NO313917B1 - Antigen-presenterende kapsid med fusert MS2-kappeprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et kapsid-dannende protein omfattende de trekk som er nevnt i krav 1, og spesielt slike proteiner som er inneholdende slike epitoper, samt fremstillingen av slike proteiner og deres bruk som vaksiner .

Veksten av rekombinant DNA-teknologi i de senere år har ført til innføringen av vaksiner hvor et immunogent protein har blitt identifisert, klonet og uttrykt i en passende bakteriell vert til å erholde tilstrekkelige mengder protein for å tillate effektiv beskyttende immunisering både hos dyr og mennesker. Som en utvidelse av slike teknikker, har det blitt foreslått å innbefatte kun de immunogene epitoper i bærerproteiner som er i stand til ekspresjon i en passende vertsorganisme mens de opprettholder de immuniserende egenskaper hos epitopen. Således beskriver Beesley et al., Biotechnology, £3, 1990, 644-649, fremstillingen av kimeriske proteiner hvor epitoper for munn og klovsykevirus eller human korionisk gonadotropin er fusert til N-terminalen av hepatitt B kjerneprotein som bærer. Ekspresjon av det kimeriske protein ble utført i gjær, idet ekspresjon i E. coli ble funnet ikke å være fullstendig tilfredsstillende.

Det har også blitt antydet av Pushko et al., Abstracts of VTIIth International Congress of Virology, Berlin, August 26-31 1990, P38-006, at visse uidentifiserte områder av RNA-fag fra kappeproteinkapsidet kan være i stand til å akseptere fremmede aminosyresekvenser uten tap av kapsid-dannende egenskap. Imidlertid, gav disse arbeidere ingen indikasjon på noe annet enn tilfeldig innsetting av slike aminosyresekvenser gjennom hele kappeproteinet for å erholde visse uidentifiserte kimeriske konstruksjoner.

Det er klart et behov ved videreføring av vaksineteknologi for fremstilling av kimeriske proteiner som er i stand til effektiv og reproduserbar presentasjon av fremmede immunogene epitoper, hvilke proteiner kan bli dannet ved rekombinante metoder innbefattende ekspresjon i en godt forstått og regulerbar bakteriell vertsorganisme så som E. coli. Naturlige virale epitoper blir selvfølgelig presentert på det normale overflatenettverk hos virale skall eller mem-braner. Et system som etteraper denne naturlige form for antigenpresentering bør, i teorien, vise seg spesielt effektiv til å fremskaffe immunresponsen. Imidlertid, for å oppnå et slikt resultat, er det nødvendig å identifisere bakterielle viruskappeproteiner som kan klones og som, når de uttrykkes, danner kapsider uavhengig av det genetiske materiale hos viruser. Videre, er det nødvendig å identifisere et spesielt område hos kappeproteinet som ikke er essensielt for kapsiddannelse og som kan manipuleres uavhengig av det gjenværende av proteinet for å motta den fremmede epitop.

Det har nå blitt funnet at epitopinnsetning i en identifisert klasse virusproteinbærere, kan bli spesifikt rettet slik at fremmede epitoper pålitelig blir presentert på overflaten av proteinkapsidsammensetningen etter ekspresjon av det kimeriske protein i en bakteriell vert.

Det var på ingen måte forutsigbart at et slikt resultat kunne bli oppnådd. Ikke alle virus har kappeproteiner som vil sette seg sammen på egen hånd; videre, var det ikke mulig å forutsi noen slik egensammensetning. Enda videre, kan ulikt dyrevirus, bakterielle virus ikke naturlig bli ventet å ha immunodominante områder og det er således ingen rettledning angående hvilket område hos et bakterielt viruskappeprotein (om de finnes) som kunne modifiseres med rimelig forventning til å indusere en immunrespons.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet et kimerisk protein som er i stand til å danne deler av en kapsidsammensetning og som omfatter aminosyresekvensen til et modifisert kappeprotein av fag MS-2, eller av en relatert E. Coli-replikerbar RNA-fag med en struktur som likner den til MS-2 ved at den har et N-terminalt P-hårnålsløkke-område hos kappeproteinet idet kappeproteinet har blitt modifisert ved innsetning av en fremmed epitop ved eller nær midten av det N-terminale p-hårpinne-område, som bestemt ved røntgenstrålekrystallografi av hele fagpar-tikkelen.

Overraskende er det blitt funnet at et slikt kimerisk protein kan bli uttrykt i en passende bakteriell vert for å gi kapsider som mangler fag-RNA og som for en stor del er fri for andre nukleinsyreforurensninger.

Det kimeriske kappeprotein er fortrinnsvis det som er avledet fra fag MS-2, men det kan også være avledet fra relaterte RNA-fager som er i stand til replikasjon i E. coli, så som fager RI7, fr, GA, QP og SP. Slike RNA-fager med fysisk struktur lignende den til MS-2 vil inneholde noe kjemisk variasjon i aminosyreresiduene til kappeproteinet, og er således konservativt modifiserte varianter av MS-2 kappeproteinet. Selv om det er antatt for tiden at i hovedsak det fullstendige kappeprotein kan være nødvendig for kapsidsammensetning, kan delesjoner og/eller innsetninger av relativt liten natur også være mulig mens det fremdeles opprettholdes kapsiddannende egenskap. Proteiner med slike modifiserte sekvenser, er innbefattet i omfanget av oppfinnelsen.

Som angitt ovenfor, blir den fremmede epitop satt inn ved området i proteinet som i det sammensatte kapsid tilsvarer den N-terminale p-hårpinne. Den tredimensjonale struktur til MS-2 fag-partikkelen har blitt publisert av Valegård et al., (Nature, 1990, 345, 36-41). De publiserte data viser for det første at strukturen av kappeproteinet ikke er relatert til det åtte-kjedede p-tønnemotiv som finnes i alle andre sfæriske RNA-virus subenheter hvis strukturer er kjent på nåværende tidspunkt. For det andre, selv om kappeproteinet oppbeviser kvasiekvivalente intersubenhetkontak-ter, finnes ingen andre innretninger så som forlengede polypeptidarmer som hjelper til med å sikre hver protein-form. Kappeproteinstrukturen kan bli betraktet i lys av tre atskilte områder. Disse er ikke domener i den vanlige be-tydning, men kan representere uavhengige foldende enheter. Disse områder er residuer 1-20 som danner p-hårpinnestruk-turen som stikker ut fra overflaten av fagen som danner den mest fjerntliggende da det gjelder trekk. Dette område er fulgt av residuer 21-94 som danner fem p-kjeder innbefattende "FG-løkken" som er området ved den eneste konformasjonelle hovedendring mellom kvasiekvivalente konformere. Disse p-kjeder blir så fulgt av to a-tvinninger, residuer 95-125, som griper inn i hverandre for å sikre dimere av kappeproteinsubenhetene. Valegård et al. er kun opptatt av den fysiske struktur av MS-2 viruset og forsøker ikke å utarbeide virkningsmåten til viruset.

Som forklart ovenfor, omfatter foreliggende oppfinnelse en kappeproteinaminosyresekvens som er modifisert ved å inn-føre en fremmed epitop i området som tilsvarer den utstikk-kende hårpinne. Det kimeriske protein ifølge oppfinnelsen har følgelig blitt slik modifisert i området til aminosyreresiduer 1-20, idet slik nummerering er under referanse til den fullstendige kappeproteinsekvens til MS-2, som publisert av Fiers, Nature, 1976, 260, 500-507. Foretrukket lig-ger modifikasjonen til å sette inn den fremmede epitop mot eller ved midten av hårpinneområdet. Det er følgelig foretrukket å innføre den fremmede epitop i området til glysin 14- og treonin 15-residuene av kappeproteinet. Selv om det ikke ønskes å være bundet av noen spesiell teori, blir det funnet at nærværet av én eller flere glysinresiduer umiddelbart flankerende den innsatte epitop, er fordelaktig ved innføring av konformasjonell fleksibilitet til epitopen i dens påfølgende presentasjon.

Den fremmede innsatte epitop kan i stor grad variere, avhengig av de immunogene egenskaper som ønskes i det kimeriske protein. Således, i henhold til en form av oppfinnelsen, blir en 9-mer peptidsekvens avledet fra hemagglutininet av det humane patogeninfluensavirus (eller en hemagglutininenhet inneholdende epitopen) satt inn i MS-2 kappeproteinet. Alternativt, kan et dekapeptid fra den tunge kjeden av IgE, anvendelig ved vaksinering mot IgE-medierte allergiske reaksjoner, eller et dekapeptid relatert til dette, bli innført. Et slikt dakapeptid er beskrevet og krevet i internasjonal patentsøknad publikasjonsnr. WO 90/15878. Selv om relativt korte sekvenser med kun et par aminosyreresiduer kan bli satt inn, er det også tenkt at lengre epitoper, for eksempel 30 eller flere residuer, kan bli satt inn, for eksempel en epitop omkring 24 residuer inneholdende den identifiserte 8-mer immunodominante sekvens til gpl20 fra humant HIV 1 virus. Det vil bli forstått at den maksimale lengde til epitopen og naturen til epitopen, vil avhenge av at det resulterende kimeriske protein opprettholder sin egenskap å danne en kapsidsammensetning. Multiple kopier, eller en blanding av epitoper, spesielt av korte epitoper, kan bli innført så lenge den kapsiddannende egenskap blir opprettholdt, og oppfinnelsen er tenkt å innbefatte innføringen av multiple kopier av en fremmed epitop eller et antall fremmede epitoper i området hos den N-terminale p-hårpinne til kappeproteinet. Epitoper fra andre patogener, av viktighet i human og veterinær medisin, er også tenkt for innsetning, for eksempel avledet fra FMDV VPl-protein eller HIVp24. Det vil bli forstått at den innsatte epitop kan være bundet ved en eller begge ender av ytterligere aminosyrer som ikke er essensielle for den epitopiske funksjon av innsetningen. Videre, er uttrykket "epitop" tenkt å innbefatte precursor-innskudd som kan oppvise sin epitopiske funksjon etter posttranslasjonell modifisering.

Oppfinnelsen strekker seg også til kapsidsammensetninger av de kimeriske proteiner ifølge oppfinnelsen. Det er blitt funnet at slike kapsider kan bli uttrykt i E. coli som "tomme fager" uten RNA av det levende virus. Fremstillingen av blandede kapsidsammensetninger er påtenkt, for eksempel ved tidligere nedbrytning av in vivo sammensatte homogene prøver fulgt av ny sammensetning av en blanding. Slike kapsidsammensetninger er for eksempel ment å være i stand til å fremskaffe en blandet immunrespons, og således være i stand til å finne anvendelse som vaksiner for immunisering mot et naturlig spektrum av virale epitoper i en popula-sjon. Oppfinnelsen strekker seg følgelig også til vaksiner omfattende et eller flere kimeriske proteiner som definert ovenfor.

De kimeriske proteiner ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å innføre cDNA-sekvensen som tilsvarer kappeproteinet til MS-2 (eller cDNA-sekvensen som tilsvarer en konservativt modifisert variant av et slikt kappeprotein eller tilstrekkelig av nevnte protein eller variant for å opprettholde kapsiddannende egenskap) i en sekvenserende vektor som er egnet for seterettet mutagenese, fremstilling av et unikt restriksjonsenzymgjenkjennelsessete i området hos cDNA som koder for den utstikkende hårpinne, innføring av oligonukleotider som omfatter den fremmede epitop ved restriksjonssetet (ved vanlige genetiske manipuleringstek-nikker) og subkloning av det således modifiserte gen i en egnet ekspresjonsvektor, fulgt av induksjon av ekspresjon fra den modifiserte ekspresjonsvektor som bærer det fremmede gen i en egnet vertsorganisme. En egnet vertsorganisme for MS-2 er E. coli, som er fordelaktig ved at fermenterin-ger er relativt lette og billige å utføre, og systemet er velkjent. Alternativt, kan ekspresjon bli utført i en heterolog vertsorganisme, så som gjær, som kan tillate post-translasjonell behandling av innsatte sekvenser.

Foretrukket blir restriksjonsenzymgjenkjennelsessetet dannet ved cDNA-kodonene som tilsvarer glysin 14 og treonin 15, under referanse til aminosyresekvensen av kappeproteinet til MS-2. Passende blir et Kpn 1 gjenkjennelsessete dannet. Et slikt sete har blitt funnet å være spesielt egnet ved at fordøying med Kpn 1 og påfølgende ligering ved nærvær av det fremmede oligonukleotid resulterer i innsetning i leserammen av epitopen flankert ved begge ender av et glysin og trioninresiduum, som, er det antatt, øker den konformasjonelle fleksibilitet av epitopen og når dette presenteres in vivo, bør dette hjelpe til med immungjen-kjennelse.

Sekvenseringsvektoren kan være enhver av de som er kjent som seterettet mutagenese, så som M13 mp 18. cDNA blir erholdt fra RNA til MS-2 ved standard reverstranskrip-sjonsteknikker. Utgangspunkt RNA til MS-2 kan bli erholdt ved å dyrke organismen eller fra en kommersiell prøve (tilgjengelig fra Boehringer, Mannheim, Tyskland). Eks-presjonsvektoren som brukes for ekspresjon i E. coli er passende pGWll sammen med det nødvendige promoter/induser så som en tac-promoter indusert av IPTG.

Etter ekspresjon i E. coli, blir de overuttrykte cellulære proteiner underkastet opprenskningsprosedyrer for å erholde det MS-2-avledede kappeprotein. En passende opprensknings-prosedyre omfatter ultralydbehandling for å frigjøre opp-løselige cellulære proteiner, sentrifugering, behandling av den resulterende supernatant med DNase I, ammoniumsulfatutfelling, dialyse og størrelsesfraksjonering for å erholde sammensatte kapsider, samt slike teknikker som immunoaffinitetskromatografi. Opprenskningsprosedyren kan kreve modifisering avhengig av den kjemiske og fysiske natur av den innførte fremmede epitop. De resulterende kapsider kan bli karakterisert ved gelfiltrering og/eller sukrosetett-hetsgradiensteknikker og identiteten av innskuddet bli bekreftet ved sekvensering. Det har blitt funnet at det er mulig å erholde i hovedsak homogent kappeprotein som tomme kapsider som vist ved elektronmikroskopi og proteinsekven-sering, og disse kapsider har også blitt krystallisert.

Disse kapsider i hvilke en fremmed epitop har blitt inn-ført, har blitt vist ved Western blot-teknikker å reagere både med et monoklonalt antistoff mot den fremmede epitop og med et polyklonalt serum inneholdende antistoff mot villtypekappeproteinet, idet villtypekapsider kun reagerer med det polyklonale serum.

De kimeriske proteiner og sammensatte kapsider ifølge foreliggende oppfinnelse er tenkt anvendt som vaksiner i enhver av de vanlige måter innen faget.

Således er det, for eksempel, tenkt at kapsidene kan anven-des i vandig suspensjon med eller uten tilstedeværelse av en adjuvant og/eller ytterligere forsterkende fraksjoner, for anvendelse ved injeksjon eller beskyttet oral avlever-ing. Egnede adjuvanter er de som vanligvis brukes i humane og veterinære vaksiner, så som ufullstendig Freunds adjuvant, aluminiumhydroksydgeladjuvanten "Alhydrogel" (et registrert varemerke) eller Saponin. Alternativt kan vaksinen formuleres som en sakte frigjørende kapsel. Ytterligere materialer kan bli innbefattet for å øke immungjen-kj ennel sen, så som muramyldipeptid.

Selv om det vil bli forstått at størrelsen og frekvensen av immuniseringsdosene vil variere vesentlig avhengig av an-vendelsesområdet (humant eller veterinært) og patogenene mot hvilket beskyttelse er ønsket, kan en typisk vaksine anvende fra 0,2 til 5 mg kapsider, passende omkring 0,5 mg, hvor meningen, for eksempel, er å tilføre vaksinen i form av 1 til 3 doser ved 2 til 4 ukers intervaller. Slike doser er tenkt å illustrere oppfinnelsen og er ikke tenkt på noen måte å være begrensende.

Ved å ta 9-meren avledet fra influensavirus, beskrevet ovenfor som et eksempel, er det tenkt at en typisk pasient vil bli immunisert ved tilførsel av 0,2 til 5 mg protein, enten i vandig suspensjon eller etter blanding med adjuvant så som aluminiumhydroksydsuspensjon, enten som en enkel dose eller flere doser ved intervaller på, for eksempel, 2 uker. Enhver passende inokuleringsrute kan bli utført, for eksempel, subkutan (s.c), intramuskulær eller intradermal. Alternativt kan en tablett av et passende belagt materiale (for å beskytte mot fordøying i magen) bli gitt for å stimulere immunitet ved overflaten av mageslimhinnen.

Det vil være tydelig at det foreligger flere fordeler ved å bruke MS-2 og relaterte fager som et antigenpresentasjons-system. Således, kan de tomme kappeproteinkapsider lett bli uttrykt i relativt høyt utbytte i E. coli, hvor produktet lett blir renset og det har blitt funnet at de sammensatte kapsider viser stor stabilitet med hensyn til et område av temperaturer, pH og ionestyrker. Selv om det ikke ønskes å bli begrenset av en spesiell teori, er det antatt at oppfinnelsen også tillater å presentere epitoper i et regel-messig mønster på overflaten av bærerkapsider, ved på for-hånd bestemte beliggenheter, noe som vil maksimalisere immungjenkjenneIse og som baserer seg på den flerfoldige natur av antistoffmolekyler.

Det er antatt at MS-2-systemet har vesentlig potensiell anvendelse for presentasjonen av fremmede peptidsekvenser på overflaten av en sfærisk bakteriofag. Systemet har et antall fordeler i forhold til filamentøse bakteriofag-alternativer. MS-2-kappeproteinet er i stand til å lette selvsammensetning i fravær av nukleinsyre, ulikt de fila-mentøse fager hvori sammensetning faller sammen med inn-kapsling av nukleinsyre. Videre må det filamentøse kappeprotein undergå en posttranslasjonell behandling og mem-braninnsetting før sammensetning inntreffer, mens MS-2-proteinet er ubehandlet. MS-2-systemet har også fordelen med en detaljert molekylær modell for kappeproteinet, noe som tillater effektene av fremmed peptidinnsetting å bli modellert. Den tilsynelatende egenskap til MS-2-kimere materialer å fremskaffe spesifike titere mot definerte konformasjoner av epitoper, antyder at de gir en billig og elegant metode for fremstilling av forbedrede vaksiner.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Eksempel 1. Presentasjon av epitop avledet fra influensavirus . a) Fremstilling av ekspresjonsvektor innbefattende kappeprotein cDNA fra MS- 2.

Kappeproteinet til MS-2 ble erholdt ved å dyrke fag MS-2, rense RNA, fulgt av oligonukleotidprimærrettet revers transkripsjon for å fremstille enkeltkjedet cDNA som ble konvertert til dobbeltkjedet cDNA ved å bruke oligoprimere og Klenow polymerase. cDNA ble så subklonet i en ekspresjonsvektor (pGWll), noe som plasserer kappeproteinet under kontroll av den induserbare tac-promoter. b) Fremstilling av modifisert ekspresjonsvektor innbefattende fremmed epitop.

cDNA til MS-2-kappeproteinet (erholdt som i a) ovenfor) ble subklonet fra ekspresjonsvektor pGWll i standard sekven-seringsvektor M13mpl8, for å danne et enkeltkjedet substrat for seterettet mutagenese. Et Kpn 1 restriksjonssete ble innført ved å modifisere DNA-kodonene som tilsvarer glysin 14 og treonin 15 hos MS-2-kappeproteinet. En nukleotid-sekvens som tilsvarer en 9-mer peptidsekvens avledet fra hemagglutininet hos det humane patogeninfluensavirus, ble innført med fordøying med Kpn 1 og påfølgende ligering. Det således modifiserte gen ble subklonet i en passende ekspresjonsvektor (pGWll). Oligonukleotidet kodet for 9-mer aminosyresekvensen YPYDVPDYA, identifisert som inneholdende en av de antigene determinanter av Wilson et al., (Molecular and Cell Biology, mai 1988, 2159-2165 og Cell, volum 37, 1984, 767-788). Den oligonukleotid-seterettede mutagenese beskrevet ovenfor for å konstruere Kpn 1-setet ble utført ved å bruke standard kommersielt tilgjengelige sett. Ytterligere DNA-manipulasjoner ble utført ved å bruke standard teknikker (Maniatis et al., "Molecular Cloning. A laboratory manual", 2. utgave, (1989), Cold Spring Harbor Press, CSH, New York).

Den resulterende vektor ble sekvensert for å vise innset-ningene av kodonene for 9-meren. Som en følge av bruken av Kpn 1-setet, ble to ytterligere kodoner, for glysin og treonin, dannet nedstrøms for innskuddet, d.v.s. en total innsetning på 11 kodoner.

c) Ekspresjon av vektorer i E. coli.

pGWll ekspresjonsvektorene med og uten innføring av de

fremmede epitopkodoner ble uttrykt i E. coli og de cellulære proteiner erholdt, renset og karakterisert som følger: Standard laboratoriestammer av E. coli ble transformert (for ampicillinresistens) med ekspresjonsplasmidet som

bærer det rekombinante MS-2-kappeproteingen. Raskt voksende kulturer av disse transformanter i rike medier ble indusert ved tilsetning av IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM når O.D. 600 av kulturen var 0,4-0,6. Cellevekst ble fortsatt over natten før cellene ble innhøstet ved sentrifugering,

resuspendert i nøytral buffer, ultralydbehandlet for å lysere cellene, fulgt av sentrifugering for å atskille supernatanten (inneholdende de uttrykte rekombinante pro-dukter) og celleavfall. Supernatanten ble fraksjonert ved ammoniumsulfatutfelling, produktpelleten ble resuspendert i buffer før den ble renset på basis av størrelse ved enten sukrosetetthetsgradienter eller gelfiltreringskromatografi eller immunoaffinitetskromatografi. Det modifiserte kappeprotein blir heretter referert til som MS2-HA. Dets sekvens ble bekreftet ved N-terminal aminosyresekvensering over de første 3 0 residuer.

Eksempel 2. Presentasjon av epitop relatert til human IgE.

Ved å bruke teknikkene beskrevet i punkt a), b) og c) av eksempel 1, ble et dekapeptid relatert til en sekvens fra humant IgE som er ansvarlig for å sette i gang degranu-lering av mastceller som beskrevet i internasjonal patent-søknad publikasjonsnr. WO90/15878, satt inn i MS-2-kappeprotein samt uttrykt og renset. Oligonuleotidinnskuddet ved Kpn 1 restriksjonssetet kodet for 10-mer aminosyresekvensen FGFFGSGKTK, hvor det modifiserte kappeprotein heretter blir referert til som MS2-IgE' på grunn av dets slektskap til IgE-dekapeptidet. Som beskrevet i eksempel 1, som en følge av bruken av Kpn 1-setet, ble to ytterligere kodoner, for glysin og treonin, dannet, noe som fører til en total innsetning på 12 aminosyrer. Det IgE'-modifiserte MS-2-kappeprotein ble identifisert og dets aktivitet under-søkt som nedenfor. N-terminal aminosyresekvensering over de første 3 0 residuer bekreftet sekvensen for innskuddet.

Eksempel 3. Presentasjon av epitop avledet fra HIVgpl20.

Ved å bruke teknikken beskrevet i eksempel 1, med modifisering som beskrevet nedenfor, ble en 24-mer avledet fra V3-løkken til gp 120 fra humansviktvirus (HIV-1) inkorpo-rert i MS-2-kappeproteinet samt uttrykt og renset, gp 120-innskuddet ble dannet ved først å knytte sammen oligonukleotider som koder for aminosyresekvensene N N T R K S I R I Q R G P G og GPGRAFVTIGKIG, behandling med Klenow-polymerase for å gjøre dem dobbeltkjedet, T4-polynukleotidkinase og DNA-ligase for å danne tandemligerte fragmenter som så ble fordøyet med Kpn 1 før gelrensing og kloning i passende fremstilte porsjoner av ekspresjonsvektorene. Den innsatte 24-mer aminosyresekvens var N N T R KSIRIQRGPGRAFVTIGKIGog det resulterende modifiserte kappeprotein er heretter referert til som MS2-gp 12 0. Igjen er det bemerket at, som en følge av bruken av Kpn 1-setet, blir to ytterligere kodoner dannet, noe som fører til en total innsetning på 26 aminosyrer. Det gp 120-modifiserte MS-2-kappeprtein ble identifisert som beskrevet nedenfor.

Eksempel 4. Immunrespons av MS2- HA.

Immunresponsen av det modifiserte kappeprotein erholdt i henhold til eksempel 1, og renset ved sentrifugering gjennom sukrosetetthetsgradienter, ble undersøkt som følger: Kappeproteinprøver med og uten innsetningen av den fremmede epitop ble underkastet Western blotting og undersøkt med de følgende antistoff: i) et polyklonalt serum inneholdende antistoff mot villtype MS-2-kappeprotein erholdt fra New Zealand hvite kaniner immunisert i nærvær av fullstendig Freunds adjuvant med renset monomerisk MS-2-kappeprotein renset fra den intakte fag.

ii) et museantipeptidmonoklonalt antistoff mot 9-meren (12CA5 som kan erholdes fra the Research Institute of Scripps Clinic, California, USA).

Den anvendte prosedyre var som følger:

Kappeproteinprøver med og uten 9-mer-innskuddet ble underkastet SDS-PAGE og derpå overført til nitrocellulosepapir. Western blottet ble så undersøkt med enten punkt i) eller ii) og gjort synlig med pepperrotperoksydase - henholdsvis konjugert geite-anti-kanin eller rotte-anti-mus IgG, ved å bruke metoden til Harlow og Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Det polyklonale serum i) reagerte med begge prøver av kappeprotein med kun liten kryssreaksjon til andre protein-komponenter og til en prøve av renset influensahemaggluti-nin. Imidlertid, reagerte det monoklonale antistoff ii) i hovedsak kun med kappeproteinbåndet inneholdende 9-mer pep-tidepitopen. Dette bekrefter tilstedeværelsen av epitopen i kappeproteinmaterialet som er i stand til selvsammensetning in vivo og er fullstendig konsistent med mobiliteten av proteinprøvene på SDS-PAGE, hvor villtypeproteinet migrerer noe raskere enn det kimere 9-mer protein.

Eksempel 5. Identifisering av kimeriske MS- 2- proteiner.

A) SDS- PAGE og Western blot- analyse.

500 ml's kulturer av E. coli (TG 1) som bærer de passende pGWll ekspresjonsvektorer, med og uten innføring av fremmede epitopkodoner, ble dyrket til O.D. 600 omkring 0,4 til 0,6 ved 37°C, indusert ved tilsetning av fast IPTG til 1 mM og inkubering ble fortsatt over natten. Cellene ble innhøs-tet ved sentrifugering og pelletene resuspendert med 2-3 X's volum i 50mM Tris-HCl + 0,5% w/v Sarkosyl pH 6,5, derpå ble cellene ødelagt ved ultralydbehandling. Det totale ultralydbehandlede materiale blir satt på to SDS-PAGE (16,5%T:6%C) akrylamidgeler i henhold til fremgangsmåtene til Shågger og Jagow (Anal. Biochem. 166, 368-379). Elek-troforese ble utført ved 95V i 8-10 timer og akrylamid-gelene derpå farget med en 0,5% w/v Cbmmassie Blue R250 oppløsning i metanol:eddiksyre:vann (2:0,2:3) i 8 timer, derpå avfarget i samme oppløsning men uten tilsetning av fargestoff.

Resultatene bekreftet at det i hvert tilfelle tilsvarte det hovedinduserte polypeptidbånd den ventede molekylvekt for MS-2-kappeprotein og de fremstilte kimeriske materialer.

Geler som var ekvivalente med de fremstilt som beskrevet umiddelbart ovenfor, ble blottet på 0,2 (im nitrocellulose-membran i henhold til fremgangsmåtene til Harlow og Lane ("Antibodies: A Laboratory Manual" (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, New York), og proteinene er gjort synlig ved behandling med et anti-MS2-kappeprotein kaninpoly-klonalt antistoff fulgt av pepperrotperoksydasekonjugert geite-anti-kanin IgG. Resultatene er vist i figur 1, hvor brønn a) viser villtype MS-2-kappeprotein, brønn b) viser MS2-HA, brønn c) viser MS2-IgE' og brønn d) viser MS2-gp 120. Brønn e) er innbefattet som et molekylvektsmarkørspor (kommersielt tilgjengelig BRL Ltd.) med distinkte bånd som representerer henholdsvis 43, 29, 18, 14, 6,2 og 3,4 kDa molekylvekter.

Western blot ble fremstilt som ovenfor og MS2-HA og MS2-IgE'-overføringer undersøkt med enten et muse- eller rottemonoklonalt antistoff rettet henholdsvis mot HA 9-meren eller IgE 10-meren (relatert til den innsatte IgE' 10-mer). Disse monoklonale antistoff ble henholdsvis erholdt fra Dr. I. A. Wilson, Scripps Research Institute, La Jolla, California eller Dr. D. R. Stanworth, University of Birmingham, UK. MS2-gp 12 0 overføringen ble undersøkt med geitepolyklonalt anti-gp 120 (erholdt fra Repligen Corp., Boston, USA). For synliggjøring ble henholdsvis pepperrotperoksydase konjugert til kanin-anti-mus IgG, anti-rotte eller anti-geit IgG brukt. Resultatene viste spesifik immunoreaktivitet mot det ventede kimeriske materiale. Det bør bemerkes at det anti IgE monoklonale antistoff faktisk kryssreagerte med det MS2-IgE' kimeriske materiale.

B) Elektronmikrografi

Celler ble fremstilt som i punkt A) ovenfor, men med de følgende endringer: Cellene ble dyrket ved 3 0°C. Den opprinnelige supernatant ble dialysert direkte mot 2 0 mM natriumfosfat, pH 7,4 ved 4°C før den ble påført en immunoaffinitetskolonne, som så ble renset i utstrakt grad med dialysebuffer og derpå samme buffer + 100 mM NaCl før MS-2-proteinene ble eluert i 20 mM eddiksyre, 200 mM NaCl. De eluerte proteiner ble umiddelbart justert til pH 7,0 med IM Tris-HCl, pH 9,0, konsen-trert med ammoniumsulfatutfelling, resuspendert i 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,0 og derpå dialysert mot samme buffer før de ble preparert for elektronmikroskopi ved å bruke den negative fargingsfremgangsmåte til Sugiyama et al., (J. Mol. Biol., 166, 1967, 368-379). Mikrografer ble fremstilt ved å bruke et JEM-1200 instrument ved en akselererende spenning på 75kV.

Immunoaffinitetskolonnen besto av affinitetsrenset kanin-anti-MS2-CP polyklonale IgGs kovalent koblet til Affigel-HZ™ (BioRad) i henhold til forhandlers instruksjoner.

Resultatene er vist i figur 2-5, hvor figur 2 viser villtype MS2-kapsider, figur 3 viser MS2-HA-kapsider, figur 4 viser MS2-IgE'-kapsider og figur 5 viser MS2-gp 120 kapsider .

Eksempel 6. Antigenisitet av MS2- HA in vivo

For å undersøke immunogenisiteten til MS2-HA konstruksjonen i mus, ble MS2-HA erholdt som beskrevet i eksempel 1 og renset over sukrosetetthetsgradienter, d.v.s. fra den opp-løselige supernatant av den initielle cellefraksjonering.

Sammenslåtte fraksjoner inneholdende den sammensatte MS2-HA ble utfelt med ammoniumsulfat, presipitatet ble samlet opp ved sentrifugering og derpå resuspendert i den valgte buffer (eller lagret ved -20°C). Grupper av mus (TUXCS nummer en) ble immunisert s.c. med et doseområde fra 5 ng til 500 ug av totalkonstruksjon (hvor den innsatte HA9-mer er 9/140 per vekt av denne dose). Doser inneholdt adjuvant (Alhydrogel) som en 1:1 blanding. Forsterkende doser ble gitt ved 7 eller 14 dagers intervaller, etter fjerning av en blodprøve for analyse. Selv med de laveste doser var det en viss immunoreaktivitet som målt ved ELISA-assay mot MS2-HA (d.v.s. "selv") som antigenet. Imidlertid ble signifikante res-ponser observert kun for de større doser og var fremdeles økende etter 42 dager. En doseresponskurve for de 42 dagers titre er vist i figur 6.

42-dagersprøvene fra mus immunisert med 500 ug av MS2-HA ble analysert for spesifisitet mot det innsatte peptid. Dette ble igjen fortatt ved ELISA-assay ved å bruke enten

selv eller bærer, d.v.s. villtype MS-2 tomme kapsider som antigen. Resultatene er vist i figur 7. Gjennom titrerings-seriene er det en høyere verdi for assayet mot selv. Titre ved 50% metning er 1:7500 for selv, mot 1:3200 for MS-2-bærer, noe som indikerer at høye spesifike antistofftitre mot innskuddet hadde blitt dannet. Serumet som ble dannet, kryssreagerte også med HA9-mer-peptidet koblet til nøkkel-hulliglehemocyanin (KLH), selv om dette mye mindre godt, sannsynligvis fordi i dette tilfelle blir peptidet presentert enkeltvis som et lineært fragment.

Videre immunogenisitetsforsøk ble utført med ELISA, på 54 dagers blodtapninger fra Balb C mus immunisert med MS2-HA fremstilt som beskrevet ovenfor med og uten Alhydrogeladjuvant og villtype MS-2 med og uten adjuvant. For sam-menlignings formål ble forsøk også utført på 54-dagers blodtapninger fra Balb C mus immunisert med HA9-mer peptid koblet til KLH, med og uten Alhydrogeladjuvant og et syn-tetisk peptid omfattende HA9-mer-sekvensen alene med og uten adjuvant. Et 500 mg-doseområde ble anvendt. Alhydrogel ble, når det ble benyttet, anvendt som en 1:1 blanding. Resultatene blir vist i tabell 1 nedenfor. Titrene som er gitt, er mot "selv" og "bærer". For injeksjonene med MS2-HA og villtype MS-2, er "selv" MS2-HA-konstruksjonen, mens "bærer" er villtype MS-2. For injeksjonene med KLH-konstruksjoner er "selv" KLH-HA9-mer-konstruksjonen og "bærer" er KLH. For injeksjonene med HA9-mer-peptid alene, er "selv" HA9-mer-peptidet alene og det er ingen "bærer". Resultatene vist i tabell 1, viser klart spesifisiteten til antistoffrespons mot HA9-meren konstituitivt uttrykt i MS2-HA-konstruksjonen. Videre er det også vist at det ikke all-tid nødvendigvis behøver å brukes en adjuvant eller bærer som KLH, for å oppnå en meget spesifik antistoffrespons mot et konstituitivt uttrykt fremmed peptid, så som HA9-meren.

Eksempel 7. Antigenisitet til MS2- IgE' in vivo.

For å undersøke immunogenisiteten til MS2-IgE' konstruksjonen i rotter, ble en prøve av MS2-IgE' fremstilt som følger: Lysater av konstruksjonen ble fremstilt som beskrevet i eksempel 5A, bortsett fra at cellene ble dyrket ved 3 0°C og resuspensjonsbufferen som ble brukt var 50 mM Hepes + 100 mM NaCl + 10 mM DTT + 5 mM ADTA pH 7,4. Lysater ble klar-gjort ved sentrifugering.

Etter sentrifugering ble pelleter resuspendert i samme isoleringsbuffer og den følgende ekstraksjonsprosedyre ble utviklet. Den resuspenderte pellet ble behandlet med DNase I (lOmg/ml) med tilsetning av magnesiumacetat til 6 mM. Etter 3 0 minutter ved 3 7°C, ble en saltekstraksjon utført ved tilsetning av NaCl til 50 mM i 20 minutter ved 37°C. Deretter ble prøven sentrifugert ved 10 000 rpm i 2 0 minutter ved 4°C og pelleten ble suspendert i resuspensjonsbuf-fer (RS), men med tilsetning av 1% v/v Triton X-100 + 0,05% w/v natriumdeoksykolat. Ved å bruke en magnetisk rører, ble blandingen konstant omrørt i 60 minutter på is. Blandingen ble så sentrifugert og resuspendert i RS, som ovenfor. Fluortriklormetan ble tilsatt til suspensjonen (1:1) og blandingen ble konstant omrørt ved å bruke en magnetisk rører i 15 minutter ved 4°C. Blandingen ble sentrifugert ved 3 00 rpm i 3 0 minutter ve 4°C og det øverste oppløste lag (SL) ble luftet og lagret på is mens den mellomliggende fase ble resuspendert og fremgangsmåten ble gjentatt 5 ganger. De sammenslåtte SL ble ammoniumsulfatkonsentrert, sentrifugert og lagret ved 4°C for videre analyse.

Det ovenfor fremstilte materiale ble brukt til å immunisere to Wistar hannrotter (200 g) i henhold til de to følgende prosedyrer: 1. prosedyre: 0,25 ml av suspensjonen MS2-IgE' konstruksjon ble injisert på både dag 0 og 14. På dag 36 ble 0,75 ml av en 2:1 av konstruksjonssuspensjon og Alhydrogel (inkubert ved romtemperatur i 20 minutter) injisert s.c. Serum ble erholdt etter haleblodtapping ved dag 21, 48 og 70 for ELISA-assay. 2. prosedyre: 0,35 ml av en 2:1 blanding av konstruksjonssuspensjon og Alhydrogel (inkubert ved romtemperatur i 20 minutter) ble injisert s.c. på både dag 0 og 14. På dag 36 ble 0,75 ml konstruksjonssuspensjon og Alhydrogelblanding injisert subkutant. Serum ble erholdt for ELISA-assay etter haleblodtapping på dag 21, 4 8 og 70.

Serumene erholdt som ovenfor ble undersøkt med ELISA mot det injiserte immunogen MS2-IgE' ved å bestemme respons mot "selv" (i dette tilfelle MS2-IgE') og mot bærer MS-2. De høyeste titere var, mot selv (henholdsvis 1. prosedyre 70-dagstapping, og 2. prosedyre 70-dagstapping) 1:50000 og 1:70000 og mot bærer (henholdsvis 1. prosedyre 70-dagtapping, 2. prosedyre 70-dagstapping) 1:10000 og 1:20000.

Resultatet viser den spesifikke natur til antistoffrespon-sen som erholdes mor IgE<1> peptidet uttrykt konstituitivt i MS2-IgE' konstruksjonen.

Claims (9)

1. Kapsid-dannende protein, karakterisert ved at det omfatter et modifisert kappeprotein av fagen MS-2 eller av en relatert E.coli-replikerbar RNA-fag med en struktur som likner den til MS-2 ved at den har et N-terminalt p-hårnålsløkke-område hos kappeproteinet, idet kappeproteinet er modifisert ved innsetting av en fremmed epitop ved eller nær midten av det N-terminale hårnålsløkke-område.

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at fagen er valgt fra MS-2, R17, fr, GA, <)>p og SP.

3. Protein ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at kappeproteinet er det fra en fag som er relatert til eller som er fra fag MS-2 og som er modifisert ved innsetting av en fremmed epitop mellom residuene som tilsvarer eller som er glycin-14 og treonin 15 i MS-2.

4. Kapsid, karakterisert ved at det er dannet med et protein ifølge ethvert av kravene 1 til 3.

5. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter kapsider ifølge krav 4.

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av et protein ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den omfatter å inn-føre cDNA-sekvensen som tilsvarer kappeproteinet til MS-2, eller fra nevnte relaterte fag, inn i en sekvenserings-vektor som er egnet for sete-rettet mutagenese, danne et enestående restriksjonsenzym gjenkjennelses-sete i det området av dette cDNA som koder for den N-terminale P-hårnålsløkke, innføre oligonukleotider som omfatter den fremmede epitop ved restriksjonssetet og sub-klone det således modifiserte gen inn i en egnet ekspresjonsvektor, fulgt av å indusere ekspresjon fra den modifiserte ekspresjonsvektor som bærer det fremmede gen i en egnet vertsorganisme .

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at vertsorganismen er E. coli.

8. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter DNA som koder for et kapsid-dannende protein ifølge ethvert av kravene 1 - 4.

9. Vertsorganisme, karakterisert ved at den er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 8.