7. ábra a kezeletlen vagy a GnRH aminosavszekvenciáját hordozó mutáns fimbrillával kezelt patkányok petefészkének átlagos tömegét mutatja.
A 8. ábra az anti-GnRH-antitest-titerének változását mutatja a kezeletlen vagy a GnRH aminosavszekvenciáját hordozó mutáns fimbrillával kezelt fiatal borjúk plazmájában. Az ábrán az 5600-szoros hígítású plazma relatív kötődését adjuk meg.
A 9. ábra a kezeletlen vagy a GnRH-aminosavszekvenciáját hordozó mutáns fimbrillával kezelt fiatal borjúk herezacskóátmérő-növekedését mutatja.
HU 217 096 Β
7.
2.
3.
4.
5.
Szekvencialista számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 36 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: kettős (D) topológia: lineáris
G CAG CAC TGG AGC Gin His Trp Ser 1 számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 10 aminosav (B) típus: aminosav
Gin His Trp Ser T 1 számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 31 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: kettős (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) hipotetikus: nem
G CAG CAC TGG AGC Gin His Trp Ser 1 számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 10 aminosav (B) típus: aminosav
Gin His Trp Ser Tyr 1 5 számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 39 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: kettős (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: DNS (genomiális)
GACT CAG CAC TGG AGC Gin His Trp Se
6.
7.
számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 10 aminosav (B) típus: aminosav
Gin His Trp Ser Tyr 1 5 számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 42 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: kettős (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: DNS (genomiális)
GGGATCC GAC CAC TGG Gin His Trp (ii) molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) hipotetikus: nem antiszenz: nem (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS (B) lokáció: 2-31 (xi) szekvencia
TAC GGC CTG CGT CCA GGA TCCCG Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 5 10 (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: fehérje (xi) szekvencia r Gly Leu Arg Pro Gly 5 10 antiszenz: nem (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS (B) lokáció: 2-31 (ix) jelleg (A) név/kulcs: vegyes-eltérő (B) lokáció: (31, ””) helyettesítés (xi) szekvencia
TAC GGC CTG AGG CCT GGG r Gly Leu Arg Pro Gly 5 10 (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: fehérje 30 (xi) szekvencia
Gly Leu Arg Pro Gly 10 (iii) hipotetikus: nem antiszenz: nem (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS
| (B) lokáció: 5-34 | ||
| 40 | (xi) szekvencia | |
| TAC | GGC CTG CGT CCA | GGG GATCC |
| Tyr | Gly Leu Arg Pro | Gly |
| 5 | 10 |
(D) topológia: lineáris 45 (ii) molekula típusa: fehérje (xi) szekvencia
Gly Leu Arg Pro Gly 10 (iii) hipotetikus: nem antiszenz: nem (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS (B) lokáció: 8-37 55 (xi) szekvencia
AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGC GGTCC Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
10
HU 217 096 Β
| 8. számú szekvencia | (D) topológia: lineáris |
| (i) szekvenciajellemzők | (ii) molekula típusa: fehéije |
| (A) hossz: 10 aminosav | (xi) szekvencia |
| (B) típus: aminosav | |
| Gin His | Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly |
| 1 | 5 10 |
| 9. számú szekvencia | (iii) hipotetikus: nem |
| (i) szekvenciajellemzők | antiszenz: nem |
| (A) hossz: 48 bázispár | (ix) jelleg |
| (B) típus: nukleinsav | 10 (A) név/kulcs: CDS |
(C) szál: kettős (B) lokáció: 7-36 (D) topológia: lineáris (xi) szekvencia (ii) molekula típusa: DNS (genomiális)
GGGTTG CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGA TCCCGAACCC 46 Gin His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
| 1 5 TG | 10 |
| 10. számú szekvencia | (D) topológia: lineáris |
| (i) szekvenciajellemzők | (ii) molekula típusa: fehéije |
| (A) hossz: 10 aminosav | 20 (xi) szekvencia |
| (B) típus: aminosav | |
| Gin His Trp Ser Tyr | Gly Leu Arg Pro Gly |
| 1 5 | 10 |
| 11. számú szekvencia | (iii) hipotetikus: nem |
| (i) szekvenciajellemzők | 25 antiszenz: nem |
| (A) hossz: 42 bázispár | (ix) jelleg |
| (B) típus: nukleinsav | (A) név/kulcs: CDS |
| (C) szál: kettős | (B) lokáció: 7-36 |
| (D) topológia: lineáris | (xi) szekvencia |
(ii) molekula típusa: DNS (genomiális) 30
GGGTTG CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG AGG CCT GGA ACCCTG 42 Gin His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly
| 1 | 5 10 |
| 12. számú szekvencia | (D) topológia: lineáris |
| (i) szekvenciajellemzők | 35 (ii) molekula típusa: fehérje |
| (A) hossz: 10 aminosav | (xi) szekvencia |
| (B) típus: aminosav | |
| Gin His Trp Ser | Tyr Gly Leu Arg Pro Gly |
| 1 | 5 10 |
| 13. számú szekvencia | 40 (iii) hipotetikus: nem |
| (i) szekvenciajellemzők | antiszenz: nem |
| (A) hossz: 51 bázispár | (ix) jelleg |
| (B) típus: nukleinsav | (A) név/kulcs: CDS |
| (C) szál: kettős | (B) lokáció: 10-39 |
| (D) topológia: lineáris | 45 (xi) szekvencia |
(ii) molekula típusa: DNS (genomiális)
GGGTTGACT CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGG GATCCAACCC 49
| Gin His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly | ||
| 1 TG 14. számú szekvencia | 5 | 10 51 (D) topológia: lineáris |
| (i) szekvenciajellemzők | (ii) molekula típusa: fehéije | |
| (A) hossz: 10 aminosav | (xi) szekvencia | |
| (B) típus: aminosav | ||
| Gin His Trp Ser | Tyr | Gly Leu Arg Pro Gly |
| 1 | 5 | 10 |
| 75. számú szekvencia | (C) szál: kettős | |
| (i) szekvenciajellemzők | (D) topológia: lineáris | |
| (A) hossz: 54 bázispár | (ii) molekula típusa: DNS (genomiális) | |
| (B) típus: nukleinsav | 60 |
HU 217 096 Β (A) név/kulcs: CDS (B) lokáció: 13-42 (xi) szekvencia
TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGC 42 Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 5 10 (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: fehéije 10 (xi) szekvencia
Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 5 10 (iii) hipotetikus: nem antiszenz: nem (ix) jelleg (A) név/kulcs: CDS (B) lokáció: 1-27 (xi) szekvencia
GCT TAT CCC CTG 27 Alá Tyr Pro Leu (iii) hipotetikus: nem antiszenz: nem (ix) jelleg
GGGTTGGGAT CC CAG CAC Gin Hi s 1
GGTCCAACCC TG
16. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 10 aminosav (B) típus: aminosav
Gin Hi s Trp Ser 1
17. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 27 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: kettős (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: DNS (genomiális)
GGG ACT GCA GGT GAC Gly Thr Alá Gly Asp 1 5
18. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 9 aminosav (B) típus: aminosav
Gly Thr 1
19. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 10 aminosav (B) típus: aminosav (C) szál: egyes
Gin Hi s Trp 1
20. számú szekvencia (i) szekvenciajellemzők (A) hossz: 30 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: kettős
CAG CTTTTAA
Alá Gly Asp Alá 5 (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: fehéije (xi) szekvencia
Tyr Pro Leu (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: peptid (iii) hipotetikus: nem (v) fragment típusa: belső (xi) szekvencia
Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 5 10 (D) topológia: lineáris (ii) molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) hipotetikus: nem antiszenz: nem (xi) szekvencia AGGCCTTGGA GCAGCTAAAA 30
21. számú szekvencia (D) topológia: lineáris (i) szekvenciajellemzők (ii) molekula típusa: DNS (genomiális) (A) hossz: 30 bázispár 45 (iii) hipotetikus: nem (B) típus: nukleinsav antiszenz: nem (C) szál: kettős (xi) szekvencia
TTCTTTCGAT GGGTTAACCC TGAAAGATGG 30
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas immunogénhordozó rendszer, azzal jellemezve, hogy legalább egy E. coli Pfimbrilla-szálat tartalmaz, amely legalább egy, inszertet hordozó főalegységet tartalmaz, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység 4 hipervariábilis szaka55 szának megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol a főalegység mutációt tartalmaz a vad típusú főalegység 1 hipervariábilis szakaszának vagy az ezzel szomszédos homológ szakasznak megfelelő aminosavszekvenciában.
- 2. Az 1. igénypont szerinti immunogénhordozó60 rendszer, azzal jellemezve, hogy a GnRH, ennek ana15HU 217 096 Β lógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptid a gin his trp ser tyr gly leu arg pro gly aminosavszekvenciából származik.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti immunogénhordozó rendszer, azzal jellemezve, hogy a főalegység F-11 szerotípusú P-fimbrilla-szálból származik.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti immunogénhordozó rendszer, azzal jellemezve, hogy az inszert hosszúsága legfeljebb 16 aminosav.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti immunogénhordozó rendszer, azzal jellemezve, hogy az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptid mellett legalább egy további aminosavat tartalmaz.
- 6. Rekombináns DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy egy inszertet hordozó, E. coli P-fimbrilla-szál főalegységet kódol, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység 4 hipervariábilis szakaszának megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol a rekombináns DNS-szekvencia egy mutációt tartalmaz a főalegységet kódoló DNS-szekvencia 1 hipervariábilis szakaszában vagy az ezzel szomszédos homológ szakaszban.
- 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti immunogénhordozó rendszer vagy a 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, azzaljellemezve, hogy a vad típusú főalegység 1 hipervariábilis szakaszának vagy az ezzel szomszédos homológ szakasznak megfelelő aminosavszekvenciában található mutáció egy Stul felismerőhely.
- 8. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a 6. vagy 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz.
- 9. Mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a 6. vagy 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvenciát és/vagy a 8. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmaz, és a rekombináns DNS-szekvencia kifejezésére alkalmas.
- 10. A 9. igénypont szerinti mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy fimbrillák biológiai előállítására alkalmas.
- 11. GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz állatban történő kiváltására alkalmas vakcina, azzal jellemezve, hogy hatékony mennyiségben az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti immunogénhordozó rendszert, vagy a 8. igénypont szerinti expressziós vektort, vagy a 9. vagy 10. igénypont szerinti mikroorganizmust tartalmaz adott esetben egy vagy több, vakcinában szokásos hordozóanyag és egyéb segédanyag mellett.
- 12. Eljárás GnRH, ennek analógja vagy származéka elleni immunválasz kiváltására alkalmas immunogénhordozó rendszer előállítására, azzal jellemezve, hogy egy olyan rekombináns DNS-szekvenciát fejezünk ki, amely legalább egy olyan E. coli P-fimbrilla-szálat kódol, amely legalább egy, inszertet hordozó főalegységet tartalmaz, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység 4 hipervariábilis szakaszának megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol az inszertet hordozó főalegység mutációt tartalmaz a vad típusú főalegység 1 hipervariábilis szakaszának vagy az ezzel szomszédos homológ szakasznak megfelelő aminosavszekvenciában.
- 13. Eljárás rekombináns DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy egy inszertet hordozó, E. coli P-fimbrilla-szál főalegységet kódoló szekvenciát enzimatikus vagy szintetikus úton előállítunk, ahol az inszert a GnRH, ennek analógja vagy származéka legalább egy antigén determinánsát hordozó peptidet tartalmaz, és a főalegységben a vad típusú főalegység 4 hipervariábilis szakaszának megfelelő pozícióban helyezkedik el, és ahol a rekombináns DNS-szekvencia egy mutációt tartalmaz a főalegység 1 hipervariábilis szakaszában vagy az ezzel szomszédos homológ szakaszban.
- 14. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy a 13. igénypont szerint előállított rekombináns DNS-szekvenciát gazdasejtben expresszió kiváltására képes szekvenciához kapcsoljuk.
- 15. Eljárás rekombináns mikroorganizmus előállítására, azzaljellemezve, hogy a 14. igénypont szerint előállított expressziós vektorral mikroorganizmust transzformálunk.
- 16. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerint előállított immunogénhordozó rendszert hordozóanyaggal és egyéb segédanyaggal keveijük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92201775 | 1992-06-18 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9301764D0 HU9301764D0 (en) | 1993-10-28 |
| HUT68554A HUT68554A (en) | 1995-06-28 |
| HU217096B true HU217096B (hu) | 1999-11-29 |
Family
ID=8210697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9301764A HU217096B (hu) | 1992-06-18 | 1993-06-17 | GnRH elleni immunválasz kiváltására alkalmas immunogén hordozórendszer, ezt hordozó rekombináns DNS-szekvencia és ennek alkalmazása |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5684145A (hu) |
| EP (1) | EP0578293B1 (hu) |
| JP (1) | JPH0656696A (hu) |
| KR (1) | KR100293025B1 (hu) |
| AT (1) | ATE188737T1 (hu) |
| AU (1) | AU667715B2 (hu) |
| BR (1) | BR9302408A (hu) |
| CA (1) | CA2098533C (hu) |
| DE (1) | DE69327553T2 (hu) |
| DK (1) | DK0578293T3 (hu) |
| ES (1) | ES2142848T3 (hu) |
| GR (1) | GR3033086T3 (hu) |
| HU (1) | HU217096B (hu) |
| MX (1) | MX303646A (hu) |
| NZ (1) | NZ247907A (hu) |
| PT (1) | PT578293E (hu) |
| TW (1) | TW240232B (hu) |
| ZA (1) | ZA934199B (hu) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8826116D0 (en) * | 1988-11-08 | 1988-12-14 | Danbiosyst Ltd | Adhesive drug delivery composition |
| CA2114125A1 (en) * | 1991-07-26 | 1993-02-18 | Wayne G. Reilly | Self-adjuvanting peptide vaccine delivery system and production thereof |
| US5759551A (en) * | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| US5688506A (en) * | 1994-01-27 | 1997-11-18 | Aphton Corp. | Immunogens against gonadotropin releasing hormone |
| WO1995020657A1 (en) * | 1994-01-27 | 1995-08-03 | Gx Biosystems A/S | Receptor specific bacterial adhesins and their use |
| US6635740B1 (en) * | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| AUPO776897A0 (en) * | 1997-07-09 | 1997-07-31 | Csl Limited | A method of achieving production gains in livestock and agents useful for same |
| US6013770A (en) * | 1997-07-21 | 2000-01-11 | Washington State University | Chimeric contraceptive vaccines |
| US6656906B1 (en) * | 1998-05-20 | 2003-12-02 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| US6258782B1 (en) * | 1998-05-20 | 2001-07-10 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| AUPP807399A0 (en) | 1999-01-08 | 1999-02-04 | Csl Limited | Improved immunogenic lhrh composition and methods relating thereto |
| DK1035133T3 (da) * | 1999-02-17 | 2005-05-02 | Pfizer Prod Inc | Fusionsproteiner, der omfatter bærere, som kan inducere et dobbelt immunrespons |
| EP1278542A2 (en) * | 2000-05-05 | 2003-01-29 | Cytos Biotechnology AG | Molecular antigen arrays and vaccines |
| AU2001259452A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-20 | Aphton Corporation | Chimeric peptide immunogens their preparation and use |
| US7264810B2 (en) | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7115266B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| NZ531534A (en) * | 2001-10-05 | 2005-10-28 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptides conjugated with a carrier comprising a virus-like particle |
| RU2450827C2 (ru) | 2002-07-19 | 2012-05-20 | Цитос Биотехнологи Аг | Композиции вакцин, содержащие наборы антигенов в виде амилоида бета 1-6 |
| US7537767B2 (en) | 2003-03-26 | 2009-05-26 | Cytis Biotechnology Ag | Melan-A- carrier conjugates |
| NZ542323A (en) | 2003-03-26 | 2008-07-31 | Cytos Biotechnology Ag | Melan-A peptide analogue-virus-like-particle conjugates |
| GB0424563D0 (en) | 2004-11-05 | 2004-12-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| NZ220932A (en) * | 1986-07-03 | 1990-05-28 | Victoria State | Composition comprising an antigenic substance, such as lhrh, conjugated to at least two different carriers and method of immunological castration and spaying |
| DE3783425T2 (de) * | 1986-10-13 | 1993-05-13 | Solvay | Mikroorganismen, die fremdproteinenthaltende pili tragen, isolierte pili, verfahren zur ausscheidung von proteinen in verwendung dieser pili und deren nutzen. |
| AU616662B2 (en) * | 1987-04-27 | 1991-11-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Peptide production by protein engineering |
| DE3871489D1 (de) * | 1987-10-26 | 1992-07-02 | Akzo Nv | Impfstoff gegen e.coli-blutvergiftung bei gefluegel. |
| US5036047A (en) * | 1988-09-29 | 1991-07-30 | Pitman-Moore, Inc. | Method and composition for preventing conception |
| GB8826116D0 (en) * | 1988-11-08 | 1988-12-14 | Danbiosyst Ltd | Adhesive drug delivery composition |
| GB2228262B (en) * | 1989-01-25 | 1992-10-07 | Nat Inst Immunology | Antigenic derivative of gnrh |
| NL8900726A (nl) * | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Stichting Centr Diergeneeskund | Peptide, immunogene samenstelling en vaccin- of geneesmiddelpreparaat; werkwijze voor het immuniseren van een zoogdier tegen lhrh, en werkwijze voor het verbeteren van de vleeskwaliteit van varkens. |
-
1993
- 1993-06-14 ZA ZA934199A patent/ZA934199B/xx unknown
- 1993-06-15 EP EP93201712A patent/EP0578293B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-15 DE DE69327553T patent/DE69327553T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-15 DK DK93201712T patent/DK0578293T3/da active
- 1993-06-15 ES ES93201712T patent/ES2142848T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-15 PT PT93201712T patent/PT578293E/pt unknown
- 1993-06-15 AT AT93201712T patent/ATE188737T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-06-16 NZ NZ247907A patent/NZ247907A/en unknown
- 1993-06-16 CA CA002098533A patent/CA2098533C/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-17 KR KR1019930011071A patent/KR100293025B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-06-17 MX MX303646A patent/MX303646A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-06-17 TW TW082104843A patent/TW240232B/zh active
- 1993-06-17 HU HU9301764A patent/HU217096B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-06-18 JP JP5172381A patent/JPH0656696A/ja active Pending
- 1993-06-18 BR BR9302408A patent/BR9302408A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-06-18 AU AU41343/93A patent/AU667715B2/en not_active Ceased
-
1995
- 1995-05-30 US US08/453,588 patent/US5684145A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-29 US US08/521,079 patent/US6019983A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-29 GR GR20000400775T patent/GR3033086T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX303646A (es) | 1994-05-31 |
| TW240232B (hu) | 1995-02-11 |
| DE69327553T2 (de) | 2000-08-10 |
| EP0578293A1 (en) | 1994-01-12 |
| AU667715B2 (en) | 1996-04-04 |
| ES2142848T3 (es) | 2000-05-01 |
| NZ247907A (en) | 1994-12-22 |
| EP0578293B1 (en) | 2000-01-12 |
| US6019983A (en) | 2000-02-01 |
| CA2098533C (en) | 2005-08-16 |
| CA2098533A1 (en) | 1993-12-19 |
| GR3033086T3 (en) | 2000-08-31 |
| KR940000115A (ko) | 1994-01-03 |
| BR9302408A (pt) | 1994-01-11 |
| ZA934199B (en) | 1994-01-10 |
| US5684145A (en) | 1997-11-04 |
| PT578293E (pt) | 2000-06-30 |
| DK0578293T3 (da) | 2000-06-26 |
| DE69327553D1 (de) | 2000-02-17 |
| ATE188737T1 (de) | 2000-01-15 |
| AU4134393A (en) | 1993-12-23 |
| JPH0656696A (ja) | 1994-03-01 |
| KR100293025B1 (ko) | 2001-09-17 |
| HUT68554A (en) | 1995-06-28 |
| HU9301764D0 (en) | 1993-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0578293B1 (en) | E-coli P-fimbrine as immunogenic carrier system against GnRH | |
| EP0920510B1 (en) | GnRH-LEUKOTOXIN CHIMERAS | |
| CA1340958C (en) | Synthetic peptides representing a t-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines | |
| US6228987B1 (en) | Artificial T helper cell epitopes as immune stimulators for synthetic peptide immunogens including immunogenic LHRH peptides | |
| EP0708656B1 (en) | Immunogenic lhrh peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines | |
| JP7072921B2 (ja) | Ａ群レンサ球菌ワクチン | |
| HU219267B (en) | Dna fragments coding for neisseria meningitidis transferrin receptor subunits and method for their preparation | |
| NO313917B1 (no) | Antigen-presenterende kapsid med fusert MS2-kappeprotein | |
| KR19980702118A (ko) | ＧｎＲＨ-루코톡신 키메라 | |
| HU219673B (hu) | Neisseria meningitidis elleni vakcina | |
| DK175831B1 (da) | Neisseria gonorrhoeae-relaterede nucleinsyrer, rekombinantvektorer, værtsorgaismer, encellede organismer, polypeptidfremstillingsmetoder, polypeptidsammensætninger, vaccinepræparater, DNA-sonder, påvisningsmetoder og diagnostiske prövesæt, ......... | |
| EP0359919A2 (en) | Recombinant mycoplasma hyopneumoniae antigen and uses therefor | |
| van der Zee et al. | P-fimbriae of Escherichia coli as carriers for gonadotropin releasing hormone: development of a recombinant contraceptive vaccine | |
| KR20210119230A (ko) | 웅취 제거용 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물 | |
| US5240706A (en) | Intranasal administration of Mycoplasma hyopneumoniae antigen | |
| HU219762B (hu) | Neisseria meningitidis fertőzések elleni alegység vakcina és a megfelelő tisztított alegységek | |
| CA2233882A1 (en) | Pseudomonas exotoxin as immunogenic carrier in synthetic conjugate vaccines | |
| JP7430011B2 (ja) | 動物の中性化用組換えタンパク質およびこれを含むワクチン組成物 | |
| US6348332B1 (en) | DNA molecule encoding gonorrhoeal hybrid PIA/PIB protein | |
| JP2787926B2 (ja) | 融合タンパク質 | |
| AU728253B2 (en) | GNRH-leukotoxin chimeras | |
| JP3516688B6 (ja) | トランスフェリン受容体遺伝子 | |
| MXPA00011947A (en) | Methods for suppressing reproductive behavior in animals | |
| MXPA00001706A (en) | Fusion proteins comprising carriers that can induce a dual immune response |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |