JPH0656696A - 免疫原性キャリアー系 - Google Patents
免疫原性キャリアー系Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 大腸菌線毛フィラメントに結合したゴナドト
ロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨペプチド）から成る、Ｇ
ｎＲＨに対する免疫応答を誘発する免疫原性キャリアー
系及びこのキャリアー系を含有するワクチン。 【効果】 動物の発情周期、精子形成及び／または性的
行動を効果的に抑制する。
ロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨペプチド）から成る、Ｇ
ｎＲＨに対する免疫応答を誘発する免疫原性キャリアー
系及びこのキャリアー系を含有するワクチン。 【効果】 動物の発情周期、精子形成及び／または性的
行動を効果的に抑制する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫学の分野に関する。
より詳細には、本発明は、「黄体形成ホルモン放出ホル
モン」（ＬＨＲＨ）とも呼ばれる「ゴナドトロピン放出
ホルモン」（ＧｎＲＨ）またはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体に対する免疫応答を誘発し得る免疫原性キャリ
アー系に関する。
より詳細には、本発明は、「黄体形成ホルモン放出ホル
モン」（ＬＨＲＨ）とも呼ばれる「ゴナドトロピン放出
ホルモン」（ＧｎＲＨ）またはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体に対する免疫応答を誘発し得る免疫原性キャリ
アー系に関する。
【０００２】このようなキャリアー系をコードするＤＮ
Ａ配列、キャリアー系を含む組成物及びＧｎＲＨに対し
て哺乳類を免疫感作するためのキャリアー系の使用など
も本発明の範囲に包含される。キャリアー系は例えばワ
クチンまたは医薬製剤の成分を構成する。
Ａ配列、キャリアー系を含む組成物及びＧｎＲＨに対し
て哺乳類を免疫感作するためのキャリアー系の使用など
も本発明の範囲に包含される。キャリアー系は例えばワ
クチンまたは医薬製剤の成分を構成する。
【０００３】
【従来の技術】ＧｎＲＨはアミノ酸構造：ｐＧｌｕ−Ｈ
ｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2を有するホルモン活性を有
するデカペプチドである。ここでは慣用の３文字コード
を使用しており、ｐＧｌｕはピログルタミン酸を示し、
Ｇｌｙ−ＮＨ2はグリシンアミドを示す。ＧｎＲＨのｍ
ＲＮＡはＧｎＲＨ配列とシグナル配列とから成り、シグ
ナル配列は、ピロ−Ｇｌｕを形成するためにＮ末端Ｇｌ
ｎ残基の翻訳及び環化後に開裂される。
ｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ2を有するホルモン活性を有
するデカペプチドである。ここでは慣用の３文字コード
を使用しており、ｐＧｌｕはピログルタミン酸を示し、
Ｇｌｙ−ＮＨ2はグリシンアミドを示す。ＧｎＲＨのｍ
ＲＮＡはＧｎＲＨ配列とシグナル配列とから成り、シグ
ナル配列は、ピロ−Ｇｌｕを形成するためにＮ末端Ｇｌ
ｎ残基の翻訳及び環化後に開裂される。
【０００４】哺乳類にワクチンとして接種するためにＧ
ｎＲＨをキャリアータンパク質に結合させて使用し得る
ことは公知である。このようなワクチンは様々な理由で
接種されるが、すべてＧｎＲＨの自然機能と関係があ
る。視床下部で形成されるＧｎＲＨは、下垂体による性
ホルモンＬＨ（即ち「黄体形成ホルモン」）及びＦＳＨ
（「卵胞刺激ホルモン」）の産生及び放出を調節する。
血液中の性腺刺激ホルモンの量が減少すると、性腺の刺
激が減少し、血液中のステロイドレベルが下がる。Ｇｎ
ＲＨに対して動物を効果的に免疫感作することによっ
て、血中ステロイドレベルを性腺摘出後のステロイドレ
ベルと同じ程度まで低下させ得る。
ｎＲＨをキャリアータンパク質に結合させて使用し得る
ことは公知である。このようなワクチンは様々な理由で
接種されるが、すべてＧｎＲＨの自然機能と関係があ
る。視床下部で形成されるＧｎＲＨは、下垂体による性
ホルモンＬＨ（即ち「黄体形成ホルモン」）及びＦＳＨ
（「卵胞刺激ホルモン」）の産生及び放出を調節する。
血液中の性腺刺激ホルモンの量が減少すると、性腺の刺
激が減少し、血液中のステロイドレベルが下がる。Ｇｎ
ＲＨに対して動物を効果的に免疫感作することによっ
て、血中ステロイドレベルを性腺摘出後のステロイドレ
ベルと同じ程度まで低下させ得る。
【０００５】ＧｎＲＨまたはその類似体を抗原即ち免疫
原として患者または動物に投与するとき、ＧｎＲＨまた
はその類似体はワクチンとして作用し、宿主体内では、
宿主自身のＧｎＲＨにも作用するＧｎＲＨまたはその類
似体の抗体が産生される。従って類似体の効果は、類似
体自体が代謝または排泄された後にも持続するであろ
う。種々のＧｎＲＨ類似体またはＧｎＲＨ自体に関する
このような処理は、Ａｒｉｍｕｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ ９３：１０９２〜１１０３（１９７
３）；Ｈ．Ｍ．Ｆｒａｓｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ６３：３９９４０６
（１９７４）；Ｓ．Ｌ．Ｊｅｆｆｃｏａｔｅら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１１、Ｐ．７５〜
７７（１９７４）；Ｉ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ７８：３
９〜４７（１９７８）；Ｌ．Ｐｉｑｕｅ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１５、ｐ．５５〜６０
（１９７８）；Ｖ．Ｃ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖ
ｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：３０７〜３１４（１９
８１）；及び米国特許第３,９６３,６９１号に記載され
ている。
原として患者または動物に投与するとき、ＧｎＲＨまた
はその類似体はワクチンとして作用し、宿主体内では、
宿主自身のＧｎＲＨにも作用するＧｎＲＨまたはその類
似体の抗体が産生される。従って類似体の効果は、類似
体自体が代謝または排泄された後にも持続するであろ
う。種々のＧｎＲＨ類似体またはＧｎＲＨ自体に関する
このような処理は、Ａｒｉｍｕｒａら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ ９３：１０９２〜１１０３（１９７
３）；Ｈ．Ｍ．Ｆｒａｓｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ６３：３９９４０６
（１９７４）；Ｓ．Ｌ．Ｊｅｆｆｃｏａｔｅら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１１、Ｐ．７５〜
７７（１９７４）；Ｉ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅら、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ７８：３
９〜４７（１９７８）；Ｌ．Ｐｉｑｕｅ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１５、ｐ．５５〜６０
（１９７８）；Ｖ．Ｃ．Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖ
ｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：３０７〜３１４（１９
８１）；及び米国特許第３,９６３,６９１号に記載され
ている。
【０００６】欧州特許第０,１８１,２３６号は、有効な
避妊薬、性的活動亢進の治療薬、性ホルモンによって刺
激される癌及びその他の疾患の治療薬として有用な免疫
原性ワクチンを記載している。このワクチンは、キャリ
アータンパク質とＧｎＲＨに由来の１種以上のノナ−ま
たはデカペプチドとのコンジュゲートから成る。この免
疫感作は可逆的であり、従って外科的方法よりも有利で
ある。
避妊薬、性的活動亢進の治療薬、性ホルモンによって刺
激される癌及びその他の疾患の治療薬として有用な免疫
原性ワクチンを記載している。このワクチンは、キャリ
アータンパク質とＧｎＲＨに由来の１種以上のノナ−ま
たはデカペプチドとのコンジュゲートから成る。この免
疫感作は可逆的であり、従って外科的方法よりも有利で
ある。
【０００７】国際特許出願ＷＯ ８８／０５３０８は、
アミノ酸５、６または７個の長さを有するＧｎＲＨの部
分ペプチドとコンジュゲートしたウシ血清アルブミンの
ような免疫原性タンパク質を含む組成物によって哺乳類
を免疫中和する方法を提案している。
アミノ酸５、６または７個の長さを有するＧｎＲＨの部
分ペプチドとコンジュゲートしたウシ血清アルブミンの
ような免疫原性タンパク質を含む組成物によって哺乳類
を免疫中和する方法を提案している。
【０００８】世界で最初に商品化された家畜の避妊用ワ
クチンであるＶａｘｓｔｒａｔｅは、選択された雌ウシ
の約８０％で避妊効果を示した抗ＧｎＲＨのｔｗｏ−ｄ
ｏｓｅワクチンであると説明されている。このワクチン
は、油を基剤とするワクチンのアジュバントであるオボ
アルブミンにコンジュゲートした合成ＧｎＲＨを使用し
ており、ＧｎＲＨに対する免疫を刺激する。このような
ワクチンは体内評価及び産生効率の面で更に改善される
必要がある。
クチンであるＶａｘｓｔｒａｔｅは、選択された雌ウシ
の約８０％で避妊効果を示した抗ＧｎＲＨのｔｗｏ−ｄ
ｏｓｅワクチンであると説明されている。このワクチン
は、油を基剤とするワクチンのアジュバントであるオボ
アルブミンにコンジュゲートした合成ＧｎＲＨを使用し
ており、ＧｎＲＨに対する免疫を刺激する。このような
ワクチンは体内評価及び産生効率の面で更に改善される
必要がある。
【０００９】ＷＯ ９０／１１２９８によれば、これま
でに記載されたワクチンよりも信頼できるワクチンが得
られる。このワクチンは特に、去勢しない豚肉の臭みを
防ぐために使用される。このワクチンは、好ましくはＫ
ＬＨのようなタンパク質にコンジュゲートしたＧｎＲＨ
タンデム構造を有するペプチドを基剤とする。このペプ
チドを、最初に完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）
と混用し、８週後にブースターで追加刺激する。
でに記載されたワクチンよりも信頼できるワクチンが得
られる。このワクチンは特に、去勢しない豚肉の臭みを
防ぐために使用される。このワクチンは、好ましくはＫ
ＬＨのようなタンパク質にコンジュゲートしたＧｎＲＨ
タンデム構造を有するペプチドを基剤とする。このペプ
チドを、最初に完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）
と混用し、８週後にブースターで追加刺激する。
【００１０】ＷＯ ８８／０００５６は、ＧｎＲＨに対
する免疫応答を誘発するために十分な量でＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体に個別に結合した２種以上の異なる
キャリアーを含む組成物を記載している。通常はタンパ
ク質キャリアー及びアジュバントを使用し、１回以上の
ブースターが必要である。
する免疫応答を誘発するために十分な量でＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体に個別に結合した２種以上の異なる
キャリアーを含む組成物を記載している。通常はタンパ
ク質キャリアー及びアジュバントを使用し、１回以上の
ブースターが必要である。
【００１１】ＧｎＲＨまたはその類似体をタンパク質キ
ャリアーにコンジュゲートさせた後で使用する上記のご
とき公知のワクチンは、免疫系を刺激して抗ＧｎＲＨ抗
体を産生させ、この抗体がＧｎＲＨと反応してその体内
濃度を有効に低下させると推測される。しかしながらこ
の方法は、注射直後に受胎防止に有効でない初期期間が
あり、しかもこの期間の長さが一定でない。
ャリアーにコンジュゲートさせた後で使用する上記のご
とき公知のワクチンは、免疫系を刺激して抗ＧｎＲＨ抗
体を産生させ、この抗体がＧｎＲＨと反応してその体内
濃度を有効に低下させると推測される。しかしながらこ
の方法は、注射直後に受胎防止に有効でない初期期間が
あり、しかもこの期間の長さが一定でない。
【００１２】ＷＯ ９０／０３１８２は、この問題を解
決するために、（１）遊離ＧｎＲＨまたはその類似体
と、（２）ＧｎＲＨまたはその類似体とキャリアータン
パク質との免疫原性コンジュゲートと、から成る組成物
の使用を提案している。遊離ＧｎＲＨまたはその類似体
は、投与の約６週間後までの期間、即ちコンジュゲート
に応答して形成されたＧｎＲＨ抗体が通常は約０.５〜
２年後に代謝されるまで哺乳類の受胎防止を維持する。
しかしながらポリペプチドコンジュゲート自体はそれだ
けでは免疫原的に不十分である。
決するために、（１）遊離ＧｎＲＨまたはその類似体
と、（２）ＧｎＲＨまたはその類似体とキャリアータン
パク質との免疫原性コンジュゲートと、から成る組成物
の使用を提案している。遊離ＧｎＲＨまたはその類似体
は、投与の約６週間後までの期間、即ちコンジュゲート
に応答して形成されたＧｎＲＨ抗体が通常は約０.５〜
２年後に代謝されるまで哺乳類の受胎防止を維持する。
しかしながらポリペプチドコンジュゲート自体はそれだ
けでは免疫原的に不十分である。
【００１３】ＧｎＲＨをポリペプチドキャリアー、例え
ばウシまたはヒトの血清アルブミンまたは破傷風トキソ
イドまたはチログロブリンにコンジュゲートさせる手順
は一般的な結合方法（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏ
ｄ）を含み、その結果として得られる免疫原は確定し難
い。このような不確定の免疫原は、ＧｎＲＨの作用をｉ
ｎ ｖｉｖｏで遮断し得る抗ＧｎＲＨ抗体を得るために
望ましい溶液中の遊離ＧｎＲＨの構造的特徴をすべて維
持することが難しいためであろう。更に、ペプチドが免
疫学的認識に重要な領域を介してキャリアーに付着する
危険がある。
ばウシまたはヒトの血清アルブミンまたは破傷風トキソ
イドまたはチログロブリンにコンジュゲートさせる手順
は一般的な結合方法（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏ
ｄ）を含み、その結果として得られる免疫原は確定し難
い。このような不確定の免疫原は、ＧｎＲＨの作用をｉ
ｎ ｖｉｖｏで遮断し得る抗ＧｎＲＨ抗体を得るために
望ましい溶液中の遊離ＧｎＲＨの構造的特徴をすべて維
持することが難しいためであろう。更に、ペプチドが免
疫学的認識に重要な領域を介してキャリアーに付着する
危険がある。
【００１４】実際、内因性ＧｎＲＨの生物学的効力を有
意に低減させ得る高力価の抗ＧｎＲＨ抗体を与えるため
にかかるコンジュゲートで哺乳類を有効に免疫感作する
ためには、フロインド完全アジュバントまたは不完全ア
ジュバントに代表されるような不都合な副作用を生じ易
いアジュバントの存在が必須であった。フロインド完全
アジュバントは家畜のツベルクリン検査を妨害する。ま
た、このアジュバント及びフロインド不完全アジュバン
トは、注射部位に種々の量の慢性炎症反応を生じさせ
る。
意に低減させ得る高力価の抗ＧｎＲＨ抗体を与えるため
にかかるコンジュゲートで哺乳類を有効に免疫感作する
ためには、フロインド完全アジュバントまたは不完全ア
ジュバントに代表されるような不都合な副作用を生じ易
いアジュバントの存在が必須であった。フロインド完全
アジュバントは家畜のツベルクリン検査を妨害する。ま
た、このアジュバント及びフロインド不完全アジュバン
トは、注射部位に種々の量の慢性炎症反応を生じさせ
る。
【００１５】英国特許第２,１９６,９６９号は、天然型
アミノ酸配列のＣ末端に短いペプチド延長部を有するＧ
ｎＲＨの類似体を含むワクチンを記載している。ポテン
シャルエネルギー計算によれば、これは溶液中で天然型
ＧｎＲＨと実質的に同じコンホーメーションを有すると
予測され、且つＣ末端に備えられたシステインまたはチ
ロシン残基の側鎖を介してキャリアーポリペプチドに容
易に結合すると考えられる。
アミノ酸配列のＣ末端に短いペプチド延長部を有するＧ
ｎＲＨの類似体を含むワクチンを記載している。ポテン
シャルエネルギー計算によれば、これは溶液中で天然型
ＧｎＲＨと実質的に同じコンホーメーションを有すると
予測され、且つＣ末端に備えられたシステインまたはチ
ロシン残基の側鎖を介してキャリアーポリペプチドに容
易に結合すると考えられる。
【００１６】上記のごとき従来のワクチンは概して、何
らかの抗体応答を得るためには大量に使用する必要があ
り、これに付随して大量の強いアジュバントが使用され
る。このようなアジュバントはＧｎＲＨに関連する生物
学的活性にほとんどまたは全く効果がない。上記のワク
チンの多くは免疫応答を誘発し得るが、この免疫応答
は、ＧｎＲＨに対する抗体を形成するだけであり、ワク
チン接種された哺乳類の体内ＧｎＲＨの生物学的活性に
対する効果を含むことはめったにない。生物学的効果を
与えるようなワクチンは１００％免疫感作を達成するこ
とができない。
らかの抗体応答を得るためには大量に使用する必要があ
り、これに付随して大量の強いアジュバントが使用され
る。このようなアジュバントはＧｎＲＨに関連する生物
学的活性にほとんどまたは全く効果がない。上記のワク
チンの多くは免疫応答を誘発し得るが、この免疫応答
は、ＧｎＲＨに対する抗体を形成するだけであり、ワク
チン接種された哺乳類の体内ＧｎＲＨの生物学的活性に
対する効果を含むことはめったにない。生物学的効果を
与えるようなワクチンは１００％免疫感作を達成するこ
とができない。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｇｎ
ＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対して顕
著に改善された免疫応答を誘発し得る免疫原性キャリア
ー系を提供することである。本発明のキャリアー系の使
用によって得られる免疫応答は、免疫感作された哺乳類
の体内ＧｎＲＨの生物学的活性に影響を与える十分に高
い免疫応答である。本発明のキャリアー系は、動物の発
情周期、精子形成及び／または性的行動を効果的に抑制
するための使用に特に適している。本発明のキャリアー
系はワクチン中に使用でき、このワクチンは免疫応答を
生じさせるためにフロインドアジュバントまたは不完全
フロインドアジュバントのような攻撃性のアジュバント
をもはや不要とする。より攻撃性でないアジュバントを
使用できる。
ＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対して顕
著に改善された免疫応答を誘発し得る免疫原性キャリア
ー系を提供することである。本発明のキャリアー系の使
用によって得られる免疫応答は、免疫感作された哺乳類
の体内ＧｎＲＨの生物学的活性に影響を与える十分に高
い免疫応答である。本発明のキャリアー系は、動物の発
情周期、精子形成及び／または性的行動を効果的に抑制
するための使用に特に適している。本発明のキャリアー
系はワクチン中に使用でき、このワクチンは免疫応答を
生じさせるためにフロインドアジュバントまたは不完全
フロインドアジュバントのような攻撃性のアジュバント
をもはや不要とする。より攻撃性でないアジュバントを
使用できる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対して免疫応答を
誘発し得る免疫原性キャリアー系を提供する。このキャ
リアー系は、インサートを伴う主要サブユニットの少な
くとも一部から成る大腸菌Ｐ線毛フィラメントの少なく
とも一部を含み、このインサートは、ＧｎＲＨまたはＧ
ｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なくとも
１つを有するペプチドから成り、このインサートは、野
性型主要サブユニットの超可変領域４の位置に対応する
主要サブユニット内の位置に配置されている。この場合
の野性型なる用語は、インサートを伴わない主要サブユ
ニットの形態を意味する。
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対して免疫応答を
誘発し得る免疫原性キャリアー系を提供する。このキャ
リアー系は、インサートを伴う主要サブユニットの少な
くとも一部から成る大腸菌Ｐ線毛フィラメントの少なく
とも一部を含み、このインサートは、ＧｎＲＨまたはＧ
ｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なくとも
１つを有するペプチドから成り、このインサートは、野
性型主要サブユニットの超可変領域４の位置に対応する
主要サブユニット内の位置に配置されている。この場合
の野性型なる用語は、インサートを伴わない主要サブユ
ニットの形態を意味する。
【００１９】フィムブリエとも呼ばれている線毛フィラ
メントは、多くの細菌株でしばしば大量に検出される長
い繊維状の付属体である。各フィラメントは、α−ヘリ
カル状に重合した約１０００個のサブユニットから構成
されている（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ、Ｔ．Ｋ．＆ Ｒｈｅ
ｎ、Ｍ．、Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．１９８２、１４、
２７２〜２７７；Ｇｉｌｅｓ、Ｃ．Ｌ．＆ Ｍａａｓ、
Ｗ．Ｋ．、Ｐｒｏｇ．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏ １９８７、３、１３９〜１５８）。フィム
ブリエ構造は詳細に研究されており、合成ペプチドから
成るハイブリッドフィムブリエとしても知られた組換え
線毛フィラメントも既に文献に記載されている。次に、
フィムブリエの構造及び公知のハイブリッドフィムブリ
エについて説明する。
メントは、多くの細菌株でしばしば大量に検出される長
い繊維状の付属体である。各フィラメントは、α−ヘリ
カル状に重合した約１０００個のサブユニットから構成
されている（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ、Ｔ．Ｋ．＆ Ｒｈｅ
ｎ、Ｍ．、Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．１９８２、１４、
２７２〜２７７；Ｇｉｌｅｓ、Ｃ．Ｌ．＆ Ｍａａｓ、
Ｗ．Ｋ．、Ｐｒｏｇ．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉ
ｍｍｕｎｏ １９８７、３、１３９〜１５８）。フィム
ブリエ構造は詳細に研究されており、合成ペプチドから
成るハイブリッドフィムブリエとしても知られた組換え
線毛フィラメントも既に文献に記載されている。次に、
フィムブリエの構造及び公知のハイブリッドフィムブリ
エについて説明する。
【００２０】主として尿路疾患性大腸菌に関連して検出
され上皮組織に対する細菌の付着に関与するＰフィムブ
リエは、１種類（ｔｙｐｅ）の主要サブユニットと複数
の異なる副次的サブユニットとを含む。副次的線毛成分
の局在及び発生に関してはＬｉｎｄｂｅｒｇらによって
研究された（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） １９８７
３２８：８４〜８７及びＲｉｅｇｍａｎら １９８８
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：７３〜８０）。
され上皮組織に対する細菌の付着に関与するＰフィムブ
リエは、１種類（ｔｙｐｅ）の主要サブユニットと複数
の異なる副次的サブユニットとを含む。副次的線毛成分
の局在及び発生に関してはＬｉｎｄｂｅｒｇらによって
研究された（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） １９８７
３２８：８４〜８７及びＲｉｅｇｍａｎら １９８８
Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：７３〜８０）。
【００２１】大腸菌ＰフィムブリエまたはＰフィムブリ
リン（ｆｉｍｂｒｉｌｌｉｎ）の主要サブユニットが優
勢であり抗原特性を決定する。血清型Ｆ７〜Ｆ１３がＰ
フィムブリエに割り当てられ、この血清型は主要サブユ
ニットによって特定されることが知られている。種々の
血清型からの主要サブユニットタンパク質のアミノ酸配
列の比較によって、他の点ではより相同の配列に５つの
超可変領域（ＨＲｓ）が検出された。この超可変領域は
Ｐフィムブリエの天然エピトープを含む（ｖａｎ Ｄｉ
ｅら（１９８７）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇ
ｅｎ ３：１４９〜１５４；ｖａｎ Ｄｉｅら（１９８
８）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ．４９：９
５〜１００）。
リン（ｆｉｍｂｒｉｌｌｉｎ）の主要サブユニットが優
勢であり抗原特性を決定する。血清型Ｆ７〜Ｆ１３がＰ
フィムブリエに割り当てられ、この血清型は主要サブユ
ニットによって特定されることが知られている。種々の
血清型からの主要サブユニットタンパク質のアミノ酸配
列の比較によって、他の点ではより相同の配列に５つの
超可変領域（ＨＲｓ）が検出された。この超可変領域は
Ｐフィムブリエの天然エピトープを含む（ｖａｎ Ｄｉ
ｅら（１９８７）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇ
ｅｎ ３：１４９〜１５４；ｖａｎ Ｄｉｅら（１９８
８）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ．４９：９
５〜１００）。
【００２２】Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９
０）２２２：２９７〜３０３においてｖａｎ Ｄｉｅら
は、血清型Ｆ１１を有するＰフィムブリエの主要サブユ
ニットの超可変領域１及び４（ＨＲ１及びＨＲ４）をど
のように用いて外来エピトープを挿入するかを記載して
いる。種々の病原体に由来の抗原決定基をコードするい
くつかのオリゴヌクレオチドをクローニングすると、得
られた組換え主要サブユニットがときどきフィムブリエ
として集合する。挿入されたペプチドの長さがアミノ酸
１４個以下の長さのときにだけフィムブリエの集合が生
じた。
０）２２２：２９７〜３０３においてｖａｎ Ｄｉｅら
は、血清型Ｆ１１を有するＰフィムブリエの主要サブユ
ニットの超可変領域１及び４（ＨＲ１及びＨＲ４）をど
のように用いて外来エピトープを挿入するかを記載して
いる。種々の病原体に由来の抗原決定基をコードするい
くつかのオリゴヌクレオチドをクローニングすると、得
られた組換え主要サブユニットがときどきフィムブリエ
として集合する。挿入されたペプチドの長さがアミノ酸
１４個以下の長さのときにだけフィムブリエの集合が生
じた。
【００２３】本明細書の導入部で既に説明したように、
ＧｎＲＨに対する免疫応答を誘発するために適当な種々
の系に関する研究は数多く行なわれている。しかしなが
ら今日まで、ＧｎＲＨに対する免疫応答を誘発するため
の適当なエピトープを含むハイブリッドフィムブリエに
関する実験が記載されたことはない。
ＧｎＲＨに対する免疫応答を誘発するために適当な種々
の系に関する研究は数多く行なわれている。しかしなが
ら今日まで、ＧｎＲＨに対する免疫応答を誘発するため
の適当なエピトープを含むハイブリッドフィムブリエに
関する実験が記載されたことはない。
【００２４】ＧｎＲＨ自体は免疫原性でなく、免疫原性
キャリアーを必要とする。フィムブリエは高分子構造を
有しているので高度に免疫原性であり、ＧｎＲＨまたは
ＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の免疫原性キャリアー
として作用し得ると予想できる。発明者らは更に、主要
サブユニット中にインサートを有するＰ線毛フィラメン
トを含む外来合成ペプチドの免疫原性キャリアーは、こ
のインサートが免疫原性に乏しいことが知られているＧ
ｎＲＨの抗原決定基を含むとき、前記合成ペプチドに対
する免疫原応答を改善し得ると推定した。また、フィム
ブリエをもつ（ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ）細菌は廉価に培
養でき、細菌からフィムブリエを容易に単離し精製し得
るので、ＧｎＲＨに対する免疫感作に使用するための免
疫原性キャリアー系がより廉価に且つより効率よく得ら
れる。
キャリアーを必要とする。フィムブリエは高分子構造を
有しているので高度に免疫原性であり、ＧｎＲＨまたは
ＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の免疫原性キャリアー
として作用し得ると予想できる。発明者らは更に、主要
サブユニット中にインサートを有するＰ線毛フィラメン
トを含む外来合成ペプチドの免疫原性キャリアーは、こ
のインサートが免疫原性に乏しいことが知られているＧ
ｎＲＨの抗原決定基を含むとき、前記合成ペプチドに対
する免疫原応答を改善し得ると推定した。また、フィム
ブリエをもつ（ｆｉｍｂｒｉａｔｅｄ）細菌は廉価に培
養でき、細菌からフィムブリエを容易に単離し精製し得
るので、ＧｎＲＨに対する免疫感作に使用するための免
疫原性キャリアー系がより廉価に且つより効率よく得ら
れる。
【００２５】しかしながらこのためには、線毛サブユニ
ットの形成を妨害することなく且つ好ましくは多数の重
合サブユニットから成る線毛フィラメントの形成を以後
に妨害することなく、線毛サブユニットのエピトープの
１つを置換しなければならない。更に外来エピトープ
は、抗原決定基が免疫応答を誘発するように適正に露出
し且つサブユニットの重合を妨害しないような立体配置
で線毛サブユニット内に存在しなければならない。
ットの形成を妨害することなく且つ好ましくは多数の重
合サブユニットから成る線毛フィラメントの形成を以後
に妨害することなく、線毛サブユニットのエピトープの
１つを置換しなければならない。更に外来エピトープ
は、抗原決定基が免疫応答を誘発するように適正に露出
し且つサブユニットの重合を妨害しないような立体配置
で線毛サブユニット内に存在しなければならない。
【００２６】その後の研究で発明者らは、ＧｎＲＨをコ
ードするＤＮＡ配列を線毛成分をコードする主要サブユ
ニット遺伝子のＨＲ１に組込んだ。ＧｎＲＨ以外のペプ
チドがＨＲ１に有効に取込まれたことを証明したＶａｎ
Ｄｉｅら（１９９０、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２２２：２９７〜３０３）の結果と違って、Ｐ線毛フィ
ラメントの主要サブユニットのＨＲ１にＧｎＲＨが挿入
されたＰ線毛フィラメントをコードするＤＮＡを含む微
生物は実際にはフィムブリエを形成できないことが知見
された。
ードするＤＮＡ配列を線毛成分をコードする主要サブユ
ニット遺伝子のＨＲ１に組込んだ。ＧｎＲＨ以外のペプ
チドがＨＲ１に有効に取込まれたことを証明したＶａｎ
Ｄｉｅら（１９９０、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２２２：２９７〜３０３）の結果と違って、Ｐ線毛フィ
ラメントの主要サブユニットのＨＲ１にＧｎＲＨが挿入
されたＰ線毛フィラメントをコードするＤＮＡを含む微
生物は実際にはフィムブリエを形成できないことが知見
された。
【００２７】しかしながら発明者らは更に研究を続行
し、ＧｎＲＨの抗原決定基を少なくとも１つ含む外来ペ
プチドが線毛フィラメントの主要サブユニットのＨＲ４
に挿入された大腸菌Ｐ線毛フィラメントをコードするＤ
ＮＡを含む微生物は十分にフィムブリエを形成するとい
う意外な知見を得た。より重要な知見は、得られたフィ
ラメントが明らかに、ＧｎＲＨの少なくとも１つの抗原
決定基を十分に露出した立体配置で含むことである。更
に、このようなフィラメントを含む組成物を注射した動
物はＧｎＲＨに対して予想外に高い抗体価を与える。実
際、得られた免疫応答は極めて高いのでＧｎＲＨ関連プ
ロセスで生物学的効果が得られる。
し、ＧｎＲＨの抗原決定基を少なくとも１つ含む外来ペ
プチドが線毛フィラメントの主要サブユニットのＨＲ４
に挿入された大腸菌Ｐ線毛フィラメントをコードするＤ
ＮＡを含む微生物は十分にフィムブリエを形成するとい
う意外な知見を得た。より重要な知見は、得られたフィ
ラメントが明らかに、ＧｎＲＨの少なくとも１つの抗原
決定基を十分に露出した立体配置で含むことである。更
に、このようなフィラメントを含む組成物を注射した動
物はＧｎＲＨに対して予想外に高い抗体価を与える。実
際、得られた免疫応答は極めて高いのでＧｎＲＨ関連プ
ロセスで生物学的効果が得られる。
【００２８】従って本発明の目的は、ＧｎＲＨまたはＧ
ｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を誘発
し得る免疫原性キャリアー系を提供することである。こ
のキャリアー系は、インサートを伴う少なくとも１つの
主要サブユニットを含む大腸菌Ｐ線毛フィラメントの少
なくとも一部を含み、このインサートは、ＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なく
とも１つを有するペプチドから成り、このインサート
は、野性型主要サブユニットの超可変領域４（ＨＲ４）
内の位置に対応する主要サブユニット内の位置に配置さ
れている。
ｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を誘発
し得る免疫原性キャリアー系を提供することである。こ
のキャリアー系は、インサートを伴う少なくとも１つの
主要サブユニットを含む大腸菌Ｐ線毛フィラメントの少
なくとも一部を含み、このインサートは、ＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なく
とも１つを有するペプチドから成り、このインサート
は、野性型主要サブユニットの超可変領域４（ＨＲ４）
内の位置に対応する主要サブユニット内の位置に配置さ
れている。
【００２９】本発明のキャリアー系に含まれるＧｎＲＨ
の少なくとも１つの抗原決定基を伴うペプチドは、配列
ｇｌｎ−ｈｉｓ−ｔｒｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｌ
ｅｕ−ａｒｇ−ｐｒｏ−ｇｌｙ（配列番号：１９）を有
するＧｎＲＨをコードするデカペプチドでもよくまたは
ＧｎＲＨの少なくとも１つの抗原決定基を含む上記配列
の誘導体でもよい。（アミノ酸配列は慣用の３文字アミ
ノ酸コードで示す）。
の少なくとも１つの抗原決定基を伴うペプチドは、配列
ｇｌｎ−ｈｉｓ−ｔｒｐ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ｇｌｙ−ｌ
ｅｕ−ａｒｇ−ｐｒｏ−ｇｌｙ（配列番号：１９）を有
するＧｎＲＨをコードするデカペプチドでもよくまたは
ＧｎＲＨの少なくとも１つの抗原決定基を含む上記配列
の誘導体でもよい。（アミノ酸配列は慣用の３文字アミ
ノ酸コードで示す）。
【００３０】ノナペプチドｋｗｓｙｇｌｒｐｇはＧｎＲ
Ｈに対する免疫応答を誘発することが知られており（米
国特許第４,６０８,２５１号）、部分ペプチド（以後、
１文字アミノ酸コードを用いる）＃ｅｈｗｓｙ、＃ｅｈ
ｗｓｙｇ、＃ｅｈｗｓｙｇｌ、ｈｗｓｙｇｌｒ、ｗｓｙ
ｇｌｒ、ｓｙｇｌｒｐｇ、ｙｇｌｒｐｇも同じである
（国際特許出願ＷＯ ８８／０５３０８）。従ってこれ
らの誘導体もまた、本発明のＧｎＲＨに対する免疫応答
を誘発するキャリアー系の組換え線毛フィラメントの一
部を構成し得る適当なペプチドである。
Ｈに対する免疫応答を誘発することが知られており（米
国特許第４,６０８,２５１号）、部分ペプチド（以後、
１文字アミノ酸コードを用いる）＃ｅｈｗｓｙ、＃ｅｈ
ｗｓｙｇ、＃ｅｈｗｓｙｇｌ、ｈｗｓｙｇｌｒ、ｗｓｙ
ｇｌｒ、ｓｙｇｌｒｐｇ、ｙｇｌｒｐｇも同じである
（国際特許出願ＷＯ ８８／０５３０８）。従ってこれ
らの誘導体もまた、本発明のＧｎＲＨに対する免疫応答
を誘発するキャリアー系の組換え線毛フィラメントの一
部を構成し得る適当なペプチドである。
【００３１】本発明のキャリアー系の成分を構成し得る
その他の適当なペプチドは、ＧｎＲＨに対する免疫応答
を誘発し得るＧｎＲＨの類似体または誘導体である。米
国特許第３,９６３,６９１号及び第４,６０８,２５１号
は、抗ＧｎＲＨ抗体を刺激するために有用なＧｎＲＨ類
似体を開示している。従って、該特許に記載された任意
の類似体またはＧｎＲＨに対する免疫応答を誘発し得る
少なくとも１つの抗原決定基を含むその他の任意のＧｎ
ＲＨの類似体もしくは誘導体がＰ線毛フィラメントの主
要サブユニットの一部に組込まれたペプチドを含むキャ
リアー系は本発明のキャリアー系の一例である。
その他の適当なペプチドは、ＧｎＲＨに対する免疫応答
を誘発し得るＧｎＲＨの類似体または誘導体である。米
国特許第３,９６３,６９１号及び第４,６０８,２５１号
は、抗ＧｎＲＨ抗体を刺激するために有用なＧｎＲＨ類
似体を開示している。従って、該特許に記載された任意
の類似体またはＧｎＲＨに対する免疫応答を誘発し得る
少なくとも１つの抗原決定基を含むその他の任意のＧｎ
ＲＨの類似体もしくは誘導体がＰ線毛フィラメントの主
要サブユニットの一部に組込まれたペプチドを含むキャ
リアー系は本発明のキャリアー系の一例である。
【００３２】本明細書で既に説明したように、フィンブ
リエには血清型Ｆ７〜Ｆ１３が存在する（Ｏｒｓｋｏ
ｖ、Ｉ． ＆ Ｆ．Ｏｒｓｋｏｖ．１９８５、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｅｘｔｒａｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｈｙｇ．９
５：５５１〜５７５）。異なる血清型を有するいくつか
のＰフィムブリリンのアミノ酸配列は、ｖａｎ Ｄｉｅ
ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．３、１４
９〜１５４、１９８７）によって開示されている。本発
明のキャリアー系は、Ｐフィムブリエの血清型のいずれ
かに由来し得る組換え主要サブユニットを含み得る。実
施例では、本発明のキャリアー系の適当な例を示すため
に血清型Ｆ１１を使用した。
リエには血清型Ｆ７〜Ｆ１３が存在する（Ｏｒｓｋｏ
ｖ、Ｉ． ＆ Ｆ．Ｏｒｓｋｏｖ．１９８５、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎ ｅｘｔｒａｉｎｔｅ
ｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｈｙｇ．９
５：５５１〜５７５）。異なる血清型を有するいくつか
のＰフィムブリリンのアミノ酸配列は、ｖａｎ Ｄｉｅ
ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．３、１４
９〜１５４、１９８７）によって開示されている。本発
明のキャリアー系は、Ｐフィムブリエの血清型のいずれ
かに由来し得る組換え主要サブユニットを含み得る。実
施例では、本発明のキャリアー系の適当な例を示すため
に血清型Ｆ１１を使用した。
【００３３】単一組換え主要サブユニットをＰ線毛フィ
ラメントの一部として含む上記のキャリアー系及び重合
した組換え主要サブユニットをＰ線毛フィラメントの一
部として含むキャリアー系はいずれも本発明の範囲に包
含される。
ラメントの一部として含む上記のキャリアー系及び重合
した組換え主要サブユニットをＰ線毛フィラメントの一
部として含むキャリアー系はいずれも本発明の範囲に包
含される。
【００３４】好ましくは本発明のキャリアー系は、Ｐ線
毛フィラメントの一部を含むかまたは２つ以上の主要サ
ブユニットから成る完全Ｐ線毛フィラメントを含み得
る。組換え完全Ｐ線毛フィラメントは、１０００個とい
う多数の組換え主要サブユニットを含み得る。本発明の
キャリアー系において、重合した組換え主要サブユニッ
ト中にＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体
に対する免疫応答を誘発し得るペプチドがマルチコピー
で存在することが好ましい理由は、線毛フィラメントに
エピトープがマルチコピーで存在するとき、このような
エピトープに対して極めて高い免疫原活性が得られるか
らである。
毛フィラメントの一部を含むかまたは２つ以上の主要サ
ブユニットから成る完全Ｐ線毛フィラメントを含み得
る。組換え完全Ｐ線毛フィラメントは、１０００個とい
う多数の組換え主要サブユニットを含み得る。本発明の
キャリアー系において、重合した組換え主要サブユニッ
ト中にＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体
に対する免疫応答を誘発し得るペプチドがマルチコピー
で存在することが好ましい理由は、線毛フィラメントに
エピトープがマルチコピーで存在するとき、このような
エピトープに対して極めて高い免疫原活性が得られるか
らである。
【００３５】本発明のキャリアー系は、インサートを伴
う少なくとも１つの主要サブユニットを含むＰ線毛フィ
ラメントの少なくとも一部をコードする組換えＤＮＡ配
列の発現によって得られる。インサートはＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なく
とも１つを有するペプチドであり、このインサートは野
性型主要サブユニットの超可変領域４（ＨＲ４）の位置
に対応する主要サブユニット内の位置に配置されてい
る。野性型なる用語に関しては本文中で既に定義した。
従ってこのような組換えＤＮＡ配列は本発明の範囲に包
含される。
う少なくとも１つの主要サブユニットを含むＰ線毛フィ
ラメントの少なくとも一部をコードする組換えＤＮＡ配
列の発現によって得られる。インサートはＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なく
とも１つを有するペプチドであり、このインサートは野
性型主要サブユニットの超可変領域４（ＨＲ４）の位置
に対応する主要サブユニット内の位置に配置されてい
る。野性型なる用語に関しては本文中で既に定義した。
従ってこのような組換えＤＮＡ配列は本発明の範囲に包
含される。
【００３６】本発明の組換えＤＮＡ配列は、ＧｎＲＨま
たはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つ
の抗原決定基を有するペプチドを少なくともコードする
少なくとも１つのＤＮＡ配列Ｌを含む。このＤＮＡ配列
ＬはＰ線毛フィラメントの野性型主要サブユニットの超
可変領域ＨＲ４の位置に対応する位置でＤＮＡ配列Ｓに
組込まれている。配列Ｓは野性型主要サブユニットの少
なくとも一部をコードしている。
たはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つ
の抗原決定基を有するペプチドを少なくともコードする
少なくとも１つのＤＮＡ配列Ｌを含む。このＤＮＡ配列
ＬはＰ線毛フィラメントの野性型主要サブユニットの超
可変領域ＨＲ４の位置に対応する位置でＤＮＡ配列Ｓに
組込まれている。配列Ｓは野性型主要サブユニットの少
なくとも一部をコードしている。
【００３７】本発明の組換えＤＮＡ配列中のＤＮＡ配列
Ｌの好ましい特定例は、以下のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを含むＤＮＡ配列Ｌである： （１）Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ； （２）Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ； （３）Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ； （４）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ。
Ｌの好ましい特定例は、以下のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを含むＤＮＡ配列Ｌである： （１）Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ； （２）Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ； （３）Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ； （４）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｔｒ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ。
【００３８】上記アミノ酸配列をコードする適当なＤＮ
Ａ配列の夫々を順番に以下に示す： （１）ＴＴＧ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＴＡ
Ｃ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＴＣＣ
−ＣＧＡ−ＡＣＣ； （２）ＴＴＧ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＴＡ
Ｃ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＡＧＧ−ＣＣＴ−ＧＧＡ−ＡＣ
Ｃ； （３）ＴＴＧ−ＡＣＴ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＡＧ
Ｃ−ＴＡＣ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＧＧ
−ＧＡＴ−ＣＣＡ−ＡＣＣ； （４）ＴＴＧ−ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧ
Ｇ−ＡＧＣ−ＴＡＣ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＣＣＡ
−ＧＧＣ−ＧＧＴ−ＣＣＡ−ＡＣＣ。
Ａ配列の夫々を順番に以下に示す： （１）ＴＴＧ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＴＡ
Ｃ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＴＣＣ
−ＣＧＡ−ＡＣＣ； （２）ＴＴＧ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＡＧＣ−ＴＡ
Ｃ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＡＧＧ−ＣＣＴ−ＧＧＡ−ＡＣ
Ｃ； （３）ＴＴＧ−ＡＣＴ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧＧ−ＡＧ
Ｃ−ＴＡＣ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＧＧ
−ＧＡＴ−ＣＣＡ−ＡＣＣ； （４）ＴＴＧ−ＧＧＡ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＣＡＣ−ＴＧ
Ｇ−ＡＧＣ−ＴＡＣ−ＧＧＣ−ＣＴＧ−ＣＧＴ−ＣＣＡ
−ＧＧＣ−ＧＧＴ−ＣＣＡ−ＡＣＣ。
【００３９】本発明の組換えＤＮＡ配列の適当な例は、
主要サブユニットの超可変領域４（ＨＲ４）にＤＮＡ配
列Ｌが組込まれたＦ１１の遺伝子クラスター（ふさ状構
造）を含む。尿路疾患性大腸菌の血清学的に異なる種々
のＰフィムブリエ、即ちＦ７1、Ｆ７2、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ
１１及びＦ１３を合成できる遺伝子はクローニングされ
ている： −Ｄｅ Ｒｅｅ、Ｊ．Ｍ．、Ｐ．Ｓｃｈｗｉｌｌｅｎ
ｓ、Ｌ．Ｐｒｏｍｅｓ、Ｉ．ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｈ．Ｂｅ
ｒｇｍａｎｓ、Ｈ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、１９
８５。尿路疾患性大腸菌に由来のＦ９フィムブリエの分
子クローニング及びキャラクタリゼーション。ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５：１６３〜１６
９； −Ｄｅ Ｒｅｅ、Ｊ．Ｍ．、Ｐ．Ｓｃｈｗｉｌｌｅｎ
ｓ、Ｊ．Ｆ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、１９８５。
尿路疾患性大腸菌に由来のＦ１１フィムブリエの分子ク
ローニング及びモノクローナル抗体によるフィムブリエ
のキャラクタリゼーション。ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：９１〜９７； −Ｈａｃｋｅｒ、Ｊ．、Ｍ．Ｏｔｔ、Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ、Ｒ．Ｈｕｌｌ、Ｗ．Ｇｏｅｂｅｌ、１９８６、大腸
菌に由来のＦ８線毛抗原の分子クローニング。ＧＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６：１３９〜１４
４； −Ｈｕｌｌ、Ｒ．Ａ．、Ｒ．Ｅ．Ｇｉｌｌ、Ｐ．Ｈｓ
ｕ、Ｂ．Ｈ．Ｍｉｎｓｈｅｗ、Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ、１９
８１。尿道感染大腸菌単離物に由来の１型またはＤ−マ
ンノース耐性のピリ線毛をコードする組換えプラスミド
の構築及び発現。Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：９
３３〜９３８； −Ｒｈｅｎ、Ｍ．、Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｍ．Ｅ．Ｐｅ
ｎｔｉｌｌａ、Ｍ．Ｓａｒｖａｓ、Ｔ．Ｋ．Ｋｏｒｈｏ
ｎｅｎ、１９８３。大腸菌のＰフィムブリエ；構造遺伝
子を含むＤＮＡフラグメントの分子クローニング。ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１１９〜
１２３； −Ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｉ．、Ｇ．Ｓｐｅｉｒｉｎｇｓ、
Ｉ．ｖａｎ Ｍｅｇｅｎ、Ｅ．Ｚｕｉｄｗｅｇ、Ｗ．Ｈ
ｏｅｋｓｔｒａ、Ｈ．Ｂｅｒｇｍａｎｓ、１９８５。尿
路疾患性大腸菌のＦ７1フィムブリエをコードする遺伝
子クラスターのクローニング及び遺伝的編成並びにＦ７
2遺伝子クラスターとの比較。ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８：３２９〜３３４； −Ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｉ．、Ｃ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎ
ｄｅｌ、Ｈ．−Ｊ．Ｈａｍｓｔｒａ、Ｗ．Ｈｏｅｋｓｔ
ｒａ、Ｈ．Ｂｅｒｇｍａｎｓ、１９８３。大腸菌０６：
Ｋ２：Ｈ１：Ｆ７株のフィムブリエに関する研究：ヒト
赤血球のマンノース耐性凝集反応を生じさせる線毛抗原
をコードするＤＮＡフラグメントの分子クローニング。
ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：７７
〜８２、 これらのＤＮＡ配列のいずれか及びその一部が本発明に
よる組換えＤＮＡ配列に使用できる。
主要サブユニットの超可変領域４（ＨＲ４）にＤＮＡ配
列Ｌが組込まれたＦ１１の遺伝子クラスター（ふさ状構
造）を含む。尿路疾患性大腸菌の血清学的に異なる種々
のＰフィムブリエ、即ちＦ７1、Ｆ７2、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ
１１及びＦ１３を合成できる遺伝子はクローニングされ
ている： −Ｄｅ Ｒｅｅ、Ｊ．Ｍ．、Ｐ．Ｓｃｈｗｉｌｌｅｎ
ｓ、Ｌ．Ｐｒｏｍｅｓ、Ｉ．ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｈ．Ｂｅ
ｒｇｍａｎｓ、Ｈ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、１９
８５。尿路疾患性大腸菌に由来のＦ９フィムブリエの分
子クローニング及びキャラクタリゼーション。ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５：１６３〜１６
９； −Ｄｅ Ｒｅｅ、Ｊ．Ｍ．、Ｐ．Ｓｃｈｗｉｌｌｅｎ
ｓ、Ｊ．Ｆ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｓｃｈ、１９８５。
尿路疾患性大腸菌に由来のＦ１１フィムブリエの分子ク
ローニング及びモノクローナル抗体によるフィムブリエ
のキャラクタリゼーション。ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９：９１〜９７； −Ｈａｃｋｅｒ、Ｊ．、Ｍ．Ｏｔｔ、Ｇ．Ｓｃｈｍｉｄ
ｔ、Ｒ．Ｈｕｌｌ、Ｗ．Ｇｏｅｂｅｌ、１９８６、大腸
菌に由来のＦ８線毛抗原の分子クローニング。ＧＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．３６：１３９〜１４
４； −Ｈｕｌｌ、Ｒ．Ａ．、Ｒ．Ｅ．Ｇｉｌｌ、Ｐ．Ｈｓ
ｕ、Ｂ．Ｈ．Ｍｉｎｓｈｅｗ、Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ、１９
８１。尿道感染大腸菌単離物に由来の１型またはＤ−マ
ンノース耐性のピリ線毛をコードする組換えプラスミド
の構築及び発現。Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３３：９
３３〜９３８； −Ｒｈｅｎ、Ｍ．、Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｍ．Ｅ．Ｐｅ
ｎｔｉｌｌａ、Ｍ．Ｓａｒｖａｓ、Ｔ．Ｋ．Ｋｏｒｈｏ
ｎｅｎ、１９８３。大腸菌のＰフィムブリエ；構造遺伝
子を含むＤＮＡフラグメントの分子クローニング。ＦＥ
ＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：１１９〜
１２３； −Ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｉ．、Ｇ．Ｓｐｅｉｒｉｎｇｓ、
Ｉ．ｖａｎ Ｍｅｇｅｎ、Ｅ．Ｚｕｉｄｗｅｇ、Ｗ．Ｈ
ｏｅｋｓｔｒａ、Ｈ．Ｂｅｒｇｍａｎｓ、１９８５。尿
路疾患性大腸菌のＦ７1フィムブリエをコードする遺伝
子クラスターのクローニング及び遺伝的編成並びにＦ７
2遺伝子クラスターとの比較。ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８：３２９〜３３４； −Ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｉ．、Ｃ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎ
ｄｅｌ、Ｈ．−Ｊ．Ｈａｍｓｔｒａ、Ｗ．Ｈｏｅｋｓｔ
ｒａ、Ｈ．Ｂｅｒｇｍａｎｓ、１９８３。大腸菌０６：
Ｋ２：Ｈ１：Ｆ７株のフィムブリエに関する研究：ヒト
赤血球のマンノース耐性凝集反応を生じさせる線毛抗原
をコードするＤＮＡフラグメントの分子クローニング。
ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９：７７
〜８２、 これらのＤＮＡ配列のいずれか及びその一部が本発明に
よる組換えＤＮＡ配列に使用できる。
【００４０】いくつかの例では、本発明の組換えＤＮＡ
配列のインサート即ちＤＮＡ配列Ｌが、ＧｎＲＨまたは
ＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの抗
原決定基を含むペプチドをコードするだけでなく、前記
ペプチドをコードするＤＮＡにフランキングする別のア
ミノ酸をコードするＤＮＡも含むのが好ましい。ＤＮＡ
配列Ｌは、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘
導体の少なくとも１つの抗原決定基を含むペプチドの一
端または両端に存在するフランキングアミノ酸をコード
し得る。このようなフランキングアミノ酸配列は１つ以
上のアミノ酸を含み得る。ＤＮＡ配列ＬがＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの
抗原決定基を含むペプチドの両端にこのようなフランキ
ングアミノ酸配列を含むとき、フランキングアミノ酸配
列は等しい長さ及び／または等しい組成を有していても
よく、または異なる長さ及び／または異なる組成を有し
ていてもよい。ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を含むペプチド
の一端または両端のフランキングアミノ酸配列の存在を
コードするＤＮＡ配列Ｌを含む組換えＤＮＡ配列が好ま
しい理由は、このような組換えＤＮＡ配列が発現された
ときに得られるＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を含む本発明の
キャリアー系は、このようなフランキングアミノ酸が存
在しないキャリアー系よりも、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ
の類似体もしくは誘導体に対してより高い免疫応答を誘
発し得る改良された立体配置を有するからである。
配列のインサート即ちＤＮＡ配列Ｌが、ＧｎＲＨまたは
ＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの抗
原決定基を含むペプチドをコードするだけでなく、前記
ペプチドをコードするＤＮＡにフランキングする別のア
ミノ酸をコードするＤＮＡも含むのが好ましい。ＤＮＡ
配列Ｌは、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘
導体の少なくとも１つの抗原決定基を含むペプチドの一
端または両端に存在するフランキングアミノ酸をコード
し得る。このようなフランキングアミノ酸配列は１つ以
上のアミノ酸を含み得る。ＤＮＡ配列ＬがＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの
抗原決定基を含むペプチドの両端にこのようなフランキ
ングアミノ酸配列を含むとき、フランキングアミノ酸配
列は等しい長さ及び／または等しい組成を有していても
よく、または異なる長さ及び／または異なる組成を有し
ていてもよい。ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を含むペプチド
の一端または両端のフランキングアミノ酸配列の存在を
コードするＤＮＡ配列Ｌを含む組換えＤＮＡ配列が好ま
しい理由は、このような組換えＤＮＡ配列が発現された
ときに得られるＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を含む本発明の
キャリアー系は、このようなフランキングアミノ酸が存
在しないキャリアー系よりも、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ
の類似体もしくは誘導体に対してより高い免疫応答を誘
発し得る改良された立体配置を有するからである。
【００４１】本発明のこのような好ましい組換えＤＮＡ
配列の適当な例は、１５個のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列Ｌを含み、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もし
くは誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を含むペプチ
ドをコードするＤＮＡが、ペプチドのＮ末端の２つの付
加的アミノ酸とＣ末端の３つのアミノ酸とによってフラ
ンキングされたデカペプチドをコードしている配列であ
る。本発明のこのような好ましい組換えＤＮＡ配列の別
の例では、ＤＮＡ配列Ｌが、１つのアミノ酸をコードす
る配列によって両端でフランキングされたＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの
抗原決定基をコードするデカペプチドをコードしてい
る。
配列の適当な例は、１５個のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列Ｌを含み、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もし
くは誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を含むペプチ
ドをコードするＤＮＡが、ペプチドのＮ末端の２つの付
加的アミノ酸とＣ末端の３つのアミノ酸とによってフラ
ンキングされたデカペプチドをコードしている配列であ
る。本発明のこのような好ましい組換えＤＮＡ配列の別
の例では、ＤＮＡ配列Ｌが、１つのアミノ酸をコードす
る配列によって両端でフランキングされたＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの
抗原決定基をコードするデカペプチドをコードしてい
る。
【００４２】本発明の組換えＤＮＡ配列は好ましくは、
最大長でアミノ酸１６個から成るペプチドをコードする
ＤＮＡ配列Ｌを含む。その理由は、１７個以上のアミノ
酸をコードするインサートを伴う本発明の組換えＤＮＡ
配列を含む組換え微生物は組換えフィムブリエを形成す
る能力が極めて小さいからである。
最大長でアミノ酸１６個から成るペプチドをコードする
ＤＮＡ配列Ｌを含む。その理由は、１７個以上のアミノ
酸をコードするインサートを伴う本発明の組換えＤＮＡ
配列を含む組換え微生物は組換えフィムブリエを形成す
る能力が極めて小さいからである。
【００４３】本発明の組換えＤＮＡ配列中で、ＤＮＡ配
列Ｌは、野性型超可変領域４（ＨＲ４）の全部または一
部に置換してＤＮＡ配列Ｓに取込まれる。
列Ｌは、野性型超可変領域４（ＨＲ４）の全部または一
部に置換してＤＮＡ配列Ｓに取込まれる。
【００４４】本発明の好ましい組換えＤＮＡ配列として
は、主要サブユニットの超可変領域ＨＲ４に対応する位
置にＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の
少なくとも１つの抗原決定基を組込んだペプチドを少な
くともコードするＤＮＡ配列ＬとＤＮＡ配列Ｓとを含
み、ＤＮＡ配列Ｓが更に主要サブユニットをコードする
ＤＮＡ配列の超可変領域１（ＨＲ１）及び隣接相同領域
に突然変異を含む組換えＤＮＡ配列がある。この配列が
好ましい理由は、このような組換えＤＮＡ配列が発現し
たときは、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘
導体の少なくとも１つの抗原決定基を含む本発明のキャ
リアー系が、ＨＲ１に突然変異を含まない等価の本発明
のキャリアー系よりもＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体
もしくは誘導体に対して高い免疫応答を誘発し得るから
である。
は、主要サブユニットの超可変領域ＨＲ４に対応する位
置にＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の
少なくとも１つの抗原決定基を組込んだペプチドを少な
くともコードするＤＮＡ配列ＬとＤＮＡ配列Ｓとを含
み、ＤＮＡ配列Ｓが更に主要サブユニットをコードする
ＤＮＡ配列の超可変領域１（ＨＲ１）及び隣接相同領域
に突然変異を含む組換えＤＮＡ配列がある。この配列が
好ましい理由は、このような組換えＤＮＡ配列が発現し
たときは、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘
導体の少なくとも１つの抗原決定基を含む本発明のキャ
リアー系が、ＨＲ１に突然変異を含まない等価の本発明
のキャリアー系よりもＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体
もしくは誘導体に対して高い免疫応答を誘発し得るから
である。
【００４５】このような好ましい組換えＤＮＡ配列の適
当な例は、主要サブユニットの少なくとも一部をコード
するＤＮＡ配列Ｓの超可変領域１及び隣接相同ＤＮＡに
ＳｔｕＩ部位を含む。超可変領域１及び隣接相同領域の
突然変異ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙをコードする。ＨＲ４に置換したＤＮＡ配列Ｌが
１４個のアミノ酸をコードしており、ＨＲ１の最終アミ
ノ酸とその後の隣接相同領域の２つのアミノ酸とをコー
ドするＤＮＡ配列の９個のヌクレオチドがＧｌｙ−Ｌｅ
ｕ−ＧｌｙをコードするＤＮＡ配列によって置換された
本発明の組換えＤＮＡ配列によって特に好結果が得られ
る。
当な例は、主要サブユニットの少なくとも一部をコード
するＤＮＡ配列Ｓの超可変領域１及び隣接相同ＤＮＡに
ＳｔｕＩ部位を含む。超可変領域１及び隣接相同領域の
突然変異ＤＮＡ配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙをコードする。ＨＲ４に置換したＤＮＡ配列Ｌが
１４個のアミノ酸をコードしており、ＨＲ１の最終アミ
ノ酸とその後の隣接相同領域の２つのアミノ酸とをコー
ドするＤＮＡ配列の９個のヌクレオチドがＧｌｙ−Ｌｅ
ｕ−ＧｌｙをコードするＤＮＡ配列によって置換された
本発明の組換えＤＮＡ配列によって特に好結果が得られ
る。
【００４６】本発明の組換えＤＮＡ配列は更に、微生物
による線毛フィラメントの発生過程の種々のステップで
必要とされるＤＮＡのような別のＤＮＡを含み得る。フ
ィムブリエの発生は、フィムブリエのサブユニットを微
生物の内膜に転位させるステップとサブユニットを細胞
形質間隙に運搬するステップとサブユニットを外膜に押
出してサブユニットをフィムブリエとして重合させるス
テップとを含む。
による線毛フィラメントの発生過程の種々のステップで
必要とされるＤＮＡのような別のＤＮＡを含み得る。フ
ィムブリエの発生は、フィムブリエのサブユニットを微
生物の内膜に転位させるステップとサブユニットを細胞
形質間隙に運搬するステップとサブユニットを外膜に押
出してサブユニットをフィムブリエとして重合させるス
テップとを含む。
【００４７】Ｐ線毛フィラメントの少なくとも一部をコ
ードする本発明の組換えＤＮＡ配列の場合には、上の文
節で記述したこのような別のＤＮＡが１つの以上の付属
遺伝子を含み、これらの付属遺伝子はフィムブリエを発
生し得る微生物によってサブユニットを運搬し、サブユ
ニットから線毛フィラメントを重合するために発現され
なければならない。付属遺伝子は、サブユニットをコー
ドするＤＮＡ配列Ｓを与えた微生物と同じ血清型の微生
物から得られたＤＮＡによってコードされ得る。
ードする本発明の組換えＤＮＡ配列の場合には、上の文
節で記述したこのような別のＤＮＡが１つの以上の付属
遺伝子を含み、これらの付属遺伝子はフィムブリエを発
生し得る微生物によってサブユニットを運搬し、サブユ
ニットから線毛フィラメントを重合するために発現され
なければならない。付属遺伝子は、サブユニットをコー
ドするＤＮＡ配列Ｓを与えた微生物と同じ血清型の微生
物から得られたＤＮＡによってコードされ得る。
【００４８】本発明の組換えＤＮＡ配列中の付属遺伝子
をコードする別のＤＮＡはまた、組換え主要サブユニッ
トをコードするＤＮＡ配列を与えた微生物とは異なる血
清型のＰフィラメントを有する微生物から得られてもよ
い。その理由は、異なる血清型のＰフィムブリエをコー
ドするＤＮＡに由来の付属遺伝子がフィムブリエの発生
に不都合な影響を与えることなく微生物中で交換され得
るからである。
をコードする別のＤＮＡはまた、組換え主要サブユニッ
トをコードするＤＮＡ配列を与えた微生物とは異なる血
清型のＰフィラメントを有する微生物から得られてもよ
い。その理由は、異なる血清型のＰフィムブリエをコー
ドするＤＮＡに由来の付属遺伝子がフィムブリエの発生
に不都合な影響を与えることなく微生物中で交換され得
るからである。
【００４９】本発明の組換えＤＮＡ配列の別のＤＮＡ配
列は、微生物に組換え主要サブユニットを分泌させ得る
任意のＤＮＡ配列から成り得る。例えば、本発明の組換
えＤＮＡ配列は、組換え主要サブユニットが本発明の組
換えＤＮＡを発現させ得る微生物の膜を通過できるよう
にするシグナルペプチドをコードする別のＤＮＡ配列を
含み得る。
列は、微生物に組換え主要サブユニットを分泌させ得る
任意のＤＮＡ配列から成り得る。例えば、本発明の組換
えＤＮＡ配列は、組換え主要サブユニットが本発明の組
換えＤＮＡを発現させ得る微生物の膜を通過できるよう
にするシグナルペプチドをコードする別のＤＮＡ配列を
含み得る。
【００５０】本発明のキャリアー系は、上記組換えＤＮ
Ａ配列を発現ベクターから発現させることによって得ら
れる。従って、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を含
み、該組換えＤＮＡ配列が、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を
有するペプチドを少なくともコードする少なくとも１つ
のＤＮＡ配列Ｌを含み、このＤＮＡ配列ＬがＰ線毛フィ
ラメントの主要サブユニットの超可変領域ＨＲ４の位置
に対応する位置でＤＮＡ配列Ｓに組込まれており、配列
Ｓが少なくとも１つの主要サブユニットをコードしてい
る発現ベクター、並びに、本明細書中でこれまでに記載
した組換えＤＮＡ配列の種々の具体例のいずれかを含む
発現ベクターは本発明の範囲に包含される。このような
本発明の発現ベクターは、当業者に周知の手順、例えば
微生物の形質転換などによって組換えＤＮＡ配列を発現
させ得る宿主細胞に導入できる。
Ａ配列を発現ベクターから発現させることによって得ら
れる。従って、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を含
み、該組換えＤＮＡ配列が、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を
有するペプチドを少なくともコードする少なくとも１つ
のＤＮＡ配列Ｌを含み、このＤＮＡ配列ＬがＰ線毛フィ
ラメントの主要サブユニットの超可変領域ＨＲ４の位置
に対応する位置でＤＮＡ配列Ｓに組込まれており、配列
Ｓが少なくとも１つの主要サブユニットをコードしてい
る発現ベクター、並びに、本明細書中でこれまでに記載
した組換えＤＮＡ配列の種々の具体例のいずれかを含む
発現ベクターは本発明の範囲に包含される。このような
本発明の発現ベクターは、当業者に周知の手順、例えば
微生物の形質転換などによって組換えＤＮＡ配列を発現
させ得る宿主細胞に導入できる。
【００５１】少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を含
み、この組換えＤＮＡ配列がＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を
有するペプチドを少なくともコードする少なくとも１つ
の組換えＤＮＡ配列Ｌを含み、このＤＮＡ配列ＬがＰ線
毛フィラメントの主要サブユニットの超可変領域ＨＲ４
の位置に対応する位置でＤＮＡ配列Ｓに組込まれてお
り、配列Ｓが少なくとも１つの主要サブユニットをコー
ドしているような宿主細胞、並びに、本明細書中でこれ
までに記載した組換えＤＮＡ配列の種々の具体例のいず
れかを含む宿主細胞は本発明の範囲に包含される。宿主
細胞は、前記組換えＤＮＡ配列を発現ベクター上に含む
かまたはその染色体に取込んでいる。宿主細胞は好まし
くは細菌細胞のような微生物である。
み、この組換えＤＮＡ配列がＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体の少なくとも１つの抗原決定基を
有するペプチドを少なくともコードする少なくとも１つ
の組換えＤＮＡ配列Ｌを含み、このＤＮＡ配列ＬがＰ線
毛フィラメントの主要サブユニットの超可変領域ＨＲ４
の位置に対応する位置でＤＮＡ配列Ｓに組込まれてお
り、配列Ｓが少なくとも１つの主要サブユニットをコー
ドしているような宿主細胞、並びに、本明細書中でこれ
までに記載した組換えＤＮＡ配列の種々の具体例のいず
れかを含む宿主細胞は本発明の範囲に包含される。宿主
細胞は、前記組換えＤＮＡ配列を発現ベクター上に含む
かまたはその染色体に取込んでいる。宿主細胞は好まし
くは細菌細胞のような微生物である。
【００５２】組換えＤＮＡ配列を含む宿主細胞は好まし
くはフィムブリエを発生し得る。フィムブリエの発生
は、フィムブリエのサブユニットを宿主細胞の内膜に転
位させ、サブユニットを細胞形質間隙に運搬し、サブユ
ニットを外膜を通って押出し次いでサブユニットを重合
させるステップを含む。
くはフィムブリエを発生し得る。フィムブリエの発生
は、フィムブリエのサブユニットを宿主細胞の内膜に転
位させ、サブユニットを細胞形質間隙に運搬し、サブユ
ニットを外膜を通って押出し次いでサブユニットを重合
させるステップを含む。
【００５３】本発明の組換えＤＮＡ細胞を含む宿主細胞
は、この組換え宿主細胞が組換えフィムブリエを発生で
きない場合にも本発明の範囲に包含される。このような
フィムブリエ組換え微生物は、該組換え微生物の培養培
地に組換え主要サブユニットまたはその一部を微生物が
分泌できるようにするＤＮＡを含み得る。このような組
換え微生物においては、組換えＰ線毛フィラメントの組
換え主要サブユニットは、重合した主要サブユニットか
ら成る組換えＰ線毛フィラメントを形成するための重合
または外膜への移行を伴うことなく細胞形質間隙に運搬
される。このような場合には、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ
の類似体もしくは誘導体の抗原決定基を有するペプチド
を含む単個の組換え主要サブユニットが当業者に周知の
手順によって微生物から得られる。
は、この組換え宿主細胞が組換えフィムブリエを発生で
きない場合にも本発明の範囲に包含される。このような
フィムブリエ組換え微生物は、該組換え微生物の培養培
地に組換え主要サブユニットまたはその一部を微生物が
分泌できるようにするＤＮＡを含み得る。このような組
換え微生物においては、組換えＰ線毛フィラメントの組
換え主要サブユニットは、重合した主要サブユニットか
ら成る組換えＰ線毛フィラメントを形成するための重合
または外膜への移行を伴うことなく細胞形質間隙に運搬
される。このような場合には、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ
の類似体もしくは誘導体の抗原決定基を有するペプチド
を含む単個の組換え主要サブユニットが当業者に周知の
手順によって微生物から得られる。
【００５４】本明細書で既に説明したように、本発明の
好ましいキャリアー系は重合した組換えサブユニットを
含む。重合サブユニットを含む本発明のキャリアー系を
得るための簡単な方法は、本発明の組換えＤＮＡを発現
させ得る微生物によって該組換えＤＮＡ配列を発現させ
ることである。この微生物はまた、得られた組換えサブ
ユニットを重合させ得る。この重合は、サブユニットが
外膜を通って移行したときにフィムブリエの発生の１ス
テップとして生じ得る。
好ましいキャリアー系は重合した組換えサブユニットを
含む。重合サブユニットを含む本発明のキャリアー系を
得るための簡単な方法は、本発明の組換えＤＮＡを発現
させ得る微生物によって該組換えＤＮＡ配列を発現させ
ることである。この微生物はまた、得られた組換えサブ
ユニットを重合させ得る。この重合は、サブユニットが
外膜を通って移行したときにフィムブリエの発生の１ス
テップとして生じ得る。
【００５５】得られた組換えフィムブリエをこのような
組換え微生物から容易に単離できる。組換え線毛フィラ
メントの構造を維持できるように非変性環境で単離する
のが好ましい。Ｒｉｅｇｍａｎ、Ｎらは、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１９９０ １７２：１１１４−１１２０に
精製フィムブリエを得る方法を記載している。
組換え微生物から容易に単離できる。組換え線毛フィラ
メントの構造を維持できるように非変性環境で単離する
のが好ましい。Ｒｉｅｇｍａｎ、Ｎらは、Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１９９０ １７２：１１１４−１１２０に
精製フィムブリエを得る方法を記載している。
【００５６】組換え微生物を非組換え微生物から容易に
識別できるのが好ましい。このためには、フィムブリエ
を発生することができない微生物を使用するか、または
組換えフィムブリエの明確な特徴を有するフィムブリエ
を産生することができない微生物を使用する。本発明の
組換えＤＮＡの発現ビヒクルとして任意のフィムブリエ
-微生物を使用し得る。
識別できるのが好ましい。このためには、フィムブリエ
を発生することができない微生物を使用するか、または
組換えフィムブリエの明確な特徴を有するフィムブリエ
を産生することができない微生物を使用する。本発明の
組換えＤＮＡの発現ビヒクルとして任意のフィムブリエ
-微生物を使用し得る。
【００５７】（通常は尿路疾患性大腸菌に検出される）
Ｐフィムブリエをもつ細菌は、Ｐ血液型の抗原のα−Ｄ
−ｇａｌ（１→４）β−Ｄ−ｇａｌ部分に結合する。Ｐ
フィムブリエは赤血球凝集反応によって容易に観察でき
るマンノースの存在下でヒト赤血球に付着するので、Ｐ
フィムブリエを担う細菌を容易に検出し得る。本発明の
組換えＤＮＡを導入する前にはヒト赤血球に付着できな
い微生物を、Ｐ型の組換え線毛フィラメントの発現ビヒ
クルとして使用し得る。得られた組換え微生物は、元の
微生物と対照的に、ヒト赤血球に付着し得る。
Ｐフィムブリエをもつ細菌は、Ｐ血液型の抗原のα−Ｄ
−ｇａｌ（１→４）β−Ｄ−ｇａｌ部分に結合する。Ｐ
フィムブリエは赤血球凝集反応によって容易に観察でき
るマンノースの存在下でヒト赤血球に付着するので、Ｐ
フィムブリエを担う細菌を容易に検出し得る。本発明の
組換えＤＮＡを導入する前にはヒト赤血球に付着できな
い微生物を、Ｐ型の組換え線毛フィラメントの発現ビヒ
クルとして使用し得る。得られた組換え微生物は、元の
微生物と対照的に、ヒト赤血球に付着し得る。
【００５８】本発明の組換えＤＮＡの発現ビヒクルの好
適例は、大腸菌Ｋ１２株ＨＢ１０１（Ｂｏｙｅｒ、Ｈ．
Ｗ．、Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ Ｄ（１９６
９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：４５９〜４７２）で
ある。最近まで、ＨＢ１０１は１型フィムブリエを産生
できないと考えられていたが、Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｓ．
Ｊ．らは、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ（１９９１）１０、４８１〜４８６に、ＨＢ１０１
の静置培養によって１型フィムブリエを発生させ得たと
記載している。発生したフィムブリエが組換えＤＮＡの
発現によって得られた組換えフィムブリエであることを
確認するために、ＨＢ１０１細胞を固体培地または攪拌
ブイヨン培地で増殖させる必要がある。
適例は、大腸菌Ｋ１２株ＨＢ１０１（Ｂｏｙｅｒ、Ｈ．
Ｗ．、Ｒｏｕｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ Ｄ（１９６
９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：４５９〜４７２）で
ある。最近まで、ＨＢ１０１は１型フィムブリエを産生
できないと考えられていたが、Ｅｌｌｉｏｔｔ、Ｓ．
Ｊ．らは、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓ
ｉｓ（１９９１）１０、４８１〜４８６に、ＨＢ１０１
の静置培養によって１型フィムブリエを発生させ得たと
記載している。発生したフィムブリエが組換えＤＮＡの
発現によって得られた組換えフィムブリエであることを
確認するために、ＨＢ１０１細胞を固体培地または攪拌
ブイヨン培地で増殖させる必要がある。
【００５９】１型フィムブリエを産生しない大腸菌Ｋ１
２株の別の例は、ＡＭ１７２７、即ちＪＥ２５７１のｒ
ｅｃＡ誘導体である（ｖａｎ Ｄｉｅら（１９８３）Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ．１９、７７〜８
２）。本発明のキャリアー系の組換えフィムブリエを産
生し得る有用な微生物の更に別の例はＪＡ２２１である
（Ｃｌａｒｋ Ｌ．＆ Ｃａｒｂｏｎ Ｊ．（１９７
８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：５１７〜５３
２）。
２株の別の例は、ＡＭ１７２７、即ちＪＥ２５７１のｒ
ｅｃＡ誘導体である（ｖａｎ Ｄｉｅら（１９８３）Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔ．１９、７７〜８
２）。本発明のキャリアー系の組換えフィムブリエを産
生し得る有用な微生物の更に別の例はＪＡ２２１である
（Ｃｌａｒｋ Ｌ．＆ Ｃａｒｂｏｎ Ｊ．（１９７
８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０：５１７〜５３
２）。
【００６０】組換え線毛フィラメントを発生させ得るＤ
ＮＡは、非形質転換微生物から部分的に得られてもよく
または前記微生物に導入される本発明の組換えＤＮＡ配
列に完全に含まれてもよい。この発生用ＤＮＡは、本発
明の組換えＤＮＡの一部として導入されてもよいが別の
発現ベクターに含まれていてもよい。
ＮＡは、非形質転換微生物から部分的に得られてもよく
または前記微生物に導入される本発明の組換えＤＮＡ配
列に完全に含まれてもよい。この発生用ＤＮＡは、本発
明の組換えＤＮＡの一部として導入されてもよいが別の
発現ベクターに含まれていてもよい。
【００６１】実施例では、本発明のいくつかの組換えＤ
ＮＡ配列を調製し、該配列によってフィムブリエ欠失微
生物を形質転換し、得られた組換え線毛フィラメントを
微生物から単離し精製することによって種々のキャリア
ー系を得る方法を記載した。組換えＤＮＡ、該組換えＤ
ＮＡを含む微生物及び実施例に記載のごときキャリアー
系を含む組成物も本発明の範囲に包含される。
ＮＡ配列を調製し、該配列によってフィムブリエ欠失微
生物を形質転換し、得られた組換え線毛フィラメントを
微生物から単離し精製することによって種々のキャリア
ー系を得る方法を記載した。組換えＤＮＡ、該組換えＤ
ＮＡを含む微生物及び実施例に記載のごときキャリアー
系を含む組成物も本発明の範囲に包含される。
【００６２】本発明はまた、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を誘発するため
の適当な組成物を目的とする。この組成物は、本明細書
に記載したようなキャリアー系を含む。本発明の組換え
ＤＮＡ配列、例えば上記のような微生物から得られる発
現産物を含むＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは
誘導体に対する免疫応答を誘発するための適当な組成物
も本発明の範囲に包含される。
類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を誘発するため
の適当な組成物を目的とする。この組成物は、本明細書
に記載したようなキャリアー系を含む。本発明の組換え
ＤＮＡ配列、例えば上記のような微生物から得られる発
現産物を含むＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは
誘導体に対する免疫応答を誘発するための適当な組成物
も本発明の範囲に包含される。
【００６３】本発明は更に、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を産生するため
のかかる組成物の使用を目的とする。特に動物の体内Ｇ
ｎＲＨの生物学的活性に影響を与えるために十分な用量
及び用法でかかる組成物を使用する。本発明の組成物の
使用目的は、動物の発情周期、精子形成及び／または性
的行動を受胎を防止するように十分に抑制することであ
る。好ましくは、組成物が、Ｐフィムブリエ発生能力を
有していた微生物に由来のキャリアー系を含む。ＧｎＲ
ＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する免疫
応答を誘発するための適当なワクチンまたは任意の医薬
製剤中に本発明組成物を使用できる。
類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を産生するため
のかかる組成物の使用を目的とする。特に動物の体内Ｇ
ｎＲＨの生物学的活性に影響を与えるために十分な用量
及び用法でかかる組成物を使用する。本発明の組成物の
使用目的は、動物の発情周期、精子形成及び／または性
的行動を受胎を防止するように十分に抑制することであ
る。好ましくは、組成物が、Ｐフィムブリエ発生能力を
有していた微生物に由来のキャリアー系を含む。ＧｎＲ
ＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する免疫
応答を誘発するための適当なワクチンまたは任意の医薬
製剤中に本発明組成物を使用できる。
【００６４】実際、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体も
しくは誘導体の抗原決定基を含む種々の公知組成物、ワ
クチン及び医薬製剤のような当分野で知られたいずれか
の用途に本発明組成物を使用し得る。従って本明細書の
導入部で示した可能な多くの用途は本発明の組成物の多
様な用途の例にすぎない。
しくは誘導体の抗原決定基を含む種々の公知組成物、ワ
クチン及び医薬製剤のような当分野で知られたいずれか
の用途に本発明組成物を使用し得る。従って本明細書の
導入部で示した可能な多くの用途は本発明の組成物の多
様な用途の例にすぎない。
【００６５】本発明組成物は、フロインドアジュバント
及び不完全フロインドアジュバントのような強いアジュ
バントを使用しないで適用でき、従ってこれらのアジュ
バントによる不都合な副作用を伴うことなく哺乳類のよ
うな動物の免疫感作に使用し得る。適当なアジュバント
の例は、アルミニウム塩（例えばＡｌ（ＯＨ）3、Ａｌ
ＰＯ4、Ａｌ2（ＳＯ4）3）、水中油型エマルジョン（Ｂ
ａｙｏｌ Ｆ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ Ｆ（登録商
標））、ビタミン−Ｅアセテート可溶化物、またはサポ
ニンであり、必要な場合、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓ
ｐａｎ（登録商標）のような１種以上の乳化剤をワクチ
ンに混入し得る。
及び不完全フロインドアジュバントのような強いアジュ
バントを使用しないで適用でき、従ってこれらのアジュ
バントによる不都合な副作用を伴うことなく哺乳類のよ
うな動物の免疫感作に使用し得る。適当なアジュバント
の例は、アルミニウム塩（例えばＡｌ（ＯＨ）3、Ａｌ
ＰＯ4、Ａｌ2（ＳＯ4）3）、水中油型エマルジョン（Ｂ
ａｙｏｌ Ｆ（登録商標）、Ｍａｒｃｏｌ Ｆ（登録商
標））、ビタミン−Ｅアセテート可溶化物、またはサポ
ニンであり、必要な場合、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓ
ｐａｎ（登録商標）のような１種以上の乳化剤をワクチ
ンに混入し得る。
【００６６】哺乳類のような動物を免疫感作するための
上記のごとき本発明組成物の使用はすべて、ＧｎＲＨま
たはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する抗体を産
生するだけでなく、かかる組成物の使用によって誘発さ
れた抗体によるＧｎＲＨの中和に起因する改質された生
物学的活性を与える。特に、本発明の組成物を使用する
と、該組成物が投与された動物の生殖活性が抑制され
る。
上記のごとき本発明組成物の使用はすべて、ＧｎＲＨま
たはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する抗体を産
生するだけでなく、かかる組成物の使用によって誘発さ
れた抗体によるＧｎＲＨの中和に起因する改質された生
物学的活性を与える。特に、本発明の組成物を使用する
と、該組成物が投与された動物の生殖活性が抑制され
る。
【００６７】本発明の組成物はワクチンの形態で適用さ
れ得る。ワクチンは、当業者に周知の方法で免疫感作す
べき哺乳類に皮下または筋肉内投与される。好ましくは
１回以上のブースター注射を投与する。各注射は０.０
１〜１ｍｇのＧｎＲＨ抗原またはＧｎＲＨ類似体抗原ま
たはＧｎＲＨ誘導体抗原を含むであろう。
れ得る。ワクチンは、当業者に周知の方法で免疫感作す
べき哺乳類に皮下または筋肉内投与される。好ましくは
１回以上のブースター注射を投与する。各注射は０.０
１〜１ｍｇのＧｎＲＨ抗原またはＧｎＲＨ類似体抗原ま
たはＧｎＲＨ誘導体抗原を含むであろう。
【００６８】動物を免疫感作するための本発明組成物の
使用を実施例３及び４において更に詳細に説明する。
使用を実施例３及び４において更に詳細に説明する。
【００６９】
【実施例】実施例１ この実施例では、血清型Ｆ１１のＰフィムブリエの主要
サブユニットをコードする遺伝子にＧｎＲＨをコードす
る遺伝情報を挿入する場合を説明する。
サブユニットをコードする遺伝子にＧｎＲＨをコードす
る遺伝情報を挿入する場合を説明する。
【００７０】（Ａ）組換えＤＮＡの調製 パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕ
ｒ）のＣＮＣＭに受託番号Ｉ−７０９で寄託されたプラ
スミドｐＰＩＬ２９１−１５を使用してプラスミドｐＰ
ＩＬ２９１−１５１０及びｐＰＩＬ２９１−１５１９を
構築した。プラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１はＦ１１
遺伝子クラスターの遺伝編成を含む。ｐＰＩＬ２９１−
１５のＢａｍＨＩ−Ｃｌａ１フラグメントはＦ１１主要
サブユニットをコードする遺伝子、ＦｅｌＡ遺伝子を含
む。
ｒ）のＣＮＣＭに受託番号Ｉ−７０９で寄託されたプラ
スミドｐＰＩＬ２９１−１５を使用してプラスミドｐＰ
ＩＬ２９１−１５１０及びｐＰＩＬ２９１−１５１９を
構築した。プラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１はＦ１１
遺伝子クラスターの遺伝編成を含む。ｐＰＩＬ２９１−
１５のＢａｍＨＩ−Ｃｌａ１フラグメントはＦ１１主要
サブユニットをコードする遺伝子、ＦｅｌＡ遺伝子を含
む。
【００７１】プラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１０及び
ｐＰＩＬ２９１−１５１９の構築はＶａｎ Ｄｉｅら、
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９９０）２２２：２９
７〜３０３及びＶａｎ Ｄｉｅら（１９８８）Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８７０〜５８７６に記載の
ごとく行なった。
ｐＰＩＬ２９１−１５１９の構築はＶａｎ Ｄｉｅら、
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９９０）２２２：２９
７〜３０３及びＶａｎ Ｄｉｅら（１９８８）Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８７０〜５８７６に記載の
ごとく行なった。
【００７２】（ｐＰＩＬ２９１−１５の３ｋｂのＣｌａ
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントのクローニングによって得
られた）ｐＰＩＬ２９１−１５１の０.７ｋｂのＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを細菌性ファージベ
クターｍ１３ｍｐ８にクローニングした。このクローン
を特定部位の突然変異誘発の鋳型として使用した。
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントのクローニングによって得
られた）ｐＰＩＬ２９１−１５１の０.７ｋｂのＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを細菌性ファージベ
クターｍ１３ｍｐ８にクローニングした。このクローン
を特定部位の突然変異誘発の鋳型として使用した。
【００７３】特定部位の突然変異誘発は、本質的に前出
の文献（Ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｉ．ら（１９８８） Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８７０〜５８７６）に記
載されたようなギャップトデュプレックス法（ｇａｐｐ
ｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｒａｍｅｒ
Ｖ．ら（１９８４） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１
２：９４４１〜９４５６）によって行なった。
の文献（Ｖａｎ Ｄｉｅ、Ｉ．ら（１９８８） Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８７０〜５８７６）に記
載されたようなギャップトデュプレックス法（ｇａｐｐ
ｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｋｒａｍｅｒ
Ｖ．ら（１９８４） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１
２：９４４１〜９４５６）によって行なった。
【００７４】得られた二重鎖ＤＮＡ分子でＨＢ２１５４
株を形質転換させ、白色プラークを選択し、制限フラグ
メントＤＮＡを単離し検査した。
株を形質転換させ、白色プラークを選択し、制限フラグ
メントＤＮＡを単離し検査した。
【００７５】ＨＲ１の突然変異誘発プライマーはヌクレ
オチド配列ＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡ
ＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡ（配列番号：２０）を有してい
た。突然変異誘発実験では、野性型Ｆ１１配列の塩基３
５５〜３６２が種々の塩基で置換され、この領域の３つ
のアミノ酸が修飾され、得られたＤＮＡ分子にＳｔｕＩ
制限部位（ＡＧＧＣＣＴ）が導入されていた。
オチド配列ＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡ
ＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡ（配列番号：２０）を有してい
た。突然変異誘発実験では、野性型Ｆ１１配列の塩基３
５５〜３６２が種々の塩基で置換され、この領域の３つ
のアミノ酸が修飾され、得られたＤＮＡ分子にＳｔｕＩ
制限部位（ＡＧＧＣＣＴ）が導入されていた。
【００７６】ＨＲ４の突然変異誘発プライマーはヌクレ
オチド配列ＴＴＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＣＣ
ＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号：２１）を有してい
た。突然変異誘発実験では、野性型Ｆ１１配列の塩基５
０２〜５２０が４つの新しい塩基で置換され、１５個の
塩基が欠失し、得られたＤＮＡ分子にＨｐａＩ制限部位
（ＧＴＴＡＡＣ）が存在していた。
オチド配列ＴＴＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＧＴＴＡＡＣＣＣ
ＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号：２１）を有してい
た。突然変異誘発実験では、野性型Ｆ１１配列の塩基５
０２〜５２０が４つの新しい塩基で置換され、１５個の
塩基が欠失し、得られたＤＮＡ分子にＨｐａＩ制限部位
（ＧＴＴＡＡＣ）が存在していた。
【００７７】次にＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメ
ントを単離し、これを使用してプラスミドｐＰＩＬ２９
１−１５１のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
と置換するとプラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１０（超
可変領域１ ＨＲ１にＳｔｕＩ制限部位を含む）とプラ
スミドｐＰＩＬ２９１−１５１９（超可変領域４ ＨＲ
４にＨｐａＩ制限部位を含む）とが得られた。双方のク
ローニング部位を同じ読取枠に構築した。
ントを単離し、これを使用してプラスミドｐＰＩＬ２９
１−１５１のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
と置換するとプラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１０（超
可変領域１ ＨＲ１にＳｔｕＩ制限部位を含む）とプラ
スミドｐＰＩＬ２９１−１５１９（超可変領域４ ＨＲ
４にＨｐａＩ制限部位を含む）とが得られた。双方のク
ローニング部位を同じ読取枠に構築した。
【００７８】種々の長さのいくつかのオリゴヌクレオチ
ドをｐＰＩＬ２９１−１５１０及び／またはｐＰＩＬ２
９１−１５１９に挿入した。挿入したオリゴヌクレオチ
ドはすべてアミノ酸配列ｇｌｎ ｈｉｓ ｔｒｐ ｓｅ
ｒ ｔｙｒ ｇｌｙ ｌｅｕａｒｇ ｐｒｏ ｇｌｙを
有するデカペプチドＧｎＲＨをコードする。種々のオリ
ゴヌクレオチドはその長さ及びデカペプチドにフランキ
ングするアミノ酸配列の組成が違っている。
ドをｐＰＩＬ２９１−１５１０及び／またはｐＰＩＬ２
９１−１５１９に挿入した。挿入したオリゴヌクレオチ
ドはすべてアミノ酸配列ｇｌｎ ｈｉｓ ｔｒｐ ｓｅ
ｒ ｔｙｒ ｇｌｙ ｌｅｕａｒｇ ｐｒｏ ｇｌｙを
有するデカペプチドＧｎＲＨをコードする。種々のオリ
ゴヌクレオチドはその長さ及びデカペプチドにフランキ
ングするアミノ酸配列の組成が違っている。
【００７９】図１及び配列番号：１〜８はプラスミドｐ
ＰＩＬ２９１−１５１０及びｐＰＩＬ２９１−１５１９
に挿入されたオリゴヌクレオチドを示す。対応するアミ
ノ酸に翻訳されたＧｎＲＨのコーディング鎖に下線を付
けて示している。
ＰＩＬ２９１−１５１０及びｐＰＩＬ２９１−１５１９
に挿入されたオリゴヌクレオチドを示す。対応するアミ
ノ酸に翻訳されたＧｎＲＨのコーディング鎖に下線を付
けて示している。
【００８０】プラスミドを含む形質転換細胞の単離後
に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに対する部位の
存在の決定によってリンカー１（配列番号：１、２）、
４（配列番号：５、６）及び５（配列番号：７、８）の
夫々と共にインサートを含むプラスミドを選択した。
に、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに対する部位の
存在の決定によってリンカー１（配列番号：１、２）、
４（配列番号：５、６）及び５（配列番号：７、８）の
夫々と共にインサートを含むプラスミドを選択した。
【００８１】インサートとしてリンカー３（配列番号：
３、４）を含むプラスミドを検出するために、オリゴヌ
クレオチドのＳｔｕＩ認識部位を使用することができな
かった。その理由は、ＳｔｕＩ認識部位の直後に２つの
グアニジンヌクレオチドが存在し、大腸菌メチラーゼに
よって認識される部位を形成し、メチル化シチジン残基
となって制限から保護されるからである。従って、リン
カー３の組込みを選択する際、ＨＲ１中の挿入を検出す
るためにはプラスミドをＳｔｕＩで消化し、ＨＲ４中の
挿入を検出するためにはＨｐａＩで消化した。
３、４）を含むプラスミドを検出するために、オリゴヌ
クレオチドのＳｔｕＩ認識部位を使用することができな
かった。その理由は、ＳｔｕＩ認識部位の直後に２つの
グアニジンヌクレオチドが存在し、大腸菌メチラーゼに
よって認識される部位を形成し、メチル化シチジン残基
となって制限から保護されるからである。従って、リン
カー３の組込みを選択する際、ＨＲ１中の挿入を検出す
るためにはプラスミドをＳｔｕＩで消化し、ＨＲ４中の
挿入を検出するためにはＨｐａＩで消化した。
【００８２】超可変領域ＨＲ１及びＨＲ４に夫々のオリ
ゴヌクレオチドが首尾よく組込まれたときには対応する
制限部位が除去された。
ゴヌクレオチドが首尾よく組込まれたときには対応する
制限部位が除去された。
【００８３】次に、正しい配向のリンカーの存在を決定
するために、選択されたプラスミドを配列決定した。記
載のごとく所望の配向でリンカーを含むプラスミドをｐ
ＡＩＸ．Ｙ．Ｏと命名した。Ｘは超可変領域の存在を示
し、Ｙは挿入されたリンカーの存在を示し、Ｏは付属遺
伝子の存在を示す。
するために、選択されたプラスミドを配列決定した。記
載のごとく所望の配向でリンカーを含むプラスミドをｐ
ＡＩＸ．Ｙ．Ｏと命名した。Ｘは超可変領域の存在を示
し、Ｙは挿入されたリンカーの存在を示し、Ｏは付属遺
伝子の存在を示す。
【００８４】ｐＰＩＬ２９１−１５１０に由来のプラス
ミドをｐＡＩ １１０、ｐＡＩ １３０、ｐＡＩ １４
０、ｐＡＩ １５０と命名した。組換え超可変領域１、
即ちプラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１０に挿入された
後のＨＲ１中では、オリゴヌクレオチドの前にグリシン
残基のコドンが存在した。
ミドをｐＡＩ １１０、ｐＡＩ １３０、ｐＡＩ １４
０、ｐＡＩ １５０と命名した。組換え超可変領域１、
即ちプラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１０に挿入された
後のＨＲ１中では、オリゴヌクレオチドの前にグリシン
残基のコドンが存在した。
【００８５】配列番号：１〜８で示されるリンカーを含
むプラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１９をｐＡＩ ４１
０（配列番号：９、１０）、ｐＡＩ ４３０（配列番
号：１１、１２）、ｐＡＩ ４４０（配列番号：１３、
１４）及びｐＡＩ ４５０（配列番号：１５、１６）と
夫々命名した。組換え超可変領域ＨＲ４においては、プ
ラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１９の超可変領域４ Ｈ
Ｒ４に挿入されたオリゴヌクレオチドの前にロイシン残
基が存在する。組換え超可変領域４の最終アミノ酸はト
レオニンである。
むプラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１９をｐＡＩ ４１
０（配列番号：９、１０）、ｐＡＩ ４３０（配列番
号：１１、１２）、ｐＡＩ ４４０（配列番号：１３、
１４）及びｐＡＩ ４５０（配列番号：１５、１６）と
夫々命名した。組換え超可変領域ＨＲ４においては、プ
ラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１９の超可変領域４ Ｈ
Ｒ４に挿入されたオリゴヌクレオチドの前にロイシン残
基が存在する。組換え超可変領域４の最終アミノ酸はト
レオニンである。
【００８６】図２及び配列番号：９〜１６は夫々、プラ
スミドｐＡＩ ４１０、４３０、４４０及び４５０の超
可変領域４ ＨＲ４のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸
配列４１０（配列番号：９、１０）、４３０（配列番
号：１１、１２）、４４０（配列番号：１３、１４）及
び４５０（配列番号：１５、１６）とＦ１１の野性型Ｈ
Ｒ４のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（配列番号：１７）
を示す。アミノ酸に従って翻訳されたＧｎＲＨのコーデ
ィング領域は配列表の情報項目の（ｉｘ）配列の特徴、
（Ｂ）存在位置に夫々示されている。
スミドｐＡＩ ４１０、４３０、４４０及び４５０の超
可変領域４ ＨＲ４のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸
配列４１０（配列番号：９、１０）、４３０（配列番
号：１１、１２）、４４０（配列番号：１３、１４）及
び４５０（配列番号：１５、１６）とＦ１１の野性型Ｈ
Ｒ４のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（配列番号：１７）
を示す。アミノ酸に従って翻訳されたＧｎＲＨのコーデ
ィング領域は配列表の情報項目の（ｉｘ）配列の特徴、
（Ｂ）存在位置に夫々示されている。
【００８７】表１は、ＧｎＲＨの少なくとも１つの抗原
決定基をコードするデカペプチドＧｎＲＨのフランキン
グ配列の比較、及び組換え超可変領域４ ＨＲ４と野性
型超可変領域４ ＨＲ４との長さの比較を示す。
決定基をコードするデカペプチドＧｎＲＨのフランキン
グ配列の比較、及び組換え超可変領域４ ＨＲ４と野性
型超可変領域４ ＨＲ４との長さの比較を示す。
【００８８】（Ｂ）組換えＤＮＡの発現から得られたフ
ィムブリエの分析 ｐＰＩＬ２９１−１５のＦｅｌＡ遺伝子を含むＣｌａＩ
／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、リンカー１、３、４
及び５を夫々含むｐＡＩ−プラスミドの突然変異Ｃｌａ
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントによって置換し、得られた
４つのプラスミドでＨＢ１０１のコンピテント細胞を形
質転換した。
ィムブリエの分析 ｐＰＩＬ２９１−１５のＦｅｌＡ遺伝子を含むＣｌａＩ
／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、リンカー１、３、４
及び５を夫々含むｐＡＩ−プラスミドの突然変異Ｃｌａ
Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントによって置換し、得られた
４つのプラスミドでＨＢ１０１のコンピテント細胞を形
質転換した。
【００８９】血球凝集反応が陽性のクローンを選択し、
ＤＮＡ制限フラグメント分析によって検査した。形質転
換ＨＢ１０１細胞によるハイブリッドフィムブリエの発
現を電子顕微鏡によって観察した。結果を表２にまとめ
る。
ＤＮＡ制限フラグメント分析によって検査した。形質転
換ＨＢ１０１細胞によるハイブリッドフィムブリエの発
現を電子顕微鏡によって観察した。結果を表２にまとめ
る。
【００９０】これらの試験は、ＨＢ１０１／ＰＡＩ ４
４０が正常Ｆ１１遺伝子クラスターを保有するＨＢ１０
１／ｐＰＩＬ２９１−１５とほぼ同じ効率でフィムブリ
エを発現させることを示唆した。プラスミドｐＡＩ ４
１０及び４３０を含むＨＢ１０１細胞中のフィムブリエ
の産生はわずかに減少した。超可変領域１にリンカーを
挿入すると、細胞あたりの検出されるフィムブリエはご
く少数にすぎなかったのでフィムブリエの発生がかなり
妨害されると考えられる。
４０が正常Ｆ１１遺伝子クラスターを保有するＨＢ１０
１／ｐＰＩＬ２９１−１５とほぼ同じ効率でフィムブリ
エを発現させることを示唆した。プラスミドｐＡＩ ４
１０及び４３０を含むＨＢ１０１細胞中のフィムブリエ
の産生はわずかに減少した。超可変領域１にリンカーを
挿入すると、細胞あたりの検出されるフィムブリエはご
く少数にすぎなかったのでフィムブリエの発生がかなり
妨害されると考えられる。
【００９１】また、野性型Ｆ１１フィムブリエを含む完
全細菌に対するポリクローナル抗体によるＥＬＩＳＡア
ッセイによって組換えフィムブリエの発現を検査した。
このアッセイを用いた理由は、新しい連結によってＦ１
１特異的エピトープがねじれるので（Ｖａｎ Ｄｉｅ
ら、ＭＧＧ２２２（１９９０） ｂｌｚ．２９７〜３０
３に記載された現象）、モノクローナル抗体が使用でき
ないからである。結果を表３に示す。
全細菌に対するポリクローナル抗体によるＥＬＩＳＡア
ッセイによって組換えフィムブリエの発現を検査した。
このアッセイを用いた理由は、新しい連結によってＦ１
１特異的エピトープがねじれるので（Ｖａｎ Ｄｉｅ
ら、ＭＧＧ２２２（１９９０） ｂｌｚ．２９７〜３０
３に記載された現象）、モノクローナル抗体が使用でき
ないからである。結果を表３に示す。
【００９２】材料及び方法 （ａ）細菌 ハイブリッドフィムブリエの形態形成発現用宿主菌株と
しては１型フィムブリエ形成の欠失した大腸菌ＨＢ１０
１株を使用した（Ｂｏｙｅｒ、Ｈ．Ｗ．、Ｄ．Ｒｏｕｌ
ｌａｒｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ（１９６９）；Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４１：４５９〜４７２）。ＨＢ１０１を回転
震盪器で培養し、非形質転換細胞がフィムブリエ(-)で
あることを確認した。
しては１型フィムブリエ形成の欠失した大腸菌ＨＢ１０
１株を使用した（Ｂｏｙｅｒ、Ｈ．Ｗ．、Ｄ．Ｒｏｕｌ
ｌａｒｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ（１９６９）；Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４１：４５９〜４７２）。ＨＢ１０１を回転
震盪器で培養し、非形質転換細胞がフィムブリエ(-)で
あることを確認した。
【００９３】ＤＮＡ配列決定のためにはＪＭ１０１株を
Ｍ１３ＭＰ８誘導体の宿主として使用した（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｊ．、Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ（１９８２）；Ｇｅｎｅ
１９：２６９〜２７６）。
Ｍ１３ＭＰ８誘導体の宿主として使用した（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｊ．、Ｊ．Ｖｉｅｉｒａ（１９８２）；Ｇｅｎｅ
１９：２６９〜２７６）。
【００９４】特定部位の突然変異誘発実験では、ＨＢ２
１５４をＭ１３ｍｐ１８の宿主株として使用した（Ｃａ
ｒｔｅｒ、Ｐ．、Ｈ．Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ、Ｇ．Ｗｉｎ
ｔｅｒ（１９８５）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１３：４４３１〜４３）。
１５４をＭ１３ｍｐ１８の宿主株として使用した（Ｃａ
ｒｔｅｒ、Ｐ．、Ｈ．Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ、Ｇ．Ｗｉｎ
ｔｅｒ（１９８５）；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１３：４４３１〜４３）。
【００９５】アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む脳
心インフュージョンブイヨンで細菌を増殖させた。
心インフュージョンブイヨンで細菌を増殖させた。
【００９６】（ｂ）酵素 制限エンドヌクレアーゼを製造業者の指示通りに使用し
た。
た。
【００９７】連結のためにはＴ４ ＤＮＡリガーゼを製
造業者の指示通りに使用した。
造業者の指示通りに使用した。
【００９８】（ｃ）ＤＮＡ分析 ＤＮＡフラグメントの分析は０．６％アガロースゲル中
の電気泳動によって行なった。
の電気泳動によって行なった。
【００９９】ＤＮＡ配列決定のためには、Ｓａｎｇｅｒ
らのジデオキシ鎖終止法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．、Ｓ．Ｎ
ｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ（１９７７）；
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
４：５４６３〜６７）を使用した。
らのジデオキシ鎖終止法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．、Ｓ．Ｎ
ｉｃｋｌｅｎ、Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ（１９７７）；
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
４：５４６３〜６７）を使用した。
【０１００】（ｄ）形質転換 形質転換はＫｕｓｈｎｅｒの方法で行なった（Ｋｕｓｈ
ｎｅｒ、Ｓ．Ｒ．（１９７８）；ｐ．１７〜２３：Ｈ．
Ｗ．Ｂｏｙｅｒ ＆ Ｓ．Ｎｉｃｏｓｉａ （ｅｄ）
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ）。
ｎｅｒ、Ｓ．Ｒ．（１９７８）；ｐ．１７〜２３：Ｈ．
Ｗ．Ｂｏｙｅｒ ＆ Ｓ．Ｎｉｃｏｓｉａ （ｅｄ）
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｌｓｅｖ
ｉｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ）。
【０１０１】（ｅ）部位特異的突然変異誘発 ギャップトデュプレックス法によって部位特異的突然変
異誘発を実施した。プライマーをＭ１３ｍｐ１８と共に
鋳型ＤＮＡと６５℃で１時間ハイブリダイズさせた。所
要のｄＮＴＰ、１０単位のＴ４リガーゼ及び３単位のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント添加
し、次いで１６℃で４時間インキュベーションすること
によってこのギャップトデュプレックス分子を伸長及び
連結させた。
異誘発を実施した。プライマーをＭ１３ｍｐ１８と共に
鋳型ＤＮＡと６５℃で１時間ハイブリダイズさせた。所
要のｄＮＴＰ、１０単位のＴ４リガーゼ及び３単位のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント添加
し、次いで１６℃で４時間インキュベーションすること
によってこのギャップトデュプレックス分子を伸長及び
連結させた。
【０１０２】（ｆ）リンカー合成 Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡシンセ
サイザーモデル３８１Ａを使用説明書通りに使用してＧ
ｎＲＨオリゴヌクレオチドを合成した。
サイザーモデル３８１Ａを使用説明書通りに使用してＧ
ｎＲＨオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１０３】（ｇ）リンカーの挿入 プラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１９を以下の手順でＨ
ｐａＩで消化した：１μｇのＤＮＡと５単位の制限酵素
ＨｐａＩとＴＥバッファ（１０ｍＭのトリス１ｍＭのＥ
ＤＴＡ）で１５μｌ希釈した１.５μｌの制限バッファ
（１０×）との混合物を調製し、この混合物を３７℃で
１.５時間インキュベートした。次いで６５℃で１０分
間加熱して酵素を失活させ、混合物をフェノール抽出し
次いでアルコール沈殿させた。
ｐａＩで消化した：１μｇのＤＮＡと５単位の制限酵素
ＨｐａＩとＴＥバッファ（１０ｍＭのトリス１ｍＭのＥ
ＤＴＡ）で１５μｌ希釈した１.５μｌの制限バッファ
（１０×）との混合物を調製し、この混合物を３７℃で
１.５時間インキュベートした。次いで６５℃で１０分
間加熱して酵素を失活させ、混合物をフェノール抽出し
次いでアルコール沈殿させた。
【０１０４】線状化したプラスミドを以下の手順でＧｎ
ＲＨリンカーに連結させた：５単位のリガーゼと１μｌ
のリガーゼバッファ（１０×）とベクターＤＮＡとリン
カーＤＮＡとを容量１０μｌで調製した。１６℃でＯ／
Ｎ連結を生じさせた。
ＲＨリンカーに連結させた：５単位のリガーゼと１μｌ
のリガーゼバッファ（１０×）とベクターＤＮＡとリン
カーＤＮＡとを容量１０μｌで調製した。１６℃でＯ／
Ｎ連結を生じさせた。
【０１０５】１００μｌのＨＢ１０１のコンピテント細
胞（Ｋｕｓｈｎｅｒ、Ｓ．Ｒ．（１９７８）；ｐ．１７
〜２３ ：Ｈ．Ｗ．Ｂｏｙｅｒ ＆ Ｓ．Ｎｉｃｏｓｉ
ａ（ｅｄ） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を結合プラスミドと共に氷
上に３０分間維持した。次いでこの混合物を３７℃で５
分間熱衝撃した。ＬＢ培地を添加し、１．５時間後にＡ
ｍｐプレートにプレートアウトした。得られたコロニー
を単離し、培養し、これらのコロニーからプラスミドＤ
ＮＡを単離し配列決定した。
胞（Ｋｕｓｈｎｅｒ、Ｓ．Ｒ．（１９７８）；ｐ．１７
〜２３ ：Ｈ．Ｗ．Ｂｏｙｅｒ ＆ Ｓ．Ｎｉｃｏｓｉ
ａ（ｅｄ） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を結合プラスミドと共に氷
上に３０分間維持した。次いでこの混合物を３７℃で５
分間熱衝撃した。ＬＢ培地を添加し、１．５時間後にＡ
ｍｐプレートにプレートアウトした。得られたコロニー
を単離し、培養し、これらのコロニーからプラスミドＤ
ＮＡを単離し配列決定した。
【０１０６】ＨＲ１にＧｎＲＨを挿入する場合にも同じ
手順を用いたがＨｐａＩの代わりにＳｔｕＩを用いて消
化した。
手順を用いたがＨｐａＩの代わりにＳｔｕＩを用いて消
化した。
【０１０７】（ｈ）完全細菌ＥＬＩＳＡ 抗血清としてはＦ１１フィムブリエに対する吸収に掛け
られた超免疫ウサギ抗血清を使用した。
られた超免疫ウサギ抗血清を使用した。
【０１０８】各アッセイにおいて、陽性及び陰性の対照
菌株も試験した。
菌株も試験した。
【０１０９】洗浄後の細菌を平底ポリスチレンマイクロ
タイタープレートに播種した。細菌浮遊液を乾燥させ、
洗浄後にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−８０／新生仔ウシ血清で
ブロックした。次いで、吸収血清の一連の連続希釈液を
添加し、３７℃で１時間インキュベーション後にプレー
トを洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤ
ギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加した。洗浄し、ウレ
ウム−ペルオキシド（ｕｒｅｕｍ−ｐｅｒｏｘｉｄｅ）
と３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンとを含
むＴＭＢ基質バッファを添加した後、Ｈ2ＳＯ4を添加し
て反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ読取装置によ
って着色を測定した。力価測定によれば、最大希釈度の
抗血清のＡ450はバックグラウンドＡ450の２倍以上であ
った。
タイタープレートに播種した。細菌浮遊液を乾燥させ、
洗浄後にＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−８０／新生仔ウシ血清で
ブロックした。次いで、吸収血清の一連の連続希釈液を
添加し、３７℃で１時間インキュベーション後にプレー
トを洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤ
ギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加した。洗浄し、ウレ
ウム−ペルオキシド（ｕｒｅｕｍ−ｐｅｒｏｘｉｄｅ）
と３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジンとを含
むＴＭＢ基質バッファを添加した後、Ｈ2ＳＯ4を添加し
て反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ読取装置によ
って着色を測定した。力価測定によれば、最大希釈度の
抗血清のＡ450はバックグラウンドＡ450の２倍以上であ
った。
【０１１０】（ｉ）ハイブリッドＧｎＲＨ−Ｆ１１フィ
ムブリエの産生、単離及び精製 プラスミドｐＡＩ ４１０、ｐＡＩ ４４０、ｐＡＩ
１０４１０及びｐＡＩ１０４４０で形質転換し３０％グ
リセロール中に−７０℃で維持した大腸菌Ｋ−１２株を
２回前培養した（Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ Ｎ
ｏ．２（Ｏｘｏｉｄ）＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンと共にプレート上で３７℃で一夜及び１００ｍｌの脳
心インフュージョン培地（ＢＨＩ、Ｏｘｏｉｄ）＋アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）中で攪拌しながら３７℃
で７時間）。
ムブリエの産生、単離及び精製 プラスミドｐＡＩ ４１０、ｐＡＩ ４４０、ｐＡＩ
１０４１０及びｐＡＩ１０４４０で形質転換し３０％グ
リセロール中に−７０℃で維持した大腸菌Ｋ−１２株を
２回前培養した（Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ Ｎ
ｏ．２（Ｏｘｏｉｄ）＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンと共にプレート上で３７℃で一夜及び１００ｍｌの脳
心インフュージョン培地（ＢＨＩ、Ｏｘｏｉｄ）＋アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）中で攪拌しながら３７℃
で７時間）。
【０１１１】主培養のためには、１２リットルのＢＨ
Ｉ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び５ｍｌの１
０％ＰＰＧ（消泡剤）を充填した発酵槽に前培養物を接
種し１７時間増殖させた（３７℃；空気で調節した５０
％Ｏ2飽和；１００〜１０００ｒｐｍで攪拌）。
Ｉ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び５ｍｌの１
０％ＰＰＧ（消泡剤）を充填した発酵槽に前培養物を接
種し１７時間増殖させた（３７℃；空気で調節した５０
％Ｏ2飽和；１００〜１０００ｒｐｍで攪拌）。
【０１１２】６５℃に（１５分間）加熱して培養細菌か
らフィムブリエを取出し、ｐＨ１０で処理し（１時間、
室温、攪拌）、遠心した（１５分間、１３０００ｒｐｍ
のＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ、ロータＧＳＡ）。
らフィムブリエを取出し、ｐＨ１０で処理し（１時間、
室温、攪拌）、遠心した（１５分間、１３０００ｒｐｍ
のＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５Ｂ、ロータＧＳＡ）。
【０１１３】上清を２００〜６００ｍｌに濃縮し（ＸＭ
３００フィルター、Ｍｉｎｉｔａｎ Ｓｙｓｔｅｍ、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、トリス／グリシンバッファ（ｐ
Ｈ１０）で洗浄し、ｐＨを８.５に調節し、得られた沈
殿物を４℃で少なくとも１日間沈降させた。
３００フィルター、Ｍｉｎｉｔａｎ Ｓｙｓｔｅｍ、
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、トリス／グリシンバッファ（ｐ
Ｈ１０）で洗浄し、ｐＨを８.５に調節し、得られた沈
殿物を４℃で少なくとも１日間沈降させた。
【０１１４】沈殿物を採取し（４８,０００ｇ、４℃で
２０分間遠心）、ペレットを１００ｍｌのトリス／グリ
シンバッファｐＨ８.５に２Ｍの尿素と共に溶解させ
た。この調製物を濃縮し（ＹＭ１００フィルター、Ａｍ
ｉｃｏｎ限外濾過セル）、洗浄し（２×２００ｍｌのト
リス／グリシンバッファｐＨ８.５）、ワクチン製造に
使用するまで−２０℃で保存した。
２０分間遠心）、ペレットを１００ｍｌのトリス／グリ
シンバッファｐＨ８.５に２Ｍの尿素と共に溶解させ
た。この調製物を濃縮し（ＹＭ１００フィルター、Ａｍ
ｉｃｏｎ限外濾過セル）、洗浄し（２×２００ｍｌのト
リス／グリシンバッファｐＨ８.５）、ワクチン製造に
使用するまで−２０℃で保存した。
【０１１５】実施例２ 超可変領域１の突然変異及び超可変領域４の挿入も試験
した。実施例１で記載したような部位特異的突然変異誘
発によってプラスミド中にＳｔｕＩ認識部位を構築し
た。次いでフィムブリエの形成、及びこれらの構築物の
抗原性を実施例１の構築物の場合と同様にして判定し
た。
した。実施例１で記載したような部位特異的突然変異誘
発によってプラスミド中にＳｔｕＩ認識部位を構築し
た。次いでフィムブリエの形成、及びこれらの構築物の
抗原性を実施例１の構築物の場合と同様にして判定し
た。
【０１１６】意外にも、超可変領域１内の突然変異の存
在、即ちＳｔｕＩ認識部位の存在は、プラスミドｐＡＩ
４１０、ｐＡＩ ４３０及びｐＡＩ ４４０と同量の
フィムブリエ形成を形質転換細胞によって生じる組換え
ＤＮＡを与えた。結果を表２に示す。
在、即ちＳｔｕＩ認識部位の存在は、プラスミドｐＡＩ
４１０、ｐＡＩ ４３０及びｐＡＩ ４４０と同量の
フィムブリエ形成を形質転換細胞によって生じる組換え
ＤＮＡを与えた。結果を表２に示す。
【０１１７】超可変領域１にＳｔｕＩ部位を構築すると
超可変領域４に組込まれたリンカーの露出が改善される
と考えられる。超可変領域１にＳｔｕＩ部位を含む突然
変異体はイムノゴールド標識実験で陽性反応を示した。
同様に試験したプラスミドｐＡＩ ４１０を含む細胞で
はラベルが全く検出されない。この観察は、試験下の２
つの超可変領域が密接に接触していることを示す。
超可変領域４に組込まれたリンカーの露出が改善される
と考えられる。超可変領域１にＳｔｕＩ部位を含む突然
変異体はイムノゴールド標識実験で陽性反応を示した。
同様に試験したプラスミドｐＡＩ ４１０を含む細胞で
はラベルが全く検出されない。この観察は、試験下の２
つの超可変領域が密接に接触していることを示す。
【０１１８】実施例３ 実施例１及び２に記載の構築物で形質転換された微生物
から得られた組換え線毛フィラメントを含むフィムブリ
エ調製物について実験を行なった。
から得られた組換え線毛フィラメントを含むフィムブリ
エ調製物について実験を行なった。
【０１１９】ＧｎＲＨに対する中和作用を決定するため
に免疫感作試験を実施した。免疫感作試験では、免疫感
作された哺乳類の発情周期がかく乱されたりまたは抑制
されたりした。
に免疫感作試験を実施した。免疫感作試験では、免疫感
作された哺乳類の発情周期がかく乱されたりまたは抑制
されたりした。
【０１２０】この実施例において、ＧｎＲＨのアミノ酸
配列を含む突然変異フィムブリエを用いて雌ラットにワ
クチン接種した。この試験では超可変領域４ ＨＲ４に
ＧｎＲＨ様ペプチドだけが構築されたフィムブリエと極
めて小さい別の変化（ＨＲ１にＳｔｕＩ部位の挿入）を
更に与えたフィムブリエとの活性の違いを確認した。
配列を含む突然変異フィムブリエを用いて雌ラットにワ
クチン接種した。この試験では超可変領域４ ＨＲ４に
ＧｎＲＨ様ペプチドだけが構築されたフィムブリエと極
めて小さい別の変化（ＨＲ１にＳｔｕＩ部位の挿入）を
更に与えたフィムブリエとの活性の違いを確認した。
【０１２１】Ｗｉｓｔｅｒ始原系統から繁殖させた雌の
成ラットを正常発情周期に基づいて選択し、油／水混合
物（７０／３０、ｖ／ｖ）中のフィムブリエ（５０μ
ｇ）の０.５ｍｌのエマルジョンを６週間の間隔をおい
て２回皮下注射した。注射剤の油相は液体パラフィン
（Ｍａｒｃｏｌ ５２）中のポリソルベート８０とソル
ビタンモノオレエートから成り、水相は蒸留水中のＡｌ
（ＯＨ）3を含んでいた。突然変異フィムブリエはｐＡ
Ｉ １０４１０、ｐＡＩ ４４０及びｐＡＩ １０４４
０であった。実施例１及び２と同様の手順でフィムブリ
エ調製物を得た。注射前、注射間及び注射後に、腟のス
ミアを毎日採取し、所定間隔で眼窩後方叢（ｒｅｔｒｏ
−ｏｒｂｉｔａｌ ｐｌｕｘｕｓ）から血液を採取し、
血清を−２０℃でアッセイまで保存した。実験終了後に
動物を殺し、卵巣を計量した。
成ラットを正常発情周期に基づいて選択し、油／水混合
物（７０／３０、ｖ／ｖ）中のフィムブリエ（５０μ
ｇ）の０.５ｍｌのエマルジョンを６週間の間隔をおい
て２回皮下注射した。注射剤の油相は液体パラフィン
（Ｍａｒｃｏｌ ５２）中のポリソルベート８０とソル
ビタンモノオレエートから成り、水相は蒸留水中のＡｌ
（ＯＨ）3を含んでいた。突然変異フィムブリエはｐＡ
Ｉ １０４１０、ｐＡＩ ４４０及びｐＡＩ １０４４
０であった。実施例１及び２と同様の手順でフィムブリ
エ調製物を得た。注射前、注射間及び注射後に、腟のス
ミアを毎日採取し、所定間隔で眼窩後方叢（ｒｅｔｒｏ
−ｏｒｂｉｔａｌ ｐｌｕｘｕｓ）から血液を採取し、
血清を−２０℃でアッセイまで保存した。実験終了後に
動物を殺し、卵巣を計量した。
【０１２２】腟スミア 毎日の腟スミアを顕微鏡スライドにした。乾燥させメタ
ノールで定着した後で、蒸留水で１：１０に希釈したギ
ームザ溶液（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｗ．Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）で２０分間染色し、水道水でよく洗い、
乾燥した。各スミアを顕微鏡観察し（１００×）、ケラ
チン化有核上皮細胞及び白血球のパーセンテージを算定
した。
ノールで定着した後で、蒸留水で１：１０に希釈したギ
ームザ溶液（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｗ．Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）で２０分間染色し、水道水でよく洗い、
乾燥した。各スミアを顕微鏡観察し（１００×）、ケラ
チン化有核上皮細胞及び白血球のパーセンテージを算定
した。
【０１２３】正常ラットの腟は４日間の発情周期で：発
情間期−発情前期−発情期のサイクルを示した。これら
の発情フェーズを図中に以下のスコアで示す：１＝発情
間期、２＝発情前期、３＝発情期。
情間期−発情前期−発情期のサイクルを示した。これら
の発情フェーズを図中に以下のスコアで示す：１＝発情
間期、２＝発情前期、３＝発情期。
【０１２４】アッセイ 血清サンプル中の抗ＧｎＲＨ抗体による125Ｉ−ＧｎＲ
Ｈの結合をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって定
量した。
Ｈの結合をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって定
量した。
【０１２５】インキュベーションの前に、解凍した血清
サンプルをアッセイバッファ（０.０１ｍｏｌ／リット
ルのＮａ2ＨＰＯ4.２Ｈ2Ｏ、０.１５ｍｏｌ／リットル
のＮａＣｌ、０.１％ゼラチン及び０.１％ナトリウムア
ジドｐＨ８.０）に希釈した。
サンプルをアッセイバッファ（０.０１ｍｏｌ／リット
ルのＮａ2ＨＰＯ4.２Ｈ2Ｏ、０.１５ｍｏｌ／リットル
のＮａＣｌ、０.１％ゼラチン及び０.１％ナトリウムア
ジドｐＨ８.０）に希釈した。
【０１２６】０.１ｍｌの希釈血清サンプルと０.２ｍｌ
のアッセイバッファと０.０５ｍｌの125Ｉ−ＧｎＲＨと
から成る二重のサンプルを４℃で１６時間インキュベー
ションすることによってＲＩＡを実施した。分離の前に
０.０５ｍｌのヒト血清をキャリアータンパク質として
試験管に添加した。
のアッセイバッファと０.０５ｍｌの125Ｉ−ＧｎＲＨと
から成る二重のサンプルを４℃で１６時間インキュベー
ションすることによってＲＩＡを実施した。分離の前に
０.０５ｍｌのヒト血清をキャリアータンパク質として
試験管に添加した。
【０１２７】全部の試験管に０.５ｍｌのＰｅｇ溶液
（ゼラチンを含まないアッセイバッファ中に４０％のＰ
ｅｇ−４０００）を添加することによって遊離抗体と結
合抗体とを分離した。混合物を遠心し、沈殿物をγ分光
計でカウントした。
（ゼラチンを含まないアッセイバッファ中に４０％のＰ
ｅｇ−４０００）を添加することによって遊離抗体と結
合抗体とを分離した。混合物を遠心し、沈殿物をγ分光
計でカウントした。
【０１２８】結合放射能の非特異的結合を補正し、添加
放射能総量に対する放射能の結合割合（％）として力価
を計算した。
放射能総量に対する放射能の結合割合（％）として力価
を計算した。
【０１２９】結果 抗ＧｎＲＨ抗体及び発情周期に対する効果 （図３〜５） −アジュバントだけで処理した動物の血清は抗ＧｎＲＨ
抗体を示さなかった。これらの動物で発情周期の抑制は
全く観察されなかった。
抗体を示さなかった。これらの動物で発情周期の抑制は
全く観察されなかった。
【０１３０】−突然変異フィムブリエで処理したすべて
の動物は血清抗体結合を示し、この結果として発情周期
が破壊され抑制された。
の動物は血清抗体結合を示し、この結果として発情周期
が破壊され抑制された。
【０１３１】体重 特に、ｐＡＩ １０４１０またはｐＡＩ １０４４０で
処理したラットは、ブースター注射の３〜５週後にプラ
セーボで処理した動物を上回る体重を示した（図６）。
処理したラットは、ブースター注射の３〜５週後にプラ
セーボで処理した動物を上回る体重を示した（図６）。
【０１３２】卵巣重量 すべての突然変異体のフィムブリエは卵巣重量の減少を
示した（図７）。
示した（図７）。
【０１３３】実施例４ ラットの実験に加えて、雄の仔ウシにも同じ調製物を試
験した。異種交配した４箇月齢の雄の仔ウシに油／水混
合物（７０／３０、ｖ／ｖ）中のフィムブリエ（２００
μｇ）の２ｍｌのエマルジョンを８週間の間隔で２回皮
下注射した。注射剤の油相は液体パラフィン（Ｍａｒｃ
ｏｌ ５２）中のポリソルベート８０とソルビタンモノ
オレエートから成り、水相は蒸留水中のＡｌ（ＯＨ）3
を含んでいた。突然変異フィムブリエはｐＡＩ ４１
０、ｐＡＩ １０４１０、ｐＡＩ４４０及びｐＡＩ １
０４４０であった。実施例１及び２と同様の手順でフィ
ムブリエ調製物を得た。注射前、注射間及び注射後に、
陰嚢周囲を毎週測定し、所定の時期に頸静脈から血液を
採取し、血漿を−２０℃でアッセイまで保存した。
験した。異種交配した４箇月齢の雄の仔ウシに油／水混
合物（７０／３０、ｖ／ｖ）中のフィムブリエ（２００
μｇ）の２ｍｌのエマルジョンを８週間の間隔で２回皮
下注射した。注射剤の油相は液体パラフィン（Ｍａｒｃ
ｏｌ ５２）中のポリソルベート８０とソルビタンモノ
オレエートから成り、水相は蒸留水中のＡｌ（ＯＨ）3
を含んでいた。突然変異フィムブリエはｐＡＩ ４１
０、ｐＡＩ １０４１０、ｐＡＩ４４０及びｐＡＩ １
０４４０であった。実施例１及び２と同様の手順でフィ
ムブリエ調製物を得た。注射前、注射間及び注射後に、
陰嚢周囲を毎週測定し、所定の時期に頸静脈から血液を
採取し、血漿を−２０℃でアッセイまで保存した。
【０１３４】アッセイ 血漿サンプル中の抗ＧｎＲＨ抗体による125Ｉ−ＧｎＲ
Ｈの結合を実施例３に記載のようなラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）によって定量した。
Ｈの結合を実施例３に記載のようなラジオイムノアッセ
イ（ＲＩＡ）によって定量した。
【０１３５】結果（図８及び図９） −アジュバントだけで処理した動物の血漿は抗ＧｎＲＨ
抗体を含んでいなかった。実験期間中に４頭の雄ウシの
陰嚢周囲は規則的に増大した。
抗体を含んでいなかった。実験期間中に４頭の雄ウシの
陰嚢周囲は規則的に増大した。
【０１３６】−ｐＡＩ ４１０で処理した雄ウシの血漿
中では抗体結合が観察され、その結果として対照動物に
比較して陰嚢周囲が縮小していた。
中では抗体結合が観察され、その結果として対照動物に
比較して陰嚢周囲が縮小していた。
【０１３７】−ｐＡＩ ４４０で処理した雄ウシの血漿
中では抗体結合が観察され、１頭は特に高い値を示し
た。この結果として対照動物に比較して陰嚢周囲が縮小
していた。
中では抗体結合が観察され、１頭は特に高い値を示し
た。この結果として対照動物に比較して陰嚢周囲が縮小
していた。
【０１３８】−ｐＡＩ １０４１０処理した雄ウシの全
部は対照動物に比較して、特にブースター注射後の短期
間内に高い血漿抗体結合と陰嚢周囲のかなりの縮小とを
示した。
部は対照動物に比較して、特にブースター注射後の短期
間内に高い血漿抗体結合と陰嚢周囲のかなりの縮小とを
示した。
【０１３９】−ｐＡＩ １０４４０で処理した雄ウシの
血漿中では抗ＧｎＲＨ抗体結合が観察され、また対照動
物と比較して陰嚢成長がかなり低下した。
血漿中では抗ＧｎＲＨ抗体結合が観察され、また対照動
物と比較して陰嚢成長がかなり低下した。
【０１４０】−ＨＲ１にＳｔｕＩ部位を付加すると、抗
ＧｎＲＨ抗体の誘発及びその活性がリンカー１または４
のいずれを使用したかにかかわりなく顕著に改善され
た。
ＧｎＲＨ抗体の誘発及びその活性がリンカー１または４
のいずれを使用したかにかかわりなく顕著に改善され
た。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】
【表２】
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
【配列表】 配列番号：１ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：２..３１ （xi）配列 G CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGA TCCCG 36 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：２ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：３ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：２..３１ （xi）配列 G CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG AGG CCT GGG 31 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：４ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：５ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：５..３４ （xi）配列 GACT CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGG GATCC 39 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：６ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：７ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：８..３７ （xi）配列 GGGATCC CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGC GGTCC 42 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：８ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：９ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：４８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：７..３６ （xi）配列 GGGTTG CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGA TCCCGAACCC 46 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：１０ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：１１ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：７..３６ （xi）配列 GGGTTG CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG AGG CCT GGA ACCCTG 42 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：１２ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：１３ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：５１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１０..３９ （xi）配列 GGGTTGACT CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGG GATCCAACCC TG 51 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：１４ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：１５ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：５４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１３..４２ （xi）配列 GGGTTGGGAT CC CAG CAC TGG AGC TAC GGC CTG CGT CCA GGC GGTCCAACCCTG 54 Gln His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 配列番号：１６ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：１７ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （ix）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す名称／記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置：１..２７ （xi）配列 GGG ACT GCA GGT GAC GCT TAT CCC CTG 27 Gln Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Pro Leu 1 5 配列番号：１８ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 配列番号：１９ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル：無 （ｖ）フラグメントの型：中間部 配列番号：２０ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （xi）配列 CAGCTTTTAA AGGCCTTGGA GCAGCTAAAA 30 配列番号：２１ （ｉ）配列の特性： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：無 （iii）アンチセンス：無 （xi）配列 TTCTTTCGAT GGGTTAACCC TGAAAGATGG 30
【図１】プラスミドｐＰＩＬ２９１−１５１０及びｐＰ
ＩＬ２９１−１５１９に挿入されたオリゴヌクレオチ
ド。コードされたＧｎＲＨアミノ酸配列に下線を付けて
示している。
ＩＬ２９１−１５１９に挿入されたオリゴヌクレオチ
ド。コードされたＧｎＲＨアミノ酸配列に下線を付けて
示している。
【図２】プラスミドｐＡＩ ４１０、４３０、４４０及
び４５０中の組換えＨＲ４領域のＤＮＡ配列及び対応す
るアミノ酸配列。コードされたＧｎＲＨアミノ酸配列に
下線を付けて示している。
び４５０中の組換えＨＲ４領域のＤＮＡ配列及び対応す
るアミノ酸配列。コードされたＧｎＲＨアミノ酸配列に
下線を付けて示している。
【図３】ＧｎＲＨのアミノ酸配列を含む突然変異フィム
ブリエで処理されたかまたは非処理の雌ラットの血清中
の抗ＧｎＲＨ抗体価の増加を示す。血清希釈度５６００
×における相対結合。
ブリエで処理されたかまたは非処理の雌ラットの血清中
の抗ＧｎＲＨ抗体価の増加を示す。血清希釈度５６００
×における相対結合。
【図４】アジュバントだけによって処理したラットの発
情周期： スコア：１＝発情間期 ２＝発情前期または発情後期 ３＝発情期
情周期： スコア：１＝発情間期 ２＝発情前期または発情後期 ３＝発情期
【図５】ｐＡＩ １０４１０で処理したラットの発情周
期： スコア：１＝発情間期 ２＝発情前期または発情後期 ３＝発情期
期： スコア：１＝発情間期 ２＝発情前期または発情後期 ３＝発情期
【図６】ＧｎＲＨのアミノ酸配列を含む突然変異フィム
ブリエによって処理されたかまた非処理の雌ラットの平
均体重。
ブリエによって処理されたかまた非処理の雌ラットの平
均体重。
【図７】ＧｎＲＨのアミノ酸配列を含む突然変異フィム
ブリエによって処理されたかまた非処理のラットの卵巣
重量。
ブリエによって処理されたかまた非処理のラットの卵巣
重量。
【図８】ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）のア
ミノ酸配列を含む突然変異フィムブリエによって処理さ
れるかまた非処理の仔ウシの血漿中の抗ＧｎＲＨ抗体価
の増加。血漿希釈度５６００×における相対結合。
ミノ酸配列を含む突然変異フィムブリエによって処理さ
れるかまた非処理の仔ウシの血漿中の抗ＧｎＲＨ抗体価
の増加。血漿希釈度５６００×における相対結合。
【図９】ＧｎＲＨのアミノ酸配列を含む突然変異フィム
ブリエによって処理されたかまた非処理の仔ウシの陰嚢
周囲の増加。
ブリエによって処理されたかまた非処理の仔ウシの陰嚢
周囲の増加。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イルマ・マリアンヌ・フアン・デイー オランダ国、2804・ペー・ゼツト・ホウ ダ、ワテルレリー・124 (72)発明者 ウイレム・ピエテル・マルテイン・フーク ストラ オランダ国、ゼイスト、コーウエンホーフ エン・61−46 (72)発明者 ヨセフス・テオドルス・ヘーレン オランダ国、5845・アー・エム・セント・ アンソニス、ケンペンスボス・10
Claims (11)
- 【請求項１】 ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲ
Ｈ）またはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体に対する免
疫応答を誘発し得る免疫原性キャリアー系であって、前
記キャリアー系が、インサートを伴う主要サブユニット
の少なくとも一部を含む大腸菌Ｐ線毛フィラメントの少
なくとも一部を含み、前記インサートが、ＧｎＲＨまた
はＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なく
とも１つを有するペプチドから成り、前記インサート
が、野性型主要サブユニットの超可変領域４の位置に対
応する主要サブユニット内の位置に配置されていること
を特徴とする免疫原性キャリアー系。 - 【請求項２】 ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの類似体もしく
は誘導体の抗原決定基少なくとも１つを含むペプチド
が、アミノ酸配列ｇｌｎ ｈｉｓ ｔｒｐ ｓｅｒ ｔ
ｙｒ ｇｌｙ ｌｅｕ ａｒｇ ｐｒｏ ｇｌｙに由来
することを特徴とする請求項１に記載の免疫原性キャリ
アー系。 - 【請求項３】 主要サブユニットが血清型Ｆ−１１のＰ
−フィラメントに由来することを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の免疫原性キャリアー系。 - 【請求項４】 インサートの最大長さがアミノ酸１６個
であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項
に記載の免疫原性キャリアー系。 - 【請求項５】 インサートが更に、ＧｎＲＨまたはＧｎ
ＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基少なくとも１
つを含むペプチドにフランキングする少なくとも１つの
アミノ酸を含むことを特徴とする請求項１から４のいず
れか一項に記載の免疫原性キャリアー系。 - 【請求項６】 インサートを伴う主要サブユニットが更
に、野性型主要サブユニットの超可変領域１及び隣接相
同領域の一部に対応するアミノ酸配列中に突然変異を含
むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記
載の免疫原性キャリアー系。 - 【請求項７】 インサートを伴う大腸菌Ｐ線毛フィラメ
ントの主要サブユニットの少なくとも一部をコードする
組換えＤＮＡ配列であって、前記インサートが、ＧｎＲ
ＨまたはＧｎＲＨの類似体もしくは誘導体の抗原決定基
少なくとも１つを含むペプチドから成り、前記インサー
トが、野性型主要サブユニットの超可変領域４の位置に
対応する主要サブユニット内の位置に配置されているこ
とを特徴とする組換えＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 請求項７に記載の組換えＤＮＡ配列を含
む発現ベクター。 - 【請求項９】 請求項７に記載の組換えＤＮＡ配列及び
／または請求項８に記載の発現ベクターを含み、前記組
換えＤＮＡ配列を発現させ得る微生物。 - 【請求項１０】 フィムブリエを発生し得る請求項９に
記載の微生物。 - 【請求項１１】 動物体内でＧｎＲＨまたはＧｎＲＨの
類似体もしくは誘導体に対する免疫応答を誘発し得るワ
クチンであって、前記ワクチンが、有効量の請求項１か
ら６のいずれか一項に記載の免疫原性キャリアー系を含
むかまたは請求項８に記載の発現ベクターを含むかまた
は請求項９もしくは１０に記載の微生物を含み、ワクチ
ンに慣用の１種以上のアジュバントもしくはその他の化
合物を任意に含むことを特徴とするワクチン。
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